Introduction
최근에 개발 된 높은 처리량 단일 세포 분석 기법은 신규 효소는 기능적 활동을 기반으로 한 대규모 유전자 라이브러리로부터 스크리닝 될 수있다. 단일 세포 수준에서 전사 조절 단백질을 표적 효소 활성의 결과로 생산되는 작은 분자를 감지하여 리포터 유전자의 발현을 유발하기 위해 사용된다. 초기의 방법은 상기 기판은 리포터 단백질이 발현을 유도하는 (SIGEX) 메소드를 스크리닝 기판 - 유도 유전자 발현을 사용 Ralstonia eutropha E2로부터 페놀 분해 오페론의 분리를 포함했다. 슈도모나스 푸티 다 (Pseudomonas putida)의 NhaR은 알데하이드 탈수소 효소 (3)을 선택하기 위해 사용하고, 코리 네 박테 리움 글루 타미 쿰에서 LysG은 다양한 돌연변이 라이브러리 (4)로부터 새로운 L- 라이신 생산 균주의 고 처리량 스크리닝에 이용 하였다.
이전에는 유전 적 효소 screeniNG 시스템 (GESS)는 일반적으로 적용 선별 플랫폼 (5)로 제안되었다. 이 시스템의 P., DmpR을 페놀 인식 디메틸 레귤레이터를 사용 푸티 다. DmpR (E135K) 및 DmpR의 돌연변이는 또한 P의 니트로 페놀 (PNP)의 검출 GESS (PNP-GESS)에 사용될 수있다. 페놀 성 화합물의 제조 표적 효소의 존재에 GESS E. 대장균 세포는 형광 활성화 된 세포 분류기 (FACS)를 사용하여 단일 세포의 신속한 분리를 가능하게하는 형광 신호를 방출한다. 그러나 군 유전체학 효소의 발현은 통상적 인 재조합 효소보다 약한 것으로 보인다; 따라서 GESS 최적의 운전 조건과 함께 5 리보솜 결합 부위 (RBS) 및 종료 서열의 조합을 조사하여 최대 감도와 페놀 성 화합물을 검출하도록 설계되었다.
GESS의 기본적인 장점 중 하나는이 하나의 방법은 이론적으로 오븐의 심사를 수 있다는 것입니다BRENDA 데이터베이스에있는 효소의 어 200 다양한 유형 (표 1에 http : // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) 단순히 다른 기판을 사용함으로써. 그것은 그 셀룰라 제, 리파제를 도시하고, 메틸 파라티온 가수 분해 효소 (MPH)의 P의 -nitrophenyl 부티레이트, P의 -nitrophenyl-cellotrioside, 메틸 파라티온, 각각 5 적절한 기질 PNP-GESS을 이용하여 검출 될 수있다. 최근에는 PNP-GESS를 사용하여 식별 소설 효소의 하나 인 알칼리성 포스파타제 (AP)가, 추위 적응 해양 metagenomes 6에서 발견 된 첫 번째 thermolabile의 AP는 것을 입증했다.
여기서, 검사 공정의 상세 PNP-GESS는 5,6- 군 유전체학 라이브러리로부터 새로운 후보 효소를 빠르게 식별 enzymes- 리파아제, 셀룰라아제, 알칼리 포스파타제의 세 가지 유형의 활동을 검출 -and되게된다. 프로세스는 metagenome PNP-GESS로 전처리 및 FL을 운영 포함세포 계측법 분류기를 흐름. 얻은 히트 더 식별 순서가 될 필요가 있지만,이 프로토콜은 유동 세포 계측법 사용하여 효소 활성을 확인하는 단계까지의 절차를 설명합니다.
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Protocol
1. PNP-GESS와 군 유전체학 라이브러리를 준비
- E.에서 군 유전체학 라이브러리를 구축 대장균은 fosmid 벡터를 제조자의 프로토콜에 따른 5 fosmid 라이브러리 제조 키트를 사용.
- 분취 군 유전체학 라이브러리 세포의 원천의 -70 ° C에서 저장 라이브러리 100 ㎕.
