Summary
Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) hanno la capacità intrinseca di differenziare e di auto-organizzarsi in schemi dei tessuti distinti; anche se questo richiede la presentazione di gradienti spaziali ambientali. Presentiamo stencil micropatterning come metodo semplice e robusto per generare gradienti biochimici e meccanici per controllare modelli differenziazione HPSC.
Introduction
Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs), comprese le cellule staminali embrionali (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs), sono ampiamente sfruttati in medicina rigenerativa, nonché la modellazione sperimentale di organogenesi normale e malati a causa del loro potenziale di differenziazione in linee cellulari di tutti tre strati germinali 1,2. I destini di differenziazione di hPSCs sono estremamente sensibili ai fattori ambientali locali in grado di modulare i processi meccanotrasduzione autocrini o paracrini segnalazione 1 e mediate da stimoli fisici 3-5. Cellulare micropatterning comprende un insieme di tecniche che sono state sviluppate per organizzare spazialmente la geometria e la posizione di una popolazione di cellule come un mezzo per controllare il microambiente cellulare locale, come le interazioni cellula-cellula 6 e interazioni cellula-matrice 3. Nel contesto di hPSCs, micropatterning cellulare è stato impiegato per ottenere informazioni importanti sul modo in cui nicchia dipendeent segnalazione autocrina modula hESC pluripotenza decisioni-differenziazione 7 e organizzazione in primi modelli di differenziazione embrionali 6. 2D e 3D hPSCs micropatterned sono stati utilizzati per controllare la dimensione delle colonie di modelli multicellulari, che a sua volta influenzato decisioni differenziazione nei tre strati germinali 8,9. Abbiamo impiegato multicellulari microdisegni HPSC di modulare la portata di cellula-cellula e cellula-matrice interazioni all'interno di una colonia HPSC per sondare come integrina-E-caderina crosstalk può dare origine a destino cellulare eterogeneità 10. Le manifestazioni delle suddette relazioni aprire nuove strade verso l'applicazione di microdisegni multicellulari di hPSCs come modelli sperimentali per lo screening tossicità dei farmaci per le malattie dello sviluppo 11, per studiare l'effetto di fattori di crescita e ormoni durante tessuti o lo sviluppo degli organi, e per svelare la formazione di modelli tessuti.
Una miriade di cellule micropattertecniche ning sono stati sviluppati come recensito da Falconnet et. al. 12, ma solo una manciata, come il micro-contatto stampa 7,8,13, cultura micropozzetti 14,15, photopatterning 6 e microstencils 16 sono state implementate con successo con hPSCs. La sfida con hPSCs micropatterning risiede nella loro vulnerabilità e un requisito stringente di matrici specifiche extracellulare (ECM) e condizioni di crescita per il fissaggio e la sopravvivenza cellulare. Per i modelli 2D HPSC, stampa micro-contatto è uno dei metodi più comuni per generare microdisegni HPSC per la cultura dei tessuti e del vetro substrati 13. Il metodo può essere utilizzato per modello ECM comune utilizzato in coltura HPSC, compresi laminina e membrana basale matrici, come Matrigel. Tuttavia, esso richiede in genere un processo di rivestimento in due fasi aiutati da poli-D-lisina, e ha bisogno di particolari condizioni atmosferiche e di umidità inerti per rendere microdisegni ECM stabili per hPSCs di allegare a 6,13. La più importante considerazione di ciascun metodo micropatterning è se il regime di modifica della superficie in grado di generare modelli di ECM HPSC-adesivo alla risoluzione geometrica desiderata, riducendo al minimo l'adesione cellulare non specifica alle aree circostanti.
