Protocol
כל הניסויים עם ראשני laevis Xenopus בוצעו בהתאם להנחיות שאושרו על ידי ועדת כלל אוניברסיטאית גטינגן של אתיקה לניסויים בבע"ח.
1. Electroporation
- בחר החיות של שלבים 49-54 פי Nieuwkoop ופייבר" 7.
- ודא כי הגדרת ההקלטה מורכבת סטראו עם מרחק עבודה גדול לבין מכשיר electroporation אשר יכול להחיל פולסי מתח של 20 V עבור 20 msec בתדר Hz 2 לפחות. החל את פולסי מתח באמצעות שתי אלקטרודות פלטינה בקוטר גסה של 200 מיקרומטר, כך שהם יכולים להיות מוכנס לתוך הנחיריים 'ראשנים ללא גרימת נזק.
- הכן גבישים של צבע מצומדות dextran (למשל, סידן גרין 10 kDa Dextran, או אלקסה פלואוריד 647 10 kDa Dextran) על ידי המסת כמות נמסר בדרך כלל של 5 מ"ג בכ -100 μl של מים מזוקקים ולתת טיפות קטנות של2 μl יבש על גיליון Parafilm.
הערה: הגבישים לייבוש פחות מיממה והוא יכול להיות מאוחסן לאחר מכן ב- C -18 ° במקפיא לתקופה של למעלה משנה. - להרדים את בעלי החיים באמצעות הצבתם במי ברז המכילים sulfonate מתאן 3% Tricaine במשך 1-2 דקות עד שהוא מגיע למצב הרדמה כירורגית מאופיין ירד קצב הלב, אובדן של כל התנועות וחוסר תגובות לגירויים מכניים.
- לטבול את החיה הרדימה במשך 10 שניות במים ברז טהורים.
- מניח את החיה על כרית ג'ל ולתקן אותה על ידי הצבת מחטים סביבו מבלי לפגוע בו.
הערה: אין לתקן את החיה על ידי חדירת מחטים דרך העור שלה. - בעדינות לייבש את האזור שמסביב הנחיריים עם רקמה.
- מניחים את החיה תחת סטראו ולהתמקד הנחיריים.
- שימוש במלקחיים כדי להרים גביש צבע בגודל התאמת חור הנחיר, למקם אותו באחד חללי האף ולחכות עד שהוא נמס לגמרי, which לוקח פחות מ 1 דקות. אם הגבישים קטנים, להוסיף 2 או 3 לתוך כל חלל עד שהם מייצרים פתרון גבוה מרוכז שאינו שקוף.
- מניחים את הקתודה על העור של הראשן ואת האנודה לאחת הנחיריים.
הערה: הגדרה מסוימת זה חלה על הצבעים צטטו בשלב 1.3. עבור צבעים עם קוטביות שונות, התוצאות מכתים ניתן לשפר על ידי הצבת הקתודה לתוך הנחיריים. אם אינך בטוח לגבי הקוטביות של הצבע, הוא אלקטרודות ניתן למקם בו זמנית הנחיריים (אחד לכל נחיר), ואת הקוטביות לסירוגין בין פולסי מתח היחיד. - החל שישה פולסים של 20 V ו- 20 msec עם כ -0.5 שניות של מרווח גירוי.
הערה: בועות קטנות אמורות להופיע סביב האלקטרודה בנחיר במהלך electroporation ובלבד אלקטרודות נמצאים בקשר עם העור והפתרון בנחיר. אם אין בועות גלויות לבדוק את כבלי מחברים וודא Electroporating devicדואר מספק את הדופק למתח הרצוי. - חזור על התהליך (1.9-1.11) עבור הנחיר השני.
- מעביר את ראשן electroporated לתוך כוס המלאה במים ברז בטמפרטורת חדר. מתן 5 עד 10 דקות עד החיה להכרתו ומחדשת השחייה שלה. להאכיל אותו ולתת לו להתאושש במשך יום 1 לפחות שבמהלכה לצבוע מועבר לאורך עצב ההרחה כדי נורת חוש הריח.
- השתמש חיות electroporated בתוך 1-7 ימים לאחר electroporation עבור תוצאות ההדמיה הטובה ביותר. תן לפחות 24 שעות זמן לתחבורה לצבוע והתאוששות לפני ההדמיה.
2. הר שלם הכנה
- להרדים את החיה במי ברז המכילים sulfonate מתאן 3% Tricaine עד שכל התנועות הפסיקו וזה כבר לא מגיב על גירויים מכניים.
- מעביר את הראשן כדי כרית ג'ל תחת סטראו ולתקן אותה בחוזקה על ידי חדירת מחטים דרך העור בכל צד של FOrebrain.
- להקריב את הראשן על ידי ניתוק חוט השדרה שלה.
- השתמש באזמל כדי לנתח את גוש הרקמה המכילה שני חללי אף, עצב חוש הריח נורה חוש ריח (איור 1 א). הפוך את החתך הראשון קרוב שמאל נחיר-בלי לגעת בו-להזיז את חיתוך להב קדימה לצד עצב ההרחה שמאל הנורה עד לגבול telencephalic-diencephalic. האם גם בצד ימין. לבודד את הכנת משאר מערכת העצבים על ידי יצירה אחורית לחתוך סופי אל telencephalon.
- השלך את הגוף של הראשן ובזהירות להעיף את גוש רקמות במהופך כך שהצד הגחון של התכשיר המוח פונה כלפי מעלה.
