Protocol
Alle Versuche mit Xenopus laevis Kaulquappen wurden nach den Richtlinien der Universität Göttingen Ausschuss für Ethik in der Tierversuche genehmigt durchgeführt.
1. Die Elektroporation
- Wählen Sie Tiere der Stufen 49-54 nach Nieuwkoop und Faber 7.
- Stellen Sie sicher, dass das Aufzeichnungs Aufbau eines Stereomikroskopes mit einem großen Arbeitsabstand und eine Elektroporationsvorrichtung besteht, die Spannungsimpulse von 20 V für 20 msec bei einer Frequenz von mindestens 2 Hz anwenden können. Übernehmen Sie die Spannungsimpulse über zwei Platinelektroden mit einem groben Durchmesser von 200 & mgr; m, so dass sie ohne Schaden zu verursachen in die Kaulquappen "Nasenlöcher eingeführt werden kann.
- Bereiten Kristalle eines Dextran konjugierten Farbstoff (beispielsweise Calcium Green 10 kDa Dextran oder Alexa Fluor 647 10 kDa Dextran) , indem die typischerweise gelieferte Menge von 5 mg in 100 ul destilliertem Wasser gelöst und lassen kleine Tröpfchen von2 ul trocken auf einem Blatt Parafilm.
Anmerkung: Die Kristalle in weniger als einem Tag trocken und kann danach bei -18 ° C im Gefrierschrank für eine Dauer von mehr als einem Jahr gelagert werden. - Anesthetize die Tiere, indem sie in Leitungswasser, das 3% Tricaine Methansulfonat für 1-2 min platzieren, bis er die chirurgische Anästhesie Zustand gekennzeichnet erreicht durch eine verminderte Herzfrequenz, Verlust aller Bewegungen und fehlende Antworten auf mechanische Reize.
- Tauchen Sie den narkotisierten Tier für 10 Sekunden in reinem Leitungswasser.
- Legen Sie das Tier auf einem Gelkissen und fixieren Sie sie mit Nadeln herum platzieren, ohne sie zu beschädigen.
Hinweis: Nehmen Sie das Tier nicht beheben, indem Nadeln durch seine Haut Stossen. - Trocknen Sie den Bereich vorsichtig die Nase mit einem Gewebe umgeben.
- Legen Sie das Tier unter dem Stereomikroskop und konzentrieren sich auf die Nase.
- Verwenden einer Pinzette, einen Farbstoff Kristall von Größe zu wählen, die Nasenloch Loch passend, legen Sie es in eine der Nasenhöhlen und warten, bis es vollständig auflöst, which dauert weniger als 1 min. Wenn die Kristalle kleiner sind, fügen Sie 2 oder 3 in jeden Hohlraum, bis sie eine nicht-durchlässiger, hochkonzentrierte Lösung herzustellen.
- Platzieren Sie die Kathode auf der Haut der Kaulquappe und der Anode in eine der Nüstern.
Hinweis: Diese besondere Einstellung zu den in Schritt 1.3 genannten Farbstoffe gilt. Für Farbstoffe mit einer anderen Polarität, die Färbeergebnisse kann durch Anordnen der Kathode in die Nasenlöcher verbessert werden. Wenn Sie sich unsicher über die Polarität des Farbstoffs können beide Elektroden gleichzeitig in der Nase (eine pro Nasenloch) angeordnet werden, und die Polarität zwischen den einzelnen Spannungsimpulse abwechselten. - Bewerben sechs Impulse von 20 V und 20 ms mit etwa 0,5 Sekunden von Stimulus-Intervall.
Hinweis: Kleine Blasen um die Elektrode in das Nasenloch bei der Elektroporation vorgesehen, dass die Elektroden in Kontakt mit der Haut und der Lösung in das Nasenloch erscheinen soll. Wenn keine Blasen sichtbar überprüfen Sie die Anschlusskabel sind und stellen Sie sicher, dass die Elektroporation device liefert die gewünschte Spannungsimpuls. - Wiederholen Sie den Vorgang (1,9-1,11) für das zweite Nasenloch.
