C2C12 근육 모세포의 세포에 근긴장 성 이영양증 1 모델링
Summary
이 프로토콜에서는, 우리는 최적화 된 C2C12 세포의 유지 보수, 유전자 형질 전환 / 전달 및 심근 분화를 포함한 근긴장 성 이영양증 1 근원 세포 모델을 설정하는 절차를 제시한다.
Abstract
근긴장 이상증 1 (DM1)는 근육 영양 장애의 일반적인 형태입니다. 여러 동물 모델이 DM1 설립되었지만 그들은 세포 및 분자 이벤트를 공부하기위한 효율적인 세포의 대안을 제공하기 때문에, 근원 세포 세포 모델은 여전히 중요하다. C2C12 근육 모세포의 세포가 광범위하게 유전자 형질 전환, 형질 도입 또는 바이러스에 근육 생성, 저항을 연구하는 데 사용되었다하더라도, C2C12 세포의 연구를 방해한다. 여기, 우리는 C2C12의 근육 아세포 및 심근 분화의 유도에 유전자를 도입하는 일상적인 유지 보수, 형질 전환 및 전달 절차를 포함하는 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 종합적으로, 이러한 절차는 최선의 형질 전환 / 전달 효율뿐만 아니라 일관성있는 차별화 된 성과를 가능하게한다. 근긴장 성 이영양증의 연구뿐만 아니라 다른 근육 질환에 유익 할 DM1 근육 모세포 셀 모델 확립에 기재된 프로토콜.
Introduction
근긴장 이상증 (DM)는 여러 시스템, 특히 심장과 골격 근육 (1)에 영향을 미치는 염색체 우성 질환이다. 이 질병, DM1과 DM2의 두 하위 유형이 있습니다. DM1 더 일반적이며 DM2 2보다 더 심한 표현이 있습니다. DM1 근본적인 유전 적 변이는 3 '비 번역 영역 DM 단백질 키나제 유전자 (DMPK) 3 (UTR)에있는 CUG 삼중 반복의 확장이다. 영향을받지 않는 개인의 CUG 반복 수는 대조적으로 (37)에 5,은 50 개 이상으로 증가하고, 때로는 최대 DM1 환자 4 천에 달라집니다. 그 결과, 같은 RNA 결합 단백질, muscleblind 형 1 (MBNL1) CUGBP 및 Elav 같은 가정 한 (Celf1) misregulated이다. 때문에 확장 된 CUG 반복에 격리에 MBNL1 대체 스 플라이 싱 (5)을 조절하는 능력을 잃게된다. Celf1 반면에, 6,7-을 조절한다. Celf1 과발현 근육 손실과 연관된MBNL1 기능의 손실에 기인되지 않고 약점. DMPK 3'-UTR CUG 확장, MBNL1 상실 및 과발현 Celf1 포함 DM1 관련 변화를 시뮬레이션 동물 모델이 수립되었다. 그러나, 근육 아세포에서 DM1을 모델링 특히 DM1 관련 세포 및 분자 이벤트를 해부에 대한 효율적인 대안을 제공합니다.
C2C12 근육 모세포 세포주 제 부상 C3H 마우스 근육 분리 널리 근육 조직 분화 8,9을 연구하기 위해 사용되었다. C2C12 세포는 급속 소 태아 혈청 (FBS)을 함유 미디어 증식 용이 FBS가 소모 될 때 분화를 겪는다. 그러나,이 근육 모세포 분화 모델을 사용하여 두 가지 과제를 제시한다 : C2C12 세포는 종종 유전자 형질 전환 / 바이러스 형질 도입에 대해 내성이고; 세포 처리 및 분화 과정에 약간의 차이는 myotube 형성에 표시된 변경 될 수 있습니다.
우리 연구실은 정기적으로 교류 등 C2C12의 근육 아세포를 사용엘 모델과 효과적으로 C2C12 세포주 (10)에 플라스미드 형질 전환, 레트로 바이러스 전달 및 렌티 바이러스 전달에 의해 유전자를 제공하는 프로토콜을 개발했다. 비디오에서 우리는 / 형질 C2C12 세포를 형질 도입 및 DM1의 근원 세포 모델을 확립 차별화 일관성을 유지하기위한 최적화 과정을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
C2C12 세포주 11-14 근육 생성을 연구 모델로서 이용되어왔다. 이러한 세포는 섬유 아세포와 같은 모양을 유지, 20 % 소 태아 혈청을 함유하는 배지에서 증식 신속 용이 2 % 말 혈청 (15)를 포함하는 배지에서 분화. 빠른 성장 및 분화는 근육 생성 세포 모델에서 유리한 특성이다. 여기서는 C2C12 세포 내로 cDNA의 3'-UTR, 및 shRNA를 소개하는 플라스미드, 레트로 바이러스 및 렌티 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Drs. Tom Cooper from the Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan from the University of Wisconsin-Madison, and Didier Trono from the University of Geneva for reagents. This work is supported by a University of Houston startup fund (YL), American Heart Association grant (YL, 11SDG5260033), and the National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).
Materials
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-084 | for culture medium |
| Fetal Bovine Serum – Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | for culture medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Life Technologies | 10378-016 | for culture medium |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I6634-100MG | for differentiation medium |
| equine serum | Atlanta Biologicals | S12150 | for differentiation medium |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | for transfection |
| G418 sulfate | Gold Biotechnology | G-418-10 | for drug resistant selection |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | sc-108071 | for drug resistant selection |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | for western blot |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Life Technologies | NP00061 | for western blot |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) | Life Technologies | NP0002 | for western blot |
| Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300mmx4m | GE healthcare life science | 10600015 | for western blot |
| MF 20 | Developmental Hybridoma Bank | MF 20 | primary Ab for immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secondary Ab for immunostaining |
| One step qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | for qRT-PCR |
| TriPure Isolation Reagent | Roche | 11667165001 | for RNA isolation |
| CUG-BP1 Antibody (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primary Ab western blot |
| Actin Antibody | santa cruz | sc-1615 | goat polyclonal IgG for loading control |
| 293T Ecopack | Clontech | 631507 | cells for retrovirus preparation |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | empty retroviral vector for retrovirus preparation |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | house-constructed | not available | retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation |
| psPAX2 | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| pMD2.G | gift from Didier Trono | not available | for lentivirus preparation |
| GFP-CUG5 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| GFP- CUG200 | gift from M.S. Mahadevan | not available | details in reference 10 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | for immunostaining |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | for immunostaining |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | for immunostaining |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | for immunostaining |
References
- Harper, P. S. . Myotonic dystrophy. 3rd edn. , (2001).
- Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
- Brook, J. D., et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3′ end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell. 68 (4), 799-808 (1992).
- Chau, A., Kalsotra, A. Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics. Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).
- Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).
- Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation. Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).
- Kalsotra, A., et al. The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression. Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
- Peng, X., et al. Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity. Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation. Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).
- Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model. Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).
- Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. (CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy. Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Dev Biol. 265 (2), 294-301 (2004).
- Emerson, C. P., Sweeney, H. L. . Methods in muscle biology. 52, (1997).
- Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).
- Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).