- הצמד את בלוק הרקמות שוב על ידי הוספת שתי מחטים בין עצבי הריח.
- שים טיפת פתרון צפרדע רינגר (98 mM NaCl, KCl 2 מ"מ, 1 מ"מ 2 CaCl, 2 מ"מ MgCl 2, 5 גלוקוז מ"מ, 5 מ"מ Na-פירובט, 10 HEPES מ"מ, מותאם 7.8 pH, osmolarity של 230 mOsmol / L) על הרקמה.
- הסר את קרומי המוח מכסה את אזור מיון האקסון ואת נורות חוש הריח על ידי ביצוע שלושה חתכים באמצעות מספריים בסדר. החל מהקצה האחורי של בלוק הרקמות, לחתוך caudorostrally הדוק לאורך נורת הריח שנותרה עד נקודת הכניסה של עצבי חוש הריח לתוך הנורות (אזור מיון האקסון).
- חזור על שלב 2.8 עבור האונה הימנית.
- הרם את קרומי המוח עם מלקחיים ולעשות את החתך השלישי, בניצב מהקודמים על אזור מיון האקסון.
הערה: צד הגחון של נורת חוש הריח זמין כעת עבור הדמיה וטעינת בולוס. - כדי לשפר את איכות התמונה בתמונה האור המועבר, לחזור על התהליך בצד הגבי. שלבים נוספים אלה יכולים להקל על הניווט של micropipette לטעינת בולוס, אבל הם לא הכרחיים.
- מעבירים את המדגם כדי בתא ההקלטה מלא צפרדע רינגר לעיבוד הדמיה נוספת. הפוך sיור שאזור הבטן פונה מעלה ולאבטח את המדגם עם רשת של סיבי ניילון, השתרע על מסגרת פלטינה קטנה.
- עבור יישום קל של גירויים למקם את חללי אף על גב אחד של סיבי הניילון.
3. בולוס טוען
- ממיסים 50 מיקרוגרם של צבע סידן AM (למשל, AM Fluo-8) ב 20 μl של sulfoxide דימתיל (DMSO) המכיל 20% של Pluronic F-127 (w / v) להכין פתרון המניות של צבע AM. להקפיא את פתרונות המניות aliquots קטן של 1-2 נפח μl. הפתרון המניות הוא יציב במשך לפחות חצי שנה, אך להימנע להקפיא להפשיר מחזורים.
- השתמש חולץ micropipette ולמשוך טפטפות עם התנגדות של 5-8 MΩ ו בקוטר טיפ של 1-2 מיקרומטר.
- ממס את פתרון המניות המוכן של הצבע בתמיסה של צפרדע רינגר בריכוז של 250-500 מיקרומטר.
- להוסיף MK571 להגיע לריכוז של 500 מיקרומטר לחסום מובילי ההתנגדות multidrug.
- מלא את micropipette עם 10 μl של הפתרון באמצעות קצה פיפטה מוארך ולהסיר את כל בועות האוויר על ידי מצליף micropipette.
- הר micropipette ב בעל פיפטה ולוודא כי לחץ יכול להיות מיושם באופן ידני עם מזרק או מכשיר פליטת תרופה פנאומטי ולנטר את הלחץ המופעל עם מד.
- במידת האפשר, להשתמש ההתקנה מיקרוסקופ עם יכולת להלהיב את צבע מוזרק כך כי יצוא מקצה micropipette ניתן דמיינו ומותאמים. באופן אידיאלי, להשתמש התקנת הדמית confocal. שימוש במיקרוסקופ זקוף עם מטרת טבילה כך הרקמות ניתן להגיע עם micropipette.
- מניח את הכנת ההר השלמה מתחת למיקרוסקופ, בצע את עצב ההרחה עד הנורה ולהתמקד על האזור של עניין הנורה חוש הריח.
- Perfuse פתרון רינגר טרי באמצעות לתא ההקלטה על מנת להגביר את הכדאיות של התכשיר ולשטוף את הדולף לצבועמקצה micropipette.
- מנמיך את פיפטה על פני השטח של נורת חוש הריח, עם הקצה ומופנה לכיוון המקורי של התכשיר.
- החל לחץ חיובי קטן וקבוע (~ 25 hPa) אל micropipette כדי למנוע סתימה של פיפטה בעדינות להכניס אותו לתוך הרקמה.
- ברגע פיפטה הפר את שכבות רקמה החיצוניות, להזיז אותו לכיוון rostro-הגבה לתוך שכבת תאי צניפי. (לתשומת לבך, מכתים דלפק של נוירונים קולטני ריח ידי electroporation כדאי להתאים את המיקום של micropipette.) באופן אידיאלי, הנח את הקצה פיפטה במרחק של 50-100 מיקרומטר מאתר ההקלטה הרצוי.
- עבור מכתים את glomerulus γ רגיש טמפרטורה, ממקד לאזור כ -50 מיקרומטר rostrally מהעמדה של neuropil presynaptic של-glomerulus γ.
- החל לחץ חיובי בטווח של 100-200 hPa. התאם את עוצמת הלחץ תלוי בגודל שלקצה micropipette. אשר את היצוא מן פיפטה ידי צפייה לתנועות רקמות קלות גלויות תחת תאורת BrightLight כאשר לחץ מוחל בפעם הראשונה.
- לשמור על לחץ קבוע במשך כ 10 דקות בעוד micropipette נשאר בתוך הרקמה. במידת ההאפשר, לבדוק את neuropil בינתיים לטעינת תא תחת תאורת ניאון כמו טעינה מוצלחת תגרום מכתים somata התא גלוי עם הגדלה עוצמת לאורך זמן.