- Übertragen Sie die elektroporierten Kaulquappe in ein Becherglas mit Leitungswasser bei Raumtemperatur gefüllt. Warten Sie 5 bis 10 Minuten, bis das Tier das Bewusstsein wiedererlangt und wieder seine Schwimmen. Ziehen Sie es und lassen Sie es für mindestens 1 Tag erholen, während der der Farbstoff entlang der Riechnerv zu den Riechkolben transportiert wird.
- Verwenden Sie die elektroporierten Tiere innerhalb von 1-7 Tagen nach der Elektroporation für die beste Bildergebnisse. Geben Sie mindestens 24 Stunden Zeit für Farbstofftransport und Erholung vor Bildgebung.
2. Ganze Berge Vorbereitung
- Anästhesieren das Tier in Leitungswasser, enthaltend 3% Tricaine Methansulfonat, bis alle Bewegungen aufgehört haben, und es reagiert nicht mehr auf mechanische Stimulationen.
- Übertragen Sie die Kaulquappe zu einem Gel-Kissen unter einem Stereomikroskop und fixieren Sie es fest, indem Sie auf jeder Seite der fo Nadeln durch die Haut Stossenrebrain.
- Opfere die Kaulquappe durch sein Rückenmark Trennen.
- Verwenden Sie ein Skalpell einen Block von Gewebe beide Nasenhöhlen enthält , zu sezieren aus, die Geruchsnerven und Riechkolben (Abbildung 1A). Machen Sie den ersten Einschnitt nahe an linken Nasenflügel, ohne es zu berühren-und die Klinge nach vorne Schneiden neben dem linken Nervus olfactorius und Birne bis zum telencephalic-diencephalic Grenze bewegen. Do ebenfalls auf der rechten Seite. Isolieren Sie die Vorbereitung von dem Rest des Nervensystems durch einen endgültigen Schnitt hinter dem Telenzephalon machen.
- Entsorgen Sie den Körper des Kaulquappe und vorsichtig den Gewebeblock drehen den Kopf, so dass die Bauchseite des Gehirns Vorbereitung nach oben zeigt.
- Pin der Gewebeblock wieder durch Einsetzen zwei Nadeln zwischen den Geruchsnerven.
- Einen Tropfen Frog Ringer - Lösung (98 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 5 mM Glucose, 5 mM Na-Pyruvat, 10 mM HEPES, eingestellt auf pH 7,8, osmolarität von 230 mosmol / L) auf das Gewebe.
- Entfernen Sie die Meningen Abdeckung der Axon Sortierzone und die Riechkolben, indem sie drei Schnitte mit einer feinen Schere. Ausgehend von der hinteren Kante des Gewebeblocks, schneiden caudorostrally eng entlang des linken Bulbus olfactorius, bis der Eintrittspunkt der Geruchsnerven in den Lampen (das Axon Sortierzone).
- Wiederholen Sie Schritt 2.8 für die rechte Hemisphäre.
- Heben Sie die Meningen mit einer Pinzette und den dritten Schnitt zu machen, die senkrecht zu den vorherigen an der Axon Sortierzone.
Hinweis: Die Bauchseite des Bulbus olfactorius für die Bildgebung und Bolus-Laden jetzt zugänglich ist. - Um die Bildqualität im Durchlichtbild, wiederholen Sie den Vorgang für die dorsale Seite zu verbessern. Diese zusätzlichen Schritte können die Navigation der Mikropipette zur Bolus-Laden zu erleichtern, sind aber nicht unbedingt erforderlich.
- Übertragen Sie die Probe auf eine Aufnahmekammer mit Frosch Ringer für die Weiterverarbeitung und Bild gefüllt. Machture, dass die Bauchseite mit einem Netz aus Nylonfasern nach oben und zur Sicherung der Probe wird mit Blick auf überspannt einen kleinen Platin-Rahmen.
- Für eine einfachere Anwendung von Stimuli stellen die Nasenhöhlen auf einer der Nylonfasern.
3. Bolus Loading
- Auflösen 50 ug des Calcium AM - Farbstoff (zB Fluo-08.00 Uhr) in 20 & mgr; l Dimethylsulfoxid (DMSO) , die 20% Pluronic F-127 (w / v) , um eine Stammlösung von AM Farbstoffes herzustellen. Frieren Sie die Stammlösungen in kleinen Portionen von 1-2 & mgr; l Volumen. Die Stammlösung ist stabil für mindestens ein halbes Jahr, aber Gefrier-Auftau-Zyklen vermeiden.
