Abstract
동결 시료의 파단 크라이 주사 전자 현미경 (SEM)의 근처 기본 조건에서 생물학적 구조를 조사 할 수있다. 여기, 우리는 잎 샘플에서 광합성 (틸라코이드) 막의 초분자 조직을 연구하는 기술에 대해 설명합니다. 이는 고압 잎 조직의 동결, 동결 파쇄, 이중층 코팅 최종적 극저온 SEM 촬영에 의해 달성된다. 이중 층 코팅 방법의 사용은 고배율 취득 수 (> 100,000X) 냉동 수화 샘플 최소 빔의 손상뿐만 아니라, 최소한의 충전 효과 이미지. 설명 된 절차를 사용하여 우리는 현장에서, 부활 공장 Craterostigma의 pumilum의 탈수시 발생하는 광계 빛 수확 안테나 단백질 복합체의 초분자 분포의 변화를 조사 하였다.
Introduction
산소를 광합성, 고대 시아 노 박테리아에서 원래는 엽록체 세포 기관의 개발을 주도 endosymbiotic 이벤트에 의해 조류와 육상 식물에 의해 계승되었다. 모든 현대 산소를 광 영양 생물에서 광합성 전자 수송 및 양성자 동기 힘의 생성과 환원력은 '틸라코이드'막이라고 평평 주머니 같은 소포 내에서 수행된다. 이러한 막은 광합성 광 구동 반응을 수행 및 에너지 전달을위한 매체를 제공하는 단백질 복합체를 집. 식물과 (일부) 조류의 틸라코이드 막은 두 가지 형태 도메인으로 구분됩니다 : '기질 라멜라'라는 '그라나'와 그라나을 상호 언 스택 막이라고 단단히 appressed 막 지역 1. 식물과 조류 틸라코이드 막의 다양한 동결 골절 연구는 1970 년대 초반부터 진행되고있다. 때 동결 골절, 막세포 구획에 따라 한 exoplasmic 얼굴 (EF)와 원형질 얼굴 (PF)를 생성, 자신의 소수성 코어 (2)에 따라 분할되는 반 막 테두리, 원래 Branton 등에 의해 화폐로 주조있다. . 각각의 '와'U '나타내는'누적 '과'언 스택 '막 지역으로, EFS, EFU, PF에와 PFU : 1975 년 3 식물과 조류 틸라코이드 네 가지 골절면이있다. 분할 또는 파손되지 않은 막 단백질 복합체, 전자 또는 멤브레인의 P의 양쪽으로 유지하는 경향이있다. 틸라코이드의 다른 골절면이 서로 다른 크기의 입자 밀도 (4), 다음에 많은 연구를 포함하는 초기의 관찰은 광 반응을 수행 관찰 된 입자와 세포막 단백질 복합체 사이의 식별과 상관되었다 5-13 (참조 또한 14, 15 리뷰).
FRE틸라코이드 막 랑 골절 실험은 일반적으로 분리 절차를 수행하는 동안 발생할 수있는 구조 및 / 또는 초분자 조직의 모든 변화의 위험, (그러나 16, 17 참조) 엽록체 또는 격리 된 틸라코이드 막 준비에 수행된다. 파쇄 후에, 레플리카들은 다음의 탄소 (C)의 두꺼운 층으로 백금 / 탄소 백금 (Pt / C)의 증발에 의해 제조되고, 생체 물질 (18)의 마지막으로 소화. 복제본은 투과형 전자 현미경 (TEM)에 의해 가시화된다. 기존의 동결 골절 - 복제 기술은 다른에 초분자 광합성 막의 조직 및 적응 연구를위한 중요한 도구, 예를 들어 역할을하고 있습니다., 빛, 조건 19-23.
Craterostigma 24 pumilum homoiochlorophyllous 부활 식물의 우리의 최근의 연구에서 우리는 초분자 조직 오의 변화를 조사하는 것을 목표로탈수 및 재수 동안 F 틸라코이드 막뿐만 아니라 전반적인 세포 조직. homoiochlorophyllous 부활 종의 고유성은 자신의 광합성 장치를 유지하면서, 자신의 식물 조직 (잎)에서 탈수의 조건 살아남을 수 있다는 것입니다. 물을 사용할 수있게되면,이 식물은 복구하고 몇 일 25 시간 내에 광합성 활동을 다시 시작합니다. 이 연구를 위해 동결 파쇄 판 시료의 극저온 주사 EM (SEM) 이미지는 고압 샘플 크라이 고정화 냉동실과 결합시켰다. 이러한 절차는 기본 상태 (26)에 가까운 상태에서 냉동 수화 생물학적 시료를 시각화하기위한 수단을 제공한다. 하나의 주요 장점은 샘플이없는 연속적인 단계를 동결 골절 및 코팅 후 직접 조사하는 것입니다. 자신의 수화 상태가 준비하는 동안 유지되는이 다른 상대 수분 함량 (RWC)에서 식물의 조사에 특히 관련이있다. 방법지금까지 하나의 중요한 단점은 광합성 단지의 크기의 정확한 측정에 필요한 높은 배율에서 스캔 할 때 냉동 - 수화 샘플 특히, 영상 중에 빔 손상으로 고통 수 있다는 것이다. 이것을 극복하기 위해서, 방법은 "이중층 코팅 '(DLC) 특정 극저온 SEM 촬상 조건을 사용 하였다 결합 27,28했다. 이들은 훨씬 적은 빔 구분 샘플 결과 및 광합성 단백질 초분자 조직과 부활의 식물 C.의 다른 세포 성분에 대한 가치있는 정보의 해명에 대해 허용 현장에서 높은 배율에서 pumilum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
고압 냉동에 의해 잎 조직의 1 곳을 알아내는 - 고정
참고 :이 섹션은 동결 파괴 실험에 잎 조직의 고압 동결을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 식물 샘플과 관련된 고려 사항에 대해서는 29를 참조하십시오. 이것은 약간 변형 조직 또는 샘플들의 다른 유형에 적응 될 수있다.