הערה: לעתים קרובות הסיבה לטעינה מוצלחת היא פיפטה סתימה בשל רקמת הזנת הקצה או אשכולות לצבוע מצטברים. לפעמים זה אפשרי כדי להציל את פיפטה על ידי שבירת קצהו בעדינות כנגד המשטח התחתון של תא הקלטת. עם זאת, קצה פיפטה לא יעלה מיקרומטרים אחדים. לפצות פתחים פיפטה גדולים על ידי הפעלת לחץ נמוך במהלך טעינת בולוס. - לאחר 10 דקות של טעינה, להפחית את הלחץ המופעל לאפס ולבדוק מכתים.
הערה: גודלו של האזור המוכתם משתנה באופן משמעותי ותלוי על מספר פרמטרים כמו כמות צבע מוזרק והמיקום של אתר פליטה. מכתים טוב משתרע על שטח של כ -100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר. - אם את האזור המוכתם הוא קטן מדי או אינו מכסה את אתר ההקלטה הרצוי, חזור על שלבי 3.10-3.13. השתמש באותו micropipette עבור הזריקה הבאה אם זה טרם סתום.
- חכו לפחות 30 דקות לאחר ההזרקה האחרונה לפני תחילת הניסויים כל לאפשר ספיגת לצבוע deesterification. המשך perfuse לתא ההקלטה עם פתרון Ringer טרי בכל העת.
4. הגדרות מדידה
- ודא כי הגדרת המדידה מורכבת מיקרוסקופ confocal עם מהירות מספקת כדי להקליט שלושה כרכים ממדיים. בחר רכישה בשיעור של לפחות 1 רץ לכל מחסנית.
הערה: כולל setups מתאים מיקרוסקופי קו תאורה למשל סריקת הקו-החכם המדגם במקום נקודה ידי point. הכרה פשוטה של התקנה כזה תוארה 6 בעבר. אפשרויות אחרות מסתובבות מיקרוסקופי דיסק. אם לא הגדרה איכותית זמינה, זה עדיין אפשרי למדוד אזורים קטנים עם התקנה נקודה-סריקה רגילה. - הגדר את פרמטרי מידות כך כמויות גדולות מספיק כדי להתאים לגודל של glomerulus יכולות להיות מכוסות.
הערה: עובי אופייני של עוצמת ההקלטה היא בטווח של 20 מיקרומטר שאמור להיות מכוסה על ידי 5 שכבות לפחות. - בדוק את כל המדידות presynaptic להלבנה. התאם את כוח הליזר עד עוצמת הקרינה הממוצעת של תמונות שתועדו לא לרדת לאורך מהלך הזמן של ההקלטה.
- הגבל את זמן המדידה ואזור להקלטות בצד הפוסט-סינפטי להימנע הלבנה ככל האפשר, אם כי למדידות עולה 20-30 הלבנת שניות צפויה להתרחש.
5. יישום ריח ניסויי טמפרטורה
- יוצקים 25מ"ל של תמיסת רינגר טריים (נשמרו קודם ב 4 ° C) בצינור 50 מ"ל. מניחים את הצינור בתוך דלי קרח.
- לנטר את הטמפרטורה של רינגר מקורר על ידי החדרת החללית הנקיה של מדחום לתוך הצינור. מתן עד הטמפרטורה יורדת מתחת ל -1 ° C לפני תחילת הניסוי.
- הכן 50 מ"ל של L-היסטידין מומס בתמיסה רינגר בריכוז של 10 מיקרומטר.
- השתמש משפך מוליך 8 או מערכות יישום דומות המאפשרות משלוח גירוי בו זמנית אל Ringer המרוססת כך את זרימת המים בתא נשאר קבועה ובלתי פוסקת במהלך שחרורו של פתרון הגירוי. מקם את המשפך בצורה כזאת כי שקע דיסטלי הוא פחות מ -1 מ"מ הרחק אפיתל ההרחה.
- מניח חיישן טמפרטורת NiCr-Ni המחובר קרוב מדחום דיגיטלי כדי האפיתל ולשקע של מוליך המשפך. וחוט יציאת פלט מדחום למחשב להקליט חזותי דיסלשחק שינויי מתח המשקף תנודות טמפרטורה קטנות.
- לפני תחילת הניסוי, להתחבר עוד thermosensor כדי מדחום רגיל להקים את גורם קנה המידה מתח אל-טמפרטורה.
- סקר הטמפרטורה באמבטיה בחדר ההקלטה ולהבטיח שזה לא יעלה על 22 מעלות צלזיוס.
- הפעל את רכישת התמונה ברצף להחיל 200-400 μl של קר רינגר, L-היסטידין והצלצול-בטמפרטורת החדר (20-22 מעלות צלזיוס) באמצעות פיפטה אלקטרונית עם מרווח interstimulus של 20-30 שניות. עבור שליטה טובה יותר של יישום גירוי, לשחרר את הגירוי עם אות ההדק ששלחה ההתקנה הדמיה נבחרה כדי פיפטה במידת האפשר. חזור על פרוטוקול יישום עבור תוצאות לשחזור.
- קח סטים של הקלטות כבר עם כמה סיבובים של גירוי מאז הם עדיפים לניתוח שלאחר הדמיה עם הדמית מתאם פעילות.