- Verwenden Sie einen Mikropipette Abzieher und ziehen Pipetten mit einem Widerstand von 5-8 MOhm und einem Spitzendurchmesser von 1-2 um.
- Man löst die vorbereitete Vorratslösung des Farbstoffes in Frog Ringerlösung in einer Konzentration von 250-500 & mgr; M.
- In MK571 zu einer Konzentration von 500 erreichen uM multidrug resistance Transporter zu blockieren.
- Füllen Sie die Mikropipette mit 10 ul der Lösung, die eine längliche Pipettenspitze und entfernen Sie alle Luftblasen durch den Mikro schnippen.
- Montieren Sie die Mikropipette in der Pipettenhalter und stellen Sie sicher, dass der Druck angewendet werden kann entweder manuell mit einer Spritze oder einem pneumatischen Arzneimittelausstoßvorrichtung und überwachen den ausgeübten Druck mit einem Messgerät.
- Wenn möglich, verwenden Sie ein Mikroskopaufbau mit der Fähigkeit, die injizierte Farbstoff zu erregen, so dass der Abfluss aus der Mikropipettenspitze sichtbar gemacht werden kann und angepasst. Idealerweise mit einem konfokalen Imaging-Setup verwenden. Verwenden ein aufrechtes Mikroskop mit einem Immersionsobjektiv, so dass das Gewebe mit der Mikropipette erreicht werden kann.
- Legen Sie die ganze Berg Vorbereitung unter dem Mikroskop, folgen Sie den Riechnerv, bis die Glühbirne und konzentrieren sich auf den Bereich von Interesse im Riechkolben.
- Perfuse frische Ringer-Lösung durch die Aufnahmekammer, um die Lebensfähigkeit der Zubereitung zu erhöhen und den Farbstoff undichten auswaschenvon der Mikropipettenspitze.
- Senken Sie die Pipette auf die Oberfläche des Riechkolbens, mit der Spitze nach in die rostrale Richtung der Zubereitung.
- Eine kleine und konstante positive Druck (~ 25 hPa) auf die Mikropipette Verstopfen der Pipette zu verhindern, und sanft in das Gewebe einzuführen.
- Sobald die Pipette die äußeren Gewebeschichten durchbrochen hat, verschieben Sie es in einer rostro-dorsale Richtung in die Mitral-Zellschicht. (Beachten Sie, dass eine Gegenfärbung der olfaktorischen Rezeptorneuronen durch Elektroporation hilfreich ist die Mikro Position einzustellen.) Idealerweise legen Sie die Pipettenspitze in einem Abstand von 50 bis 100 & mgr; m von der gewünschten Aufnahmeort.
- Für den temperaturempfindlichen γ-Glomerulus Anfärben, Ziel eine Fläche etwa 50 um rostral von der Position des präsynaptischen Neuropil des γ-Glomerulus.
- Tragen Sie einen positiven Druck im Bereich von 100 bis 200 hPa. Einstellen der Druckfestigkeit in Abhängigkeit von der Größe derdie Mikropipettenspitze. Bestätigen Sie den Abfluss aus der Pipette durch für leichte Gewebe Bewegungen sichtbar unter Brightlight Beleuchtung zu beobachten, wenn der Druck zum ersten Mal angewendet wird.
- Halten Sie einen konstanten Druck für etwa 10 Minuten, während die Mikropipette im Gewebe bleibt. Wenn möglich, überprüfen Sie die Neuropil in der Zwischenzeit für die Zellbelastung unter Fluoreszenzbeleuchtung als erfolgreiche Laden in sichtbare Zelle somata Färbung führen wird mit Intensität im Laufe der Zeit zu erhöhen.
Hinweis: Oft ist der Grund für erfolglose Belastung ist aufgrund von Gewebe Pipette Verstopfung der Spitze oder aggregierte Farbstoff Cluster eingeben. Es ist manchmal möglich, die Pipette zu retten, indem Sie vorsichtig seine Spitze gegen die untere Oberfläche des Aufzeichnungskammer zu brechen. Allerdings sollte die Pipettenspitze nicht wenige Mikrometer nicht überschreiten. Compensate größere Öffnungen für Pipetten mit niedrigerem Druck während Bolus Laden Anwendung. - Nach den 10 Minuten der Belastung und reduzieren den ausgeübten Druck auf Null gesetzt und die Färbung überprüfen.