- 면도날의 모서리를 사용하여, (도 1)을 0.1 / 0.2 mm의 알루미늄 판 상체의 0.1 mm의 캐비티의 바닥을 긁어. 12 개 이상의 혈소판 (6 샘플)을 준비합니다. 디스크의 둘레에 칼 자국을 만들 않도록주의하십시오.
- 긁힘 후, 무수 에탄올에 디스크를 씻어 그들을 건조하게 깨끗한 접시에 보관하십시오.
- 제조업체의 지시에 따라 고압 냉동 시스템을 준비한다. 이소프로판올와 고압 냉동 기계의 알코올 챔버를 입력합니다.
- 집에서 만든 진공 보조 infiltratio 준비N 장치는 액체와 잎 조직에서 발견되는 가스를 대체합니다.
- 단단히 10 ㎖ 주사기의 끝 부분에 200 μL 피펫 팁을 연결한다. 팁 ~ 1cm를 잘라. 단단히 절단 팁을 맞는 1.5 ML의 microcentrifuge 관의 뚜껑에 구멍을 만듭니다. 진공 주사기의 플런저를 당겨 관내 생성 될 수있다.
- 면도날을 사용하여 식물 잎의 작은 조각을 잘라 핀셋으로 1 헥사로 절반 가득 microcentrifuge 관 내부의 잎을 배치합니다. 부드럽게 진공을 만들 수있는 플런저를 잡아 당겨 액체와 잎의 세포 간 공간을 침투, 약 30 초 동안 유지 한 후 천천히 플런저를 놓습니다.
- 핀셋을 사용하여 튜브의 잎 조각을 제거합니다. 가 0.2 mm보다 두꺼운 경우에는 면도날과 잎을 잘라 내고 혈소판에 맞는 작은 조각을 잘라.
- 냉동 시스템의 홀더에 가입 긁힌면이 깨끗하고 혈소판을 배치 한 후 르의 절단 조각을 배치혈소판에 AF. 1 헥사와 잎 주변의 나머지 공간을 채 웁니다. 잎 직면하고있는 상처와 다른 혈소판을 이용하여 샌드위치를 닫습니다.
- 닫고 홀더를 강화하고 시스템의 챔버에 삽입합니다. 다음 (~ 300 2,100 바 - 500 밀리 초)을 고정하기 위해 '제트'버튼을 눌러 신속하게 액체 질소에 홀더를 전송합니다. 조심스럽게 샌드위치를 파괴하지 않도록주의하면서 미리 냉각 된 핀셋을 사용하여 홀더에서 냉동 샌드위치를 제거합니다.
참고 : 휴일 냉동 샌드위치 즉시 골절 동결 또는 나중에 사용하기 위해 액체 질소에 보관 될 수 있습니다. 액체 질소를 처리 할 때 보호 복 및 보호 안경을 사용합니다.
2. 동결 골절 및 더블 레이어 코팅 27,28
- 제조업체의 지시에 따라, 백금 / 탄소 백금 (Pt / C), 탄소를 증발 건 모두 포함한 사용 냉동 파쇄 시스템을 준비. 45도에서의 Pt / C 총을 놓습니다ND 90도 카본 건.
- 사전 프로그램의 Pt / C (피복 률 0.02-0.04 ㎚ / 초)의 두 나노 층의 코팅 방식과 (0.1 ㎚ / 초 ~ AT) 탄소 나노 6 층.
- 동결 골절 기계의 화면에 설정을 입력합니다. 코팅 방식이 저장 될 사용자 번호를 선택합니다.
- '레이어 1'에 대한 백금 / C를 선택합니다. 시간 프레임을 선택 예. 5 분 (코팅을 완료하기 위해 필요한 필요한 시간 초과). 2 nm의 두께를 정의하기 위해 상하 화살표를 사용.
- 선택 탄소를 제외하고, 2 단계를 반복 2.1.1.2을 레이어로 이동 6 nm의 두께를 정의하기 위해 '레이어'버튼을 누릅니다.
- 테스트 및 총 동작을 조정합니다.
- 선택 '레이어 1'. 'GUN1'버튼을 눌러 편 / C 건을 선택하고 동결 골절 기계의 증발 제어 장치에 'ON'버튼을 누릅니다. 증착 속도를 모니터링하고 UNT 전압 및 발광 노브를 사용하여 조정0.04 ㎚ / 초 - (IL)는 0.02의 비율로 도달. 를 눌러 'OFF'는 백금 / C 총을 끕니다.
- 선택 '레이어 2'. 선택 'GUN2'를 제외하고, 2.1.2.1를 반복 0.1 나노 미터 / 초 ~의 증발 속도를 조정.