הערה: פשרה בין זמן ההקלטה ואת הכדאיות הפרוסה ישלהימצא. מדידות של CA. 2 דקות מכסי 6 יישומי גירוי מאפשרות פעילות מספקת עבור שחזור טוב של הרשת.
6. הדמית מתאם פעילות באמצעות עיבוד תמונה (ACI)
- עיבוד תמונה של הקלטות מראש הסינפטי
- בהקלטות עם גירוי על ידי פתרון רינגר קר היסטידין, להבדיל הטמפרטורה הרגישה γ-neuropil מן glomerulus היסטידין רגיש השכנה ידי פרופילי התגובה השונים שלהם (ראה Kludt et al. 5).
- צור הקרנת עצמה מרבית בכיוון הצירי מהקלטות של הכנת המוח שבו ORNs כבר electroporated עם שני צבעים שונים כדי להמחיש את העצבוב הבילטרליים של-glomerulus γ.
- עיבוד תמונה של ההקלטות פוסט-סינפטי באמצעות הדמית מתאם פעילות (ACI)
- הקלטות בחרו עם נקודות מספיק זמן (יותר מ -100 מסגרות) ואת סכום מכובד של פעילות (לפחות שני אירועים).
הערה: הפעילות יכולה להיות גם ספונטני כדי לחשוף את התהליכים של תאים צניפי יחיד או המושרה על ידי מספר יישומים של גירויים באותה הקלטה כדי לחשוף את רשתות הסלולר מופעל על ידי גירויים חוש הריח. - בחר הקלטות שבו המבנים נמדדו לעבור לא יותר מ 2-3 פיקסלים לאורך זמן ההקלטה.
הערה: הקלטות עם תנועה רבה מדי יכולות להינצל על ידי החלת הליך תיקון משמרת המתוארת Kludt ואחות 5. - בדקו אם הקלטה סובלים לבן. אם העוצמה הממוצעת של התמונה כולה טיפות במשך זמן ההקלטה, תיקון אקונומיקה הכרחי, אחרת לדלג על שני השלבים הבאים.
- חישוב המגמה ליניארי עבור עקבות הזמן של כל פיקסל על ידי ביצוע רגרסיה ליניארית.
- לחסר את התוצאה מכל פיקסל בנפרד לחסל את componen ליניאריt של הלבנה.
הערה: כמו הולם לז חלופי יכול לשמש כפי שתואר על ידי Bao ו שילד 9. - הורד את התסריט MATLAB מוכן לשימוש יחד עם מדריך צעד-אחר-צעד הדמיה מתאם פעילות (ACI) כפי שתואר על ידי Junek et al. 6
הערה: בצע את השלבים המתוארים Junek ואח 6 כחלופה באמצעות סקריפט MATLAB הניתנים.. - הזז את 'aci.m' הקבצים, 'matVis.m' ו 'aci_roiSelector.m' מהמכל שהורד לנתיב MATLAB של המערכת בשימוש להערכת נתונים.
- טענת את הנתונים הגולמיים רכשו בשלב 5.8 כמשתנה לסביבת העבודה של משתמש MATLAB המאורגן כמו [x, y, z, t] -matrix עם x ו- y בהתייחסו הממדים לרוחב, z, את הכיוון ואת t הציריים, את מהלך הזמן .
- 'ACI' שיחה משורת הפקודה MATLAB.
- בממשק המשתמש (UI)המופיעה, בחר 'כן נתונים', ולאחר מכן בחר במשתנה המכילה את הנתונים ואת ספרייה שבה התוצאות תישמרנה.
הערה: לקבלת תיאור מלא של ממשק המשתמש לראות במדריך המלווה את התסריט ACI. - גלול z-השכבות נמדדו על ידי הזזת המחוון המקביל בממשק המשתמש כדי לקבל סקירה של המפה השונה המוצגת.
- הזן את גודל האזור של עניין (ROI) לתוך ממשק המשתמש. עבור סומה תא צניפי להתאים את ההחזר על ההשקעה כדי להקיף כ 10 מיקרומטר לרוחב ו -5 מיקרומטר בכיוון הצירי. במשך glomerulus, הערכים מעט גבוה של 20 מיקרומטר רוחבית 10 מיקרומטר axially מתאימים.
הערה: גודל ROI יש להזין כמספר הפיקסלים, אשר תלוי דרוג פיקסל שנבחר ההקלטה. - בחר ROI המכיל את-glomerulus γ ואזורים נוספים עבור כל soma גלוי של תאים צניפי שמסביב ידי לחיצה עם כפתור העכבר האמצעי על center של התא / glomerulus.
- סגור את ממשק המשתמש העיקרי אשר מפעיל חישוב קורלציה ממפה עבור כל עקבות ההתייחסות. התוצאה נשמרת אוטומטית ומוצגת.
- הקלטות בחרו עם נקודות מספיק זמן (יותר מ -100 מסגרות) ואת סכום מכובד של פעילות (לפחות שני אירועים).
