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Biology

मल्टी एंजाइम एक उच्च throughput जेनेटिक एनजाइम स्क्रीनिंग प्रणाली का प्रयोग स्क्रीनिंग

Published: August 8, 2016 doi: 10.3791/54059
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Synthetic Biology & Bioengineering Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, 2Biosystems and Bioengineering Program, University of Science and Technology, Daejeon, South Korea

Introduction

हाल ही में विकसित उच्च throughput एकल कोशिका परख तकनीक उपन्यास एंजाइमों एक बड़े पैमाने पर आनुवंशिक उनके कार्यात्मक गतिविधियों के आधार पर 1 पुस्तकालय से जांच की जा करने के लिए अनुमति देता है। एकल कोशिका के स्तर पर, प्रतिलेखन विनियमन के प्रोटीन छोटे अणुओं है कि एक लक्ष्य एंजाइम गतिविधि का एक परिणाम के रूप में उत्पादित कर रहे हैं संवेदन द्वारा पत्रकार जीन अभिव्यक्ति को गति प्रदान करने के लिए कार्यरत हैं। एक प्रारंभिक दृष्टिकोण सब्सट्रेट प्रेरित आनुवंशिक अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग (SIGEX) विधि है, जिसमें सब्सट्रेट एक संवाददाता प्रोटीन 2 की अभिव्यक्ति लाती का उपयोग कर Ralstonia eutropha E2 से एक फिनोल अपमानजनक operon के अलगाव शामिल किया गया। स्यूडोमोनास putida की nhar benzaldehyde डिहाइड्रोजनेज 3 चयन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और Corynebacterium glutamicum से LysG विविध उत्परिवर्ती पुस्तकालयों 4 से एक नया एल Lysine उत्पादक तनाव के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया गया था।

इससे पहले, एक आनुवंशिक एंजाइम screeniएनजी प्रणाली (GESS) एक आम तौर पर लागू स्क्रीनिंग मंच 5 के रूप में प्रस्तावित किया गया था। इस प्रणाली फिनोल-पहचानने dimethylphenol नियामक, DmpR का उपयोग करता है, पी की putida। DmpR (E135K), और DmpR की एक उत्परिवर्ती, भी पी -nitrophenol (PNP) का पता लगाने के लिए GESS (PNP-GESS) में नियोजित किया जा सकता है। लक्ष्य phenolic यौगिकों का निर्माण एंजाइमों की उपस्थिति में, GESS ई में कोलाई कोशिकाओं एक प्रतिदीप्ति संकेत उत्सर्जन करता है, एक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टर (FACS) का उपयोग करते हुए एकल कोशिकाओं का तेजी से अलगाव सक्षम करने से। लेकिन metagenomic एंजाइम की अभिव्यक्ति पारंपरिक पुनः संयोजक एंजाइमों की तुलना में कमजोर प्रतीत होता है; इसलिए, GESS इष्टतम ऑपरेटिंग हालत 5 के साथ साथ ribosomal बाध्यकारी साइट (आरबीएस) और टर्मिनेटर दृश्यों का संयोजन की जांच से अधिकतम संवेदनशीलता के साथ phenolic यौगिकों का पता लगाने के लिए डिजाइन किया गया था।

GESS के मौलिक लाभ में से एक यह है कि इस एक विधि सैद्धांतिक रूप से ov की स्क्रीनिंग की अनुमति देता हैBRENDA डेटाबेस में एंजाइमों के एर 200 से अधिक विभिन्न प्रकार के (तालिका 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) बस विभिन्न substrates को रोजगार से। ऐसा नहीं है कि Cellulase, lipase दिखाया गया था, और मिथाइल Parathion hydrolase (मील प्रति घंटे) पी -nitrophenyl butyrate, पी -nitrophenyl-cellotrioside, और मिथाइल Parathion क्रमश: 5 की उचित substrates के साथ PNP-GESS उपयोग कर पता लगाया जा सकता है। हाल ही में, यह साबित हो गया है कि एक alkaline फॉस्फेट (एपी) है, जो PNP-GESS का उपयोग कर पहचाना उपन्यास एंजाइमों में से एक है, पहले thermolabile एपी ठंड में अनुकूलित समुद्री metagenomes 6 में पाया जाता है।

इधर, जांच प्रक्रिया का ब्यौरा PNP-GESS एंजाइमों lipase, cellulase, और alkaline फॉस्फेट के तीन विभिन्न प्रकार की गतिविधियों का पता लगाने के -और तेजी से एक metagenomic पुस्तकालय 5,6 से उपन्यास उम्मीदवार एंजाइमों की पहचान के साथ प्रस्तुत किया है। प्रक्रियाओं metagenome PNP-GESS साथ preprocessing और एक FL ऑपरेटिंग शामिलओउ cytometry सॉर्टर। हिट प्राप्त आगे पहचान के लिए अनुक्रम किया जा करने की आवश्यकता होगी, वहीं इस प्रोटोकॉल प्रवाह cytometry का उपयोग एंजाइम गतिविधि पुष्टि के इस कदम को प्रक्रिया को शामिल किया।

