Protocol
Alle experimenten met Xenopus laevis kikkervisjes werden uitgevoerd volgens de door de Universiteit van Göttingen Comité van de ethiek in de Animal Experimentation goedgekeurde richtlijnen.
1. Elektroporatie
- Kies dieren fasen 49-54 volgens Nieuwkoop en Faber 7.
- Zorg ervoor dat de opname opstelling bestaat uit een stereomicroscoop met een grote werkafstand en een elektroporatie-inrichting die spanningspulsen kunnen toepassen van 20 V gedurende 20 msec bij een frequentie van ten minste 2 Hz. Breng de spanningspulsen via twee platina-elektroden met een ruw diameter van 200 urn zodat daarmee de neusgaten kikkervisjes "kan worden ingebracht zonder schade.
- Bereid kristallen van dextran geconjugeerd kleurstof (bijvoorbeeld Calcium Green 10 kDa Dextran of Alexa Fluor 647 10 kDa dextran) door het oplossen van de typisch geleverde hoeveelheid van 5 mg in 100 pl gedestilleerd water en laten kleine druppeltjes2 pl droog op een vel Parafilm.
Opmerking: De kristallen droog in minder dan een dag en kan daarna worden opgeslagen bij -18 ° C in de vriezer gedurende meer dan een jaar. - Verdoven dieren door ze in leidingwater met 3% tricaïne methaansulfonaat 1-2 min totdat de chirurgische verdoving die wordt gekenmerkt door bereikt vertraagde hartslag, verlies van alle bewegingen en gebrek aan respons op mechanische stimuli.
- Dompel de verdoofde dier voor 10 sec in zuiver water uit de kraan.
- Leg het dier op een gel kussen en zet het vast door het plaatsen van naalden omheen zonder nadelige gevolgen voor het.
Let op: Laat het dier niet op te lossen door porren naalden door zijn huid. - Voorzichtig droog het gebied rond de neus met een tissue.
- Plaats het dier onder de stereomicroscoop en focus op de neusgaten.
- Gebruik een tang om een kleurstof kristal van grootte overeenkomen met het neusgat gat halen, plaats deze in een van de neusholten en wacht tot het volledig oplost, which duurt minder dan 1 minuut. Als de kristallen kleiner, voeg 2 of 3 in elke holte, totdat een ondoorzichtige hoog geconcentreerde oplossing te produceren.
- Plaats de kathode op de huid van het kikkervisje en de anode in een van de neusgaten.
Let op: Deze bijzondere instelling geldt voor de hierboven in stap 1.3 kleurstoffen. Voor kleurstoffen met een andere polariteit, kan de kleuringen worden verbeterd door het plaatsen van de kathode in de neusgaten. Als twijfelt over de polariteit van de kleurstof, beide elektroden kan worden gelijktijdig in de neusgaten (één per neusgat) geplaatst, en de polariteit afwisselend één spanningspulsen. - Solliciteer zes pulsen van 20 V en 20 msec met ongeveer 0,5 sec van de stimulus interval.
Opmerking: Kleine belletjes moet tijdens de elektroporatie voorwaarde dat de elektroden in contact met de huid en de oplossing in het neusgat rond de elektrode in het neusgat weergegeven. Als er geen luchtbellen zichtbaar zijn controleer de verbindingskabels en zorg ervoor dat de electroporating Device levert de gewenste spanningspuls. - Herhaal de procedure (1,9-1,11) voor de tweede neusgat.
- Breng de geëlektroporeerd kikkervisje in een beker gevuld met kraanwater bij kamertemperatuur. Wacht 5 tot 10 minuten totdat het dier terug bij bewustzijn komt en hervat haar zwemmen. Voeden en laten herstellen gedurende ten minste 1 dag waarin de kleurstof wordt getransporteerd langs de reukzenuw naar de olfactorische knobbel.
- Gebruik de geëlektroporeerde dieren binnen 1-7 dagen na de elektroporatie voor de beste beeldvormende resultaten. Geef ten minste 24 uur tijd voor kleurstof transport en herstel voor de beeldvorming.
2. Hele Mount Voorbereiding
- Verdoven van het dier in leidingwater met 3% tricaïne methaansulfonaat totdat alle bewegingen zijn gestopt en niet meer reageert op mechanische prikkels.
- Breng het kikkervisje een gelkussen onder een stereomicroscoop en stevig vast door poking naalden door de huid aan weerskanten van de forebrain.
- Offer het kikkervisje door het doorsnijden van haar ruggenmerg.
- Gebruik een scalpel te ontleden uit een blok van weefsel die zowel neusholten, de olfactorische zenuwen en olfactorische bollen (figuur 1A). Maak de eerste incisie in de buurt van linker neusgat, zonder het aan te raken-en bewegen het mes naar voren snijden langs de linker reukzenuw en gloeilamp tot de telencephalic-diencephalic grens. Doe ook aan de rechterkant. Isoleer de bereiding van de rest van het zenuwstelsel door een definitieve posterior het telencephalon.