- 사전 프로그램의 Pt / C (피복 률 0.02-0.04 ㎚ / 초)의 두 나노 층의 코팅 방식과 (0.1 ㎚ / 초 ~ AT) 탄소 나노 6 층.
- (수화 또는 탈수 잎에 대한 각각) -140 C 또는 -160 ℃로 동결 골절 시스템 단계 쿨. 기계로 진공 냉동 이송 셔틀을 장착하고 액체 질소로의 챔버를 입력합니다. -7 10 × 8 밀리바 - 냉각 동결 골절 실의 압력은 일반적으로 1 사이입니다.
- 로딩 스테이션으로 동결 파쇄 시편 홀더 (3 mm 혈소판 적합)를 삽입한다. 액체 질소로 로딩 스테이션 챔버 홍수.
- 고정밀 급 핀셋을 사용하여 하나 홀더 하나 상에 두 개의 냉동 샌드위치를 넣습니다. 제자리에 안전하게 맞는지 확인하기 위해 홀더를 뒤집어 후 홀더에 첫 번째 샌드위치를 조이고. 두 번째 샌드위치에 대해 반복합니다.
- 디동결 골절 시스템에서 냉각 된 셔틀 인 Etach 및 로딩 스테이션에 연결합니다. , 셔틀 밸브를 열고 홀더에 후퇴 암을 소개하고 제자리에 고정. 셔틀에 홀더 팔을 다시 소개하고 로딩 스테이션 노브를 사용하여 셔틀 밸브를 닫습니다. 동결 골절 기계에 셔틀 버스를 연결하고 후퇴 팔 챔버로 홀더를 소개합니다. 기계에서 셔틀 버스를 분리합니다.
- 이 샌드위치의 정상 혈소판을 노크되도록 높이로 동결 골절 마이크로톰 칼을 맞 춥니 다.
- 마이크로톰 나이프, 신속하게 샌드위치를 중단하고 즉시 칼에 파편 집착하여 샘플의 오염을 방지하기 위해 그것을 인상, 그리고 물 분자에 의해 오염 가능성에서 샘플을 보호하기 위해 새로 노출 된 평면 위의 냉각 셔터를 켜 챔버.
- 코트 백금 및 카본으로 샘플.
- SC의 '레이어 1'을 입력재 N. 'ON'버튼 다음에 'GUN1'버튼을 눌러 편 / C 총을 켭니다. 증발 속도를 조사하고 이르면 0.02 - 0.04 ㎚ / 초, 동시에 샘플을 노출시켜 증착 된 층의 두께를 모니터링 '측정'버튼을 누른다.
참고 : 두께가 미리 선택된 값에 도달 할 때 총이 자동으로 꺼집니다. - 백금 / C의 증착이 완료되면 셔터 샘플을 커버한다.
- '레이어 2'로 이동하는 '레이어'버튼을 누릅니다. 반복 (카본) 'GUN2'0.1 ㎚ / 초 ~의 증착 속도를 선택 제외한 2.8.1 및 2.8.2 단계.
- SC의 '레이어 1'을 입력재 N. 'ON'버튼 다음에 'GUN1'버튼을 눌러 편 / C 총을 켭니다. 증발 속도를 조사하고 이르면 0.02 - 0.04 ㎚ / 초, 동시에 샘플을 노출시켜 증착 된 층의 두께를 모니터링 '측정'버튼을 누른다.
- -120 ℃로 동결 골절 시스템 스테이지를 따뜻하게.
3. 전자 현미경을 알아내는은 스캐닝
- 크라이 작업 주사 전자 현미경을 준비한다.
- 주 메뉴 및 확인의 단계 / 스테이지 초기화를 선택합니다.
- 선택 도구 / 당함O 패널, 그리고 목록에서 선택하여 '에어 록'패널을 엽니 다. Close (닫기) 열 회의소 밸브 '버튼을 클릭합니다. '진공'탭 아래에있는 벤트 버튼을 클릭하여 현미경 실을 환기.
- 선택 도구 / 고토 패널, 그리고 '스테이지 포인트 목록'패널을 엽니 다. 샘플 홀더를 수용하기위한 적절한 좌표로 무대를 이동하는 냉동 교환 위치를 선택합니다. 주 : "극저온 교환 위치"진공 반송 유닛의 위치와 정렬되도록 미리 설정된다.
- 장갑의 깨끗한 쌍 시료 챔버를 열고 현미경의 메인 무대에 크라이 단계를 삽입합니다. 챔버를 닫고 '진공 탭'아래의 펌프 버튼을 클릭합니다.
- -120 ℃로 현미경 쿨. 액체 질소와 현미경 듀어를 입력합니다. 스테이지의 온도 이하 -120 ° C - 방울 후 -120 ℃로 크라이 전송 제어 장치에 가열 기능을 활성화.
- AT & T는현미경으로 극저온 이송 셔틀을 ACH 및 (단계 250에서와 같이) 현미경 크라이 단계로 후퇴 아암을 이용하여 샘플 홀더 옮긴다. 현미경에서 셔틀 버스를 분리합니다.
- 에어 락 패널에서 '열기 열 회의소 밸브'버튼을 클릭합니다.
- 조이스틱을 사용하여 - 조심스럽게 대물 렌즈 (2mm 작업 거리 1)에 가까운 시편 홀더를 이동합니다. '조리개'탭에서 10 μm의 구멍을 선택합니다. '총'탭에서 EHT 필드를 두 번 클릭합니다. EHT 목표 10 (kV의)를 입력하고 확인을 클릭합니다. 바닥 EHT 탭을 클릭하고 'EHT에'를 선택합니다.
