Introduction
Un haut-débit technique de dosage unique cellule récemment développée permet de nouvelles enzymes destinées à être projetées à partir d' une bibliothèque génétique à grande échelle sur la base de leurs activités fonctionnelles 1. Au niveau d'une seule cellule, les protéines régulatrices de la transcription sont utilisées pour déclencher l'expression du gène rapporteur par la détection de petites molécules qui sont produites par suite d'une activité de l'enzyme cible. Une première approche implique l'isolement d'un opéron phénol dégradant de Ralstonia eutropha E2 en utilisant l'expression génique induite par le substrat procédé de criblage (SIGEX), dans lequel le substrat induit l'expression d'une protéine rapporteur 2. Nhar de Pseudomonas putida a été utilisé pour sélectionner benzaldéhyde déshydrogénase 3 et lysG de Corynebacterium glutamicum a été utilisée pour le criblage à haut débit d'une nouvelle souche L-lysine-production de diverses bibliothèques de mutants 4.
Auparavant, une enzyme génétique screenisystème ng (GESS) a été proposé comme une plate - forme de criblage généralement applicable 5. Ce système utilise le régulateur de diméthylphénol phénol-reconnaissant, DmpR, de P. putida. DmpR (E135K), et un mutant de DmpR, peuvent également être utilisés dans GESS (PnP-GESS) pour la détection de p - nitrophénol (PnP). En présence d'enzymes cibles produisant des composés phénoliques, dans SSES E. cellules de E. coli , émet un signal de fluorescence, ce qui permet l'isolement rapide des cellules individuelles en utilisant un trieur de cellules activées par fluorescence (FACS). Mais l'expression de l'enzyme metagénomique semble être plus faible que celle des enzymes recombinantes classiques; Par conséquent, SSES a été conçu pour détecter des composés phénoliques avec un maximum de sensibilité en recherchant la combinaison d' un site de liaison au ribosome (RBS) et les séquences de terminaison ainsi que des conditions de fonctionnement optimales 5.
L'un des avantages fondamentaux de GESS est que cette méthode unique permet théoriquement la projection de over de 200 types différents d'enzymes dans la base de données BRENDA (tableau 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) en utilisant simplement différents substrats. Il a été montré que la cellulase, la lipase, et parathion-méthyl - hydrolase (MSP) peut être détectée à l' aide pnp SSES avec des substrats appropriés de p - nitrophényl butyrate de p - nitrophényle-cellotrioside et le parathion de méthyle, respectivement 5. Récemment, il a été prouvé qu'une phosphatase alcaline (AP), qui est l' une des nouvelles enzymes identifiées à l' aide pnp SSES, est le premier point d' accès trouvée dans thermolabile métagénomes marines adaptées au froid 6.
Ici, les détails du processus de sélection est présenté avec pNP-GESS détecter les activités de trois types de lipase enzymes-, cellulase, et la phosphatase alcaline différentes -et rapidement identifier de nouvelles enzymes candidats à partir d' une bibliothèque métagénomique 5,6. Les procédés comprennent métagénome prétraiter avec pNP-GESS et l'exploitation d'un flow cytométrie trieuse. Bien que les résultats obtenus devront être séquencés pour une identification plus poussée, ce protocole couvre la procédure jusqu'à les étapes de confirmation de l'activité enzymatique par cytométrie en flux.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Préparation de la bibliothèque métagénomique avec pNP-GESS
- Construire une bibliothèque métagénomique dans E. coli avec un vecteur fosmide en utilisant un kit de production de bibliothèques fosmide selon le protocole du fabricant 5.
- Aliquote de 100 ul de la bibliothèque pour le stockage à -70 ° C, ce qui est une source de cellules de la bibliothèque metagénomiques.
Note: La densité optique d'un échantillon mesuré à une longueur d'onde de 600 nm (DO 600) de cette bibliothèque disponible est d' environ 100. - Décongeler 100 pl du stock bibliothèque métagénomique sur la glace et inoculer dans un flacon de 500 ml contenant 50 ml de Luria-Bertani (LB) et 12,5 pg / ml de chloramphenicol suivi par 37 ° C pendant 2 heures d'incubation.