- Gooi het lichaam van het kikkervisje en zorgvuldig flip het weefsel blok op zijn kop, zodat de buikzijde van de hersenen voorbereiding naar boven wijst.
- Speld het weefsel blok weer door het invoegen van twee naalden tussen de olfactorische zenuwen.
- Een druppel kikker Ringer oplossing (98 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 5 mM glucose, 5 mM Na-pyruvaat, 10 mM HEPES, pH 7,8, osmolaligheid van 230 mOsmol / L) op het weefsel.
- Verwijder de hersenvliezen die de axon sortering zone en de olfactorische bollen door het maken van drie incisies met behulp van fijne schaar. Vanaf de achterste rand van het weefsel blok, snijd caudorostrally dicht langs de linker olfactorische gloeilamp tot aan de ingang punt van de olfactorische zenuwen in de bollen (de axon sortering zone).
- Herhaal stap 2.8 voor de rechter hersenhelft.
- Verhoog de hersenvliezen met een pincet en maak de derde gesneden, loodrecht op de vorige op de axon sortering zone.
Let op: De buikzijde van de olfactorische bol is nu toegankelijk voor de beeldvorming en bolus laden. - Om de beeldkwaliteit in het doorgezonden beeld licht verbeterd, herhaalt u de procedure voor de rugzijde. Deze extra stappen kunnen de navigatie van de micropipet voor bolus kunnen laden, maar niet strikt noodzakelijk.
- Breng het monster een opname kamer gevuld met kikker Ringer voor verdere verwerking en weergave. maak sure dat de buikzijde naar boven is gericht en zet het monster met een net van nylon vezels overspannen over een kleine platina frame.
- Voor een gemakkelijkere toepassing van stimuli plaats de neusholten bovenop één van de nylonvezels.
3. Bolus Loading
- Los 50 ug van het calcium AM kleurstof (bijvoorbeeld, Fluo-08:00) in 20 pl dimethylsulfoxide (DMSO) met 20% Pluronic F-127 (w / v) om een voorraadoplossing van AM kleurstof bereiden. Bevries de voorraad oplossingen in kleine porties van 1-2 ul volume. De voorraad oplossing is stabiel gedurende tenminste een half jaar maar vermijd vries-dooi cycli.
- Gebruik een micropipet trekker en trek pipetten met een weerstand van 5-8 MQ en een tip diameter van 1-2 urn.
- Los het bereide voorraadoplossing van de kleurstof in oplossing kikker Ringer bij een concentratie van 250-500 pM.
- Voeg MK571 tot een concentratie van 500 uM bereiken multidrug resistance transporters blokkeren.
- Vul het micropipet met 10 ul van de oplossing met behulp van een langwerpig pipet tip en verwijder alle luchtbellen door flicking de micropipet.
- Monteer de micropipet in de pipet houder en zorg ervoor dat de druk handmatig kan worden aangebracht met een spuit of een pneumatische drug ejectie apparaat en het toezicht op de uitgeoefende druk met een manometer.
- Indien mogelijk een microscoop opstelling met de mogelijkheid om de geïnjecteerde kleurstof wekken zodat de uitstroom uit de micropipet tip kan worden gevisualiseerd en aangepast. Gebruik bij voorkeur een confocale beeldvorming setup. Gebruik een rechtopstaande microscoop met een immersie objectief, zodat het weefsel kan worden bereikt met de micropipet.
- Plaats de hele berg voorbereiding onder de microscoop, volg de olfactorische zenuw tot de lamp en de focus op het gebied van interesse in de olfactorische bulb.
- Perfuseren verse Ringer oplossing door de opname kamer met het oog op de levensvatbaarheid van het preparaat te verhogen en uit te wassen de kleurstof lekkenvan de micropipet tip.
- Laat de pipet op het oppervlak van de bulbus olfactorius, met de punt wijst in de rostrale richting van het preparaat.
- Breng een kleine en een constante positieve druk (~ 25 hPa) naar de micropipet om verstopping van de pipet te voorkomen en steekt hem voorzichtig in het weefsel.
- Zodra de pipet de buitenste weefsellagen heeft geschonden, verplaatsen in een rostro-dorsale richting in de mitralisklep cellaag. (Merk op dat een tegenkleuring van olfactorische receptor neuronen door elektroporatie is nuttig de positie van de micropipet aanpassen.) Dit plaatst de pipetpunt op een afstand van 50-100 urn van de gewenste opname onderzocht.
- Voor het kleuren van de temperatuurgevoelige γ-glomerulus doel een gebied van ongeveer 50 pm rostraal van de positie van de presynaptische neuropil van de γ-glomerulus.
- Breng een positieve druk in het traject van 100-200 hPa. Stel de druksterkte afhankelijk van de grootte vande micropipet tip. Bevestig de uitstroom uit de pipet door te kijken voor lichte weefsel bewegingen zichtbaar onder Brightlight verlichting wanneer druk wordt uitgeoefend voor de eerste keer.
- Een constante druk gedurende ongeveer 10 minuten onder de micropipet in het weefsel blijft. Als het mogelijk is, controleer dan de neuropil in de tussentijd voor de mobiele laden bij tl-verlichting zo succesvol laden zal leiden tot zichtbare cel Somata kleuring met toenemende intensiteit in de tijd.