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Protocol

1. PNP-GESS साथ Metagenomic लाइब्रेरी तैयारी

  1. ई में एक metagenomic पुस्तकालय का निर्माण कोलाई एक fosmid वेक्टर के साथ निर्माता प्रोटोकॉल 5 के अनुसार एक fosmid पुस्तकालय उत्पादन किट का उपयोग।
  2. अशेष -70 डिग्री सेल्सियस, जो metagenomic पुस्तकालय कोशिकाओं का एक स्रोत है पर भंडारण के लिए पुस्तकालय के 100 μl।
    ध्यान दें: एक नमूना इस पुस्तकालय शेयर के 600 एनएम (600 आयुध डिपो) की तरंग दैर्ध्य में मापा के ऑप्टिकल घनत्व लगभग 100 है।
  3. बर्फ पर शेयर metagenomic पुस्तकालय के 100 μl गला लें और एक 500 मिलीलीटर 50 मिलीलीटर Luria-Bertani (पौंड) और 12.5 माइक्रोग्राम / एमएल 37 2 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन द्वारा पीछा chloramphenicol युक्त कुप्पी में टीका लगाना।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 1,000 XG पर centrifugation द्वारा एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं फसल।
  5. गोली जल्दी से 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 1,000 XG पर 50 मिलीलीटर ठंडा आसुत जल (DW) और सेंट्रीफ्यूज में resuspend फिर से।
  6. रेस10% (वी / वी) ग्लिसरॉल के साथ 50 μl ठंडा DW में गोली uspend। electroporation के लिए इस सेल विभाज्य के 50 μl का प्रयोग करें।
  7. Electrocompetent कोशिकाओं 50 μl और pGESS (E135K) 5 डीएनए (100ng) का मिश्रण एक ठंडा electroporation क्युवेट और electroporate (1.8 केवी / सेमी, 25 μF) मिश्रण में रखें।
  8. जल्दी से 1 मिलीलीटर catabolite दमन (समाज) माध्यम के साथ सुपर इष्टतम शोरबा जोड़ने और धीरे कोशिकाओं resuspend।
  9. एक पिपेट का उपयोग कर 14 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूब में कोशिकाओं स्थानांतरण और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  10. एक पौंड 20 x 20 सेमी वर्ग की थाली 12.5 माइक्रोग्राम / एमएल chloramphenicol और 50 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन युक्त पर बरामद कोशिकाओं के 500 μl बिखरा हुआ है। 12 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
  11. एक सेल खुरचनी का उपयोग कालोनियों परिमार्जन और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब ठंडा सेल भंडारण मीडिया का उपयोग करने में कोशिकाओं को इकट्ठा।
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 1,000 XG पर अपकेंद्रित्र। 10 मिलीलीटर ठंडा सेल भंडारण मीडिया में गोली Resuspendएक आयुध डिपो के 100 से 600 तक पहुंचने के लिए।
  13. अशेष -70 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए कोशिकाओं के 20 μl।