- '감지기'탭에있는 감지기 드롭 다운 목록에서 'InLens'를 선택합니다. 적절한 촬영 조건 (초점, 밝기 및 대비, 빔 정렬, 난시)을 최적화합니다.
- '검색'탭을 클릭합니다. 빔 피해를 최소화하기 위해 (픽셀 당 나노초 (100)의 체류 시간에 해당하는 '스캔 속도 = 1') 고속 스캔을 선택하고,1,024 x 768 픽셀의 '스토어 해상도'. '노이즈 감소'드롭 다운 목록에서 '선 평균'를 선택합니다. 검색을위한 30 라인 - 20 N의 값을 조정합니다. 골절 세포와 엽록체 (도 2A와 2B)와 지역을 검색합니다 (키보드에서 컨트롤 탭을 눌러)이 '센터 포인트'기능을 사용하여 샘플을 이동합니다.
- (- 70 kX이 50) (그림 2C 및 2D) 낮은 배율에서 골절 엽록체의 이미지를 획득. 흥미로운 엽록체 골절면을 확대하고 높은 배율에서 이미지를 수집하기 위해 (키보드 제어 전환 탭을 눌러)이 '센터 기능'기능을 사용하여 (100-200 kX이, 3도, 4). 이미지 획득을위한 단계 3.6에서와 동일한 매개 변수를 사용하지만, 노이즈 감소 (30)에 대한 N> 100 선 평균 값을 변경합니다.
- 주 현미경 제어 유닛에 또는 '검색'탭을 눌러 정지는 검색을 중지하고 저장'저장 TIFF'버튼을 눌러 이미지입니다.
4. 이미지 분석
참고 :이 섹션은 피지 (31) 오픈 소스 패키지를 사용하여 동결 골절 SEM 이미지에서 막 입자의 분할에 대한 간단한 절차를 설명합니다. 유사한 결과가 다른 화상 해석 소프트웨어를 얻을 수있다.
- 주 프로그램 창에 이미지 파일을 드래그하여 피지 오픈 이미지입니다. 이미지 / 종류 / 8 비트를 선택하여 8 비트 이미지를 변환합니다. 선택 이미지 / / 밝기 / 명암 대비를 조정하고 필요에 따라 (그림 5A)를 조정합니다.
- 직선 도구를 사용하면 선을 포함 된 이미지 스케일 바의 크기를 그립니다. / 설정 규모를 분석 선택합니다. 적절한 규모의 정보 (길이 알려진 거리 단위)를 입력하고 확인을 클릭합니다. 이 조정 조정 된 이미지를 저장합니다.
- 선택 프로세스 / 필터 / 가우시안 블러 (1.5 nm의 반경) 및 OK (그림 5B)를 클릭합니다.
- 선택 이미지 / / AUT를 조정오 현지 임계 값합니다 (니 블랙 방법을 사용) 및 OK (그림 5C)를 클릭합니다.
- 다음 편집 / 반전 및 프로세스를 선택 / 진 / 유역 (그림 5D).
- 자유형 선택 도구와 관심 (ROI)의 영역 주위에 테두리를 그립니다. / 선택 편집 / 선택하여 투자 수익 (ROI) 관리자에게 선택을 추가 관리자 또는 'T'를 클릭하여 추가합니다.
- 외부 편집 / 삭제 (그림 5E)을 선택합니다.
- / 설정 측정 분석 선택 적절한 매개 변수 (예를 들어, 지역에 맞는 타원)을 선택합니다.
- 분석 선택 / 입자를 분석합니다. 옵션 '가장자리에 제외'하고 확인을 클릭합니다 필요한 경우, '관리자에 추가', 입자의 크기에 적절한 범위를 입력하고 '결과 표시'를 표시합니다. 결과는도 5F에 도시된다.
- 저장된 조정 이미징 파일 (4.2 단계)를 엽니 다. '모두보기'를 선택하고 투자 수익 (ROI) 관리자에서 '라벨'을 선택 취소합니다. 선택한 partic를 검토레는 원본 이미지에 놓고 수동으로 추가하거나이 투자 수익 (ROI) 관리자의 버튼을 '추가'또는 '삭제'를 사용하여 선택을 제거합니다. 자유형 선택 도구와 ROI 관리자 (그림 5 세대와 5H)의 '업데이트'버튼을 사용하여 필요한 모든 선택 사항을 수정합니다.
- 얻어진 측정 값을 사용하여 데이터를 분석한다. 결과 창에서 / 결과를 클릭 얻을 요약, 예를 들어, 평균 지역 및 주요 및 ROI 관리자에 나열된 입자의 마이너 축을 의미한다. , 결과 / 배포를 클릭합니다 (예 : 지역 등) 매개 변수를 선택하고이 매개 변수에 대한 히스토그램을 볼 수 확인을 클릭합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
도 1은 고압 동결, 동결 파쇄 Craterostigma pumilum 잎 조각을 포함 혈소판 극저온 SEM 이미지를 나타낸다. 일부 샘플에서 골절 세포의 큰 영역 (그림 1A)를 얻을 수있다. 다른 사람에, 잎 조각은 단단히 상부 디스크에 결합 된 상태를 유지하고 그것으로 (그림 1B)를 따라 참패를 당하고있다. 그러나, 두 번째 경우에서, 일부 잎 조직 여전히 잎 "찌꺼기"묘화에 의해 수집 될 수있는 산화철 (도 1b, 화살촉) 및 데이터의 상당한 양의 칼날 홈에 부착 된 상태로있다가 골절 하였다 제공. 성공적인 골절이 발견되면, 세포의 저배율 사진이 경우 엽록체 (도 2)에 대한 관심 지역을 식별하기 위해 취득된다.