Let op: Vaak is de reden voor de mislukte lading is pipet verstopping te wijten aan het weefsel invoeren van de tip of geaggregeerde kleurstof clusters. Soms is het mogelijk om de pipet te redden door zachtjes de punt breken tegen het onderoppervlak van de opname kamer. Toch moet de pipetpunt niet meer dan enkele micrometers. Compenseer grotere pipet openingen door het toepassen van een lagere druk tijdens bolus laden. - Na de 10 min van lading, vermindering van de toegepaste druk op nul en controleer de kleuring.
NotitieDe grootte van de vlek varieert aanzienlijk en hangt af van verschillende parameters, zoals hoeveelheid ingespoten kleurstof en plaats van uitwerpen plaats. Een goede kleuring heeft een oppervlakte van ongeveer 100 urn x 100 urn. - Als de vlek is te klein of dekt niet de gewenste opname site, herhaalt u stap 3,10-3,13. Gebruik dezelfde micropipet voor de volgende injectie als het nog niet is verstopt.
- Wacht ten minste 30 minuten na de laatste injectie voordat u begint met experimenten om kleurstof opname en esterificatie mogelijk te maken. Blijf de opname kamer perfuseren met verse Ringer oplossing te allen tijde.
4. Meting Instellingen
- Zorg ervoor dat de meetopstelling bestaat uit een confocale microscoop met voldoende snelheid om driedimensionale volumes op te nemen. Kies een overname van ten minste 1 Hz per stack.
Let op: Geschikt opstellingen omvatten bijvoorbeeld line-verlichting microscopen scannen van de steekproef line-wise in plaats van punt door point. Een eenvoudige realisatie van een dergelijke opstelling is eerder beschreven 6. Andere opties zijn draaiende schijf microscopen. Indien dergelijke setup is, is het nog steeds mogelijk kleinere gebieden gepaard met een normale point-scanning setup. - Stel de meetparameters zodat een volume groot genoeg om de grootte van een glomerulus past kan worden afgedekt.
Opmerking: De typische dikte van een opnamevolume in het traject van 20 urn die moet worden door ten minste 5 lagen. - Controleer alle presynaptische metingen voor het bleken. Stel het laservermogen tot de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de opgenomen beelden niet in het tijdsverloop van de opname zakt.
- Beperk de meettijd en oppervlakte van opnamen op de postsynaptische kant bleken zoveel mogelijk te vermijden, hoewel metingen dan 20-30 sec bleken kan optreden.
5. Geur Toepassing en Temperatuur Experimenten
- giet 25ml verse Ringer oplossing (eerder opgeslagen bij 4 ° C) in een 50 ml buis. Plaats de buis in een ijsemmer.
- Controleer de temperatuur van de gekoelde Ringer aan door de schone sonde van de thermometer in de buis. Wacht tot de temperatuur daalt tot onder 1 ° C vóór het begin van het experiment.
- Bereid 50 ml van L-histidine werd opgelost in Ringer oplossing bij een concentratie van 10 uM.
- Gebruik een trechter applicator 8 of soortgelijke aanvraag systemen waarmee stimulus levering gelijktijdig aan de perfuseren Ringer, zodat de waterstroom in de kamer constant en ononderbroken bij de introductie van de stimulus oplossing blijft. Plaats de trechter zodanig dat het distale uitlaat minder dan 1 mm van de olfactorische epithelium.
- Plaats een NiCr-Ni temperatuursensor verbonden met een digitale thermometer dichtbij het epitheel en de uitlaat van de trechter applicator. Sluit de thermometer output poort van een computer op te nemen en visueel disspelen voltage veranderingen als gevolg van kleine temperatuurschommelingen.
- Voordat de proef begon, sluit een andere temperatuursensor een temperatuurmeter de spanning-temperatuur schaalfactor vastgesteld.
- Onderzoeken de badtemperatuur in de opname kamer en waarborgen dat deze niet groter dan 22 ° C.
- Start het beeld acquisitie en na elkaar toe te passen 200-400 ul van koude Ringer, L-histidine en kamertemperatuur Ringer (20-22 ° C) via een elektronische pipet met een interstimulus interval van 20-30 sec. Voor een betere controle van de stimulustoediening, laat de stimulus met een triggersignaal van de gekozen imaging opstart naar de pipet indien mogelijk. Herhaal de aanvraag protocol voor reproduceerbare resultaten.
- Neem sets van meer opnamen met verschillende rondes van stimulatie, omdat ze de voorkeur voor post-imaging analyse van de activiteit correlatie beeldvorming.
Opmerking: Een compromis tussen de opnametijd en de slice levensvatbaarheid heeftte vinden. Metingen van ca. 2 min die 6 stimulus toepassingen voldoende activiteit van een reconstructie van het netwerk.