2. Metagenomic लाइब्रेरी से झूठी सकारात्मक हटाना

  1. (चरण 1.13 से) शेयर metagenomic पुस्तकालय कोशिकाओं बर्फ पर metagenomic डीएनए fosmid और pGESS (E135K) युक्त गला लें।
  2. एक 14 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूब में 50 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन और 12.5 माइक्रोग्राम / एमएल chloramphenicol युक्त 2 मिलीलीटर लेग में कोशिकाओं के 10 μl टीका लगाना। 4 घंटे के लिए 200 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. इस बीच, FACS मशीन पर बारी और डिफ़ॉल्ट FACS सॉफ्टवेयर खुला। निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें: नोक टिप व्यास, 70 माइक्रोन; आगे तितर बितर क्षेत्र (एफएससी-ए) संवेदनशीलता, 300 वी-लघुगणक प्रवर्धन; ओर तितर बितर क्षेत्र (एसएससी-ए) संवेदनशीलता, 350 वी-लघुगणक प्रवर्धन; Fluorescein आइसोथियोसाइनेट क्षेत्र (FITC-ए) संवेदनशीलता, 450 वी-लघुगणक प्रवर्धन; सीमा पैरामीटर, FSC-ए मूल्य 5।
    नोट: विशिष्ट सेटिंग्स दिया जाता हैFACS डिवाइस सामग्री की तालिका में उल्लेख किया है। अन्य FACS उपकरणों के लिए सेटिंग्स को समायोजित करें।
  4. एक 5 मिलीलीटर दौर नीचे 1 मिलीलीटर पीबीएस युक्त ट्यूब के लिए नमूने के 5 μl जोड़कर चरण में 2.2 से metagenomic पुस्तकालय कोशिकाओं पतला।
  5. FACS साधन की लोडिंग बंदरगाह पर पतला पुस्तकालय नमूना प्लेस और FACS सॉफ्टवेयर के अधिग्रहण के डैशबोर्ड पर लोड बटन पर क्लिक करें।
  6. क्लिक करें और डैशबोर्ड पर फ्लो दर बटन को नियंत्रित करने से 1,500 घटनाओं / सेक - 1,000 घटना दर को समायोजित करें।
  7. लॉग बनाएं एफएससी-एक छोटा बनाम लॉग उपकरण पट्टी में डॉट साजिश बटन पर क्लिक करके एक वैश्विक वर्कशीट पर पहुंचा एसएससी-एक तितर बितर साजिश है। स्वेटर घटनाओं (बैक्टीरियल आबादी) उपकरण पट्टी में बहुभुज गेट बटन का उपयोग करने के लिए धरना बिखराव गेट R1 समायोजित करें।
  8. सेल गिनती के साथ एक हिस्टोग्राम प्लॉट बनाम लॉग हिस्टोग्राम बटन पर क्लिक करके वर्कशीट पर पहुंचा FITC-ए। फिर, Cytome से FITC वोल्टेज समायोजितइंस्पेक्टर नियंत्रण खिड़की पर आतंकवाद सेटिंग टैब ऐसी है कि घंटी के आकार वितरण के शिखर कम से कम FITC-ए का 10 2 है।
  9. एक लॉग पहुंचा एफएससी-ए बनाम बनाएँ। लॉग FITC-ए वैश्विक वर्कशीट पर डॉट साजिश बटन पर क्लिक करके साजिश है। साजिश उपकरण पट्टी पर बहुभुज गेट बटन का उपयोग करने पर एक छँटाई गेट R2 इतना तय है कि गेट (कुल 10% कोशिकाओं वितरण के केंद्र bell- के शिखर के आसपास से 5% और -5% की कोशिकाओं के बीच स्थित है आकार का वक्र)।
  10. 1.2 मिलीलीटर लेग FACS साधन के आउटलेट पर 50 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन और 12.5 माइक्रोग्राम / एमएल chloramphenicol युक्त और बाहर तरह 10 6 दोनों R1 और R2 फाटकों को संतोषजनक कोशिकाओं से युक्त एक संग्रह ट्यूब रखें।
  11. हटाये संग्रह ट्यूब, टोपी, और धीरे भंवर।

3. Metagenomic एनजाइम स्क्रीनिंग

  1. आयुध डिपो के 600 0.5 तक पहुँच जाता है जब तक 200 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर (कदम 2.11 से) हल कोशिकाओं को सेते हैं।
  2. जोड़े 1 μl intracellular fosmid प्रतिलिपि संख्या बढ़ाना प्रेरण समाधान की नकल। एक अतिरिक्त 3 250 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
  3. छंटाई के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, एक अंतिम एकाग्रता में एक 14 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूब में संवर्धित कोशिकाओं के 0.5 मिलीलीटर और एक उचित सब्सट्रेट (पी -nitrophenyl एसीटेट, पी -nitrophenyl-β-D-cellobioside, या फिनाइल फॉस्फेट) जोड़ने 100 माइक्रोन की।
    1. एक नियंत्रण नमूना के लिए, एक 14 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूब में कदम 3.2 से संवर्धित कोशिकाओं के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। पीबीएस का एक ही मात्रा 3.3 कदम में सब्सट्रेट मात्रा के रूप में जोड़े।
  4. 3 घंटे के लिए 200 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर दो नमूने सेते हैं।
  5. इस बीच, 2.3 कदम के रूप में एक ही विन्यास के साथ FACS मशीन तैयार करते हैं।
  6. दो 5 मिलीलीटर दौर नीचे क्रमश: 1 मिलीलीटर पीबीएस युक्त, ट्यूबों के लिए कोशिकाओं (छँटाई के लिए) और नियंत्रण कोशिकाओं के 5 μl जोड़ें।
  7. टी पर नियंत्रण कोशिकाओं से युक्त ट्यूब रखेंवह FACS के बंदरगाह लोड हो रहा है और FACS सॉफ्टवेयर के अधिग्रहण के डैशबोर्ड पर लोड बटन पर क्लिक करें। डैशबोर्ड पर फ्लो दर बटन को नियंत्रित करने से 3,000 घटनाओं / सेक - 1,000 घटना की दर को समायोजित।
  8. बनाम लॉग सॉफ्टवेयर की वैश्विक वर्कशीट पर डॉट साजिश बटन पर क्लिक करके और (बैक्टीरियल आबादी) स्वेटर घटनाओं धरना बिखराव गेट R1 समायोजित पर बहुभुज गेट बटन का उपयोग करके बढ़ाया एसएससी-एक तितर बितर साजिश बनाने लॉग एफएससी-एक छोटा उपकरण पट्टी।
  9. बनाम लॉग साजिश उपकरण पट्टी पर बहुभुज गेट बटन का उपयोग करने पर वर्कशीट पर डॉट साजिश बटन पर क्लिक करके और सेट एक छँटाई गेट R2 द्वारा बढ़ाया FITC-एक तितर बितर साजिश बनाने लॉग एफएससी-एक छोटा तो यह है कि कम से कम 0.1% नकारात्मक कोशिकाओं R2 फाटक के भीतर पता चला रहे हैं।
  10. छँटाई नमूना ट्यूब के साथ नियंत्रण नमूना ट्यूब की जगह, और 1000 के लिए घटना की दर को समायोजित - डैशबोर्ड पर फ्लो दर बटन को नियंत्रित करने से 3,000 घटनाओं / सेक।
  11. जगह 0.5 युक्त एक संग्रह ट्यूबFACS साधन की दुकान पर मिलीलीटर लेग और तरह बाहर 10 4 कोशिकाओं दोनों R1 और R2 फाटकों संतोषजनक।
    नोट: छँटाई कसौटी R2 गेट में FITC-ए का शीर्ष से 0.1% से 5% हो सकती है। इस प्रोटोकॉल में, शीर्ष 1% की कोशिकाओं को सकारात्मक रूप में एकत्र किए गए थे।
  12. हटाये संग्रह ट्यूब, टोपी, और धीरे भंवर।
  13. दो अगर प्लेट (90 मिमी पेट्री डिश) पौंड, 50 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन, 12.5 माइक्रोग्राम / एमएल chloramphenicol युक्त पर 0.5 मिलीलीटर नमूने एकत्र बिखरा हुआ है और रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
  14. यदि आवश्यक हो, कदम 3.1-3.14 दोहरा द्वारा FITC-ए संवर्धन के लिए छँटाई की अतिरिक्त फेरे प्रदर्शन करते हैं।