Qui, si segnala l'uso di stencil micropatterning come un metodo semplice per generare microdisegni HPSC senza ulteriori passaggi la modifica della superficie prima della generazione di modelli ECM adesivi per hPSCs per fissare su. La cella comprende stencil di una sottile membrana, foglio per esempio, polidimetilsilossano (PDMS), con Micron per millimetriche dimensioni fori passanti sigillati su un substrato di coltura cellulare per contenere fisicamente rivestimenti ECM e hPSCs successivamente seminate. Come stencil patterning agisce trattenendo fisicamente la posizione in cui HPSC può accedere e collegare direttamente al substrato sottostante ECM rivestite, questo metodo è compatibile con vari substrati che possono sostenere culture HPSC. Gli unici requirement è che la scelta del materiale matrice può formare una tenuta reversibile con il substrato. Tali substrati comprendono convenzionale polistirene coltura tissutale (TCPS) 17, substrati coniugati ligando 18, così come substrati elastomerici rigidità sintonizzabile (ad es., PDMS) 19. Questo metodo permette anche di rivestimento di diversi ECM, come ad esempio vitronectina (o proteine VTN), laminina e matrici membrana basale (ad esempio, Matrigel e Geltrax) per consentire il corretto fissaggio e la differenziazione di hPSCs. Pertanto, siamo in grado di trasferire ottimizzati configurazioni ECM-substrato per una specifica linea di HPSC a stencil micropatterning per ottimale cellula-matrice di adesione, la sopravvivenza e la differenziazione. Recentemente, un metodo simile è stato anche segnalato per dirigere la differenziazione epatica da hESC micropatterning utilizzando poli (metacrilato di metile) (PMMA) matrici di micro-stencil 16.
stencil cellulari possono essere fabbricate con materiali diversi, tra cui incontratials 20,21, poli (p-xililene) polimeri 22,23, PMMA 16 e più comunemente, PDMS 24-28. Silicone e poli (p-xililenici) polimeri stencil richiedono incisione diretta dei fori passanti con attrezzature specializzate 20-23, che limita la loro accessibilità agli utenti biologici. PDMS stencil possono essere fabbricati con metodi diversi a seconda della dimensione del tratto richiesto, che varia tipicamente da 3 micron a 2000 micron 11,26-29. Se piccole caratteristiche si desiderano, fogli Stenciling sottili possono essere prodotti da stampa stampaggio PDMS pre-polimero su un modello di silicio microfabbricazione contenente rilievi dei microdisegni 28. Per le caratteristiche> 1.000 micron, un taglio laser CO 2 fornisce un metodo semplice e di basso costo per tagliare direttamente i modelli su un foglio pre-fuso PDMS durante stencil fabbricazione. La riciclabilità dei stencil PDMS li rende anche conveniente per condurre una serie di esperimenti con sufficiente coerenza.
10.
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Protocol
NOTA: Questo protocollo descrive la fabbricazione di PDMS stencil con 1.000 micron modelli di taglio laser e micropatterning della linea hESC, H9 con lo stencil PDMS.
1. progettazione e fabbricazione di PDMS Stencil per micropatterning
- Progettare il foglio di stencil con fori passanti della geometria desiderata e le dimensioni (ad esempio, 1.000 micron cerchi) e la guarnizione stencil utilizzando il computer-aided software di progettazione 10.
- Laser-tagliare il foglio di stencil e la guarnizione sul 120-150 micron e 2 mm di spessore polidimetilsilossano (PDMS) fogli rispettivamente con un laser CO 2-cutter 10.
- Incollare la guarnizione PDMS con il foglio di stencil PDMS utilizzando PDMS TDS liquidi e cuocere in forno a 60 ° C per 3-4 ore per ottenere lo stencil PDMS per micropatterning.
- Sterilizzare il stencil PDMS in autoclave a 120 ° C per 30 min ed essiccamento in forno prima dell'uso.
2. hESC principalemanutenzione
- Cultura le linee di hESC in un mezzo di manutenzione senza alimentatore su 1 × membrana basale matrice rivestito piastre di coltura di cellule hESC-qualificato a 37 ° C e 5% di CO 2.
- Passaggio le hESC quando sono circa il 70% confluenti per 3 min di incubazione a 37 ° C con dispasi trattamento e dissociare meccanicamente le colonie hESC in 100-200 micron grumi. Piastra le ciuffi hESCs ad una densità di 30-50 ciuffi per 9,6 centimetri 2 di superficie crescita su membrana basale matrice rivestite tessuto coltura polistirene in rapporto 1: 6 splitting.
3. Stencil micropatterning di cellule staminali embrionali umane
- Preparazione prima cella patterning
- Sigillare uno stencil PDMS su una capsula di Petri 60 millimetri per l'erogazione di 700 ml al 70% di etanolo grado analitico in acqua ultrapura nella capsula di Petri e mettendo lo stencil sulla parte superiore.