C.에서 틸라코이드 막의 높은 배율 이미지 pumilum 잎은도 3 및도 4에 도시된다. 네 가지 골절면, EFS, EFU PFS의 PFU하고는 (도 3)을 구별 할 수있다. 세포막에서 발견되는 가장 큰 단백질 복합체이다 광계 II (PSII)는, 상기 EFS (그라나) 및 EFU (기질 라멜라) 모두에 있습니다. 수화 된 상태에서, 광계 밀도는 EFU (~ 1550 단지의 μm의 -2 대 ~ 550 단지의 μm의 -2, 그림 3)에 비해 EFS의 2 ~ 3 배 높다. 이 두 연속 얼굴을 구별하기 위해 하나의 기준이됩니다. 또 그 배경에서의 차이이다. EFS 배경 부드러운 나타납니다 동안, EFU 얼굴 거친과 분리 된 PSI 단지, 보완 얼굴 골절의 PFU (10) (그림 3)의 발자국있는 구멍이 포함되어 있습니다. 틸라코이드 막의 EFS면에서 PSII 단지의 분할에 대한 예는 그림 5에 표시됩니다.
"FO : 유지-together.within 페이지를 ="ove_content C.의 pumilum의 그라나 막에서 광계의 밀도 (EFS)의 탈수 중 1 "은> 점진적 ~ 15에서 약 절반 (~ 700 단지의 μm의 -2 도달 감소 수화 조건 (100 % RWC,도 4a)에서 자신의 밀도 %의 RWC, 그림 4C)이 특히 더 탈수시, 5 -. 10 % RWC, PSII 단지 행과 배열로 구성 (화살표) 4D 및 4E도. 전체 데이터 세트의 경우, 24을 참조하십시오. 이러한 광계 배열의 형성은 그들의 결합 된 안테나 단지의 일부는 LHCII가 광계에서 분리 것을 필요로한다. EFS에서 조직 PSII 단지 보완 할 것 PF에의 행으로 구성 LHCII 단지의 예를 ( )도 4E (화살촉)에 나타낸다. 어레이에서 PSII 착체뿐만 아니라 분리 LHCII를 광 화학적 담금질 상태가 될 가능성이 있으며, 광 보호 역할을 서빙. 이러한 구조적 재 배열이 부활의 식물 C.에 의해 사용되는 메커니즘의 일부 탈수 상태 (24)에 그 자체를 보호하는 pumilum.
냉동 골절 C.와 혈소판의 그림 1은 낮은 배율을 알아내는-SEM 이미지 pumilum 잎 조각입니다. (A) 골절 세포의 큰 영역 (점선)는 C.의 pumilum 잎. 바닥 혈소판의 칼 마크에 (B)가 잎 조각이 상단 혈소판에 참패했지만, 일부 잎 조직이 부착 된 남아 (화살촉이 중 일부를 표시). 잎 조각을 둘러싼 영역은 1- 헥사 데센 (별표)에 고정된다. 스케일 바 :. 200 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 엽록체로 확대. (A) 수화 잎 조직의 골절 광합성 (엽육) 세포 (별표)의 그룹. 셀 체적의 대부분은 좁은 스트립 액포를 둘러싼 모든 세포질 성분과 큰 중앙 액포로 구성된다. (B) 개의 이웃 셀 골절 - 칸막이 벽 (CW)가 셀의 경계를 표시한다. 다섯 엽록체 (c)는 (화살촉으로 표시 골절면) 골절 된 단지 하나의 화상에서 명백하다. 수화 (C)에서 하나의 골절 엽록체에 대한 (C와 D) 예 탈수 (D ~ 15 % 상대 수분 함량 [RWC]) 식물입니다. 작은 백색 점 (예를 들면, 화살촉)은 엽록체의 틸라코이드 막 내에있는 막 단백질 복합체이다. 거대한 수포의 SURR 참고탈수 된 잎 (D)에있는 엽록체를 ounding. 스케일 바 : 10 μm의 (A); 1 ㎛ (B); 200 nm의 (C와 D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 식물 조직 내에서 틸라코이드 막의 초분자 조직 다른 틸라코이드 골절의 얼굴을 볼 수있는 골절 엽록체 :. exoplasmic 골절면 (EF) 모두 (EFS) 스택과 언 스택 (EFU) 막 영역은 광계 II를 포함 (PSII) 단지; 스택 영역의 원형질 파괴 얼굴 PFS (는) 광계, LHCII의 주변 광 수확 안테나 단지를 포함, 언 스택 영역의 원형질 파괴면 (PFU)에 광계 I (PSI)과 ATP 합성 효소 골절; 시토크롬 B 6 F 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