- Récolter les cellules dans un 50 ml tube conique par centrifugation à 1000 xg pendant 20 min à 4 ° C.
- Reprendre le culot rapidement dans 50 ml d'eau glacée distillée (DW) et centrifuger à 1000 xg pendant 20 min à 4 ° C à nouveau.
- Resuspend le culot dans 50 ul DW glacé avec 10% (v / v) de glycérol. Utilisez 50 pi de cette aliquote de cellules pour l'électroporation.
- Placer le mélange de cellules électrocompétentes 50 pi et PGES (E135K) 5 ADN (100 ng) dans une cuvette d' électroporation et l' électroporation (1,8 kV / cm, 25 pF) , le mélange refroidi à la glace.
- Rapidement ajouter 1 ml super bouillon optimal avec la répression catabolique (SOC) moyenne et resuspendre doucement les cellules.
- Transférer les cellules dans un tube de 14 ml à fond rond à l'aide d'une pipette et laisser incuber à 37 ° C pendant 1 heure.
- Étaler 500 pi des cellules récupérées sur un 20 x 20 cm plaque carrée LB contenant 12,5 pg / ml de chloramphenicol et 50 pg / ml d'ampicilline. Incuber la plaque à 30 ° C pendant 12 heures.
- Grattez les colonies en utilisant un grattoir à cellules et recueillir des cellules dans un tube conique de 50 ml en utilisant des supports de stockage de cellules glacée.
- Centrifuger à 1000 xg pendant 20 min à 4 ° C. Remettre en suspension le culot dans 10 ml de milieu de stockage de cellules glacéespour atteindre une DO 600 de 100.
- Aliquoter 20 pi des cellules pour le stockage à -70 ° C.
2. Retrait de faux positifs de la Bibliothèque métagénomique
- Décongeler les actions des cellules de bibliothèque métagénomique (de l'étape 1.13) contenant fosmide d'ADN métagénomique et PGES (E135K) sur la glace.
- Inoculer 10 ul de cellules dans 2 ml de LB contenant 50 pg / ml d'ampicilline et 12,5 pg / ml de chloramphenicol dans un tube à fond rond de 14 ml. Incuber à 37 ° C sous agitation à 200 tpm pendant 4 heures.
- Pendant ce temps, mettez la machine FACS et ouvrez le logiciel FACS par défaut. Utilisez les paramètres suivants: diamètre de la pointe de buse, 70 pm; Forward Scatter Area (FSC-A) sensibilité, 300 amplification V-logarithmique; Side Scatter Area (SSC-A) sensibilité, 350 amplification V-logarithmique; Isothiocyanate de fluorescéine Area (FITC-A) sensibilité, 450 amplification V-logarithmique; paramètre de seuil, FSC Une valeur 5.
Remarque: Les paramètres typiques sont donnéspour le dispositif FACS mentionné dans le tableau des matériaux. Réglez les paramètres pour d'autres appareils de FACS. - Diluer les cellules de la bibliothèque de l'étape metagénomiques 2,2 en ajoutant 5 ul de l'échantillon dans un tube à fond rond de 5 ml contenant 1 ml de PBS.
- Placer l'échantillon de la bibliothèque diluée sur le port de chargement de l'instrument FACS et cliquez sur le bouton de charge sur le tableau de bord d'acquisition du logiciel FACS.
- Réglez le taux 1000 d'événement - 1500 événements / s en cliquant et en contrôlant les boutons sur le débit sur le tableau de bord.
- Créer journal escaladèrent FSC-A vs log échelle SSC-Un nuage de points sur une feuille de calcul globale en cliquant sur le bouton Plot Dot dans la barre d'outils. Ajustez la porte de dispersion R1 pour englober les événements singulets (population bactérienne) en utilisant le bouton Polygon Gate dans la barre d'outils.