Hinweis: Die Größe des verschmutzten Bereich variiert beträchtlich und hängt von mehreren Parametern, wie Menge des injizierten Farbstoff und Lage der Ausstoßstelle. Eine gute Färbung erstreckt sich über eine Fläche von etwa 100 & mgr; m × 100 & mgr; m. - Wenn die verschmutzten Bereich zu klein ist oder nicht den gewünschten Aufnahmeort abdecken, wiederholen Sie die Schritte 3,10-3,13. Verwenden Sie die gleiche Mikropipette für die nächste Injektion, wenn sie noch nicht verstopft ist.
- Warten Sie mindestens 30 Minuten nach der letzten Injektion, bevor Sie irgendwelche Experimente beginnen Farbstoffaufnahme und Deesterifizierung zu ermöglichen. Weiter die Aufnahmekammer mit frischen Ringer-Lösung jederzeit zu perfuse.
4. Messeinstellungen
- Stellen Sie sicher, dass die Messanordnung mit ausreichender Geschwindigkeit eines konfokalen Mikroskops besteht dreidimensionale Volumen aufzunehmen. Wählen Sie eine Erfassungsrate von mindestens 1 Hz pro Stapel.
Hinweis: Geeignete Konfigurationen umfassen zum Beispiel Line-Beleuchtung Mikroskope Abtasten der Probe zeilenweise anstelle von Punkt punkt. Eine einfache Realisierung eines solchen Einrichtung wurde zuvor 6 beschrieben. Andere Optionen sind Spinning Disk-Mikroskope. Wenn keine solche Einrichtung vorhanden ist, ist es immer noch möglich, kleinere Bereiche mit einer normalen Punkt-Scan-Einrichtung zu messen. - Stellen Sie die Messparameter so, dass ein Volumen groß genug, um die Größe eines Glomerulus zu passen abgedeckt werden kann.
Anmerkung: Die typische Dicke eines Aufzeichnungsvolumen im Bereich von 20 & mgr; m ist, die durch mindestens 5 Schichten überzogen werden soll. - Überprüfen Sie alle präsynaptischen Messungen zum Bleichen. Stellen Sie die Laserleistung, bis die mittlere Fluoreszenzintensität der aufgezeichneten Bilder nicht über den Zeitverlauf der Aufnahme fällt.
- Begrenzen Sie die Messzeit und Bereich für Aufnahmen auf der postsynaptischen Seite Bleichen so weit wie möglich zu vermeiden, obwohl für Messungen von mehr als 20 bis 30 sec Bleichen wahrscheinlich auftritt.
5. Geruch Anwendung und Temperaturexperimente
- Gießen 25ml frischem Ringer-Lösung in einem 50 ml-Röhrchen (vorher bei 4 ° C gelagert). Das Röhrchen wird in einem Eiskübel.
- Überwachen die Temperatur des abgekühlten Ringer durch die saubere Sonde eines Thermometers in das Rohr eingeführt wird. Warten Sie, bis die Temperatur unter 1 ° C fällt vor dem Start des Experiments.
- Vorbereitung 50 ml L-Histidin, gelöst in Ringer-Lösung bei einer Konzentration von 10 uM.
- Verwenden Sie einen Trichter Applikator 8 oder ähnliche Anwendungssysteme ermöglicht Stimulus Lieferung gleichzeitig an die Perfusion Ringer , so dass der Wasserstrom in der Kammer während der Freigabe der Stimulus - Lösung konstant und ununterbrochen bleibt. Positionieren des Trichters in der Weise, dass die distale Austritts weniger als 1 mm entfernt von dem olfaktorischen Epithel.
- Legen Sie eine NiCr-Ni-Temperatursensor in ein digitales Thermometer nahe dem Epithel und dem Auslass des Trichters Applikators verbunden. Draht, der die Thermometer Ausgabe-Port an einen Computer zu erfassen und visuell disspielen Spannungsänderungen reflektieren kleine Temperaturschwankungen.
- Vor dem Versuch, schließen Sie einen anderen Thermosensor zu einem Standard-Thermometer, um die Spannungs-Temperatur-Skalierungsfaktor zu etablieren.