Representative Results
את electroporation של נוירונים קולטני ריח (ORNs) הושג עם צבעי אלקסה פלואוריד או אינדיקטורים סידן מצומדות עם מולקולות Dextran תיוג האנטרוגרד באמצעות תחבורת axonal פעילה. בעוד צבעים לשעבר לספק מכתים בהיר של עצב סנסורי ומסופי האקסון שלהם הסתעפות בשכבת גלומרולרי של הנורה, האחרון לאפשר מדידת הפעילות העצבית בתאים אלה (איורים 1 ו -2). ראשית, את המיקום של γ-glomerulus thermosensitive דפוס העצבוב שלו היה דמיינו ידי electroporating אלקסה פלואוריד 647 Dextran אלקסה פלואוריד 546 Dextran ב האפיטל שמאל וימין חוש הריח, בהתאמה (איור 1 א). עשרים וארבע שעות לאחר ההליך, ORNs בנחיריים, שני עצבי חוש הריח ואת glomeruli בשתי ההמיספרות נראו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אשכולות גלומרולרי שונים היו identifiable ידי בעמדותיהם, הקבוצה הקטנה בעיקר המרכיבות את-glomerulus γ (איור 1B). מספר קטן של סיבי נגדי הרחה רץ דרך נורת חוש הריח הנגדית, חצה השליך הקדמי הסתיים ב-glomerulus γ ipsilateral (איור 2 א).
על מנת לרשום תגובות סידן של סיבי presynaptic של glomerulus-γ, סידן גרין Dextran היה electroporated ב ORNs, על פי אותו נוהל. קפיצות בטמפרטורה שליליות היו מושרה על הנחיר באמצעות השחרור המבוקר של פתרון Ringer קר כקרח (0-1 מעלות צלזיוס). נפח 3D המרכיב את-glomerulus γ היה צלם תחת מיקרוסקופ confocal קו תאורה מהר. ΔTs של -1 ° C הספיק כדי לעורר תגובות קרות glomerulus-γ ו afferents שלה, מוכר כמו פסגות הפיכות עקבות ΔF / F Ca 2 + (איור 2B </ strong>, C).
צעדי ניסויים נוספים בוצעו על מנת למדוד את הפעילות קרה הנגרם בתאים צניפי מחוברים glomerulus-γ באמצעות קצות הדנדריטים ההסתעפות שלהם. סיבי-סינפטי אלה ואת neuropil שמסביב הוכתמו ביעילות על ידי טעינת בולוס של AM Fluo-8 צבע רגיש בסידן, ביצע כמה ימים לאחר Alexa 647 Dextran היה electroporated לתוך ORNs (איור 3 א ', ב'). תאים צניפי התמלאו AM Fluo-8, ואת אפיתל ההרחה היה מגורה פעמיים על פי הפרדיגמה הבאה: Ringer קר, היסטידין (10 מיקרומטר) בטמפרטורת החדר רינגר, הוחל בהמשך. שתי עקבות התייחסות נלקחו מאזורי עניין בהיקף רשם, המגיבים באופן בלעדי טמפרטורת תרד, והשני, כדי היסטידין בלבד. הדמית מתאם פעילות (ACI) 6 חושבה בהתבסס על ההפניה שנבחרהעקבות לדמיין עם ניגודיות גבוהה את המורפולוגיה הדנדריטים של רשתות postsynaptic המתאים או לטמפרטורה או האות היסטידין-תגובה Ca 2 + (איור 3 ג, ד). לבסוף, thermosensitive ו chemosensitive מפות היו בצבעים ומצופות על גב אחד את השני, כדי להראות כיצד טמפרטורת מידע כימי מועברות מן glomeruli הבודד לתאי עצב מהסדר שני חוש הריח (איור 3E). לתיאור של האינטגרציה והעיבוד של שני סוגי המידע ברשתות הרחה משותפות, ראה ואח Kludt. 5
איור 1: סקירה כללית של טעינת electroporation ו בולוס Orn (א) נוירונים קולטני ריח בשני חללי האף של X.. laevis הזחלים היו electroporated עם צבעים Alexa או calciuצבעים מ רגיש מצמידים את מולקולות Dextran. האינדיקטורים פלורסנט הובלו anterogradely עד arborization אקסונלית סופנית. 24 שעות לאחר electroporation, השכבה גלומרולרי בשתי ההמיספרות הראתה מכתים ניאון. (ב) סכמטי של הארגון הסלולר של נורת חוש הריח בהמיספירה אחת. השכבה גלומרולרי החובקת את הנורה באשכולות: אשכולות המדיאלי, קטנים, בינוניים לרוחב. מידע חוש הריח מועבר מן הנוירונים קולטן מיטרלי תאים באמצעות סינפסות מעוררות ב glomeruli. תאי Periglomerular ותאי גרגיר הם נוירונים מעכבים ויסות עיבוד וקידוד חוש ריח. Γ-glomerulus (ציאן) זוהה בקלות כמו neuropil הקטן שבו ipsilateral (אדום) ו נגדיים (כתום) סיבי הרחה התמזגו. (C) בולוס טעינה הושגה בקרבה-glomerulus γ להכתים את neuropil פוסט סינפטי עיקריהן תאי המיטרלי dendri שלהםעצי טיק הסתעפות משמעותית בשכבת