- Tracer un histogramme avec le nombre de cellules en fonction de log échelle FITC-A sur la feuille de calcul en cliquant sur le bouton Histogramme. Ensuite, régler la tension de la FITC Cytomeonglet Paramètres ter sur la fenêtre de contrôle inspecteur de telle sorte que le pic de la distribution en forme de cloche est inférieure à 10 2 de FITC-A.
- Créer un journal à l' échelle FSC-A vs. le journal FITC Une parcelle en cliquant sur le bouton Plot Dot sur la feuille de calcul global. Définir un tri porte R2 sur le terrain en utilisant le bouton Polygon porte sur la barre d'outil de sorte que la porte est située entre + 5% et -5% de cellules du centre de la distribution (total des cellules de 10% autour du sommet de la cloche courbe en forme).
- Placer un tube contenant 1,2 ml de LB contenant 50 pg / ml d' ampicilline et 12,5 pg / ml de chloramphenicol à la sortie de l'instrument FACS et de trier les cellules 10 6 satisfaisant à la fois R1 et R2 portes.
- Retirer le tube de collecte, casquette, et doucement vortex.
3. métagénomique Enzyme Screening
- Incuber les cellules triées (étape 2.11) à 37 ° C sous agitation à 200 tours par minute jusqu'à ce que la DO600 atteigne 0,5.
- Ajouter 1 pl copie solution d'induction pour amplifier le nombre de copies fosmide intracellulaire. Incuber les cellules pendant une 3 heures supplémentaires à 37 ° C sous agitation à 250 tours par minute.
- Pour préparer des cellules pour le tri, on ajoute 0,5 ml des cellules cultivées et un substrat approprié (p d'acétate de nitrophényle, p - nitrophényle-β-D-cellobioside ou le phosphate de phényle) dans un tube de 14 ml à fond rond à une concentration finale de 100 pm.
- Pour un échantillon de contrôle, ajouter 0,5 ml de cellules cultivées à l'étape 3.2 dans un tube à fond rond de 14 ml. Ajouter le même volume de PBS au volume de substrat à l'étape 3.3.
- Incuber les deux échantillons à 37 ° C sous agitation à 200 tpm pendant 3 h.
- Pendant ce temps, préparer la machine FACS avec les mêmes configurations que l'étape 2.3.
- Ajouter 5 ul de cellules (de tri) et des cellules de contrôle à deux tubes de 5 ml à fond rond contenant 1 ml de PBS, respectivement.
- Placer le tube contenant des cellules de commande sur til port de chargement des FACS et cliquez sur le bouton Charger sur Dashboard Acquisition du logiciel FACS. Réglez l'événement Taux 1000 - 3000 événements / s en contrôlant le débit de boutons sur le tableau de bord.
- Créer journal échelle FSC-A vs log échelle SSC-Un nuage de points en cliquant sur le bouton Plot Dot sur la feuille de calcul globale du logiciel et d' ajuster la grille de diffusion R1 pour englober les événements singulets (population bactérienne) en utilisant le bouton Polygon porte sur la barre d'outils.
- Créer journal échelle FSC-A vs log échelle FITC Un nuage de points en cliquant sur le bouton Plot Point sur la feuille de calcul et définir un tri porte R2 sur le terrain en utilisant le bouton Polygon porte sur la barre d'outils de sorte que moins de 0,1% de cellules négatives sont détectées dans la porte R2.
- Remplacer le tube d'échantillon de contrôle avec le tube de tri des échantillons, et d'ajuster le taux d'événements pour 1000 - 3000 événements / s en contrôlant les boutons sur le débit sur le tableau de bord.
- Placer un tube contenant 0,5ml LB à la sortie de l'instrument FACS et sort sur 10 4 cellules répondant à la fois aux portes R1 et R2.
Remarque: le critère de tri peut varier de 0,1% supérieure à 5% de FITC-A dans la grille R2. Dans ce protocole, les meilleures cellules 1% ont été collectées comme positifs. - Retirer le tube de collecte, casquette, et doucement vortex.
- Répartir les 0,5 ml d'échantillons prélevés sur deux plaques de gélose (90 mm) des boîtes de Petri contenant du milieu LB, 50 pg / ml d'ampicilline, 12,5 pg / ml de chloramphenicol et on incube la plaque à 37 ° C pendant une nuit.