6. Beeldverwerking Met behulp van Activity Correlation Imaging (ACI)
- Beeldverwerking van de Pre-synaptische Recordings
- In opnamen met stimulatie door koude Ringer oplossing en histidine onderscheiden temperatuurgevoelige γ-neuropil van de naburige histidine-gevoelige glomerulus door hun verschillende responsprofielen (zie Kludt et al. 5).
- Een maximale intensiteit uitsteeksel in de axiale richting van opnamen van de hersenen preparaat waarin ORNs werden geëlektroporeerd met twee verschillende kleurstoffen bilaterale innervatie van de γ-glomerulus visualiseren.
- Beeldverwerking van de Post-synaptische Recordings Met behulp van Activity Correlation Imaging (ACI)
- Selecteer opnames met voldoende tijd punten (meer dan 100 frames) en een behoorlijke hoeveelheid activiteit (ten minste twee events).
Opmerking: Activiteit kan hetzij spontaan aan de processen van één of mitrale cellen geïnduceerd onthullen door verscheidene toepassingen van stimuli in dezelfde opname om het cellulaire netwerk geactiveerd door de olfactorische stimuli onthullen. - Kies opnames waarbij de gemeten structuren te bewegen niet meer dan 2-3 pixels in het tijdsverloop van de opname.
Opmerking: Opname van te veel beweging kan worden gered door een verschuiving correctieprocedure in Kludt et al 5. - Controleer of de opnames last van bleken. Als de gemiddelde intensiteit van het gehele beeld druppels op het tijdsverloop van de opname, bleekmiddel correctie nodig, omdat anders de volgende twee stappen overslaan.
- Bereken de lineaire trend voor het tijddiagram van elke pixel door het uitvoeren van een lineaire regressie.
- Trek het resultaat van elke pixel individueel aan de lineaire componen eliminerent van het bleken.
Opmerking: Als alternatief Legendre fitting kan worden gebruikt zoals beschreven door Schild Bao en 9. - Download de kant-en-klare MATLAB script samen met een stap-voor-stap handleiding voor de activiteit correlatie imaging (ACI), zoals beschreven door Junek et al. 6
Let op: Volg de stappen in Junek et al 6 beschreven als een alternatief voor het gebruik van de meegeleverde MATLAB script.. - Verplaats de bestanden 'aci.m', 'matVis.m' en 'aci_roiSelector.m' uit de gedownloade container naar de MATLAB pad van de gebruikt voor data evaluatiesysteem.
- Laad de ruwe gegevens verkregen in stap 5.8 als variabele user workspace MATLAB georganiseerd als [x, y, z, t] -matrix met x en y verwijzen naar de laterale afmetingen, z de axiale richting en t het tijdsverloop .
- Call 'ACI' uit de MATLAB opdrachtregel.
- In de gebruikersinterface (UI)die verschijnt, selecteer 'Prepare Data' en selecteer de variabele met de gegevens en een map waarin de resultaten worden opgeslagen.
Opmerking: Voor een volledige beschrijving van de UI zie de handleiding bij de ACI-script. - Blader door de gemeten z-lagen door het bewegen van de overeenkomstige schuif in de gebruikersinterface om een overzicht van de kaart variantie weergegeven te krijgen.
- Voer de grootte van het gebied van belang (ROI) in de UI. Voor een mitrale cel soma stel de ROI tot ongeveer 10 urn in zijdelingse en 5 um in de axiale richting uitstrekken. Een glomerulus, de iets hogere waarden van 20 urn en 10 urn zijdelings axiaal geschikt.
Opmerking: De ROI formaat heeft een aantal pixels, die afhankelijk is van de pixel scaling gekozen voor de opname in te voeren. - Selecteer een ROI met de γ-glomerulus en aanvullende regio's voor elk zichtbaar soma van de omringende mitralisklep cellen door te klikken met de middelste muisknop op de center van de cel / glomerulus.
- Sluit het hoofdscherm van de gebruikersinterface die het startsein voor de berekening van de correlatie kaarten voor alle referentie-sporen. Het resultaat wordt automatisch opgeslagen en weergegeven.
- Selecteer opnames met voldoende tijd punten (meer dan 100 frames) en een behoorlijke hoeveelheid activiteit (ten minste twee events).
Representative Results
De elektroporatie van olfactorische receptor neuronen (ORNs) werd bereikt met Alexa Fluor kleurstoffen of calcium indicatoren geconjugeerd met dextran moleculen voor anterograde etikettering via actieve axonaal transport. Terwijl de eerste kleurstoffen lichte kleuring van de sensorische neuronen en hun axon terminals vertakking in de glomerulaire laag van de lamp, de tweede laat de meting van neuronale activiteit in deze cellen (figuren 1 en 2). Ten eerste, de positie van de voor warmte γ-glomerulus en innervatie patroon werd gevisualiseerd door electroporating Alexa Fluor 647 en Alexa Fluor Dextran 546 Dextran in de linker en rechter olfactorische epitheel, respectievelijk (Figuur 1A). Vierentwintig uur na de procedure, het ORNs in de neusgaten, de twee olfactorische zenuwen en de glomeruli in beide hemisferen waren zichtbaar onder fluorescentiemicroscopie. De verschillende glomerulaire clusters waren identifiable hun respectieve posities in met name de kleine cluster omvattende de γ-glomerulus (Figuur 1B). Een klein aantal contralaterale olfactorische vezels kwam door de contralaterale bulbus olfactorius, stak de anterieure commissuur en ingetrokken in de ipsilaterale γ-glomerulus (Figuur 2A).