- Umfrage der Badtemperatur im Aufnahmeraum und sicherzustellen, dass es nicht 22 ° C nicht übersteigt.
- Starten Sie die Bildaufnahme und gelten sequentiell 200-400 ul kalter Ringer, L-Histidin und Raumtemperatur-Ringer (20-22 ° C) über eine elektronische Pipette mit einem Interstimulus Intervall von 20-30 sec. Für eine bessere Steuerung der Reizapplikation, lassen Sie die Anregung mit einem Triggersignal von dem gewählten Bildgebungsaufbau zum Pipetten wenn möglich gesendet. Wiederholen Sie die Anwendung Protokoll für reproduzierbare Ergebnisse.
- Nehmen Sie Sätze von mehr Aufnahmen mit mehreren Runden der Stimulation, da sie für die Post-Bildanalyse mit Aktivität Korrelation Bildgebung vorzuziehen sind.
Hinweis: Ein Kompromiss zwischen der Aufzeichnungszeit und der Scheibe Lebensfähigkeit hatgefunden werden. Messungen von ca. 2 min Abdeckung 6 Stimulusanwendungen ausreichende Aktivität für eine gute Rekonstruktion des Netzes.
6. Bildverarbeitung Activity Correlation Imaging (ACI)
- Bildverarbeitung der Präsynaptische Recordings
- In Aufnahmen mit Stimulation durch Kalt Ringer - Lösung und Histidin, zeichnen die temperaturempfindliche γ-Neuropil von der benachbarten Histidin empfindlichen Glomerulus durch ihre unterschiedliche Reaktionsprofile (siehe Kludt et al. 5).
- Erstellen eines maximalen Intensitätsprojektion in der axialen Richtung von Aufnahmen des Gehirns Zubereitung in denen ORNs mit zwei verschiedenen Farbstoffen elektroporiert wurden, um die bilaterale Innervation des γ-Glomerulus zu visualisieren.
- Bildverarbeitung der postsynaptischen Recordings Mit Activity Correlation Imaging (ACI)
- Wählen Aufnahmen mit ausreichender Zeitpunkten (mehr als 100 Frames) und eine anständige Menge an Aktivität (mindestens zwei Veranstaltungen).
Hinweis: Die Aktivität kann entweder spontan sein, die Prozesse der einzelnen Mitralzellen zu offenbaren oder induziert durch mehrere Anwendungen von Stimuli während der gleichen Aufnahme der zellulären Netzwerke durch die olfaktorischen Stimuli aktiviert zu offenbaren. - Wählen Sie Aufnahmen, wo die gemessenen Strukturen bewegen nicht mehr als 2-3 Pixel über den Zeitverlauf der Aufnahme.
Hinweis: Aufnahmen mit zu viel Bewegung kann in Kludt et al durch Anlegen einer Verschiebung Korrekturverfahren gerettet werden 5. - Überprüfen Sie, ob die Aufnahmen von Bleich leiden. Wenn die durchschnittliche Intensität des gesamten Bildes fällt über den Zeitverlauf des Aufzeichnungs, Bleich Korrektur erforderlich ist, überspringen sonst die nächsten beiden Schritte.
- Berechnen der linearen Trend für die Zeitspur jedes Pixels durch eine lineare Regression durchführt.
- das Ergebnis von jedem Pixel zu subtrahieren einzeln die lineare componen zu beseitigent der Bleich.
Hinweis: Als Alternative Legendre Fitting kann verwendet werden , wie beschrieben von Bao und Schild 9. - Laden Sie die ready-to-use MATLAB - Skript zusammen mit einer Schritt- für -Schritt - Anleitung für die Aktivität Korrelation Bildgebung (ACI) , wie von Junek et al. 6
Hinweis: Folgen Sie den beschriebenen Schritten in Junek et al 6 als eine Alternative zur Verwendung der bereitgestellten MATLAB - Skript.. - Bewegen Sie das 'aci.m' Dateien 'matVis.m' und 'aci_roiSelector.m' aus dem heruntergeladenen Behälter in den MATLAB-Pfad des Systems zur Datenauswertung verwendet.