- Porre la capsula di Petri all'interno dell'armadio biosicurezza durante la notte per lasciare tegli etanolo anidro.
- Vedi esiste nessuna bolla sotto lo stampino per garantire che il stencil forma una buona tenuta con la piastra di Petri. Questo impedisce le fughe di soluzione di rivestimento ECM. Sigillare la piastra di Petri e conservare in condizioni sterili finché è pronto per la semina cellulare.
- Preparare aliquote di matrice membrana basale hESC qualificato secondo il certificato di analisi. Assicurarsi che ogni rendimenti aliquote 1 × soluzione matrice membrana basale hESC qualificato quando diluito in 25 ml di Modified Eagle Medium di Dulbecco: Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12) in base alla scheda prodotto del produttore.
- Preparare la soluzione di rivestimento ECM con l'aggiunta di una aliquota di matrice membrana basale hESC-qualificato in 16,7 ml di DMEM / F12 per fare 1,5 × soluzione matrice membrana basale hESC-qualificato. Tenere tutte le soluzione di rivestimento ECM sul ghiaccio per evitare la gelificazione.
- Supplemento hESC terreno di mantenimento con 10 inibitore ROCK micron (Y27632).
- Trattare la piastra di Petri con 100 WO 2 plasma per 90 sec. Per garantire la sterilità, solo aprire il coperchio capsula di Petri all'interno della camera di plasma prima del trattamento al plasma, e rapidamente coprire di nuovo la piastra di Petri dopo il completamento del trattamento. Questo facilita bagnatura superficiale e previene la formazione di bolle d'aria nella micropattern fori passanti durante l'aggiunta della soluzione di rivestimento ECM.
- Aggiungere 450 ml di 1,5 × soluzione matrice membrana basale hESC qualificato per coprire l'intera stencil. Sigillare la piastra di Petri con pellicola di auto-saldabile, ad esempio Parafilm, per evitare che la soluzione si secchi, e incubare per 5 ore a 37 ° C prima dell'uso.
- HESC semina sul substrato stenciled
- Esaminare le colonie hESC in 6 pozzetti per identificare le aree di cellule differenziate che mostrano la perdita della tipica morfologia hESC (ad esempio, la perdita di arrotondata, strettamente Packed morfologia epiteliale, alto rapporto / citoplasma nucleo con nucleoli prominenti). Rimuovere le regioni differenziate con un aspiratore.
- Lavare due volte con 2 ml DMEM / F12 per pozzetto.
- Aggiungere 1 ml di enzimi digestivi, come Accutase, per pozzetto della piastra da 6 pozzetti e incubare a 37 ° C per 8 min. Toccare la piastra delicatamente per staccare tutte le colonie dal substrato.
- Lavare ogni pozzetto con almeno 4 ml di DMEM / F12 per 1 ml di enzimi digestivi e raccogliere la sospensione cellulare in tubo da 15 ml.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 200 xg per 3 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare per rimuovere il surnatante e aggiungere 400 ml di media hESC manutenzione integrato con inibitore ROCK (Rocki) per risospendere le cellule. Pipetta la sospensione cellulare su e giù per 3 volte delicatamente per rompere grumi nelle singole cellule.
- Mescolare il singolo pozzo sospensione cellulare e diluire 10 ml di campioni di cellule in 190 ml di DMEM / F12 (1:20 diluizione). Utilizzare un hemocytometer per determinare la densità delle cellule in sospensione magazzino cellulare.
- Calcolare la densità di semina cellulare richiesto per un determinato stencil.
NOTA: Per esempio, abbiamo sperimentalmente determinato la densità di semina cellulare di ottenere un monostrato confluente di singole cellule è di circa 4.444 cellule / mm 2. Così, uno stencil con una superficie di 450 mm 2 e il volume semina di 400 microlitri richiederà una sospensione cellulare di essere a una densità di 2 milioni di cellule / 400 microlitri. - Diluire la sospensione della cella alla densità di semina desiderata (vedi punto 3.3.8 NOTA) con terreno di coltura hESC integrato con Rocki.
- Aggiungere un volume designato di sospensione cellulare contenente il numero di celle in ciascun stencil e lasciare la piastra di Petri indisturbato in cappuccio per 5 min a temperatura ambiente per permettere alle cellule di stabilirsi.