- Si nécessaire, effectuer des tours supplémentaires de tri pour FITC-A enrichissement en répétant les étapes 3.1-3.14.
4. Hit Sélection et l'activité enzymatique Confirmation
- Analyse par cytométrie de flux
- De la plaque a été incubée à l'étape 3.14, sélectionnez une colonie montrant aucune fluorescence à l'aide d'un sélecteur de colonie sous l'observation de 488 nm de longueur d'onde d'un illuminateur LED.
- Inoculer la colonie sélectionnée dans un 14 ml round fond tube contenant 2 ml de LB contenant 50 pg / ml d' ampicilline et 12,5 pg / ml de chloramphenicol à 37 ° C sous agitation à 200 tours par minute jusqu'à ce que la DO600 atteigne 0,5.
- Ajouter 2 ul copier solution d'induction pour amplifier le nombre de copies fosmide intracellulaire. Incuber les cellules pendant une 3 heures supplémentaires à 37 ° C sous agitation à 250 tours par minute.
- Préparer un tube à fond rond de 14 ml et ajouter 1 ml des cellules cultivées (étape 4.1.3). Ajouter un substrat approprié (acétate de p - nitrophényle, p -nitrophenyl- β - D-cellobioside ou le phosphate de phényle) à une concentration finale de 100 uM.
- Pour un contrôle, ajouter les 1 ml de cellules cultivées à l'étape 4.1.3 dans un 14 ml de tube à fond rond et ajouter le même volume de PBS que le volume de substrat à l'étape 4.1.4.
- Incuber les deux échantillons à 37 ° C sous agitation à 200 tpm pendant 3 h.
- Pendant ce temps, préparer la machine FACS avec les mêmes configurations que l'étape 2.3.
- Ajouter 5 ul de cellules témoins et de substrat traité pour tubes de 5 ml à fond rond contenant 1 ml de PBS, respectivement.
- Placez les cellules de contrôle du tube contenant sur le port de chargement de l'appareil FACS et cliquez sur le bouton Charger sur Dashboard Acquisition du logiciel FACS. Réglez le taux 1000 d'événement - 3000 événements / s à l'aide des boutons sur le débit sur le tableau de bord.
- Cliquez sur le bouton Acquisition pour mesurer FITC-A.
- Remplacer le tube d'échantillon de contrôle avec le tube d'échantillon de substrat traité. Réglez le taux 1000 d'événement - 3000 événements / s à l'aide des boutons sur le débit sur le tableau de bord.
- Cliquez sur le bouton Acquisition pour mesurer FITC-A.
- Comparer la fluorescence des deux groupes de cellules en traçant un histogramme du nombre de cellules par rapport à l'échelle log-A FITC.
- D'autres essais pour confirmer l'activité enzymatique
- Pour plus d'identification des candidats d'enzymes sélectionnées, extraire l'ADN fosmide utilisant pro extraction normecédures des kits commerciaux d'extraction et d' analyser la séquence nucléotidique, ou tester l'activité enzymatique in vitro 6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les trois substrats phénoliques ont été examinés afin d'identifier de nouvelles enzymes métagénomiques d'une bibliothèque de métagénome des sédiments océaniques plates-marée dans Taean, la Corée du Sud en suivant le protocole proposé. Pour la construction de la bibliothèque, en moyenne 30 - séquences de métagénome 40 kb ont été insérés dans fosmides, qui sont basés sur le E. coli F facteur réplicon et présenté comme un seul exemplaire dans une cellule. A noter que fosmides ont été largement utilisés pour la construction de banques génomiques complexes en raison de leur propagation stable 8.