주 :이 라이브러리 스톡을 600 nm의 (OD 600)의 파장에서 측정 한 시료의 흡광도는 약 100이다. - 얼음 재고 군 유전체학 라이브러리 100 μl를 해동하고 50 ㎖ 루리아 - 베르 타니 (LB)과 2 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션 12.5 μg의 / ㎖의 클로람페니콜을 함유하는 500 ㎖의 플라스크에 접종.
- 4 ℃에서 20 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리하여 50 ML 원뿔 튜브에 세포를 수확.
- 다시 4 ° C에서 20 분 동안 1,000 XG에 50 ml의 얼음처럼 차가운 증류수 (DW) 및 원심 분리기에 신속하게 펠렛을 재현 탁.
- 해상도10 % (v / v) 글리세롤 50 μl의 빙냉 DW에서 펠릿 uspend. 전기에 대해이 셀 나누어지는 50 μl를 사용합니다.
- 얼음처럼 차가운 전기 큐벳과 electroporate (1.8 kV의 / cm, 25 μF) 혼합물에 electrocompetent 세포를 50 μL 및 pGESS (E135K) 5 DNA (는 100 ng)의 혼합물을 놓습니다.
- 신속 catabolite 억압 (SOC) 매체와 슈퍼 최적의 국물 1 ml에 추가하고 부드럽게 세포를 재현 탁.
- 피펫을 사용하여 14 ml의 둥근 바닥 튜브에 세포를 전송하고 1 시간 동안 37 ° C에서 품어.
- 12.5 ㎍ / ml 클로르 암 페니 콜 및 50 μg의 / ㎖의 앰피 실린을 함유하는 LB 20 × 20cm 사각 접시에 회수 된 세포 500 μl를 확산. 12 시간 동안 30 ° C에서 접시를 품어.
- 셀 스크레이퍼를 사용하여 콜로니를 긁어 빙냉 셀 저장 매체를 이용하여 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 세포를 수집한다.
- 4 ℃에서 20 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. 10 mL의 빙냉 셀 저장 매체 내에 펠렛을 재현 탁OD 100의 600에 도달합니다.
- 분취 액을 -70 ℃에서 저장 셀 20 μL.
2. 군 유전체학 라이브러리에서 오판을 제거
- 얼음에 군 유전체학 DNA의 fosmid 및 pGESS (E135K)를 포함한다 (단계 1.13)에서 주식 군 유전체학 라이브러리 세포를 해동.
- 14 mL의 둥근 바닥 튜브를 50㎍ / ㎖의 앰피 실린과 12.5 μg의 / ㎖의 클로람페니콜을 함유하는 2 ml의 LB 내의 셀의 10 μl를 접종한다. 4 시간 동안 200 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 인큐베이션.
- 한편, FACS 기계를 켜고 기본 FACS 소프트웨어를 엽니 다. 다음 설정을 사용하여 노즐 팁 직경 70 μm의; 순방향 분산 영역 (FSC-A)의 감도, 300 V 대수 증폭; 사이드 분산 영역 (SSC-A) 감도 350 V 대수 증폭; 형광 염료 영역 (FITC-A) 감도 450 V 대수 증폭; 임계 값 매개 변수, FSC-A 값 5.
참고 : 일반 설정이 제공됩니다재료의 표에 언급 FACS 장치. 다른 FACS 장치에 대한 설정을 조정합니다. - 1 ㎖의 PBS를 함유하는 5 ㎖의 둥근 바닥 튜브에 시료 5 μl를 첨가하여 단계 2.2에서 군 유전체학 라이브러리 세포를 희석.
- FACS 악기의로드 포트에 희석 된 라이브러리 샘플을 놓고 FACS 소프트웨어의 취득 대시 보드에로드 버튼을 클릭합니다.
- 클릭하고 대시 보드의 유량 버튼을 제어하여 / 초 1500 이벤트 - 1,000 이벤트 속도를 조정합니다.
- 로그 도구 모음에서 도트 플롯 버튼을 클릭하여 글로벌 워크 시트에 SSC-A 산점도를 확장 대 로그를 만들기 FSC-A를 조정. 도구 모음에서 다각형 게이트 버튼을 사용하여 단일 이벤트 (세균 집단)를 포함하는 분산 형 게이트 R1을 조정합니다.
- 로그 히스토그램 버튼을 클릭하여 워크 시트에 FITC-A를 확장 대 세포 수와 히스토그램 플롯. 그리고, Cytome에서 FITC 전압을 조정종 모양의 분포의 피크가 FITC-A의 10이되도록 검사기 컨트롤 창에 터 설정 탭을 클릭합니다.