4. मारो चयन और एंजाइम गतिविधि पुष्टिकरण

  1. प्रवाह cytometry विश्लेषण
    1. चरण 3.14 पर incubated प्लेट से, कोई एक एलईडी प्रकाशक की 488 एनएम तरंगदैर्ध्य की निगरानी में एक कॉलोनी बीनने का उपयोग कर प्रतिदीप्ति दिखा एक कॉलोनी का चयन करें।
    2. एक 14 मिलीलीटर ro में चयन कॉलोनी टीका लगानाund तली 2 मिलीलीटर लेग अपने आयुध डिपो 600 0.5 तक पहुँच जाता है जब तक 200 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन और 12.5 माइक्रोग्राम / एमएल chloramphenicol युक्त ट्यूब।
    3. जोड़े 2 μl intracellular fosmid प्रतिलिपि संख्या बढ़ाना प्रेरण समाधान की नकल। एक अतिरिक्त 3 250 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
    4. एक 14 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूब को तैयार है और संवर्धित कोशिकाओं (चरण 4.1.3) के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 100 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता में एक उपयुक्त सब्सट्रेट (पी -nitrophenyl एसीटेट, पी -nitrophenyl- β डी-cellobioside, या फिनाइल फॉस्फेट) जोड़ें।
      1. एक नियंत्रण के लिए, 1 मिलीलीटर एक 14 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूब में कदम 4.1.3 से संवर्धित कोशिकाओं जोड़ने के लिए और कदम 4.1.4 में सब्सट्रेट मात्रा के रूप में पीबीएस का एक ही मात्रा में जोड़ें।
    5. 3 घंटे के लिए 200 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर दो नमूने सेते हैं।
    6. इस बीच, 2.3 कदम के रूप में एक ही विन्यास के साथ FACS मशीन तैयार।
    7. 5 मिलीलीटर दौर नीचे क्रमश: 1 मिलीलीटर पीबीएस युक्त, ट्यूबों के लिए नियंत्रण और सब्सट्रेट इलाज कोशिकाओं के 5 μl जोड़ें।
    8. FACS डिवाइस की लोडिंग बंदरगाह पर ट्यूब युक्त नियंत्रण कक्षों की जगह और FACS सॉफ्टवेयर के अधिग्रहण के डैशबोर्ड पर लोड बटन पर क्लिक करें। 3,000 घटनाओं / सेकंड डैशबोर्ड पर फ्लो दर बटन का उपयोग कर - 1,000 को घटना की दर को समायोजित करें।
    9. अधिग्रहण बटन पर क्लिक करें FITC-एक उपाय है।
    10. सब्सट्रेट इलाज नमूना ट्यूब के साथ नियंत्रण नमूना ट्यूब की जगह। 3,000 घटनाओं / सेकंड डैशबोर्ड पर फ्लो दर बटन का उपयोग कर - 1,000 को घटना की दर को समायोजित करें।
    11. अधिग्रहण बटन पर क्लिक करें FITC-एक उपाय है।
    12. कोशिकाओं की संख्या की एक हिस्टोग्राम की साजिश रचने बनाम लॉग पहुंचा FITC-ए द्वारा कोशिकाओं के दो समूहों के प्रतिदीप्ति की तुलना करें।
  2. अन्य assays एंजाइम गतिविधि पुष्टि करने के लिए
    1. चुने गए उम्मीदवारों एंजाइम की आगे की पहचान के लिए, का उपयोग कर मानक निकासी समर्थक fosmid डीएनए निकालनेवाणिज्यिक निकासी किट से cedures और न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम का विश्लेषण, या इन विट्रो एंजाइम गतिविधि 6.7 परीक्षण।