La figure 1 montre un bref organigramme du protocole de dépistage , y compris l'élimination des faux positifs avec tri négatif (Figure 1 A) suivie d' une sélection de résultat positif avec R1 et R2 de tri portes (figure 1 B). Les résultats ont été évalués en comparant la fluorescence des échantillons avec et sans supports(Figure 1 C). Dans le cas de l' acétate de p - nitrophényle de criblage à médiation par cinq candidats de la lipase ont été confirmées où la fluorescence des cellules du substrat traité était supérieure à celle des cellules témoins (Figure 2 A). Malgré les larges distributions des trois candidats de la cellulase sur la figure 2 B, ils ont également montré des différences nettes d'intensité FITC moyenne des populations. Quatre candidats phosphatases ont également montré le niveau de fluorescence élevé par rapport aux cellules témoins (figure 2 C). La différence plus de fluorescence entre les cellules négatives et le candidat de l'activité enzymatique plus forte peut être déduite depuis le rapporteur de fluorescence de pNP-GESS montre des réponses quantitatives aux concentrations de phénol 5.
Dans ce protocole, seules les différences de fluorescence ont été confirmées en utilisant une cytométrie en flux, mais divers essais d'identification peuvent être appliqués unes mentionné à l' étape 4.2. La figure 3 montre l'exemple de l' identification AP 6. Un clone sélectionné parmi les quarante-sept colonies hautement fluorescentes de la projection a été séquencé et un ORF du candidat AP a été identifié. L'ORF inséré dans un vecteur de plasmide a été confirmé comme ayant une activité AP par cytométrie en flux. Sur la figure 3, le tube présente signal de fluorescence plus fort que les cellules portant le plasmide vide (négatif). Une analyse supplémentaire de la séquence et l'activité enzymatique in vitro a découvert que ce point d' accès est très similaire à d' autres points d' accès connus dans ses caractéristiques enzymatiques à l' exception de forte activité catalytique à des températures inférieures (35 ° C) et une instabilité thermique remarquable (65 ° C) en 15 min 6 . En outre, le point d' accès filtré était comparable à celle des points d' accès disponibles dans le commerce pour éliminer les phosphates terminaux à partir des extrémités cohésives et franches de l' ADN du plasmide linéarisé 6.
Figure 1:. Processus de sélection Multi Enzymes (A) Suppression des cellules faussement positives montrant la fluorescence sans substrat. La grille de tri est situé au milieu de la densité de la population de cellules de telle sorte que la grille comporte 10% des cellules totales. (B) Tri haute fluorescent (FITC-A) cellules (positives) satisfaisant R1 et R2 portes en présence d'un substrat approprié. (C) Après la sélection et l' isolement d' une cellule unique, l'activité des enzymes candidates a été étudiée avec et sans le substrat (notée W / substrats et E / H, respectivement). La différence de signal clair entre les deux échantillons implique le vecteur fosmide des cellules contient l' information génétique cible d'intérêt. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Enzyme Activité d' évaluation utilisant la cytométrie de flux candidats enzymatiques métagénomique dépistées par pNP-GESS avec trois substrats différents (A) de l' acétate p - nitrophényle (PNPA), (B) p nitrophényle-β-D-cellobioside (pNPG2), et. (C) , le phosphate de phényle. Tous les candidats montrent la différence de signal clair entre les cellules avec et sans substrat. Les contrôles sont les cellules sans leur traitement de substrat correspondant. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: phosphatase alcaline Identification. panneau gauche montre la différence de fluorescence claire entre les cellules contenant l'enzyme frapper et un plasmide vecteur vide (négatif). Sur la droite, le dosage de la phosphatase cellules hébergeant le gène candidat de la phosphatase dans un vecteur plasmidique sur de la gélose LB contenant du phosphate de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl comme substrat colorimétrique est représenté. Les colonies bleues indiquent que les cellules sélectionnées contiennent le gène codant pour une phosphatase metagénomique. Voir 6 pour plus de détails. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Numéro CE | La description | Nombre de produire p-nitrophénol enzymes | Nombre de phénol produisant des enzymes | |
| CE 1 </ Td> | 1.3 | Agissant sur le groupe de donneurs CH-CH | - | 1 |
| Oxidoreductases | 1.11 | Peroxygenase | 2 | - |
| 1.14 | Agissant sur les donneurs appariés, avec constitution ou | - | 2 | |
| réduction de l'oxygène moléculaire | ||||
| CE 2 | 2.3 | acyltransférases | 1 | - |
| Transférases | 2.4 | glycosyltransférases | 8 | - |
| 2.5 | Transférant des groupes alkyle ou aryle, autres que des groupes méthyle | 1 | 1 | |
| 2.7 | Transférant des groupes contenant du phosphore, | 1 | 1 | |
| 2.8 | Transférant des groupes contenant du soufre, | 3 | 1 | |
| CE 3 | 3.1 | Loi sur les liaisons ester | 67 | 16 |
| Hydrolases | 3.2 | glycosylases | 75 | 21 |
| 3.4 | Loi sur les liaisons peptidiques - peptidase | 26 | 4 | |
| 3.5 | Loi sur les liaisons carbone-azote autres que les liaisons peptidiques | 5 | 3 | |
| 3.6 | Loi sur les anhydrides d'acide | 4 | - | |
| 3.7 | Loi sur les liaisons carbone-carbone | 2 | - | |
| CE 4 | 4.1 | lyases carbone-carbone | - | 3 |
| lyases | 4.2 | lyases carbone-oxygène | 1 | - |
| 4.3 | lyases carbone-azote | 1 | - | |
| Numéro Sous-total des enzymes | 197 | 53 | ||
| Nombre total d'enzymes (à l'exclusion des enzymes superposées) | 211 | |||
Tableau 1: Nombre de enzymes qui produisent p nitrophénol ou Phénol de la base de données BRENDA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Accroître l' efficacité de biocatalyseurs de production est une clé pour le succès de la bio-chimique à base industrie 9 et métagénome est considéré comme l' un des meilleurs source d'enzyme naturelle. En ce sens, il est essentiel de criblage de nouvelles enzymes du métagénome où la majorité des ressources génétiques n'a pas été explorée 10. Plusieurs méthodes de criblage ont été développés , qui détectent directement des produits enzymatiques utilisant des activateurs de transcription 11, 12 mais ces techniques nécessitent système spécifique de transcription réagissant à un métabolite. D'autre part, SSES est largement applicable en fonction de l'utilisation du phénol ou pNP marqués substrats. Bien que la plupart des enzymes signalées produisant phénol ou PnP composés dans la base de données BRENDA (tableau 1), (y compris les trois exemples dans ce travail) appartiennent à la hydrolase (numéro 3 CE) enzymes de classe, explorant des substrats phénoliques plus divers et même la conception d' une artificielle soumettre le substrat àcibler l'activité enzymatique, comme des alternatives de substrats naturels, pourraient prolonger de manière significative l'applicabilité du système de dépistage. Notez que le choix d'un phénol approprié ou pNP marqué substrat est l'une des étapes cruciales de l'application pNP-GESS depuis la perméabilité de la membrane et l'effet cellulaire du substrat influencer considérablement le protocole de dépistage. Ici, nous montrons que l'importance industrielle de trois types d'enzymes peuvent être identifiés d'une manière à haut débit en utilisant le système de contrôle unique.