- 대 로그 스케일 FSC-A를 만듭니다. 로그 FITC-A 글로벌 워크 시트의 도트 플롯 버튼을 클릭하여 플롯. 게이트가 bell-의 피크 주위에 분포의 중심 (총 10 %의 세포에서 + 5 % -5 % 세포 사이에 위치되도록 도구 모음에서 다각형 게이트 버튼을 사용하여 플롯에 정렬 게이트 R2를 설정 모양의 곡선).
- 1.2 ml의 LB는 FACS 악기의 출구에 50 μg의 / ㎖ 암피실린 및 12.5 μg의 / ㎖ 클로람페니콜을 포함하고 R1과 R2 게이트 모두를 만족 밖으로 정렬 10 6 세포를 포함한 컬렉션 튜브를 놓습니다.
- 포집 관, 모자, 부드럽게 소용돌이를 제거합니다.
3. 군 유전체학 효소 검사
- (600)이 0.5에 도달 OD 때까지 200 rpm으로 진탕 37 ° C에서 (단계 2.11)에서 정렬 된 세포를 품어.
- 1 μL가 세포 내 fosmid 사본 번호를 증폭 유도 솔루션을 복사 추가합니다. 250 rpm으로 흔들면서 37 ℃에서 추가 3 시간 동안 세포를 인큐베이션.
- 최종 농도 14 mL의 둥근 바닥 튜브에 0.5 배양 세포 ㎖의 적절한 기판 (p의 -nitrophenyl 아세테이트, P의 -nitrophenyl-β-D-cellobioside 또는 페닐 포스페이트)를 추가, 정렬 셀을 제조 100 μM의.
- 제어 샘플의 경우, 14 ml의 둥근 바닥 튜브에 단계 3.2에서 배양 된 세포 0.5 ㎖에 추가 할 수 있습니다. 단계 3.3에 기재 볼륨으로 PBS 동량을 추가한다.
- 3 시간 동안 200 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 두 샘플을 인큐베이션.
- 한편, 단계 2.3과 동일한 구성으로 FACS 기계를 준비합니다.
- 각각 1 ml의 PBS를 포함하는 두 개의 5 ml의 둥근 바닥 튜브에 (정렬) 세포 및 제어 세포의 5 μl를 추가합니다.
- 대조군 세포 t 상에 포함 된 튜브를 배치그는 FACS의 포트를로드하고 FACS 소프트웨어의 취득 대시 보드에로드 버튼을 클릭합니다. 대시 보드에 유량 버튼을 제어하여 / 초 3000 이벤트 - 1,000 이벤트 비율을 조정합니다.
- 로그 소프트웨어의 글로벌 워크 시트에 도트 플롯 버튼을 클릭하고 단일 이벤트를 포함하는 (세균 집단)를 캐터 게이트 R1을 조정에 다각형 게이트 단추를 사용하여 SSC-A 산점도를 확장 대 만들기 로그 FSC-A를 조정 도구 모음.
- 로그 도구 모음에서 다각형 게이트 버튼을 사용하여 플롯에 정렬 게이트 R2를 워크 시트에 도트 플롯 버튼을 클릭하고 설정하여 FITC-A 산점도를 확장 대 만들기 로그 FSC-A를 확장되도록의 0.1 % 음성 세포는 R2 게이트 내에서 검출된다.
- 정렬 샘플 튜브와 제어 샘플 튜브를 교체하고 1000 이벤트 속도를 조정 - 대시 보드의 유량 버튼을 제어하여 / 초 3000 이벤트.
- 0.5을 포함하는 포집 관을 배치mL 씩을 FACS기구의 출구와 LB 모두 R1 및 R2 게이트 만족 정렬 밖으로 104 세포.
참고 : 정렬 기준은 R2 게이트에 FITC-A의에서 최고 0.1 %로 5 % 범위 일 수있다. 이 프로토콜에서, 상위 1 %의 세포가 양성으로 수집 하였다. - 포집 관, 모자, 부드럽게 소용돌이를 제거합니다.