- Trasferire la piastra di Petri in incubatore e incubare per 1 ora per consentire l'adesione delle cellule. Fare attenzione a mantenere il livello capsula di Petri durante latrasferire processo in modo che le cellule rimangono come un monostrato nello stencil.
- Rimozione Stencil e passivazione del substrato nanostrutturata
- Esaminare la piastra di Petri al microscopio per verificare se le cellule siano fissati correttamente sul substrato sottostante.
- Aspirare via sospensione cellulare dallo stencil.
- Aggiungere 2 ml / piatto di coltura cellulare 0,5% di tensioattivo non ionico compatibili in DMEM / F12 alla zona circostante stencil.
- Utilizzare un paio di pinze in autoclave a buccia delicatamente lo stencil. Agitare la soluzione tensioattivo non ionico intorno come lo stencil è staccata per evitare che le cellule si secchi. Visivamente osservare le micropatterned cellule nella capsula di Petri.
- Incubare le micropatterned cellule in soluzione di tensioattivo-DMEM / F12 non ionico 0,5% per 10 min a 37 ° C.
- Aspirare via il tensioattivo-DMEM soluzione / F12 non ionico. Lavare 3 volte con 2 ml / piatto di DMEM / F12.
- Aggiungere 2 ml / piatto di hESCterreno di mantenimento integrato con Rocki e incubare a 37 ° C durante la notte.
- Dopo incubazione per una notte, aspirare hESC terreno di mantenimento supplementato con rocki, lavare una volta con DMEM / F12 e indurre differenziazione mesoendoderm aggiungendo 2 ml / piatto di terreno di differenziamento supplementato con 100 ng / ml Activin, 25 ng / ml BMP4 e 10 ng / FGF2 ml .
- Valutare le microdisegni utilizzando l'imaging a contrasto di fase e calcolare i profili di intensità media Brachyury (T) per ogni modello come descritto in precedenza 8.
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Representative Results
In questo articolo, descriviamo la fabbricazione di uno stencil cella utilizzando una taglierina laser per generare 1.000 micron caratteristiche. La matrice è composta da 2 parti: un sottile foglio stencil (circa 100-200 micron di spessore), contenente la micropattern fori passanti, ed una guarnizione PDMS a contenere la soluzione di rivestimento ECM o sospensione cellulare. Qui, 127 micron e 2 mm di spessore fogli PDMS disponibili in commercio sono stati usati come foglio stencil e la guarnizione rispettivamente. Altri metodi per la preparazione di lastre PDMS spessore controllabile, come spin-coating, possono anche essere utilizzati per fabbricare le parti. I due componenti sono stati uniti insieme mediante miscela liquida polimerizzato PDMS prepolimero-reticolante come incollaggio o plasma, e cotti a 60 ° C per 3-4 ore (Fig. 1).
Il materiale per il foglio stencil è stato scelto sulla base della scelta della coltura cellulare substrate. Quando si utilizza convenzionale polistirene coltura tissutale (TCPS) come substrato coltura, stencil PDMS possono essere utilizzati in quanto la conformità del foglio stencil PDMS formeranno una buona tenuta con la rigida TCPS (E ~ 3 GPa) (Fig. 2A). In disegni sperimentali in cui si vogliono studiare l'eterogeneità spaziale del destino delle cellule staminali su substrati di coltura cellulare più morbide, come PDMS supporti elastomerici con una gamma rigidità sintonizzabile 5 kPa a 2 MPa 30, materiali Stenciling più rigidi possono essere impiegati. Come esempio, abbiamo dimostrato l'utilizzo di un polietilene tereftalato (PET) stencil (E ~ 2 GPa) per generare 1 mm colonie HPSC micropatterned su morbida substrato PDMS avente una rigidità di ~ 5 kPa (Fig. 2B). Lo stencil PET è stato fabbricato incollando una guarnizione PDMS su un foglio stencil fatto di film in PET disponibili in commercio (Fig. 2B, nel riquadro). Notiamo che il tempo di adesione cellulare richiesto durante la micropatterningprocesso era più lungo (~ 3 ore) sulla PDMS morbide substrato della rigidità ~ 5 kPa rispetto ai substrati TCP convenzionali.
