Hjärtinfarkt i neonatala möss, en modell av Cardiac Regeneration

Summary

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

Abstract

Hjärtinfarkt inducerad av kransartärligering har använts i många djurmodeller som ett verktyg för att studera mekanismerna för hjärt reparation och förnyelse, och att definiera nya mål för läkemedel. Under årtionden, modeller av total hjärta förnyelse fanns i amfibier och fiskar, men en däggdjurs motsvarighet var inte tillgänglig. Den senaste upptäckten av en postnatal fönster under vilket möss har regenerativa kapacitet har lett till inrättandet av en däggdjursmodell av hjärt förnyelse. En kirurgisk modell av däggdjur hjärt förnyelse i neonatal mus presenteras häri. I korthet är postnatal dag 1 (P1) möss bedövades genom isofluran och placerades på en is pad för att inducera hypotermi. Efter det att bröstkorgen öppnas, och den vänstra främre nedåtgående kransartären (LAD) visualiseras, är en sutur placeras runt LAD att orsaka myokardischemi i den vänstra ventrikeln. Det kirurgiska ingreppet tar 10-15 min. Visualisera kransartären äravgörande för noggrann sutur placering och reproducerbarhet. Hjärtinfarkt och hjärtdysfunktion bekräftas av trifenyl-tetrazoliumklorid (TTC) färgning och ekokardiografi, respektive. Fullständig regenerering 21 dagar efter hjärtinfarkt verifieras genom histologi. Detta protokoll kan användas för att som ett verktyg för att klarlägga mekanismerna för däggdjur hjärt regeneration efter hjärtinfarkt.

Introduction

Hjärtinfarkt (MI) är en ledande dödsorsaken i världen, och förblir ansvarig för omkring en tredjedel av hjärtsvikt fall ^1. Medan tillkomsten av perkutan intervention och kontinuerlig optimering av användningen av trombolytika har ökat reperfusion efter Ml, cardiomyocyte död och förlust av kontraktila hjärtmuskeln ändå sker. Det finns också fortfarande ett stort antal "no-alternativ" patienter som inte är kandidater för eller inte ser nytta av dessa åtgärder. Dessa patienter fortsätter att uppleva handikapp ischemi leder till ärrbildning och skadlig kammar ombyggnad som en mekanism för infarkt healing. Denna process resulterar i slutändan i hjärtsvikt, där prognosen är fortfarande dålig, trots optimal farmakologisk hantering med angiotensin-converting enzyme (ACE) hämmare och betablockerare. Tyvärr förblir ettårsdödligheten för patienter med kraftigt nedsatt vänsterkammarfunktion fortfarande likahög som 26% ^2. Hjärttransplantation är den sista behandlingsalternativ för patienter med hjärtsvikt. Men den begränsade donatorpoolen för hjärttransplantation inte göra detta ett hållbart alternativ för de flesta patienter. Således, upptäckten av nya terapeutiska medel för att återställa den skadade hjärtmuskeln förblir ytterst viktigt att lösa hjärtsjukdom orsakad sjukdom. Tillförlitliga djurmodeller av hjärtskada Därför krävs som en viktig komponent i denna process.

Traditionella dogm har dikterat att vuxna cardiomyocytes är post-mitotiska, terminalt differentierade celler, oförmögna att dela eller de-differentiering för att ersätta den skadade hjärtmuskeln ^3. Som sådan, kan en vuxen hjärta däggdjur aldrig helt återhämta sig från skador, och förlorade kardiomyocyter skulle ersättas med fibrös vävnad. Således har forskningen främst inriktad på terapeutiska medel för att minimera infarkt expansion och minska ärrbildning. På senare tid har dock ett paradigmskifte inträffati tänkandet kring hjärt läkning och många forskningsinsatser har omdirigerats att fokusera på risken för hjärt regenere ^4.

Tills nyligen var in vivo-studie av hjärt förnyelse begränsad till ryggradslösa modeller, såsom de i urodele amfibier och teleost fisk ^5-7. Emellertid har upptäckten av kapaciteten för hjärt förnyelse i neonatal mus ledde till utvecklingen av två kirurgiska modeller av däggdjurs hjärt förnyelse: resektion av hjärt spetsen och kranskärls ocklusion för att inducera hjärtinfarkt ^8,9. Under 2011 genomfördes en mus spets resektion modell som används för att visa att hela hjärtregenerering är möjlig postnatal dag 1 (P1). Emellertid avböjer denna kapacitet snabbt efter den inledande neonatalperioden. Däggdjurs hjärta förlorar sin regenerativ potential strax efter födseln på P7 som nummer progenitorceller nedgång, och kardiomyocyter blir binucleated, förlorarderas proliferativa kompetens och permanent avsluta cellcykeln ^10,11. Att förstå de grundläggande skillnaderna mellan den neonatala och vuxna hjärta däggdjur kan leda till nya insikter i hjärt förnyelse.