- LB, 50 μg의 / ㎖ 암피실린, 12.5 μg의 / ㎖의 클로람페니콜을 포함하는 두 한천 플레이트 (90mm 배양 접시)에 0.5 ml의에게 수집 된 샘플을 확산하고 밤새 37 ° C에서 접시를 품어.
- 필요한 경우, 단계 3.1-3.14를 반복하여 FITC-A 농축에 대한 정렬의 추가 라운드를 수행합니다.
4. 히트 선택 및 효소 활동 확인
- 분석 유동 세포 계측법
- 단계 3.14에서 배양 접시에서하는 LED 조명의 488 nm 파장의 관찰 아래 식민지 선택기를 사용하여 형광을 보여주는 식민지를 선택합니다.
- 14 ml의 소유주에 선택한 식민지 접종싶게 바닥이 ml의 LB (600)가 0.5에 도달 할 때까지의 OD 200 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 50 μg의 / ㎖의 암피실린 및 12.5 μg의 / ㎖의 클로람페니콜을 함유하는 함유하는 튜브.
- 2 μL가 세포 내 fosmid 사본 번호를 증폭 유도 솔루션을 복사 추가합니다. 250 rpm으로 흔들면서 37 ℃에서 추가 3 시간 동안 세포를 인큐베이션.
- 14 ㎖의 둥근 바닥 튜브를 준비하고 배양 된 세포 (단계 4.1.3) 1 ㎖를 추가합니다. 100 μM의 최종 농도로 적당한 기판 (p의 -nitrophenyl 아세테이트, P -nitrophenyl- β-D- cellobioside 또는 페닐 포스페이트)를 추가한다.
- 제어를 들어, 14 ml의 둥근 바닥 튜브에 단계 4.1.3에서 1 ml의를 배양 된 세포를 추가하고 단계 4.1.4에서 기판 볼륨으로 PBS의 동일한 볼륨을 추가합니다.
- 3 시간 동안 200 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 두 샘플을 인큐베이션.
- 한편, 단계 2.3과 동일한 구성으로 FACS 기계를 준비.
- 각각 1 ml의 PBS를 포함하는 5 ㎖의 둥근 바닥 튜브 제어 및 기판 처리 된 세포의 5 μl를 추가합니다.
- FACS 장치의로드 포트에 튜브를 포함하는 제어 세포를 놓고 FACS 소프트웨어의 취득 대시 보드에로드 버튼을 클릭합니다. 대시 보드에 유량 버튼을 사용하여 3000 이벤트 / 초 - 1000 이벤트 속도를 조정합니다.
- FITC-A를 측정하기 위해 취득 버튼을 클릭합니다.
- 기판 처리 샘플 튜브와 제어 샘플 튜브를 교체합니다. 대시 보드에 유량 버튼을 사용하여 3000 이벤트 / 초 - 1000 이벤트 속도를 조정합니다.
- FITC-A를 측정하기 위해 취득 버튼을 클릭합니다.
- 로그 FITC-A 스케일링 대 세포 수의 히스토그램을 플로팅함으로써 세포의 두 그룹의 형광을 비교한다.
- 다른 분석은 효소 활성을 확인
- 선택한 효소 후보의 추가 식별을 위해, 표준 추출 프로를 사용하여 fosmid DNA를 추출상용 추출 키트에서 cedures하고 염기 서열을 분석하거나, 시험 관내 효소 활성을 테스트 -6,7-.
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Representative Results
세 페놀 기판은 제안 된 프로토콜에 따라 태안, 한국의 바다 - 갯벌 퇴적물의 metagenome 라이브러리에서 새로운 군 유전체학 효소를 식별하기 위해 조사 하였다. 라이브러리 건설, 평균 30~40킬로바이트의 metagenome 시퀀스는 E. 기반으로 fosmids에 삽입했다 대장균 F 인자 플리와 셀의 단일 사본으로 제시했다. fosmids 널리 인해 안정적인 전파 8 복잡한 게놈 라이브러리를 구성하기 위해 사용되어왔다 있습니다.