Abbiamo utilizzato stencil micropatterned colonie hESC per dimostrare che l'eterogeneità spaziale di adesione cellulare forze meccaniche mediate poteva modello precoce mesoendoderm differenziazione. Abbiamo precedentemente dimostrato che H9 hESC alla periferia colonia sperimentato adesioni integrine superiori rispetto alle cellule l'interno colonia, che ha provocato la loro differenziazione preferenziale in Brachyury (T), le cellule mesoendoderm -positive quando indotta con Activin, BMP4 e FGF2 31 (Fig. 3A ). Quando le cellule sono state modellate in diverse geometrie (cerchio, quadrato, rettangolo e arco semicircolare) in una zona di colonia costante, anisotropia geometrica agli angoli di quadrati, rettangoli e curvature convesse portato ad una concentrazione locale di forze di trazione integrine mediata e ha portato a una maggiore mesoendoderm differenziazione 32,33. Infatti, mappatura intensità dell'espressione T a diverse frazioni all'interno di una singola colonia, abbiamo scoperto che la portata dell'induzione mesoendoderm era maggiore nei spigoli di colonie quadrata e rettangolare (Fig. 3B) e curvature convesse di un arco semicircolare (Fig . 3C), che corrispondeva alle regioni di stress integrine-mediata elevate riportate in una geometria anisotropico 32,33. Pertanto, micropatterning può essere utilizzato per modulare la distribuzione spaziale di adesione cellulare forze meccaniche mediati entro una colonia HPSC intatto come un mezzo per controllare il processo di differenziazione conseguente.
Figura 1. Generazione di PDMS stencil per micropatterning. (A) Schema che rappresenta le fasi critiche stencil fabbricazione. Un foglio di 127 micron di spessore PDMS è stata laser-tagliato per produrre i modelli progettati, e un altro di 2 mm di spessore foglio PDMS è stato tagliato al laser per produrre la guarnizione. Questi due componenti sono stati legati insieme con PDMS non polimerizzato per assemblare lo stencil. (B) che mostra il montaggio dei componenti in modo da formare uno stencil PDMS con 1 millimetro circolare attraverso i fori. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. colonie micropatterned hESC (1.000 micron cerchi) su diversi substrati di coltura. Immagini microscopiche di hESC colonia micropattern subito dopo la rimozione di (A) PDMS stencil (riquadro) utilizzati per generare microdisegni hESC su substrati rigidi, per esempio, TCPS di rigidità ~ 2 GPa, e (B) stencil PET (inserto) Utilizzato per generare microdisegni su substrati più morbidi, per esempio, PDMS di rigidità ~ 5 kPa. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Effetto delle hESC microdisegni di diverse forme geometriche sulla loro differenziazione mesoendoderm 8. (A) microdisegni hESC di diverse forme geometriche, ma stessa area colonia sono stati generati utilizzando PDMS stencil. Immagini di fase (pannello superiore) e le mappe di intensità di espressione T (pannello inferiore) dopo 24 ore di differenziazione mesoendoderm. (B) Profili di intensità media T (insieme bianche linee tratteggiate in (A)) in colonie circolari isometriche o quadrato anisometric e colonie rettangolari . Tutte le colonie avevano la stessa area ex concetto cerchio 50%, che aveva la metà della superficie colonia. (C) profili di intensità media T dal concavo o bordi convessi verso l'interno colonia in un arco semicircolare, come indicato dalle linee tratteggiate bianche in (A). Ogni profilo di intensità in (BC) è una media di 16 profili di intensità ottenuto da 4 colonie. Le immagini vengono nuovamente stampate con il permesso di Toh et. al., 8. Scala bar = 200 micron e RFU è l'unità relativa a fluorescenza. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Rappresentazione schematica del flusso di lavoro per micropattern colonie hESC e indurre il differenziamento. Passaggi chiave per il successo della generazione di microdisegni hESC sono evidenziati in scatole grigie..com / files / ftp_upload / 54097 / 54097fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Fabbricazione di stencil micropatterning
micropatterning Stencil fornisce un metodo ideale per generare microdisegni HPSC per indagare nicchia mediata differenziazione patterning. Il vantaggio principale di stencil patterning rispetto ad altre tecniche micropatterning, come la stampa microcontact e photopatterning, è che non richiede la modifica della superficie e può essere implementato su supporti TCP convenzionali. Pertanto, terreni di coltura ottimizzati e rivestimenti ECM per le diverse linee di HPSC possono essere facilmente trasferiti a stencil micropatterning.