C.의 탈수 동안 광계 II 조직 4. 변경도 pumilum EFS 다른 RWC에서 식물의 틸라코이드 막의 얼굴 (A) 100 %, (B) ~ 40 % (C) ~ 15 %, 및 (D 및 E) 5-10%.. 탈수 동안, EFS에서 광계의 밀도가 점차 감소에 직면 1,500 ~에서 단지의 μm의 -2 (A)에 ~ 700 단지의 μm의 -2 (~ 15 % RWC, C). 특히, 건조 조건에서 (5~10%의 RWC) 일부 PSII 단지 행과 배열 (D 및 E, 화살표)로 구성 할 수 있습니다. 화살촉 (E)는 LHCII 안테나는 광계 행이 보완 EFS에서 발견 될 수있는 사이에, 행 구성 될 나타나는 더불어, PF에 얼굴을 표시합니다. 이 데이터에 대한 자세한 내용은 24를 참조하십시오. 스케일 바 :. 100 nm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 예제는 광계 II 입자의 분할. 피지 오픈 소스 패키지를 사용하기 위해, 단백질 복합체는 몇 단계 (프로토콜 부분의 제 4 부에서 발견 자세한 절차를 완료)와 이미지에서 분할 할 수 있습니다. 이미지 (A, 원 화상)는 가우시안 필터 (B)를 흐리게; 이미지는 자동 로컬 제를 사용한다 임계 된reshold 도구 (C); 이미지가 반전되고 유역 알고리즘 밀착 (D)에 위치한 별도의 개체에 순서대로 적용된다 관심 영역 (E)을 선택하고, 외부 클리어; (사용자 정의 된 크기 범위 내에서) 입자는 입자 분석기 기능을 이용하여 선택된다. 얻어진 마스크 (F)에 도시되어있다. 입자는 ROI Manager에 추가 및 오류 또는 결함이 있거나 누락 된 입자를 확인하기 위해 원본 이미지 (G)에 중첩된다. 로아 목록은 수동으로 적절한, 교체 삭제하거나 새로운 ROI를 추가, 편집 할 수있다. 최종 사용자 편집 선택은 (H)에 나타낸다. 스케일 바 :. 200 nm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 논문에 기재된 기술은 극저온 사형 전자 현미경으로 잘 보존 고압 동결 식물 조직의 컨텍스트 내에서 동결 파쇄 막의 조사를 허용한다. 이러한 절차를 사용하는 주요 장점은 시료 준비 순전히 물리적 점이다; 화학 물질이나 탈수를 포함하는 어떤 단계가 필요하지 않습니다. 따라서, 거의 원시 상태 26,32에서 생물학적 구조를 연구 할 수 있습니다. 잎 조직을 사용하는 장점은 하나의 엽록체 내, 즉 그 나라의 생리 컨텍스트 내 전체 세포 조직에 관한 정보뿐만 아니라, 틸라코이드 막으로서 연구 특정 막을 얻을 수 있다는 점이다. C. 연구에 필수적 또 다른 장점은, 다른 상대 수분 함량 (RWC)에 pumilum 식물들은 그들의 수화 상태는 제조 동안 변경되지 않는다는 것이다. 이것은 출발 원료로서 단리 또는 엽록체 틸라코이드 막이 이용 대향로동결 파괴 실험. 후자에서, 하나는 어떤 구조적 및 / 또는 초분자의 변경 가능성 소기관 / 막 분리 중에 일어나는 것을 고려한다.
비교적 두꺼운 식물 조직 샘플 작업 [> 50-100 μm의, 조직 및 종의 유형에 따라 크게 두꺼울 수, 샘플 유리화 (HPF)를 동결 고압의 사용을 지시한다. 물의 용융 온도는 약 -22 ℃로가되는 고압 [2100 바]의 애플리케이션은 얼음 결정 형성 속도가 느려지도록 물의 수소 결합 네트워크에 영향을 미친다. 따라서, 유리화 된 샘플을 얻는 기회도 비교적 느린 냉각 속도로 높다. HPF는 현재 아직 200 μm의 샘플을 초과하지 않는 두께의 유리화에 사용할 수있는 유일한 방법입니다. 식물 조직의 HPF를위한 중요한 단계는 불활성과의 간 공기 공간의 침투입니다4]. 종래 냉동실에 간극 충전재 "는 고압 하에서 조직의 붕괴를 방지하기 위해, 두께 1mm까지 가능 C.의 pumilum 잎의 경우 (후기 29,33 참조), 잎은 또한 트리밍 할 필요 또는 HPF 이전에 얇게.
본질적으로, 복제 제제 (18)의 기술도 적용 할 수 잎 조직을 동결 파쇄. 복제본이 종종 작은 조각으로 단편화 때문에, 우리의 경험을 그대로 골절 분야의 충분한 수율을 얻을 수 없습니다. 또한, 이러한 엽록체로 관심의 특정 지역을 검색하면 식물 조직의 조각 복제본 내에서 비실용적 일 수있다. 엽육 (광합성) 세포 핵, 엽록체 및 다른 세포 소기관을 포함하는 세포질 좁은 스트립 (도 2a)에 의해 둘러싸인 중앙 큰 액포로 구성되어 있기 때문에이 중심이다. 따라서, 엽록체의 전체 영역의 프랙 극소량 대표엽육 조직. 시료를 직접 파괴 (코팅 / 음영) 다음 시각화되므로 동결 파쇄 샘플 극저온 SEM 영상이 문제에 대한 해결책을 제공한다. 그러나이 방법은 냉동 - 수화 샘플 높은 배율 쉽게 손상 첫 번째 스캔에서 샘플에서 빔에 민감한 따라서 스캔하는 한계에서 겪고있다. 더블 레이어 코팅 (DLC) 27, 28이 심각한 문제점에 대한 해결책을 제공합니다.