도 1은 음의 정렬과 위양성의 제거 R1 및 R2는 게이트 (도 1 B)을 정렬 한 플러스 히트 선택 하였다 (도 1 A)을 포함하는 스크리닝 프로토콜의 간략한 흐름도를 도시한다. 조회수와는 기판없이 샘플의 형광을 비교함으로써 평가 하였다(그림 1 C). 기판 처리 된 세포의 형광은 대조군 세포 (도 2)의 그것보다 높았다 여기서 P는 -nitrophenyl 아세테이트 매개 선별시, 리파아제 다섯 후보들을 확인 하였다. 도 2의 B 셀룰라아제의 세 후보의 광범위한 분포에도 불구하고, 이들은 또한 인구 평균 FITC 강도의 명확한 차이를 보였다. 포스 포 후보들도 대조군 세포 (도 2 C)에 비해 높은 수준의 형광을 나타냈다. 강한 효소 활성은 PNP-GESS의 형광 리포터 때문에 추론 될 수있는 음극 및 상기 후보 셀 간의 더 형광 차이 페놀 농도 5 정량적 인 반응을 나타낸다.
이 프로토콜에서, 오직 형광 차이는 유동 세포 계측법을 사용하여 확인되었지만 다양한 식별 분석이 적용될 수있다단계에서 언급 s의 4.2. 그림 3은 AP 식별 (6)의 예를 보여줍니다. 심사 40-7 높은 형광 식민지 중에서 선택된 클론 서열하고, 후보 AP의 ORF가 확인되었다. 플라스미드 벡터 내로 삽입 된 ORF는 유동 세포 계측법으로 AP 활성을 갖는 것을 확인 하였다. 그림 3에서 히트 빈 플라스미드 (음)을 운반하는 세포보다 강한 형광 신호를 보여줍니다. 시퀀스의 체외 효소 활성에 추가 분석이 AP는 낮은 온도에서 높은 촉매 활성 (35 ° C) 및 15 분 (6) 내에서 놀라운 열 불안정성 (65 ° C)를 제외하고는 효소 특성이 다른 알려진 액세스 포인트에 매우 유사한 것을 발견 . 또한, 스크리닝 AP는 선형화 된 플라스미드 DNA (6)의 점착력 및 평활 말단에서 말단 인산염을 제거하는 상업적으로 이용 가능한 AP를 비교 하였다.
그림 1 :. 기판없이 형광을 나타내는 거짓 양성 세포의 멀티 효소 심사 프로세스 (A) 제거. 게이트는 전체 세포의 10 %를 포함하도록 정렬 게이트 셀 인구 밀도의 중간에 위치한다. 적절한 기판의 존재하에 R1 및 R2 게이트를 만족하는 (B) 높은 형광 정리 (FITC-A) (양성) 세포. (C)의 선택 및 단일 세포 분리 한 후, 후보 효소의 활성과 상기 기판없이 조사 하였다 (각각, W로 표시 및 / W / O 기판). 두 샘플 사이의 명확한 신호 차이가 세포의 fosmid 벡터가 관심의 대상 유전 정보가 포함되어 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 효소 활동 평가 유동 세포 계측법을 사용하여 세 가지 다른 기판 (A) P는 -nitrophenyl 아세테이트 (pNPA), (B) P는 -nitrophenyl-β-D-cellobioside (pNPG2)과 함께 PNP-GESS에 의해 선별 군 유전체학 효소 후보. (C) 페닐 포스페이트. 모든 후보자와 기판없이 세포 사이의 명확한 신호의 차이를 보여줍니다. 컨트롤이 해당 기판 처리없이 세포입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 알칼리성 포스파타제 Identification. 왼쪽 패널 명중 효소와 빈 플라스미드 벡터 (음수)를 포함하는 세포 사이의 명확한 형광 차이를 보여줍니다. 오른쪽에서 비색 기질로서 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 릴 포스페이트를 함유하는 LB 한천 배지에 플라스미드 벡터에 포스 파타 아제 후보 유전자를 보유하는 세포 포스파타제 분석이 도시되어있다. 블루 콜로니를 선택한 셀은 포스 파타 아제를 코딩하는 유전자 군 유전체학가 포함되어 있음을 나타냅니다. 자세한 내용은 6을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| EC 번호 | 기술 | 페이지 니트로 페놀 생산 효소의 번호 | 페놀 생산 효소의 번호 | |