Om calcium reacties van de presynaptische vezels van de γ-glomerulus nemen, werd Calcium Groen Dextran geëlektroporeerd in ORNs, volgens dezelfde procedure. Negatieve temperatuur sprongen werden geïnduceerd in het neusgat via de gecontroleerde afgifte ijskoude Ringer oplossing (0-1 ° C). Een 3D-volume bestaat uit de γ-glomerulus werd in beeld gebracht in het kader van een snelle lijn-verlichting confocale microscoop. ATS van -1 ° C voldoende waren om koud reacties in de γ-glomerulus en de afferenten, herkenbaar als omkeerbaar pieken in de AF / F Ca 2+ sporen (Figuur 2B <triggeren/ strong>, C).
Verdere experimentele stappen werden uitgevoerd koude geïnduceerde activiteit te meten in de mitrale cellen verbonden met de γ-glomerulus via de vertakkende dendritische uitgangen. Deze postsynaptische vezels en het omliggende neuropil doeltreffend waren gekleurd door bolus laden van de calcium-gevoelige kleurstof Fluo-08:00, uitgevoerd enkele dagen na Alexa 647 dextran werd geëlektroporeerd in ORNs (figuur 3A, B). Mitrale cellen werden gevuld met Fluo-08:00, en de olfactorische epithelium werd tweemaal gestimuleerd volgens de volgende paradigma koude Ringer, histidine (10 uM) en kamertemperatuur Ringer vervolgens toegepast. Twee referentiesporen werden uit gebieden van belang in het opnamevolume van één enkel reageert op temperatuur daalt, de ander, alleen histidine. Activiteit correlatie imaging (ACI) 6 werd berekend op basis van de geselecteerde referentiesporen te visualiseren met een hoog contrast de dendritische morfologie van de postsynaptische netwerken overeenkomt met hetzij temperatuur of histidine reagerende Ca2 + signaal (Figuur 3C, D). Tenslotte warmtegevoelige en chemotherapie gevoelig kaarten waren kleurcode en overlay bovenop elkaar tonen hoe temperatuur en chemische karakterisering van individuele glomeruli wordt naar de olfactorische tweede orde neuronen (Figuur 3E). Voor een beschrijving van de integratie en de verwerking van beide soorten informatie in gedeelde olfactorische netwerken, zie Kludt et al. 5
Figuur 1: Overzicht van de ORN elektroporatie en bolus lading (A) olfactorische receptor neuronen in beide neusholten van X.. laevis larven werden geëlektroporeerd met Alexa kleurstoffen of Calcium-gevoelige kleurstoffen gekoppeld aan dextran moleculen. De fluorescerende indicatoren zijn anterogradely vervoerd totdat de terminal axonen arborization. 24 uur na elektroporatie, de glomerulaire laag in beide hemisferen toonde fluorescerende kleuring. (B) Schematische voorstelling van de cellulaire organisatie van de bulbus olfactorius in een hemisfeer. De glomerulaire laag overspant de lamp in clusters: de mediale, kleine, intermediaire en laterale clusters. Olfactorische informatie wordt overgedragen van de receptor neuronen aan cellen mitralisklep via prikkelende synapsen in glomeruli. Periglomerular cellen en granule cellen remmende neuronen moduleren olfactorische verwerking en codering. Het γ-glomerulus (cyaan) werd gemakkelijk geïdentificeerd als kleine neuropil waarin ipsilaterale (rood) en contralaterale (oranje) olfactorische vezels samengevoegd. (C) Bolus belading werd bereikt in de nabijheid van de γ-glomerulus de postsynaptische neuropil voornamelijk bestaande uit mitrale cellen en hun dendri vlektic bomen aanzienlijk vertakking in de glomerulaire laag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Elektroporatie van ORNs onthult structurele en functionele connectiviteit (A) bilaterale innervatie van de γ-glomerulus door ipsilaterale (groen) en contralaterale (rood) olfactorische receptor neuronen (ORNs).. Schaal bar = 50 micrometer. (B) De bulbus olfactorius na elektroporatie met de calcium-gevoelige kleurstof Calcium Green Dextran. De intermediale (IMC), mediale (MC) en de kleine cluster (SC) zichtbaar. Het beeld is een maximale projectie van 100 urn dikke volume meting. Schaal bar = 50 micrometer. (C) Close-up van de kleine cluster. Het opgenomen volume (12 um) isweergegeven in een maximale projectie. Het beeld schildert de basale fluorescerende niveau in grijs en de kleurgecodeerde AF / F-kaart als een overlay. De maximale respons op stimulatie met koude Ringer oplossing wordt uitgezet. De γ-glomerulus reageerde sterk, terwijl de twee aangrenzende glomeruli zwijgen. De inzet toont de AF / F trace voor de γ-glomerulus dat beantwoordt aan de regio van belang. De blauwe balk geeft de stimulus applicatie. Schaal bar = 20 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Bolus laden en ACI dissociëren voor warmte en chemotherapie gevoelig netwerken (A) axonen van ORNs resulteert in de kleine cluster werden gekleurd door elektroporatie met de niet-calcium kleurstof Alexa 647 dextran. De stippellijn schetst de γ-glomerulus. (B) Beeld van dezelfde regio als in (A) in de tweede meting kanaal na bolus belading met de calcium-gevoelige kleurstof Fluo-08:00. Sommige mitralisklep cel Somata zichtbaar waren, maar het contrast was beperkt. Na de pijlen werden twee respons sporen uitgezet, die werden gebruikt op activiteit correlatie beeldvorming (ACI). Blauwe, rode en zwarte balken onder de sporen tonen het begin van de toepassing van koude Ringer, histidine (10 uM) en