Ci sono un certo numero di passi chiave durante la fabbricazione della matrice cellulare che contribuiscono alla generazione di buoni microdisegni. La fedeltà di riprodurre le geometrie disegnate nei microdisegni HPSC dipende dalla qualità e la coerenza della fabbricazione foro passante nel foglio stencil. Per gli studi che coinvolgono micropat multicellulareterne di> 1,000 micron, i fori passanti possono direttamente essere fabbricati mediante taglio laser su un foglio pre-fuso PDMS. La risoluzione del taglio laser dipende dalla dimensione del punto del fascio laser e la precisione della fase meccanica controlla il percorso del fascio laser. Per frese CO 2 laser tradizionali, abbiamo scoperto che esso può produrre caratteristiche circolari o curve con buona fedeltà, ma non geometrie con spigoli vivi (ad es., Quadrato). Nelle applicazioni in cui si desiderano caratteristiche piccole o taglienti, i fori passanti nel foglio stencil può essere fabbricato per stampaggio PDMS su un modello di silicio microfabbricazione contenente rilievi delle microdisegni 28. La sfida del metodo di stampaggio è produrre micro-size fori passanti nel sottili fogli PDMS senza PDMS residui sui rilievi del modello di silicio. Diverse strategie sono state sviluppate per risolvere questo problema, come descritto da Li et. al. 28
Durante l'astaggio del foglio di stencil e la guarnizione per produrre la matrice cellulare, si dovrebbe assicurare che il foglio di stencil è piatto e privo di polvere durante il processo di incollaggio, al fine di evitare fughe dalla stencil. Tali irregolarità del foglio stencil durante il processo di incollaggio può compromettere la tenuta della matrice al substrato coltura, causando soluzioni ECM e cellule di perdite di liquido dal micropattern fori passanti. La matrice deve essere sterilizzato in autoclave (120 ° C, 30 min) e viene asciugato in un forno per assicurare che possa formare una buona tenuta con il substrato coltura.
Un altro fattore importante è la selezione del materiale in foglio stencil. Lo stencil PDMS è ideale per hPSCs micropatterning su substrati di coltura rigidi, come ad esempio TCPS con rigidità di ~ 2 GPa. Tuttavia, se si vuole micropattern hPSCs su substrati più morbidi, come il PDMS substrati comunemente usati per substrato cellulare sintonizzare rigidità 34, la conformità di un PDMSfoglio di stencil renderà difficile staccare lo stencil dopo il processo di semina delle cellule, distruggendo quindi le microdisegni HPSC. In questo caso, la scelta del materiale per il foglio stencil della matrice deve essere tale da poter formare un sigillo con il substrato cultura, ma può essere staccata con facilità.
Microdisegni Generazione HPSC
Il protocollo per micropatterning H9 hESC su substrati TCP utilizzando uno stampino PDMS qui presentata è stata ottimizzata per ottenere una colonia confluente con buona vitalità delle cellule ed il modello di fedeltà. È essenziale che le hPSCs forma corretta interazioni cellula-cellula e cellula-matrice all'interno del confinamento spaziale di una particolare geometria definita dalle microdisegni modo che si può studiare come fattori geometrici dipendenti influenzano sorti differenziazione. Abbiamo identificato alcuni passaggi critici per generare con successo microdisegni HPSC (Fig. 4)e sono discussi come segue.
In primo luogo, la qualità della cultura HPSC conta. È importante raccogliere le colonie HPSC a 70-80% di confluenza, a maggioranza di colonie che mostrano indifferenziata morfologia HPSC durante la rimozione delle aree differenziate. Over-confluenti culture HPSC solito causano differenziazione spontanea, e se le aree differenziate non vengono rimossi prima della semina delle cellule, le cellule differenziate interferiscono con il normale formazione di pattern di differenziazione.
In secondo luogo, quando la raccolta colonie HPSC alla sospensione singola cella, evitando un eccesso di trattamento con enzimi digestivi è fondamentale perché questo si traduce spesso nella morte delle cellule dopo incubazione durante la notte, anche se le cellule possono collegare inizialmente. Abbiamo scoperto che 8 minuti di trattamento enzimatico è ottimale per la linea H9 hESC coltivate nel nostro laboratorio; anche se è consigliabile che il tempo di trattamento il distacco delle cellule dovrebbe essere ottimizzato separatamente per diverse linee cellulari.