| EC 1 </ TD> | 1.3 | 기증자의 CH-CH 그룹에 작용 | - | 1 |
| 산화 환원 효소 | 1.11 | Peroxygenase | 이 | - |
| 1.14 | 통합으로, 한 쌍의 기증자에 작용 또는 | - | 이 | |
| 산소 분자의 환원 | ||||
| EC (2) | 2.3 | Acyltransferases | 1 | - |
| 트랜스퍼 | 2.4 | 글리코 실 트랜스퍼 라 아제 | 8 | - |
| 2.5 | 메틸기 이외 전송 알킬 또는 아릴 기, | 1 | 1 | |
| 2.7 | 인 함유 기 전송 | 1 | 1 | |
| 2.8 | 황 함유 기 전송 | 삼 | 1 | |
| EC 3 | 3.1 | 에스테르 결합에 관한 법률 | 67 | (16) |
| 가수 분해 효소 | 3.2 | Glycosylases | (75) | (21) |
| 3.4 | 펩티드 결합에 관한 법률 - 펩 티다 | (26) | 4 | |
| 3.5 | 펩티드 결합 이외의 탄소 - 질소 채권에 관한 법률 | (5) | 삼 | |
| 3.6 | 산 무수물에 관한 법률 | 4 | - | |
| 3.7 | 탄소 - 탄소 결합에 관한 법률 | 이 | - | |
| EC (4) | 4.1 | 탄소 - 탄소 리아제 | - | 삼 |
| 리아제 | 4.2 | 탄소 - 산소 리아제 | 1 | - |
| 4.3 | 탄소 - 질소 리아제 | 1 | - | |
| 효소의 소계 수 | 197 | (53) | ||
| 효소의 총 수 (중복 효소 제외) | (211) | |||
표 1 : BRENDA 데이터베이스에서 P는 니트로 페놀 또는 페놀을 생산 효소의 수입니다.
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Discussion
생체 촉매의 생산 효율을 증가시키는 것은 가장 좋은 천연 효소 소스로 간주됩니다 산업 9 metagenome 기반 바이오 화학의 성공을위한 열쇠입니다. 이러한 의미에서, 그것은 유전자 원의 대부분이 10 탐험되지 않은 metagenome에서 새로운 효소를 선별하는 것이 필수적입니다. 몇몇 선별 방법은 직접 전사 활성화 제 11, 12를 사용하여 효소 제품을 검출하는 개발되어 있지만, 이들 기술은 특정 대사 응답 전사 시스템을 필요로한다. 한편, GESS 페놀 또는 PNP가 기판 태그의 용도에 따라 광범위하게 적용될 수있다. BRENDA 데이터베이스 (이 작업의 세 가지 예를 포함) (표 1), 페놀 또는 PNP 화합물을 제조보고 효소 대부분 가수 분해에 속해 있지만 (EC 번호 3) 분류 효소는 다양 페놀 기판 탐색 및 심지어 인공 설계 기판에 실시천연 기질 대안 크게 스크리닝 시스템의 적용 가능성을 확장 할 수 있기 때문에, 효소 활성을 표적. 적합한 페놀을 선택 또는 PNP 기판 태그하면 선별 프로토콜을 상당히 영향을 기판의 막 투과성 및 셀룰러 효과 보낸 PNP-GESS 애플리케이션의 중요한 단계 중 하나 유의. 여기서는 효소의 산업적으로 중요한 세 가지 유형은 단일 검사 시스템을 이용하여 높은 처리량의 방식으로 식별 될 수 있음을 보여준다.