גלומרולרי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: Electroporation של ORNs מגלה קישוריות מבנית ותפקודית (א) עצבוב בילטראליים של glomerulus-γ על ידי (ירוק) ipsilateral ו נגדי (אדום) נוירונים קולטני ריח (ORNs).. בר סולם = 50 מיקרומטר. (ב) הנורה חוש הריח לאחר electroporation עם סידן צבען רגיש-סידן גרין Dextran. Intermedial (המי"ל), המדיאלי (MC) ואת המקבץ הקטן (SC) גלויים. התמונה היא השלכה מרבית של 100 נפחי מדידת מיקרומטר בעובי. בר סולם = 50 מיקרומטר. (C) תצוגת תקריב של הקבוצה הקטנה. ההיקף רשם (12 מיקרומטר) הואייצג בהיטל מקסימאלי. התמונה מתארת את רמת פלורסנט הבזליים באפור והמפה בצבעים ΔF / F כשכבה. התגובה המרבית לגירוי עם פתרון Ringer קר זממה. Γ-glomerulus הגיב בחריפות תוך שתי glomeruli השכנות לשתוק. הבלעה מראה את עקבות ΔF / F עבור γ-glomerulus המתאים לאזור המצוין של עניין. הפס הכחול מייצג את יישום הגירוי. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. בולוס העמסה ACI לנתק thermosensitive ורשתות chemosensitive (א) אקסונים של ORNs סיום באשכול קטן הוכתמו על ידי electroporation עם הלא-calciאממ Alexa 647 Dextran לצבוע רגיש. הקו המקווקו מתאר את-glomerulus γ. (ב) תמונה של אותו האזור כמו ב (א) בערוץ המדידה השני לאחר טעינת בולוס עם הצבע רגיש בסידן Fluo-8 בבוקר. חלק somata תא צניפי נראה אך הקונטרסט היה מוגבל. בעקבות החצים, שתי עקבות תגובה היו זממו, אשר שמשו הדמית מתאם פעילות (ACI). כחול, ברים אדומים ושחורים מתחת העקבות לתאר את תחילת היישום של רינגר קר, היסטידין (10 מיקרומטר) בטמפרטורת חדר רינגר כפי בקרה שלילית, בהתאמה. שני עקבות 2+ Ca נלקחו מאזורים השונים של עניין של הנפח הנמדד. (C) התוצאה ACI של קורט (B) הדגשת אזורים להגיב בעיקר כדי רינגר קר. (D) התוצאה ACI של קורט (B) הדגשת אזורים להגיב בעיקר כדי היסטידין. (E) כיסוי של שתי מפות ACI. תאי צניפי להגיב histidine ואת glomerulus מעוצבבים (אדום) ניתן להבחין בקלות בין תאים צניפי thermosensitive ואת-glomerulus γ (ציאן). כל התמונות של נתון זה הם תחזיות בעוצמה מקסימלית של נפח 28 מיקרומטר בעובי. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
השיטות שהוצגו במסמך זה מכוונים עיבוד טמפרטורה הקלטה ב הנורה חוש הריח של Xenopus laevis ראשנים. כתמי הפרוטוקול הראשון ונוירונים מסדר שני ב נורה חוש הריח ומספקים הכנת מדגם שבו מערכת חוש הריח נשארת בעיקר ללא פגע. לפיכך, ההפעלה-glomerulus γ רגיש לטמפרטורה ניתן לנטר לעומת glomeruli שכנות הכימותרפיה הרגישה שלה. העצבוב הבילטרליים הייחודי של glomerulus זה דמיין ידי electroporation תא עם צבעים שונים גל. יתר על כן, טוען בולוס מאפשרת צביעת תאים צניפי פורש נפח גדול בתוך פקעת ההרחה. עיבוד רשת העצבי אותות מושרה הטמפרטורה מתגלים על ידי לקיחת מידות סידן עם יישומי גירוי חוזרים ונשנים ולאחר מכן לנתח את הנתונים עם הדמית מתאם פעילות.
פרוטוקול מבליט שני proce מכתים מתוחכם לדינים ונהלים הנוגעים לעניין, אשר שניהם דורשים מניפולציה ותרגול זהירים על מנת להשיג תוצאות מספקות לשחזור. במהלך electroporation כל פגיעה של חיות יש להימנע, במיוחד כאשר מיצוב אלקטרודות לתוך הנחיריים. באופן אופטימלי, ללא מגע עם אפיתל ההרחה אמור להתרחש. ראוי לציין, כי בעלי החיים עדיין חיים לאחר הליך electroporation וזמן ההתאוששות שלהם חייב להילקח בחשבון. אם המכתים נשאר חלש מדי אחרי סיבוב אחד של electroporation, אשר יכול לקרות בהתאם לסוגים של צבעים הרגילים, עוצמתו ניתן לשפר על ידי הגדלת ריכוז לצבוע בנחיריים. מאז מולקולות מצמידי dextran מועברות באמצעות מספר מנגנונים כולל הובלת אקסונלית איטית (במהירות של 1-2 מ"מ / יום 10) דיפוזיה פסיבית, אלטרנטיבה אחרת היא לחכות 48 שעות לאחר electroporation לפני הקרבת החיות. לחלופין, electroporation ניתן לחזור לאחר יום אחד של התאוששות.