DLC에서 골절 된 샘플들은 복제 준비를 위해 얼마나 유사한 방식으로 코팅된다. 먼저, 박막 - 백금 / C (1 내지 3)는 콘트라스트와 도전성을 제공하는 샘플로 증발시킨다. - (5 내지 10)의 탄소 보호 층이이 두꺼운 따른다. 높은 가속 전압 (kV의 10)와 결합 된 DLC는 후방 산란 전자 (BSE) 신호 (28)를 이용하여, 화상을 샘플로 사용 하였다. 백금 층으로부터 유래하는 BSE 신호는 탄소 표면을 통해 정보를 취득 할 수 있습니다그리고, 가능 (수질 오염 심지어이 경우, 진공 크라이 이송 유닛이 사용되지 않고 파쇄면은 대기에 노출시키는 실험을 축적 높은 가속 전압에서 BSE 실제적으로 투명한 수증기 오염 층 ) 두 번째의 일부분입니다. 또한, BSE 신호를 이용하여 이미징 차 전자 (SE) 검출부 (27) 명백한 효과를 충전의 문제를 최소화. 백금 / C의 3 nm의 낮은 가속 전압에서 이미징 - 여기에 설명 된 현미경 설정, 10 kV의의 인 - 렌즈 SE 검출기와 SE 신호의 영상으로 샘플 2 단독으로 코팅 된 때 얻은 것과 정보에 상응를 얻었다. 차이는 설명 된대로 DLC에 의해 제조 및 이미징 샘플이 상당히 적은 빔 민감한 것입니다. 이 광합성 단백질 supramolecul에 유용한 정보를 얻기도 반복적으로 높은 배율에서 많은 경우를 검색 할 수있게하고, 허용아칸소 조직과 다른 세포 성분 (그림 2-4) 24.
마지막으로, 여기에 기술 된 과정은 샘플의 다른 타입의 구조 및 / 또는 멤브레인 단백질 조직을 연구하기 위해 수정 될 수있다. 우리는 성공적으로 시아 노 박테리아 및 조류 세포에서 광합성 막의 초분자 조직 공부할 수있는 기술을 채용 한 (Shperberg - 아브 니 외. 게시되지 않은 데이터). 샘플 intactness 유지하면서 주요 고려 사항은, 투명화를위한 기회를 증가시키기 위해 가능한 한 얇은 샘플을 갖는 사이의 균형을 찾는 것이다. 현탁액 또는 동물 / 식물 조직 될 수있는 샘플의 종류에 대해서는, 다른 패키징 (고압 동결 이용 혈소판의 형태의 관점에서, 예)이 사용되어야한다. 성공적인 극저온 고정화가 달성되면, 동결 파쇄, DLC 및 극저온 SEM 촬상의 조합 INFOR를 얻기위한 수단을 제공 우수한최소한의 빔 손상 높은 배율로 막 단백질 조직에 mation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
우리는 전자 현미경 이미지를 스캔에 대한 자신의 도움이 조언을 안드레스 Kaech (취리히 대학) 감사합니다. 이 작품은 미국 - 이스라엘 Binational 농업 연구 개발 기금 (더 부여합니다. US-4334-10를, ZR을) 이스라엘 과학 재단 (더 부여합니다. 12분의 1,034을, ZR)을하고, 인간 프론티어 과학 프로그램에 의해 지원되었다 (RGP0005 / 2013, ZR). 전자 현미경 연구는 과학의 와이즈만 연구소의 어빙과 나노 Cherna 모스코 위츠 센터 및 바이오 나노 이미징에서 실시 하였다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol abs | Bio-Lab | 052505 | |
| Isopropanol | Bio-Lab | 162605 | |
| 1-hexadecene | Sigma-Aldrich | H7009 | |
| 0.1/0.2 Platelets | Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland | 241 | Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems. |
| High-precision-grade tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72706-01 | Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers. |
| High-pressure freezing machine | Bal-Tec | HPM 010 | High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems. |
| Freeze-fracture system | Leica Microsystems | EM BAF 060 | |
| Cryo preparation loading stage | Leica Microsystems | 16770228 | |
| Specimen holder for univeral freeze fracturing | Leica Microsystems | 16LZ04746VN | Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm |
| Vacuum cryo-transfer shuttle | Leica Microsystems | EM VCT 100 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | Ultra 055 | |
| Cryo SEM stage | Leica Microsystems | 16770299905 | |
| Image acquisiton software | SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH | ||
| Image analysis software | Fiji/Image J, National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Anderson, J. M. Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective. Aust. J. Plant Physiol. 26 (7), 625-639 (1999).
- Branton, D. Fracture Faces of Frozen Membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 55 (5), 1048-1056 (1966).
- Branton, D., et al. Freeze-Etching Nomenclature. Science. 190 (4209), 54-56 (1975).
- Goodenough, U. W., Staehelin, L. A. Structural Differentiation of Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes - Freeze-Etch Electron Microscopy of Wild-Type and Mutant Strains of Chlamydomonas. J. Cell Biol. 48 (3), 594-619 (1971).
- Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .6. Location of the P700-Chlorophyll a-Protein-1. Eur. J. Cell Biol. 31 (2), 305-314 (1983).
- Staehelin, L. A. Reversible Particle Movements Associated with Unstacking and Restacking of Chloroplast Membranes. Invitro. J. Cell Biol. 71 (1), 136-158 (1976).
- Miller, K. R. A Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-I - Changes in Unstacked Membrane Regions. Biochim. Biophys. Acta. 592 (1), 143-152 (1980).
- Miller, K. R., Cushman, R. A. Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-II - Thylakoid Stacking in the Absence of the Photosystem-II Particle. Biochim. Biophys. Acta. 546 (3), 481-497 (1979).
- Miller, K. R., Staehelin, L. A. Analysis of Thylakoid Outer Surface - Coupling Factor Is Limited to Unstacked Membrane Regions. J. Cell Biol. 68 (1), 30-47 (1976).
- Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .3. Location of the Light-Harvesting Chlorophyll-Protein. Carlsberg Res. Commun. 44 (5), 305-336 (1979).
- Olive, J., Recouvreur, M., Girardbascou, J., Wollman, F. A. Further Identification of the Exoplasmic Face Particles on the Freeze-Fractured Thylakoid Membranes - a Study Using Double and Triple Mutants from Chlamydomonas-Reinhardtii Lacking Various Photosystem-Ii Subunits and the Cytochrome B6/F Complex. Eur. J. Cell Biol. 59 (1), 176-186 (1992).
- Olive, J., Vallon, O., Wollman, F. A., Recouvreur, M., Bennoun, P. Studies on the Cytochrome B6/F Complex .2. Localization of the Complex in the Thylakoid Membranes from Spinach and Chlamydomonas-Reinhardtii by Immunocytochemistry and Freeze-Fracture Analysis of B6/F Mutants. Biochim. Biophys. Acta. 851 (2), 239-248 (1986).
- Armond, P. A., Staehelin, L. A., Arntzen, C. J. Spatial Relationship between Light Harvesting Complex and Photosystem-1 and Photosystem-2 in Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes. J. Cell Biol. 70 (2), 400-418 (1976).
- Staehelin, L. A. Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes. Photosynth. Res. 76 (1-3), 185-196 (2003).
- Nevo, R., Charuvi, D., Tsabari, O., Reich, Z. Composition, architecture and dynamics of the photosynthetic apparatus in higher plants. Plant J. 70 (1), 157-176 (2012).
- Platt, K. A., Oliver, M. J., Thomson, W. W. Membranes and Organelles of Dehydrated Selaginella and Tortula Retain Their Normal Configuration and Structural Integrity - Freeze-Fracture Evidence. Protoplasma. 178 (1-2), 57-65 (1994).
- Platt-Aloia, K. A., Thomson, W. W. Advantages of the use of intact plant tissues in freeze-fracture electron microscopy. J. Electron Microsc. Tech. 13 (4), 288-299 (1989).
- Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51694 (2014).
- Kirchhoff, H., et al. Low-light-induced formation of semicrystalline photosystem II arrays in higher plant chloroplasts. Biochemistry. 46 (39), 11169-11176 (2007).
- Johnson, M. P., et al. Photoprotective Energy Dissipation Involves the Reorganization of Photosystem II Light-Harvesting Complexes in the Grana Membranes of Spinach Chloroplasts. Plant Cell. 23 (4), 1468-1479 (2011).
- Kirchhoff, H., Tremmel, I., Haase, W., Kubitscheck, U. Supramolecular photosystem II organization in grana thylakoid membranes: evidence for a structured arrangement. Biochemistry. 43 (28), 9204-9213 (2004).
- Belgio, E., Ungerer, P., Ruban, A. V Light-harvesting superstructures of green plant chloroplasts lacking photosystems. Plant Cell Environ. , (2015).
- Goral, T. K., et al. Light-harvesting antenna composition controls the macrostructure and dynamics of thylakoid membranes in Arabidopsis. Plant J. 69 (2), 289-301 (2012).
- Charuvi, D., et al. Photoprotection Conferred by Changes in Photosynthetic Protein Levels and Organization during Dehydration of a Homoiochlorophyllous Resurrection Plant. Plant Physiol. 167 (4), 1554-1565 (2015).
- Farrant, J. M., Brandt, W., Lindsey, G. G. An Overview of Mechanisms of Desiccation Tolerance in Selected Angiosperm Resurrection Plants. Plant Stress. 1 (1), 72-84 (2007).
- Walther, P. High-resolution cryoscanning electron microscopy of biological samples. Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy. Schatten, H., Pawley, J. B. , Springer. New York. 245-261 (2008).
- Walther, P., Müller, M. Double-layer coating for field-emission cryo-scanning electron microscopy--present state and applications. Scanning. 19 (5), 343-348 (1997).
- Walther, P., Wehrli, E., Hermann, R., Müller, M. Double-layer coating for high-resolution low-temperature scanning electron microscopy. J. Microsc. 179, (Pt 3) 229-237 (1995).
- Hess, M. W. Cryopreparation methodology for plant cell biology. Cell. Electron Microsc. 79, 57-100 (2007).
- Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212 (1), 34-43 (2003).
- Nevo, R., et al. Architecture of Thylakoid Membrane Networks. Lipids Photosynth. 30, 295-328 (2009).
