Summary

C2C12 근육 모세포의 세포에 근긴장 성 이영양증 1 모델링

Published: July 29, 2016
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Summary

이 프로토콜에서는, 우리는 최적화 된 C2C12 세포의 유지 보수, 유전자 형질 전환 / 전달 및 심근 분화를 포함한 근긴장 성 이영양증 1 근원 세포 모델을 설정하는 절차를 제시한다.

Abstract

근긴장 이상증 1 (DM1)는 근육 영양 장애의 일반적인 형태입니다. 여러 동물 모델이 DM1 설립되었지만 그들은 세포 및 분자 이벤트를 공부하기위한 효율적인 세포의 대안을 제공하기 때문에, 근원 세포 세포 모델은 여전히​​ 중요하다. C2C12 근육 모세포의 세포가 광범위하게 유전자 형질 전환, 형질 도입 또는 바이러스에 근육 생성, 저항을 연구하는 데 사용되었다하더라도, C2C12 세포의 연구를 방해한다. 여기, 우리는 C2C12의 근육 아세포 및 심근 분화의 유도에 유전자를 도입하는 일상적인 유지 보수, 형질 전환 및 전달 절차를 포함하는 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 종합적으로, 이러한 절차는 최선의 형질 전환 / 전달 효율뿐만 아니라 일관성있는 차별화 된 성과를 가능하게한다. 근긴장 성 이영양증의 연구뿐만 아니라 다른 근육 질환에 유익 할 DM1 근육 모세포 셀 모델 확립에 기재된 프로토콜.

Introduction

근긴장 이상증 (DM)는 여러 시스템, 특히 심장과 골격 근육 (1)에 영향을 미치는 염색체 우성 질환이다. 이 질병, DM1과 DM2의 두 하위 유형이 있습니다. DM1 더 일반적이며 DM2 2보다 더 심한 표현이 있습니다. DM1 근본적인 유전 적 변이는 3 '비 번역 영역 DM 단백질 키나제 유전자 (DMPK) 3 (UTR)에있는 CUG 삼중 반복의 확장이다. 영향을받지 않는 개인의 CUG 반복 수는 대조적으로 (37)에 5,은 50 개 이상으로 증가하고, 때로는 최대 DM1 환자 4 천에 달라집니다. 그 결과, 같은 RNA 결합 단백질, muscleblind 형 1 (MBNL1) CUGBP 및 Elav 같은 가정 한 (Celf1) misregulated이다. 때문에 확장 된 CUG 반복에 격리에 MBNL1 대체 스 플라이 싱 (5)을 조절하는 능력을 잃게된다. Celf1 반면에, 6,7-을 조절한다. Celf1 과발현 근육 손실과 연관된MBNL1 기능의 손실에 기인되지 않고 약점. DMPK 3'-UTR CUG 확장, MBNL1 상실 및 과발현 Celf1 포함 DM1 관련 변화를 시뮬레이션 동물 모델이 수립되었다. 그러나, 근육 아세포에서 DM1을 모델링 특히 DM1 관련 세포 및 분자 이벤트를 해부에 대한 효율적인 대안을 제공합니다.

C2C12 근육 모세포 세포주 제 부상 C3H 마우스 근육 분리 널리 근육 조직 분화 8,9을 연구하기 위해 사용되었다. C2C12 세포는 급속 소 태아 혈청 (FBS)을 함유 미디어 증식 용이 FBS가 소모 될 때 분화를 겪는다. 그러나,이 근육 모세포 분화 모델을 사용하여 두 가지 과제를 제시한다 : C2C12 세포는 종종 유전자 형질 전환 / 바이러스 형질 도입에 대해 내성이고; 세포 처리 및 분화 과정에 약간의 차이는 myotube 형성에 표시된 변경 될 수 있습니다.

우리 연구실은 정기적으로 교류 등 C2C12의 근육 아세포를 사용엘 모델과 효과적으로 C2C12 세포주 (10)에 플라스미드 형질 전환, 레트로 바이러스 전달 및 렌티 바이러스 전달에 의해 유전자를 제공하는 프로토콜을 개발했다. 비디오에서 우리는 / 형질 C2C12 세포를 형질 도입 및 DM1의 근원 세포 모델을 확립 차별화 일관성을 유지하기위한 최적화 과정을 보여줍니다.