jove_content "> טוען בולוס הוא שלב קריטי שכן כמות צבע הזנת התאים צניפי קשה לווסת תלויה בפרמטרים שונים כמו גודל קצה פיפטה ומיקום של היישום. ניטור ההליך תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal מוכיח להיות שימושי התאמה משך יישום צבע ובכך ליצור תוצאות מכתימות דומות ברחבי הכנות. יתר על כן, ראשני electroporated בעבר אמורים לשמש כדי לקבוע את המיקום הטוב ביותר עבור היישום לצבוע ידי זיהוי המיקום של הקבוצה הקטנה (המרכיב את-glomerulus γ). לכל היותר שלב קריטי במהלך מדידות הוא להימנע הוא השינוי לבן של המדגם. המעבר ניתן להימנע בקפידה על ידי מיצוב זרימת רינגר תחת מיקרוסקופ. כפי להגביל את הלבנה של השטח של עניין, זמן המדידה צריך להיות מופחת החיוני .בולוס מכתים טעינה עם צבעים רגישי סידן רק מספק מאודבניגוד מוגבל מאז תאים בריאים בעלי רמות סידן נמוכות בדרך כלל ובכך להראות קרינת בסיס חלשה. החלת הדמית פעילות מתאם עוקף מגבלה זו על ידי יצירת ניגוד על בסיס מבנים פעילות המדגישים עם אותות סידן דומים. שיטת ניתוח שלאחר רכישה זו מחשבת את גורם המתאם בין אות סידן של אזור נבחר של עניין (זכר הפניה) וכי של כל פיקסל בהיקף 3D. לכן, התוצאות המתקבלות תלוי מאוד על דפוס הפעילות נבחר עקבות התייחסות. אם ההתמקדות העיקרית היא לחזות דפוסי עצבוב תא צניפי, אות התייחסות נגזר הפעילות עצבית ספונטנית היא מועדפת, ובחירת תאי צניפי הפעיל ביותר תפיק את התוצאות הטובות ביותר. לחשיפת רשתות chemo- או תרמו-רגיש של תאי צניפי, עקבות התייחסות יחידות המכילות תגובות היסטידין או או רינגר קר צריכות להיות מסומנות. הבחירה של o glomerulus כולוr סומה תא צניפי כמו האזור של עניין לא תמיד לספק שמץ התייחסות ברורה, במיוחד אם המבנים להגיב לשני גירויים שונים שוכבים על גבי אחד את השני. במקרה כזה, הוא לעתים קרובות שימושי כדי לבחור שטח קטן יותר של glomerulus או גוף תא כמו אזור של עניין.
בעשורים האחרונים, electroporation תואר שיטה יעילה להכתים תאים בודדים או מרובים 11,12. הנה זה משמש תווית נוירונים קולטני ריח ספציפי. מולקולות מצומדות dextran לתת את היעילות הגבוהה ביותר, ועל צבעי רגיש שאינו סידן, בטווח של מבחר רחב ומכסה את הספקטרום המלא משמש בדרך כלל מיקרוסקופ פלואורסצנטי 13. עם זאת, צבעי רגיש סידן אשר electroporated בהצלחה לתוך הנוירונים קולטני ריח הם כרגע מוגבל dextran סידן-ירוק, סוגי הפולימרים Fluo-4 אם עדיין זמינים מסחרית. חוץ מזה, ההקלטות למקד בעיקר superficial שכבות על פני שטח הגחון של נורת חוש הריח בלבד, שכן את עומק החדירה של טכניקות מדידה מהירות מוגבל. שני פוטוני הדמיה יכולה בחלקו להתגבר על מגבלה זו, אך לעתים קרובות חסרת מהירות ומגבילה את כמות צבעי סידן רגיש לבחירה נוספת.
תארנו כאן פרוטוקול למדידת פעילות מושרה טמפרטורה הנורה חוש הריח. המוח neuropil נסרק ככרך תלת ממדים כדי להמחיש את רשתות הסלולר המורכבות המעורבים בעיבוד חוש הריח של טמפרטורה. מדידת פעילות מושרה טמפרטורה הנורה חוש הריח כבר מזמן דיווחה 5 ודורשת הליך אישית במיוחד משלב טכניקות שונות. הנכס העיקרי של הטכניקות שהוצגו לעיל היא כי מאות תאים הם צילמו בשלושה ממדים בתוך הכנה שבו רוב של מערכת חוש הריח נשאר שלם. יתרונות אלה לשים דרישות גבוהות על הטכניקות המכתימות כמו גם את המוח pפיצוי והדמיה. לדוגמא, electroporation התא וטעינת בולוס פגעו כמויות גדולות של תאי האפיתל ואת פקעת ההרחה, ובכך לאפשר ההדמיה של רשתות הסלולר שלמות. יתר על כן, את המסירה של אינדיקטורים כימיים באמצעות טעינת בולוס במקום fluorophores מקודד גנטית מאפשרת מדידות סט פוטנציאל גדול של מינים. חלופות אחרות כמו דגירת אמבטיה עם צבעי AM לעבוד בעיקר פרוסות הפוגעות פקעת ההרחה קשה, ומשאירות רק כמה מאה מיקרומטר של רקמות שלמות. לשם השוואה, הכנת ההר השלמה בשימוש בפרוטוקול שלנו מבטיחה למשל כי עצבוב הבילטרליים של-glomerulus γ נשאר שלם וללא הקלטות ובכך נלקחות במערכת עדיין פעילה. לבסוף, הדמיה עצמה נעשית על ידי מיקרוסקופ קו תאורה המאפשר רכישת כרכים 3D. מיקרוסקופיה קו תאורה היא אחת הטכניקות confocal מתן שיעורי הרכישה הגבוה ביותר האפשרי 6 </ Sup> אשר נחוצים כדי לכסות חלק גדול של נורת חוש הריח. איטי רכישת מערכות ניתן להשתמש אך יש חיסרון, כי את גודל נפח רשמה חייב להיות מופחת. בשנים האחרונות, שיטות אחרות לרכישת תמונה מהר פותחו ויכולות לשמש חלופות 14,15. אף על פי כן, קו-תאורת מיקרוסקופיה נשאר באחת מהשיטות הקלות ביותר כדי לקבל מהירות וגם ברזולוציה מתאימות. הנה כדלקמן קצת מידע כקווים מנחים לבחירת setups הדמיה המתאימה. מאז הדמית סידן נעשית בתוך מן הכנות מוח עבות, ההתקנה צריכה לספק confocality גוון המטרות צריכות מפתח נומרי של 1.0 ומעלה. עבור נקודת התייחסות, ההקלטות שצולמו במיקרוסקופ תאורת הקו מתאימות תמונות שצולמו באמצעות מיקרוסקופ סריקת ליזר רגיל עם גודל חריר של 0.5-1 יחידות אווריריות. מהירויות רכישה מהירות רצויות. נפח עם עובי של 20 מיקרומטר מכוסה לפחות 5 ליטראיירס, שדה לרוחב המבט של 100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר גודל פיקסל של 0.5 מיקרומטר או קטן יש לסרוק במהירות מינימלית של 1 הרץ לכל מחסנית. צמצום confocality יכול להגדיל את כמות הפוטונים נספר ובכך מאפשר לרכישות מהר במידת הצורך, אבל יש את החיסרון של הקלטה יותר out-of-פוקוס אור. עם זאת, מאז גישה כזו מגדילה את עובי הפרוסות האופטיות, זה באמת יכול להקל על האיתור של דנדריטים באמצעות z-מישורים שונים לאחר היישום של ACI 6.