kamertemperatuur gekleurde als negatieve controle, respectievelijk. De twee Ca 2+ sporen waren afkomstig uit verschillende regio's van belang van de gemeten volume. (C) Het ACI resultaat van het spoor in (B) markeren gebieden reageert overwegend koude Ringer. (D) Het ACI resultaat van het spoor in (B) markeren gebieden reageert overwegend op histidine. (E) Overlay van de twee ACI kaarten. Mitralisklep cellen reageren op histidine en de geïnnerveerde glomerulus (rood) waren gemakkelijk te onderscheiden van warmtegevoelige mitralisklep cellen en de γ-glomerulus (cyaan). Alle afbeeldingen van dit cijfer zijn maximale intensiteit projecties van een 28 urn dikke volume. Schaal bar = 20 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De hierin gepresenteerde methoden zijn gericht op registratie temperatuur verwerking in de olfactorische bol van Xenopus laevis kikkervisjes. Het protocol vlekken eerste en tweede orde neuronen in de bulbus olfactorius en verschaft een voorbehandeling die het olfactorische systeem dat voornamelijk intact blijft. Zo kan de activering van de temperatuurgevoelige γ-glomerulus worden bewaakt en vergeleken met een chemogevoelige naburige glomeruli. De unieke bilaterale innervatie van deze glomerulus wordt gevisualiseerd door cell elektroporatie met spectraal verschillende kleurstoffen. Bovendien bolus loading maakt de kleuring van mitrale cellen verspreid over een groot volume binnen de bulbus olfactorius. De neurale netwerk verwerking temperatuur-geïnduceerde signalen wordt onthuld door het nemen van calcium metingen met herhaalde stimulus applicaties en vervolgens de gegevens van de activiteit correlatie beeldvorming te analyseren.
Het protocol benadrukt twee geavanceerde kleuring proce res, die beide vereisen voorzichtige manipulatie en praktijk om bevredigend en reproduceerbare resultaten te bereiken. Tijdens de elektroporatie verwondingen van de dieren moet worden vermeden, met name bij het plaatsen van de elektroden in de neusgaten. Optimaal dienen geen contact met de reukepitheel optreden. Merk op dat de dieren nog in leven na de elektroporatie procedure en de hersteltijd moet rekening worden gehouden. Indien de kleuring te zwak na één ronde van elektroporatie, dat kan gebeuren, afhankelijk van het type gebruikte kleurstoffen blijft, kan de intensiteit toenemen door kleurstofconcentratie in de neusgaten. Aangezien-dextran moleculen gekoppeld via meerdere mechanismen waaronder traag axonaal transport (bij snelheid van 1-2 mm / dag 10) en de passieve diffusie getransporteerd, ander alternatief is om 48 uur na elektroporatie wachten voordat het opofferen van de dieren. Alternatief kan de elektroporatie worden herhaald na een dag van herstel.
jove_content "> Bolus lading is een kritische stap omdat de hoeveelheid kleurstof die in de mitrale cellen moeilijk te regelen en hangt af van diverse parameters zoals pipetpunt grootte en locatie van de toepassing. Follow procedure onder een confocale fluorescentiemicroscoop nuttig blijkt te zijn voor aanpassen van de duur van kleurstof toepassing en waardoor het genereren van vergelijkbare kleuringen in preparaten. Verder eerder geëlektroporeerd kikkervisjes worden gebruikt om de beste positie voor de kleurstof toepassingsvoorwaarden te bepalen door het identificeren van de positie van de kleine cluster (omvattende de γ-glomerulus). de kritische stap bij metingen zowel verschuiving en bleken van het monster te voorkomen. de verschuiving kan worden vermeden door zorgvuldig positioneren van de gekleurde stroming onder de microscoop. Wat het bleken van het interessegebied te beperken, moet de meettijd worden gereduceerd tot de essentiële .Bolus loading kleuring met calcium-gevoelige kleurstoffen maar kortebeperkte contrast aangezien gezonde cellen hebben in het algemeen laag calciumgehalte en daarmee laten zien zwakke basale fluorescentie. Het toepassen van activiteit correlatie imaging omzeilt deze beperking door het genereren contrast op basis van de activiteit en hoogtepunten structuren met gelijkaardige calcium signalen. Deze post-acquisitie analyse methode berekent de correlatie factor tussen de calcium signaal van een geselecteerde regio van belang (referentie sporen) en die van elke afzonderlijke pixel in de 3D-volume. Daarom is het sterk verkregen resultaten afhangen van de activiteit patroon gekozen als referentiesignaal. Als het hoofddoel is om mitralis cel innervatie patronen zichtbaar te maken, wordt een referentie-signaal afkomstig van spontane neuronale activiteit die de voorkeur, en het kiezen van de meest actieve mitralisklep cellen zullen de beste resultaten te produceren. Voor het openbaren van de chemo- of thermo-gevoelige netwerken van mitralisstenose cellen, moet verwijzing sporen alleen met antwoorden op ofwel histidine of koud van de Bel worden geselecteerd. De selectie van een hele glomerulus or mitrale cel soma als gebied van interesse niet altijd een duidelijke referentiesignaal, vooral als de structuren in op de twee verschillende stimuli die bovenop elkaar. In een dergelijk geval is het vaak handig om een kleiner gebied van de glomerulus of cellichaam als gebied van interesse te selecteren.