L'approche de l'utilisation de FACS, en plus du criblage à haut débit d'enzymes métagénomique, peut également être appliquée à l'ingénierie régulateurs de transcription (TRS) pour altéré la spécificité de TR. Un exemple est une étude dans laquelle une variante de l' AraC qui a détecté mévalonate au lieu de l' arabinose a été isolé à l' aide de FACS, puis utilisé pour des cellules produisant de l' écran 13 mévalonate. En outre, l'altération de la spécificité de TRs a permis Furthingénierie er de l'activité enzymatique. Autorégulée TR, PCAU, a été conçu pour détecter le 3,4-dihydroxybenzoate (34DHB), puis appliquée à cribler pour des enzymes déshydratase déhydroshikimate (ASBF) à leur activité maximale de la conversion déhydroshikimate endogène 34DHB 14. Le concept de base de ces études est similaire à celle de pNP-GESS, depuis pNP-GESS utilise une variante DmpR pour détecter pNP et montre des performances à haut débit dans le criblage d'une bibliothèque génétique à grande échelle. Cependant, l'ingénierie de la spécificité peut provoquer des faux positifs involontaires parmi les hits, comme il est possible de déclencher l'expression du journaliste par d'autres inducteurs en raison de la spécificité élargie. Par conséquent, il serait souhaitable d'étudier l'orthogonalité de la réponse TR avant que le TR est appliqué. D'autre part, l'augmentation de la sensibilité et la plage dynamique de la TR pourrait compenser pour la génération de faux positifs. Par exemple, la sensibilité du SSES a été améliorée par l'insertion de RBS optimisés et terminateur Sequrences dans le système. Les faux positifs du système de criblage peut venir d'un mauvais fonctionnement du circuit génétique, les produits chimiques non souhaitées phénoliques activant le TR, la croissance cellulaire hétérogène et la diffusion libre de phénol ou de PnP. étaient attendus 2.9 pour éliminer les cellules faussement positives libérant la fluorescence sans traitement de substrat - Les processus de sélection négative des étapes 2.1. Ces cellules faussement positifs peuvent aussi être réduits en maximisant le rapport signal sur bruit du circuit génétique. Avec le RBS et l' ingénierie de terminaison, l'utilisation des médias M9-glucose amélioré de façon significative le signal (7 fois plus élevé que les médias LB) dans la performance pNP-GESS 5. Mais, dans ce protocole, LB a été utilisé comme un compromis entre l'expression du gène métagénomique inconnu et GESS intensité du signal. Étude des conditions plus délicates de la croissance des cellules pNP-GESS et l'effet de substrat dans M9-glucose permet d'améliorer l'intensité du signal. une régulation stricte du temps de réaction des substrats, à l'étape 3.5, estégalement important d'éviter les faux positifs provoqués par le phénol ou la diffusion PnP.
GESS permet la conversion de la fonction enzymatique en protéine rapporteur expression médiée par la transcription à un seul niveau cellulaire, mais l'identification indirecte via protéine rapporteur pourrait être l'une des limitations innées. Donc, test in vitro de l' enzyme et LC / GC-MS analyse d'un produit doivent être suivies pour l' identification précise d'un candidat de l' enzyme putative 6,7. En outre, il est possible d'utiliser GESS sans la nécessité d'une analyse de FACS coûteux en attachant des journalistes alternatifs tels que les gènes de résistance aux antibiotiques ou des enzymes chromogènes avec les journalistes fluorescents. Pour améliorer encore les applications GESS, il est nécessaire d'établir une méthode pour caractériser l'activité enzymatique et identifier les enzymes de manière à haut débit. Avec d'autres technologies à haut débit, tels que le séquençage de prochaine génération, GESS sera une stratégie largement utilisée pour les protéines et enzyMe ingénierie de catalyseur dans l'industrie en fonction de la biologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
| CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
| EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
| pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
| Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
| FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
| AZ100M | Nikon | Microscope | |
| UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
| 50-ml conical tube | BD Falcon | ||
| 14-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| 5-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
| p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
| p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
| Luria-Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 10 g/L |
| Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 0.5 g/L, Magnesium Sulfate 2.4 g/L, Potassium Chloride 186 mg/L |
| Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16 g/L, Yeast extract 10 g/L, Yeast extract 5 g/L |
| Cell storage media | 2x YT broth, 15% Glycerol, 2% Glucose | ||
| pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
References
- Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J. Novel screening methods-biosensors. Curr. Opin. Biotech. 35, 30-36 (2015).
- Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).
- Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. Selection of biocatalysts for chemical synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).
- Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13 (5), R40 (2012).
- Choi, S., et al. Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits. ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).
- Lee, D. H., et al. A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments. BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).
- Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
- Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector. Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).
- Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes. Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).
- Lorenz, P., Eck, J. Metagenomics and industrial applications. Nat. Rev. Microbiol. 3 (6), 510-516 (2005).
- Uchiyama, T., Miyazaki, K. Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes. Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).
- Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. Surveying bio-transformations with à la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes. Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).
- Tang, S. Y., Cirino, P. C. Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein. Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).
- Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).