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Representative Results

तीन phenolic substrates प्रस्तावित प्रोटोकॉल का पालन करके Taean, दक्षिण कोरिया में सागर-ज्वार फ्लैट अवसादों का एक metagenome पुस्तकालय से उपन्यास metagenomic एंजाइमों की पहचान के लिए जांच की गई। पुस्तकालय निर्माण के लिए, औसत 30 - 40 Kb metagenome दृश्यों fosmids है, जो ई के आधार पर कर रहे हैं में डाला गया कोलाई एफ कारक replicon और एक सेल में एक भी कॉपी के रूप में प्रस्तुत किया। ध्यान दें कि fosmids व्यापक रूप से उनके स्थिर प्रचार 8 के कारण जटिल जीनोमिक पुस्तकालयों के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया है।

चित्रा 1 (चित्रा 1 ए) R1 और R2 छँटाई फाटकों (चित्रा 1 बी) के साथ सकारात्मक हिट चयन के बाद नकारात्मक छँटाई के साथ झूठी सकारात्मक को हटाने सहित स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल का एक संक्षिप्त फ़्लोचार्ट पता चलता है। फिल्मों के साथ और substrates के बिना नमूनों की प्रतिदीप्ति की तुलना द्वारा मूल्यांकन किया गया(चित्रा 1 सी)। पी -nitrophenyl एसीटेट मध्यस्थता स्क्रीनिंग के मामले में, lipase के पांच उम्मीदवारों की पुष्टि की थी जहां सब्सट्रेट इलाज कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति नियंत्रण कोशिकाओं (चित्रा 2 ए) की तुलना में अधिक थे। चित्रा 2 बी में Cellulase के तीन उम्मीदवारों के व्यापक वितरण के बावजूद, वे भी आबादी की औसत FITC तीव्रता के स्पष्ट अंतर दिखाया। चार फॉस्फेट उम्मीदवारों को भी नियंत्रण कोशिकाओं (चित्रा 2 सी) की तुलना में उच्च स्तर प्रतिदीप्ति दिखाया। नकारात्मक और उम्मीदवार की कोशिकाओं को मजबूत एंजाइम गतिविधि PNP-GESS के प्रतिदीप्ति रिपोर्टर के बाद से deduced किया जा सकता है के बीच अधिक अंतर प्रतिदीप्ति फिनोल सांद्रता से 5 मात्रात्मक प्रतिक्रियाओं से पता चलता है।

इस प्रोटोकॉल में, केवल प्रतिदीप्ति मतभेद एक प्रवाह cytometry का उपयोग कर पुष्टि की थी लेकिन विभिन्न पहचान assays एक आवेदन किया जा सकताचरण में उल्लेख रहा है 4.2। चित्रा 3 एपी पहचान 6 का उदाहरण दर्शाता है। सैंतालीस स्क्रीनिंग से अत्यधिक फ्लोरोसेंट कालोनियों के बीच में एक चयनित क्लोन अनुक्रम किया गया था और उम्मीदवार एपी के एक ओआरएफ पहचान की थी। ओआरएफ एक प्लाज्मिड वेक्टर में डाला प्रवाह cytometry के साथ एपी गतिविधि है की पुष्टि की थी। चित्रा 3 में, हिट कोशिकाओं खाली प्लाज्मिड (नकारात्मक) ले जाने की तुलना में मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत से पता चलता है। अनुक्रम की और इन विट्रो enzymatic गतिविधि में आगे के विश्लेषण से पता चला कि इस एपी अत्यधिक कम तापमान पर उच्च उत्प्रेरक गतिविधि (35 डिग्री सेल्सियस) और एक उल्लेखनीय थर्मल अस्थिरता (65 डिग्री सेल्सियस) 15 मिनट 6 के भीतर छोड़कर अपने एंजाइमी विशेषताओं में अन्य ज्ञात प्राधिकृत व्यक्ति के समान था । इसके अलावा, जांच एपी को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्राधिकृत व्यक्ति तुलनीय linearized प्लास्मिड डीएनए 6 के एकजुट और कुंद छोर से टर्मिनल फॉस्फेट को दूर करने में किया गया था।