In de laatste decennia is elektroporatie beschreven als een doeltreffende methode om één of meerdere cellen 11,12 vlek. Hier wordt gebruikt om specifiek te labelen olfactorische receptor neuronen. Dextran-geconjugeerde moleculen geeft de hoogste efficiëntie, en voor niet-calciumgevoelige kleurstoffen, het bereik van de selectie is breed en omvat het complete spectrum typisch gebruikt fluorescentiemicroscopie 13. Echter, calcium-kleurstoffen die een goede geëlektroporeerd in olfactorische receptor neuronen zijn op dit moment beperkt tot calcium-green dextran en Fluo-4 dextran indien nog in de handel verkrijgbaar. Daarnaast opnamen zich voornamelijk richten superficial lagen op het ventrale oppervlak van alleen de bulbus olfactorius, omdat de indringdiepte van snelle meettechnieken beperkt. Twee-foton beeldvorming kan gedeeltelijk overwonnen deze beperking maar vaak mist snelheid en beperkt de hoeveelheid selecteerbare calcium-gevoelige kleurstoffen verder.
We beschreven hier een protocol voor het meten van temperatuur-geïnduceerde activiteit in de olfactorische bulb. De hersenen neuropil wordt gescand als een driedimensionaal volume van de complexe cellulaire netwerken betrokken bij de verwerking van olfactorische temperatuur visualiseren. Meten temperatuur geïnduceerde activiteit in de bulbus olfactorius is onlangs gerapporteerd 5 en vereist een speciaal aangepaste procedure combinatie van verschillende technieken. Een belangrijke troef van de hierboven beschreven technieken is dat honderden cellen zijn afgebeeld in drie dimensies in een preparaat waar de meeste olfactorische systeem intact blijft. Deze voordelen zetten hoge eisen aan de kleuring technieken en de hersenen preparatie en beeldvorming. Bijvoorbeeld, cellen elektroporatie en bolus laden getroffen grote hoeveelheden cellen in het olfactorisch epitheel en gloeilamp, en aldus mogelijk maken de visualisatie van totale cellulaire netwerken. Bovendien is de levering van chemische indicatoren via bolus laden in plaats van genetisch gecodeerd fluoroforen maakt metingen in een potentieel grotere set van soorten. Andere alternatieven zoals bad incubatie met AM kleurstoffen voornamelijk werken in plakken waarin de olfactorische gloeilamp ernstig beschadigen, waardoor er slechts een paar honderd micrometer van intact weefsel. Ter vergelijking: de hele berg preparaat in ons protocol zorgt bijvoorbeeld dat de bilaterale innervatie van de γ-glomerulus intact blijft en de opnames zijn dus genomen in een nog besturingssysteem. Tenslotte wordt de beeldvormende zelf gedaan door lijn-belichting microscopie konden verworven van 3D-volumes. Line-verlichting microscopie is een van de confocale technieken die de hoogste opnamesnelheden 6 </ Sup> die nodig zijn om beslaan een groot deel van de bulbus olfactorius. Langzamer overname kunnen worden gebruikt maar hebben het nadeel dat de grootte van het opgenomen volume worden verminderd. De afgelopen jaren zijn andere werkwijzen voor snelle beeldacquisitie ontwikkeld en kan worden gebruikt als alternatief 14,15. Toch line-verlichting microscopie blijft een van de eenvoudigste methoden om zowel voldoende snelheid en resolutie te krijgen. Hier volgt wat informatie als leidraad voor het selecteren van geschikte imaging setups. Aangezien calcium imaging binnen van dik hersenen voorbereidingen is gedaan, moet de setup fatsoenlijk confocaliteit te bieden en de doelstellingen moeten numerieke openingen van 1,0 of hoger. Voor een referentiepunt, de genomen met de lijn verlichting microscoop opnamen overeenkomen met beelden die met een standaard laser scanning microscoop met een pinhole grootte van 0,5-1 luchtige eenheden. Snelle meetsnelheid is gewenst. Een volume met een dikte van 20 urn bedekt met ten minste 5 layers, een zijdelingse gezichtsveld van 100 urn x 100 urn en een pixelgrootte van 0,5 pm of kleiner worden afgetast bij een minimale snelheid van 1 Hz per stapel. Vermindering van de confocaliteit kan de hoeveelheid fotonen geteld verhogen waardoor aldus snellere verwerving indien nodig, maar heeft het nadeel waarmee meer out-of-focus licht. Echter, omdat hierbij de dikte van de optische schijven toeneemt, kan zelfs het traceren van dendrieten door verschillende z-vlakken vergemakkelijken na toepassing van ACI 6.