את הכלים הדרושים כדי ללמוד עיבוד הטמפרטורה בהרחבה ברשתות פקעת ההרחה מוצגים במסמך זה. פעילות טמפרטורה הנגרמת נרשם נוירונים מסדר ראשון ושני באמצעות צבעים סידן רגיש אותות הן נכנסים ויוצאים מן-glomerulus γ. יתר על כן, את המידה שבה תאים צניפי הפרט לעבד הן מידע כימי וטמפרטורה ניתן להעריך. מאז לאה כןves נורה חוש הריח שלם, את התפקיד של העצבוב הבילטרלי עיבוד חוש הריח יכול להיחקר נוסף. ההליך הוא גם שימושי עבור חושף האם וכיצד תרמו ו chemoinformation מקודד חופפים 5 רשתות חוש הריח. לבסוף, טכניקות הנ"ל אינן מוגבלות בחקר תגובות הטמפרטורה הנורה חוש הריח אבל יכולות להיות מיושמות על הערכה כוללנית יותר של מערכת חוש הריח, ובעיקר רשתות עיבוד הסלולר גדולים בשלושה כרכים ממדיים. טעינת בולוס והדמיה מתאם הפעילות הם כלים רבי עוצמה כדי לצפות ולהשוות את הפעילות של עשרות נוירונים, מה שהופך אותם החלים על רשתות מוח שונים 16.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Sodium chloride | Merck Millipore | 1064040500 | |
| Potassium chloride | Merck Millipore | 1049360250 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1023820250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 1058330250 | |
| D(+)-Glucose | Merck Millipore | 1083371000 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| HEPES | Merck Millipore | 1101100250 | |
| Calcium Green 10 kDa Dextran | Thermo Fisher Scientific | C-3713 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | D-22914 | |
| Dextran, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | D-22911 | |
| Fluo-8 AM | TEFlabs | 203 | |
| MK571 | Alexis Biochemicals | 340-021-M005 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Pluronic acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | powder |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 53370 | |
| DMSO | Merck Millipore | 1029522500 | |
| Equipment | |||
| Electronic pipette | BrandTech | HandyStep Electronic Repeating Pipette | |
| NiCr-Ni thermocouple | Greisinger Elektronik | GTF 300 | |
| Micropipette puller | Narishige | Model PC-10 | two-step puller |
| Funnel applicator | (Custom-made) | ||
| Line-illumination microscope | (Custom-made) | otherwise, a commercially available spinning disk microscope | |
| Objective W Plan-Apochromat 63X/1.0 | Zeiss | 441470-9900-000 | |
| Objective W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | |
| Software | |||
| MATLAB | The MathWorks | from R2010b upwards |
References
- Mamasuew, K., Breer, H., Fleischer, J. Grueneberg ganglion neurons respond to cool ambient temperatures. Eur J Neurosci. 28 (9), 1775-1785 (2008).
- Brechbühl, J., Moine, F., Broillet, M. -C. Mouse Grueneberg ganglion neurons share molecular and functional features with C. elegans amphid neurons. Front. Behav. Neurosci. 7 (193), (2013).
- Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. J Comp Neurol. 489 (4), 403-424 (2005).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. J Neurosci. 35 (20), 7892-7902 (2015).
- Junek, S., Chen, T. W., Alevra, M., Schild, D. Activity correlation imaging: visualizing function and structure of neuronal populations. Biophys J. 96 (9), 3801-3809 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
- Schild, D. A computer-controlled device for the application of odors to aquatic animals. J Electrophysiol Tec. 12 (2), 71-79 (1985).
- Bao, G., Schild, D. Fast and Accurate Fitting and Filtering of Noisy Exponentials in Legendre Space. PLoSONE. 9 (3), (2014).
- Terasaki, M., Schmidek, A., Galbraith, J. A., Gallant, P. E., Reese, T. S. Transport of cytoskeletal elements in the squid giant axon. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (25), 11500-11503 (1995).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Lechleiter, J. D. Chemical Calcium Indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Salome, R., et al. Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy using acousto-optic deflectors. J Neurosci Methods. 154 (1), 161-174 (2006).
- Keller, P. J., Ahrens, M. B., Freeman, J. Light-sheet imaging for systems neuroscience. Nature Methods. 12 (1), 27-29 (2015).
- Hjorth, J. J., et al. Detection of silent cells, synchronization and modulatory activity in developing cellular networks. Dev Neurobiol. , (2015).