- Laden die Rohdaten in Schritt erworben 5,8 als Variable MATLAB Benutzerarbeitsbereich organisiert als [x, y, z, t] -Matrix mit x und y mit Bezug auf die seitlichen Abmessungen, z, der axialen Richtung und t, der Zeitverlauf .
- Rufen Sie "aci 'aus der MATLAB-Kommandozeile.
- In der Benutzeroberfläche (UI)die angezeigt wird, wählen Sie "Daten vorbereiten", dann wählen Sie die Variable, die Daten und ein Verzeichnis enthalten, in denen die Ergebnisse gespeichert werden.
Hinweis: Für eine vollständige Beschreibung der Benutzeroberfläche das Handbuch finden Sie in der aci Skript begleitet. - Blättern Sie durch die gemessenen z-Schichten, die durch den entsprechenden Schieberegler in der Benutzeroberfläche bewegen sich einen Überblick über die Varianz der Karte angezeigt zu bekommen.
- Geben Sie die Größe der Region of Interest (ROI) in der Benutzeroberfläche. Für eine mitrale Zellsoma der ROI passen ungefähr 10 & mgr; m in der lateralen und 5 um in der axialen Richtung zu erstrecken. Für eine Glomeruli, die etwas höhere Werte von 20 & mgr; m seitlich und 10 & mgr; m in axialer Richtung geeignet sind.
Hinweis: Der ROI Größe als eine Anzahl von Pixeln eingegeben werden, die auf der Pixelskalierung für die Aufzeichnung gewählt wird, hängt. - Wählen Sie einen ROI der γ-Glomeruli und zusätzliche Bereiche für jeden sichtbar soma der umliegenden Mitralzellen enthält, indem Sie mit der mittleren Maustaste auf die cente klickenr der Zelle / Glomerulus.
- Schließen Sie die Haupt-UI, die die Berechnung der Korrelation löst Karten für alle Referenzspuren. Das Ergebnis wird automatisch gespeichert und angezeigt.
- Wählen Aufnahmen mit ausreichender Zeitpunkten (mehr als 100 Frames) und eine anständige Menge an Aktivität (mindestens zwei Veranstaltungen).
Representative Results
Die Elektroporation von olfaktorischen Rezeptorneuronen (ORN) wurde für anterograde Kennzeichnung über aktive axonalen Transport konjugiert mit Dextran-Moleküle mit Alexa Fluor Farbstoffe oder Calcium-Indikatoren. Während die ehemaligen Farbstoffe in der glomerulären Schicht der Zwiebel Verzweigung helle Färbung der sensorischen Neuronen und ihre Axonterminalen liefern, wobei letztere die Messung der neuronalen Aktivität in diesen Zellen (Abbildungen 1 und 2) zu ermöglichen. Zuerst wurde die Position des wärmeempfindlichen γ-Glomerulus und seine Innervationsmuster durch Elektroporation Alexa Fluor 647 Dextran und Alexa Fluor 546 Dextran in der linken und rechten olfaktorischen Epithels sichtbar, bzw. (1A). Vierundzwanzig Stunden nach dem Eingriff, die ORN in der Nase, die beiden Geruchsnerven und die Glomeruli in beiden Hemisphären waren unter Fluoreszenzmikroskopie sichtbar. Die verschiedenen glomerulären Cluster waren identifiable von ihren jeweiligen Positionen, insbesondere die kleinen Cluster die γ-Glomerulus (1B) umfasst. Eine kleine Anzahl von Gegenriechfasern lief durch die kontralaterale Riechkolben, die vordere Kommissur gekreuzt und im ipsilateralen γ-Glomerulus (2A) beendet.
Um Calciumantworten der präsynaptischen Fasern der γ-Glomerulus, Calcium Grün Dextran in ORNs wurde aufzuzeichnen elektroporiert, nach dem gleichen Verfahren. Negative Temperatursprünge am Nasenloch über die kontrollierte Freisetzung von eiskalter Ringerlösung induziert wurden (0-1 ° C). Ein 3D-Volumen, um die γ-glomerulus umfasst, wurde unter einer schnellen Linienbeleuchtung konfokalen Mikroskop abgebildet. & Dgr; Ts von -1 ° C waren ausreichend kalt Antworten in der γ-Glomeruli und seine Afferenzen auszulösen, erkennbar als reversible Spitzen in den & Delta; F / F Ca 2+ Spuren (2B </ strong>, C).