De nodige tools om uitgebreid te bestuderen temperatuur verwerking in reukorgaan netwerken worden hierin gepresenteerd. Temperatuur-geïnduceerde activiteit in het eerste en tweede orde neuronen via calcium-gevoelige kleurstoffen en signalen zowel aankomende en vertrekkende van de γ-glomerulus. Verder is de mate waarin individuele mitrale cellen verwerken zowel chemisch als temperatuurinformatie kan worden beoordeeld. Omdat de voorbereiding leaves de bulbus olfactorius intact, kan de rol van de bilaterale innervatie in de olfactorische verwerking verder worden onderzocht. De werkwijze is ook bruikbaar voor het openbaren of en hoe thermo- en chemoinformation gecodeerd in overlappende olfactorische netwerken 5. Tenslotte worden de bovenvermelde technieken niet beperkt tot de studie van de temperatuurresponsen in de bulbus olfactorius, maar kan worden toegepast voor een meer algemene evaluatie van het olfactorische systeem, met name de cellulaire verwerkingsnetwerken in grote driedimensionale volumes. Bolus laden en activiteit correlatie imaging zijn krachtige hulpmiddelen om te observeren en te vergelijken van de activiteit van tientallen van neuronen, waardoor ze van toepassing zijn op verschillende hersengebieden netwerken 16.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Sodium chloride | Merck Millipore | 1064040500 | |
| Potassium chloride | Merck Millipore | 1049360250 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1023820250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 1058330250 | |
| D(+)-Glucose | Merck Millipore | 1083371000 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| HEPES | Merck Millipore | 1101100250 | |
| Calcium Green 10 kDa Dextran | Thermo Fisher Scientific | C-3713 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | D-22914 | |
| Dextran, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | D-22911 | |
| Fluo-8 AM | TEFlabs | 203 | |
| MK571 | Alexis Biochemicals | 340-021-M005 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Pluronic acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | powder |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 53370 | |
| DMSO | Merck Millipore | 1029522500 | |
| Equipment | |||
| Electronic pipette | BrandTech | HandyStep Electronic Repeating Pipette | |
| NiCr-Ni thermocouple | Greisinger Elektronik | GTF 300 | |
| Micropipette puller | Narishige | Model PC-10 | two-step puller |
| Funnel applicator | (Custom-made) | ||
| Line-illumination microscope | (Custom-made) | otherwise, a commercially available spinning disk microscope | |
| Objective W Plan-Apochromat 63X/1.0 | Zeiss | 441470-9900-000 | |
| Objective W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | |
| Software | |||
| MATLAB | The MathWorks | from R2010b upwards |
References
- Mamasuew, K., Breer, H., Fleischer, J. Grueneberg ganglion neurons respond to cool ambient temperatures. Eur J Neurosci. 28 (9), 1775-1785 (2008).
- Brechbühl, J., Moine, F., Broillet, M. -C. Mouse Grueneberg ganglion neurons share molecular and functional features with C. elegans amphid neurons. Front. Behav. Neurosci. 7 (193), (2013).
- Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. J Comp Neurol. 489 (4), 403-424 (2005).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. J Neurosci. 35 (20), 7892-7902 (2015).
- Junek, S., Chen, T. W., Alevra, M., Schild, D. Activity correlation imaging: visualizing function and structure of neuronal populations. Biophys J. 96 (9), 3801-3809 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
- Schild, D. A computer-controlled device for the application of odors to aquatic animals. J Electrophysiol Tec. 12 (2), 71-79 (1985).
- Bao, G., Schild, D. Fast and Accurate Fitting and Filtering of Noisy Exponentials in Legendre Space. PLoSONE. 9 (3), (2014).
- Terasaki, M., Schmidek, A., Galbraith, J. A., Gallant, P. E., Reese, T. S. Transport of cytoskeletal elements in the squid giant axon. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (25), 11500-11503 (1995).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Lechleiter, J. D. Chemical Calcium Indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Salome, R., et al. Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy using acousto-optic deflectors. J Neurosci Methods. 154 (1), 161-174 (2006).
- Keller, P. J., Ahrens, M. B., Freeman, J. Light-sheet imaging for systems neuroscience. Nature Methods. 12 (1), 27-29 (2015).
- Hjorth, J. J., et al. Detection of silent cells, synchronization and modulatory activity in developing cellular networks. Dev Neurobiol. , (2015).