Protocol

1. C2C12 세포 배양 성장 배지에서 100mm 플레이트 C2C12 마우스 근육 아세포를 유지 (둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)) 20 % 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 2 mM의 L- 글루타민. 60 % 합류 – C2C12 계대 세포는 약 50이 될 수 있습니다. 성장 배지를 버리고 3 ㎖을 실온 인산 완충 식염수 (PBS)로 C2C12 세포를 세척 하였다. PBS를 제거하고 세포를 분리하기 위해 500 ㎕를 0….

Representative Results

C2C12 세포는 GFP-CUG5 또는 GFP-CUG200로 형질했다. 약제 내성의 선택 후, 안정한 풀을 GFP 발현 (도 1a)에 의해 시각화 될 수있는 확립 하였다. 차별화 된 근육 아세포에서 Myotube 형성은 10 (그림 1B)를 면역 염색 중쇄를 미오신에 의해 검출되었다. myotube 형성의 정량은 융합 지수는 2.6 ± 1.1 %로 35.4 ± 4.1 %로 감소하고, myotube 영역이 GFP-CUG200 (그?…

Discussion

C2C12 세포주 11-14 근육 생성을 연구 모델로서 이용되어왔다. 이러한 세포는 섬유 아세포와 같은 모양을 유지, 20 % 소 태아 혈청을 함유하는 배지에서 증식 신속 용이 2 % 말 혈청 (15)를 포함하는 배지에서 분화. 빠른 성장 및 분화는 근육 생성 세포 모델에서 유리한 특성이다. 여기서는 C2C12 세포 내로 cDNA의 3'-UTR, 및 shRNA를 소개하는 플라스미드, 레트로 바이러스 및 렌티 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Drs. Tom Cooper from the Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan from the University of Wisconsin-Madison, and Didier Trono from the University of Geneva for reagents. This work is supported by a University of Houston startup fund (YL), American Heart Association grant (YL, 11SDG5260033), and the National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).

Materials

DMEM, high glucose Life Technologies 11965-084 for culture medium
Fetal Bovine Serum – Premium Atlanta Biologicals S11150 for culture medium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) Life Technologies 10378-016 for culture medium
Insulin from bovine pancreas Sigma Aldrich I6634-100MG for differentiation medium
equine serum Atlanta Biologicals S12150 for differentiation medium
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311  for transfection
G418 sulfate  Gold Biotechnology  G-418-10 for drug resistant selection
Puromycin dihydrochloride Sigma Aldrich sc-108071 for drug resistant selection
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well Life Technologies NP0323BOX for western blot
NuPAGE Transfer Buffer (20X) Life Technologies NP00061 for western blot
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) Life Technologies NP0002 for western blot
Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300mmx4m GE healthcare life science 10600015 for western blot
MF 20 Developmental Hybridoma Bank MF 20 primary Ab for immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate Thermo Fisher Scientific T-862 secondary Ab for immunostaining
One step qRT-PCR MasterMix AnaSpec 05-QPRT-032X for qRT-PCR
TriPure Isolation Reagent Roche 11667165001 for RNA isolation
CUG-BP1 Antibody (3B1) santa cruz sc-20003 primary Ab western blot
Actin Antibody santa cruz sc-1615 goat polyclonal IgG for loading control
293T Ecopack Clontech 631507 cells for retrovirus preparation
pMSCV-puro Clontech 634401 empty retroviral vector for retrovirus preparation
pMSCV-Celf1Flag-puro house-constructed not available retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation
psPAX2 gift from Didier Trono not available for lentivirus preparation
pMD2.G gift from Didier Trono not available for lentivirus preparation
GFP-CUG5 gift from M.S. Mahadevan not available details in reference 10 
GFP- CUG200 gift from M.S. Mahadevan not available details in reference 10 
Triton X-100 Sigma Aldrich X100 for immunostaining
paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 for immunostaining
TWEEN 20 Sigma Aldrich P9416 for immunostaining
DAPI Sigma Aldrich D9542 for immunostaining

References

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Cite This Article
Liang, R., Dong, W., Shen, X., Peng, X., Aceves, A. G., Liu, Y. Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells. J. Vis. Exp. (113), e54078, doi:10.3791/54078 (2016).

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