चित्रा 1:। मल्टी एनजाइम स्क्रीनिंग प्रक्रिया (ए) सब्सट्रेट बिना प्रतिदीप्ति दिखा झूठी पॉजिटिव कोशिकाओं को हटाने। छँटाई गेट सेल जनसंख्या घनत्व के बीच में स्थित है, ताकि फाटक कुल कोशिकाओं का 10% भी शामिल है। (बी) के उच्च फ्लोरोसेंट छंटनी (FITC-ए) कोशिकाओं (सकारात्मक) एक उपयुक्त सब्सट्रेट की उपस्थिति में R1 और R2 फाटकों संतोषजनक। (डब्ल्यू के रूप में चिह्नित / और डब्ल्यू / हे substrates, क्रमशः) (सी) के चयन और एकल कक्ष अलगाव के बाद, उम्मीदवार एंजाइमों की गतिविधि के साथ और सब्सट्रेट बिना जांच की गई थी। दो नमूनों के बीच अंतर स्पष्ट संकेत निकलता कोशिकाओं के fosmid वेक्टर ब्याज का लक्ष्य आनुवंशिक जानकारी शामिल है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्र 2
चित्रा 2: एंजाइम गतिविधि मूल्यांकन से फ्लो का प्रयोग Metagenomic एंजाइम उम्मीदवारों तीन अलग-अलग substrates (ए) पी -nitrophenyl एसीटेट (pNPA), (बी) के पी -nitrophenyl-β-D-cellobioside (pNPG2), और साथ PNP-GESS द्वारा जांच की। (सी) फिनाइल फॉस्फेट। सभी उम्मीदवारों के साथ और सब्सट्रेट के बिना कोशिकाओं के बीच स्पष्ट संकेत अंतर दिखा। नियंत्रण उनके इसी सब्सट्रेट इलाज के बिना कोशिकाओं रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: alkaline फॉस्फेट मैंdentification। वाम पैनल एंजाइम को मारा और एक खाली प्लाज्मिड वेक्टर (नकारात्मक) युक्त कोशिकाओं के बीच स्पष्ट प्रतिदीप्ति अंतर को दर्शाता है। सही पर, एक वर्णमिति सब्सट्रेट के रूप में 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-indolyl फॉस्फेट युक्त लेग अगर पर एक प्लाज्मिड वेक्टर में फॉस्फेट उम्मीदवार जीन को शरण देने की कोशिकाओं के फॉस्फेट परख दिखाया गया है। ब्लू कालोनियों संकेत मिलता है कि चयनित कक्षों metagenomic जीन एक फॉस्फेट एन्कोडिंग होते हैं। अधिक जानकारी के लिए 6 देखें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चुनाव आयोग संख्या विवरण पी nitrophenol उत्पादन एंजाइमों की संख्या फिनोल उत्पादन एंजाइमों की संख्या
चुनाव आयोग 1 </ Td> 1.3 दाताओं की CH-सीएच समूह पर अभिनय - 1
Oxidoreductases 1.11 Peroxygenase 2 -
1.14 समावेश के साथ, बनती दाताओं पर अभिनय या - 2
आणविक ऑक्सीजन की कमी
चुनाव आयोग 2 2.3 Acyltransferases 1 -
transferases 2.4 Glycosyltransferases 8 -
2.5 स्थानांतरण करने एल्काइल या aryl समूहों, मिथाइल समूहों के अलावा अन्य 1 1
2.7 स्थानांतरण करने फास्फोरस युक्त समूहों 1 1
2.8 स्थानांतरण करने सल्फर युक्त समूहों 3 1
चुनाव आयोग 3 3.1 एस्टर बांड पर अधिनियम 67 16
हाइड्रोलिसिस 3.2 Glycosylases 75 21
3.4 पेप्टाइड बांडों पर अधिनियम - पेप्टिडेज़ 26 4
3.5 कार्बन-नाइट्रोजन बांड, पेप्टाइड बांड के अलावा अन्य पर अधिनियम 5 3
3.6 एसिड एनहाइड्रों पर अधिनियम 4 -
3.7 कार्बन-कार्बन बांड पर अधिनियम 2 -
चुनाव आयोग 4 4.1 कार्बन-कार्बन लाइसेस - 3
लाइसेस 4.2 कार्बन ऑक्सीजन लाइसेस 1 -
4.3 कार्बन-नाइट्रोजन लाइसेस 1 -
एंजाइमों का आधा नंबर 197 53
एंजाइमों की कुल संख्या (छा एंजाइमों को छोड़कर) 211