Medan spetsen resektion erbjuder verkligen en inblick i återväxt av kontraktil vävnad blir modellen inte simulera typiska mänskliga hjärtskada, och därför inte lämpar sig såväl för utvecklingen av läkemedel. Kransartären ocklusion modell, dock simulerar mer direkt de patofysiologiska aspekter av MI patologi, och därmed kan ge mer användbara insikter i mekanismer som kan vara tillämpliga på terapeutiska framsteg för humant bruk.

Kirurgisk koronarligation har använts som en användbar experimentell teknik i många djurmodeller ^12-14. I vuxen kransartärligering modell djuren bedövas och intuberades för att kunna öppna brösthålan bibehållen respiratipå. Hjärtat fortsätter att slå regelbundet, vilket möjliggör visualisering av kranskärlen och möjliggör noggrann sutur placering. Dessutom förblir hjärt rosa som perfusion fortsätter och efter ligering den ischemiska hjärtmuskeln verkar blek, vilket indikerar framgångsrik kransartärligering. Det protokoll som beskrivits för neonatala möss, dock är mindre tillförlitligt som kransartären inte visualiseras och kirurgen måste uppskatta var att placera suturen ^15. Även om den allmänna anatomin hos kranskärlen är densamma, individuellt djur variabilitet i riktning och förgrening av LAD existerar ^16. Så när "gå i blind" artären kunde lätt missas. Andra tekniker såsom ekokardiografi därefter krävs för att bekräfta framgångsrik induktion av MI, och att se till att alla operationer resulterar i en liknande infarktstorlek. Beskrivs här är en förbättring jämfört med en nyligen publicerad metod ^15, där positionen av LAD kan etarade och således LAD kan ligeras att reproducerbart inducera Ml.

Denna teknik kräver inte endotrakeal intubation eller mekanisk ventilation, som torakotomi i en hypotermiska tillstånd i den neonatala musen inte resulterar i lungkollaps. Men i den tidigare beskrivna metoden, svår hypotermi måste induceras till punkten för både komplett apné och upphörande av hjärtrytmen ^15. Den huvudsakliga begränsningen av detta tillvägagångssätt är att kransartären inte längre perfusion och hjärtat verkar blek även innan LAD-ligering. I den strategi som beskrivs häri, är kranskärls visualisering möjligt vid en punkt i dvala innan djup hypotermi och hjärtrytmen upphörande, med full återhämtning av den neonatala musen efter operationen. Denna metod erbjuder en stor fördel med 100% reproducerbarhet.

Protocol

Häckande par av C57BL / 6 och CD-1 IG-S-möss köptes från Charles River. Djur som används i denna studie hanterades i enlighet med riktlinjerna från det kanadensiska rådet om Animal Care och studieprotokoll godkändes av Animal Använd underutskottet vid Western University, London, Kanada. 1. Djurvård Efter födelseprocess är klar och valparna har varit initialt ammas av sin mor för några timmar, placera dem i en annan bur med en CD-1 fostermor. CD-1 mödrar uppvisa en l…

Representative Results

Hjärtinfarkt förfarande vid P1 kan fyllas i 10-15 minuter och har en dödlighet på 7,8% (5 av 64 valpar). Efter operation, möss återhämta sig från hypotermiska anestesi inom de närmaste 5 – 20 min (tid för återhämtning beror på kroppstemperaturen uppnås under anestesi och hastighet kirurg). Vid användning av P7 pups (för jämförelse med en icke-regenerativ myokardium), är en längre period av kylning krävs för att nå dvala. P7 valpar är mycket större och har svårar…

Discussion

Den kirurgiska LAD ligation visas häri är en tillförlitlig metod för att producera MI i neonatala möss. Denna modell ger forskare med en reproducerbar modell med att studera däggdjurs hjärta förnyelse. Visualisering av kranskärlen är en viktig del av denna metod säkerställer korrekt sutur placering och därmed garantera reproducerbarhet. Medan vuxna möss inte har växelvarma kapacitet, är kroppstemperaturen och metabolisk hastighet av neonatala möss nära förknippade med omgivningstemperatur. Dessutom de…

Materials

8-0 Nylon Suture	Microsurgery Instruments	8-0 Nylon
11-0 Nylon Suture	Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd	H1101
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-09
Small forceps	Fine Science Tools	11063-07
Micro Needle Holder	Fine Science Tools	12060-02
Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope	Zeiss	300002
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Isoflurane Chamber	Made in Feng laboratory
Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC)	Sigma	T8877
Stereomicroscope SteREO Discovery. V8	Zeiss	435400
AxioVision 8.0	Zeiss
Axiocam Icc5	Zeiss	426554
Heat pad	Sunbeam	731A0-CN
Sterile Gloves	VWR	414004-430
Gauze Sponges	Ducare	90212
Ice