FACS를 사용하는 방법은, 군 유전체학 효소의 높은 처리량의 선별에 더하여, 또한 변경된 TR 특이성 전사 레귤레이터 (거래 정보)을 엔지니어링을 적용 할 수있다. 일례 대신 아라비의 메 발로 네이트를 검출 된 AraC 변이체는 FACS를 이용하여 분리 한 후 13 메 발로 네이트를 제조 화면 세포에 사용 하였다 된 연구이다. 또한, 거래 정보 저장소의 특이성의 변화가 푸르트 허용했다효소 활성의 어 엔지니어링. 자동 조절 TR, PcaU는, 3,4- 다이 하이드 록시 (34DHB)을 감지하도록 설계하고 34DHB (14)에 내생 dehydroshikimate 변환의 최대 활동에 dehydroshikimate 탈수 효소 (AsbF)을 선별하기 위해 적용되었다. PNP-GESS는 PNP를 검출하기 DmpR 변형을 사용하여 대규모 유전자 라이브러리의 스크리닝에 높은 처리 성능을 나타낸다 때문에이 연구의 기본 개념은, PNP-GESS 유사하다. 이 확대 특이성의 결과로 다른 유도에 의해 기자 발현을 촉발 할 수있다 그러나, 특이 공학, 히트 곡 중 의도하지 않은 잘못된 반응의 원인이 될 수 있습니다. 따라서, TR이 적용되기 전에 TR 응답의 직교성을 조사하는 것이 바람직하다. 한편, 감도와 TR의 동적 범위를 증가시키는 것은 위양성 생성을 보정 할 수있다. 예를 들어, GESS의 감도를 최적화 RBS 및 터미네이터 sequ 삽입 향상했다시스템에 화상 으. 심사 시스템의 오탐 (false positive) 가능성이 유전자 회로의 고장 출신의 TR, 이종 세포 성장, 페놀 또는 PNP의 무료 보급을 활성화 의도하지 않은 페놀 화학 물질. 단계 2.1의 음성 선별 공정 - 2.9 기판 처리없이 형광 방출 거짓 양성 세포를 제거하는 것으로 하였다. 거짓 양성 세포는 유전자 회로의 신호 대 잡음비를 최대화함으로써 감소시킬 수있다. RBS 및 종료 공학, M9-포도당 미디어의 사용과 함께 크게 PNP-GESS 성능 5 (LB 미디어보다 7 배) 신호를 향상. 그러나,이 프로토콜에 LB 미지 군 유전체학 및 유전자 발현 GESS 신호 강도 절충 사용 하였다. M9 글루코스의 PNP-GESS 세포 성장 기판 효과의보다 민감한 상황을 조사하여 신호 강도를 개선 할 수있다. 단계 3.5에 기재의 반응 시간의 긴밀한 조절은, 인또한 중요한 페놀 또는 PNP 확산에 의해 트리거 오 탐지를 방지합니다.
GESS은 단일 세포 수준에서 전사를 매개 리포터 단백질 발현에 효소 기능의 전환을 가능하게하지만, 리포터 단백질을 통한 간접적 인 식별이 본래 제한 중 하나가 될 수있다. 따라서, 체외 효소 분석과 제품의 LC / GC-MS 분석은 추정 효소 후보 6,7의 명확한 식별을 위해 따라야 할 필요가있다. 또한 같은 항생제 내성 유전자 또는 형광 기자 발색 효소로 대체 기자 부착하여 고가의 FACS 분석 없이도 GESS를 사용할 수있다. GESS 애플리케이션의 추가 개선을 위해, 그 효소 활성의 특성 및 고 처리량 방법으로 효소를 확인하는 방법을 확립하는 것이 필요하다. 이러한 차세대 시퀀싱과 같은 다른 높은 처리량 기술과 함께, GESS는 단백질과 enzy을 위해 널리 사용되는 전략이 될 것입니다생물학 기반 산업의 날 촉매 공학.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
| CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
| EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
| pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
| Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
| FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
| AZ100M | Nikon | Microscope | |
| UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
| 50-ml conical tube | BD Falcon | ||
| 14-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| 5-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
| p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
| p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
| Luria-Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 10 g/L |
| Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 0.5 g/L, Magnesium Sulfate 2.4 g/L, Potassium Chloride 186 mg/L |
| Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16 g/L, Yeast extract 10 g/L, Yeast extract 5 g/L |
| Cell storage media | 2x YT broth, 15% Glycerol, 2% Glucose | ||
| pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
References
- Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J. Novel screening methods-biosensors. Curr. Opin. Biotech. 35, 30-36 (2015).
- Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).
- Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. Selection of biocatalysts for chemical synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).
- Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13 (5), R40 (2012).
- Choi, S., et al. Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits. ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).
- Lee, D. H., et al. A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments. BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).
- Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
- Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector. Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).
- Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes. Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).
- Lorenz, P., Eck, J. Metagenomics and industrial applications. Nat. Rev. Microbiol. 3 (6), 510-516 (2005).
- Uchiyama, T., Miyazaki, K. Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes. Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).
- Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. Surveying bio-transformations with à la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes. Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).
- Tang, S. Y., Cirino, P. C. Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein. Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).
- Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).