तालिका 1: एंजाइमों कि BRENDA डाटाबेस से पी -nitrophenol या फिनोल उपज की संख्या।

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Discussion

Biocatalysts की उत्पादन क्षमता बढ़ाने आधारित उद्योग 9 और metagenome जैव रसायन की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण सबसे अच्छा प्राकृतिक एंजाइम स्रोत से एक माना जाता है। इस अर्थ में, यह metagenome जहां आनुवंशिक संसाधनों के बहुमत 10 का पता लगाया नहीं किया गया है से उपन्यास एंजाइमों स्क्रीनिंग के लिए आवश्यक है। कई स्क्रीनिंग तरीकों विकसित किया गया है जो सीधे ट्रांसक्रिप्शनल activators 11, 12 का उपयोग कर एंजाइम उत्पादों का पता लगा लेकिन इन तकनीकों विशिष्ट मेटाबोलाइट उत्तरदायी ट्रांसक्रिप्शनल प्रणाली की आवश्यकता है। दूसरी ओर, GESS फिनोल या PNP टैग की substrates के उपयोग के आधार पर मोटे तौर पर लागू है। हालांकि सूचना BRENDA डेटाबेस में फिनोल या PNP यौगिकों के उत्पादन (तालिका 1), (इस काम में तीन उदाहरण सहित) एंजाइमों के सबसे hydrolase के हैं (ईसी संख्या 3) वर्ग एंजाइमों, और अधिक विविध phenolic substrates की खोज और यहां तक कि एक कृत्रिम डिजाइनिंग सब्सट्रेट करने के लिए subjectingएंजाइम गतिविधि लक्षित करते हैं, के रूप में प्राकृतिक substrates के विकल्प, काफी स्क्रीनिंग प्रणाली के लागू विस्तार कर सके। ध्यान दें कि एक उचित फिनोल चुनने या PNP टैग की सब्सट्रेट झिल्ली पारगम्यता और सब्सट्रेट काफी स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल को प्रभावित के सेलुलर प्रभाव के बाद से PNP-GESS आवेदन के महत्वपूर्ण कदमों में से एक है। यहाँ, हम बताते हैं कि औद्योगिक रूप से महत्वपूर्ण तीन एंजाइमों के विभिन्न प्रकार एकल स्क्रीनिंग प्रणाली का उपयोग करते हुए एक उच्च throughput ढंग से पहचाना जा सकता है।

FACS का उपयोग करने का दृष्टिकोण, metagenomic एंजाइमों के उच्च throughput स्क्रीनिंग के अलावा, यह भी बदल टी.आर. विशिष्टता के लिए transcriptional नियामकों (टीआरएस) इंजीनियरिंग के लिए लागू किया जा सकता है। एक उदाहरण के एक अध्ययन है जिसमें एक Arac संस्करण है कि arabinose के बजाय mevalonate का पता चला FACS का उपयोग कर अलग किया गया था, और फिर स्क्रीन mevalonate 13 उत्पादक कोशिकाओं के लिए कार्यरत है। इसके अलावा, टीआरएस की विशिष्टता के परिवर्तन Furth के लिए अनुमति दी गई हैएंजाइम गतिविधि के ईआर इंजीनियरिंग। ऑटो विनियमित टी.आर., PcaU, 3,4-dihydroxybenzoate (34DHB) का पता लगाने के लिए इंजीनियर और फिर 34DHB से 14 अंतर्जात dehydroshikimate परिवर्तित करने की अपनी अधिकतम गतिविधि पर dehydroshikimate dehydratase एंजाइमों (AsbF) के लिए स्क्रीन करने के लिए लागू किया गया था। के बाद से PNP-GESS PNP पता लगाने के लिए एक DmpR संस्करण का उपयोग करता है और एक बड़े पैमाने पर आनुवंशिक पुस्तकालय से स्क्रीनिंग में उच्च throughput प्रदर्शन से पता चलता इन अध्ययनों की मूल अवधारणा, PNP-GESS के समान है। हालांकि, विशिष्टता इंजीनियरिंग, हिट के बीच अनायास ही झूठी सकारात्मक कारण हो सकता है के रूप में यह चौड़ी विशिष्टता का एक परिणाम के रूप में अन्य inducers द्वारा संवाददाता अभिव्यक्ति को गति प्रदान करने के लिए संभव है। इसलिए, यह पहले टी.आर. लागू किया जाता है टी.आर. प्रतिक्रिया के orthogonality जांच करने के लिए वांछनीय होगा। दूसरी ओर, संवेदनशीलता और टी.आर. के गतिशील रेंज बढ़ाने झूठी सकारात्मक पीढ़ी के लिए क्षतिपूर्ति कर सकता है। उदाहरण के लिए, GESS की संवेदनशीलता को अनुकूलित आरबीएस और टर्मिनेटर sequ डालने से सुधार किया गया थाप्रणाली में ences। स्क्रीनिंग प्रणाली की झूठी सकारात्मक संभवतः आनुवंशिक सर्किट की खराबी से आते हैं, अनायास ही phenolic रसायन टी.आर., विषम सेल के विकास, और फिनोल या PNP के मुक्त प्रसार को सक्रिय। कदम 2.1 के नकारात्मक चयन प्रक्रिया - 2.9 सब्सट्रेट इलाज के बिना प्रतिदीप्ति रिहा झूठी सकारात्मक कोशिकाओं को दूर करने की उम्मीद कर रहे थे। ये झूठी सकारात्मक कोशिकाओं को भी आनुवंशिक सर्किट के शोर अनुपात करने के लिए संकेत अधिकतम द्वारा कम किया जा सकता है। आरबीएस और टर्मिनेटर इंजीनियरिंग, M9 ग्लूकोज मीडिया के उपयोग के साथ साथ काफी सुधार हुआ है संकेत 5 pnp-GESS प्रदर्शन में (लेग मीडिया की तुलना में अधिक 7 गुना)। लेकिन, इस प्रोटोकॉल में, पौंड अज्ञात metagenomic जीन अभिव्यक्ति और GESS संकेत तीव्रता के बीच एक समझौते के रूप में इस्तेमाल किया गया था। PNP-GESS सेल के विकास और M9 ग्लूकोज में सब्सट्रेट प्रभाव अधिक नाजुक स्थितियों की जांच संकेत तीव्रता में सुधार करने के लिए सक्षम बनाता है। substrates की प्रतिक्रिया समय की तंग विनियमन, 3.5 चरण में है,यह भी फिनोल या PNP प्रसार से शुरू हो रहा झूठी सकारात्मक को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है।