Infine, vi è la necessità per passivare substrato circostante le microdisegni HPSC con molecole adesive non-cellula per limitare proliferanti o differenziazione delle cellule entro il micropattern. Ciò è essenziale per mantenere la fedeltà del micropattern HPSC, ea sua volta, il gradiente ambientale biochimica e meccanica per modelli differenziazione sviluppare. coltura cellulare tensioattivi non ionici compatibili, come Pluronic F-127 può essere utilizzato come agente passivante. Quando si passivante con tensioattivi, il tempo di trattamento e la concentrazione devono essere ottimizzati a causa della citotossicità di tensioattivo a lunga esposizione. Come abbiamo discusso in precedenza, il protocollo presentato fornisce una guida dettagliata per micropattern hPSCs utilizzando uno stampino PDMS, ma l'ottimizzazione di questo protocollo, in particolare per le fasi critiche di cui sopra, è invitato a Successfully generare microdisegni HPSC.
Una limitazione di stencil micropatterning è che è più adatto per la generazione microdisegni superiori che vanno da 100-1,500 micron. Per generare molto piccole caratteristiche destinate alla singola patterning cella, la fabbricazione di fogli stencil con <50 micron attraverso fori passanti è molto impegnativo come accennato in precedenza. Quindi, ci aspettiamo che l'uso di stencil hPSCs micropatterned si adatta bene a indagare formazione di pattern dei tessuti multicellulare durante i diversi processi di sviluppo (ad esempio, pieghevoli neuroepitelio o endoderma patterning).
Utilizzando micropatterning confinare geometricamente una popolazione HPSC, possiamo stabilire cellulo-mediata adesione meccanici 10 e paracrini gradienti di segnalazione 6 per controllare e comprendere l'organizzazione spaziale dei destini di differenziazione risultanti. Questi modelli HPSC micropatterned con differentiatio spazialmente organizzaton può a sua volta essere tradotto in malattia o di screening teratogeno modelli specifici umani 11 per difetti di nascita congeniti.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è sostenuto da NUS Messa in concessione (R-397-000-192-133) e ETPL Fondo Gap (R-397-000-198-592). GS è uno studioso NUS di ricerca. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Jiangwa Xing per il suo supporto tecnico micropatterning cellulare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.005 | Used to form reservoir for stencil |
| 120-150 μm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.040 | Used to form stencil |
| 60 mm Petri dish | Nunc Nunclon Delta | 150326 | Substrate for micropatterning |
| Accutase | Accutase, Merck Millipore, Singapore | SCR005 | Enzyme to break H9 cells into single cells |
| Activin | R&D Systems, Singapore | 338-AC-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| BMP4 | R&D Systems, Singapore | 338-BP-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| Plasma system | Femto Science, Korea | CUTE-MP | For plasma oxidation of stencil |
| Dispase | StemCell™ Technologies, Singapore | 7923 | Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging |
| DMEM/F12 | GIBCO, USA | 11330032 | Basal medium for H9 cells |
| FGF2 | R&D Systems, Singapore | 233–FB–025 | Growth factor for H9 differentiation |
| H9 cell line | WiCell Research Institute, Inc., USA | WA09 | Human embryonic stem cells |
| hESC-qualified basement membrane matrix | Matrigel, BD Biosciences, Singapore | 354277 | Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Singapore | DMi1 | For capturing bright-field images |
| Laser cutter | Epilog Helix 24 Laser System | Used to generate through holes in PDMS sheet | |
| mTeSR™1 medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5850 | Maintainence medium for H9 cells |
| PDMS | SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA | 3097358-1004 | Used for sticking the PDMS stencil and reservior |
| ROCKi Y27632 | Calbiochem, Merck Millipore, Singapore | 688000 | Maintains H9 cells as single cells |
| STEMdiff™ APEL™ medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5210 | Differentiation medium for H9 cells |
| Polyethylene terephthalate film | SureMark Singapore | SQ-6633 | Used to form stencil |
| Cell culture compatible non-ionic surfactant | Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore | P2443 | Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates |
References
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