GESS एक एकल कोशिका के स्तर पर प्रतिलेखन की मध्यस्थता संवाददाता प्रोटीन अभिव्यक्ति में एंजाइम समारोह के रूपांतरण के लिए सक्षम बनाता है, लेकिन रिपोर्टर प्रोटीन के माध्यम से अप्रत्यक्ष पहचान सहज सीमाओं में से एक हो सकता है। तो, इन विट्रो एंजाइम परख और एक उत्पाद की नियंत्रण रेखा / जीसी एमएस विश्लेषण एक ख्यात एंजाइम उम्मीदवार 6.7 की निश्चित पहचान के लिए पीछा किया जा करने की जरूरत है। इसके अलावा यह इस तरह की एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन या फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ chromogenic एंजाइमों के रूप में वैकल्पिक संवाददाताओं से संलग्न करके महंगा FACS विश्लेषण के लिए आवश्यकता के बिना GESS उपयोग करना संभव है। GESS अनुप्रयोगों के आगे सुधार के लिए, यह एंजाइम गतिविधि विशेषताएँ और एक उच्च throughput ढंग से एंजाइमों की पहचान करने के लिए एक विधि की स्थापना के लिए आवश्यक है। इस तरह के अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के रूप में अन्य उच्च throughput प्रौद्योगिकी, के साथ साथ, GESS प्रोटीन और enzy के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया रणनीति होगीजीव विज्ञान आधारित उद्योग में मेरे उत्प्रेरक इंजीनियरिंग।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
CopyControl Epicentre CCFOS110 Fosmid library production kit 
CopyControl Induction Solution Epicentre CCIS125 Fosmid copy induction solution
EPI300 Epicentre EC300110 Electrocompetent cell
pCC1FOS Epicentre CCFOS110 Fosmid vector
Gene Pulser Mxcell Bio-Rad Electroporation cuvette and electroporate system
FACSAria III Becton Dickinson Flow Cytometry (FACS machine)
AZ100M Nikon Microscope 
UltraSlim  Maestrogen LED illuminator
50-ml conical tube BD Falcon
14-ml round-bottom tube  BD Falcon
5-ml round-bottom tube BD Falcon
p-nitrophenyl phosphate Sigma-Aldrich N7653 Substrate
p-nitrophenyl β-D-cellobioside Sigma-Aldrich N5759 Substrate
p-nitrophenyl butylate Sigma-Aldrich N9876  Substrate
Luria-Bertani (LB) BD Difco 244620 Tryptone 10 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 10 g/L
Super Optimal broth (SOB) BD Difco 244310 Tryptone 20 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 0.5 g/L, Magnesium Sulfate 2.4 g/L, Potassium Chloride 186 mg/L
Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) SOB, 0.4 % glucose
2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) BD Difco 244020 Pancreatic digest of Casein 16 g/L, Yeast extract 10 g/L, Yeast extract 5 g/L
Cell storage media 2x YT broth, 15% Glycerol, 2% Glucose
pGESS(E135K) A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator.
See the reference 5 in the manuscript for more details.
Chloramphenicol Sigma C0378
Ampicillin Sigma A9518
BD FACSDiva Becton Dickinson Flow Cytometry Software Version 7.0
PBS Gibco 70011-044 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 114 जेनेटिक सर्किट उच्च throughput स्क्रीनिंग एंजाइम स्क्रीनिंग metagenome phenolic यौगिक dmpR
मल्टी एंजाइम एक उच्च throughput जेनेटिक एनजाइम स्क्रीनिंग प्रणाली का प्रयोग स्क्रीनिंग
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Kim, H., Kwon, K. K., Seong, W.,… More

Kim, H., Kwon, K. K., Seong, W., Lee, S. G. Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System. J. Vis. Exp. (114), e54059, doi:10.3791/54059 (2016).

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