Weitere experimentelle Schritte durchgeführt wurden kalt induzierte Aktivität in den Mitralzellen auf die γ-glomerulus über ihre verästelte dendritische Endungen verbunden zu messen. Diese postsynaptischen Fasern und der umgebenden Neuropil wurden effektiv gefärbt durch Bolus Beladung des Calcium-sensitiven Farbstoff Fluo-08.00 Uhr durchgeführt , einige Tage nach Alexa 647 Dextran war in ORNs elektroporiert (3A, B). Mitral-Zellen wurden mit Fluo-08.00 Uhr gefüllt und das Riechepithel wurde zweimal nach folgendem Paradigma angeregt: kalt Ringer, Histidin (10 & mgr; M) und Raumtemperatur-Ringer, angewendet anschließend. Zwei Referenzspuren wurden von interessierenden Bereichen in dem aufgenommenen Volumen entnommen, einer sich ausschließlich auf Temperatur Tropfen reagieren, die andere, nur Histidin. Aktivität Korrelation Bildgebung (ACI) 6 wurde auf dem ausgewählten Referenz berechnet basierendSpuren mit hohem Kontrast die dendritische Morphologie der postsynaptischen Netzwerke , die entweder auf die Temperatur oder den Histidin-responsive Ca 2+ -Signal (3C, D) sichtbar zu machen. Schließlich thermo und chemosensitiven Karten waren farbcodiert und überlagert auf der jeweils anderen, das zeigt , wie Temperatur und chemische Informationen an die olfaktorischen Neuronen zweiter Ordnung von einzelnen Glomeruli transportiert (Abbildung 3E). Für eine Beschreibung der Integration und Verarbeitung beider Arten von Informationen in gemeinsam genutzten olfaktorischen Netzwerke finden Sie Kludt et al. 5
Abbildung 1: Übersicht über die ORN Elektroporation und Bolus - Laden (A) olfaktorischen Rezeptorneuronen in beide Nasenhöhlen von X.. laevis Larven wurden mit Alexa - Farbstoffe oder Calciu elektroporiertm-sensitiven Farbstoffen gekoppelt Dextranmoleküle. Die fluoreszierenden Indikatoren wurden anterograd bis zum Terminal axonalen arborization transportiert. 24 Stunden nach der Elektroporation, der glomerulären Schicht in beiden Hemisphären zeigte Fluoreszenzfärbung. (B) Schematische Darstellung der zellulären Organisation des Riechkolbens in einer Hemisphäre. Die glomeruläre Schicht erstreckt sich über die Lampe in Cluster: die medialen, kleine, mittlere und seitliche Clustern. Olfaktorischen Informationen werden aus den Rezeptorneuronen übertragen Zellen über Synapsen in Glomeruli Mitral. Periglomerular Zellen und Körnerzellen sind inhibitorischen Neuronen zu modulieren olfaktorischen Verarbeitung und Kodierung. Die γ-Glomerulus (cyan) wurde leicht als kleine Neuropil identifiziert, in denen ipsilateral (rot) und kontralateralen (orange) olfaktorischen Fasern verschmolzen. (C) Bolus - Beladung wurde in der Nähe des γ-Glomerulus erreicht postsynaptischen Neuropil zu färben , bestehend hauptsächlich aus Mitralzellen und deren dendritic Bäume deutlich in der glomerulären Schicht verzweigen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Elektroporation von ORN zeigt strukturelle und funktionelle Konnektivität (A) Bilaterale Innervation des γ-Glomeruli von ipsilateral (grün) und kontralateralen (rot) olfaktorischen Rezeptorneuronen (ORN).. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. (B) Die Riechkolben nach der Elektroporation mit dem Calcium-sensitiven Farbstoff Calcium Grün Dextran. Die inter (IMC), medial (MC) und die kleine Cluster (SC) sind sichtbar. Das Bild ist eine maximale Projektion von 100 & mgr; m dicken Messvolumen. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. (C) Nahaufnahme des kleinen Cluster. Das aufgenommene Volumen (12 & mgr; m) istin einem maximalen Projektion dargestellt. Das Bild zeigt die basale fluoreszierenden Ebene in grau und die farbkodierte & Delta; F / F Karte als Overlay. Die maximale Reaktion auf die Stimulation mit kaltem Ringer-Lösung aufgetragen. Die γ-glomerulus reagierte stark, während die beiden benachbarten Glomeruli schweigen. Der Einschub zeigt die AF / F-Trace für die γ-Glomeruli an die angegebene Region von Interesse entspricht. Der blaue Balken steht für die Reizapplikation. Maßstabsbalken = 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Fig . 3: Bolus Laden und ACI Wärmeempfindliches und chemosensitiven Netzwerke dissoziieren (A) von Axons ORNs im kleinen Cluster beendet wurden durch Elektroporation mit dem nicht-gefärbten calcium empfindlichen Farbstoff Alexa 647 Dextran. Die gestrichelte Linie zeigt die γ-Glomeruli. (B) Bild des gleichen Bereichs wie in (A) in den zweiten Messkanal nach Bolus - Beladung mit dem Calcium-sensitiven Farbstoff Fluo-8 Uhr. Einige Mitralzelle somata waren sichtbar, aber der Kontrast war begrenzt. Nach den Pfeilen wurden zwei Antwortspuren aufgezeichnet, die für die Aktivität Korrelationsabbildung (ACI) verwendet wurden. Blau, rot und schwarzen Balken unterhalb der Spuren zeigen den Beginn der Anwendung von Kälte Ringer, Histidin (10 uM) und Raumtemperatur-Ringer als negative Kontrolle, respectively. Die zwei Ca 2+ Spuren wurden aus verschiedenen Regionen von Interesse des gemessenen Volumens genommen. (C) Das ACI Ergebnis der Spur in (B) hervorgehobene Bereiche überwiegend zu kalt Ringer reagieren. (D) Die ACI Ergebnis der Spur in (B) hervorgehobene Bereiche überwiegend auf Histidin reagiert. (E) Überlagerung der beiden ACI - Karten. Mitral-Zellen h reagierenistidine und die Innervation glomerulus (rot) waren leicht von thermisch empfindlichen Mitralzellen und der γ-Glomerulus (cyan). Alle Bilder dieser Figur sind maximale Intensität Projektionen eines 28 um dicken Volumen. Maßstabsbalken = 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
Die vorgestellten Methoden zielen hier bei der Aufzeichnung Temperaturverarbeitung im Riechkolben von Xenopus laevis Kaulquappen. Die Protokoll stains erster und zweiter Ordnung Neuronen im Bulbus olfactorius und stellt eine Probenvorbereitung in dem das olfaktorische System Wesentlichen intakt bleibt. Somit kann die Aktivierung des temperaturempfindlichen γ-Glomerulus überwacht und mit seiner chemoempfindlichen benachbarten Glomeruli verglichen werden. Das einzigartige bilaterale Innervation dieser Glomeruli wird durch Zelle Elektroporation mit spektral unterschiedlichen Farbstoffen sichtbar gemacht. Darüber hinaus ermöglicht Bolus Belastung für die Färbung von Mitralzellen ein großes Volumen innerhalb des Bulbus olfactorius überspannen. Die neuronalen Netzwerk-Verarbeitungstemperatur-induzierte Signale wird durch Einnahme von Kalziummessungen mit wiederholten Stimulus Anwendungen ergeben, und anschließend die Daten mit Aktivität Korrelation Bildgebung zu analysieren.
Das Protokoll hebt zwei anspruchsvolle Färbung proce Weisen, von denen beide vorsichtige Manipulation und Praxis erfordern, um zufriedenstellende und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Während der Elektroporation hat jede Verletzung der Tiere vermieden werden, vor allem, wenn die Elektroden in die Nase zu positionieren. Optimalerweise sollte kein Kontakt mit dem olfaktorischen Epithel auftreten. Beachten Sie, dass die Tiere leben noch nach der Elektroporation Verfahren und ihre Wiederherstellungszeit berücksichtigt werden. Wenn die Färbung nach einer Runde der Elektroporation zu schwach bleibt, die von den verwendeten Arten von Farbstoffen in Abhängigkeit passieren kann, kann seine Intensität durch Erhöhen der Farbstoffkonzentration in den Nüstern verbessert werden. Da Dextran-gekoppelter Moleküle über mehrere Mechanismen , einschließlich langsam axonalen Transport (bei einer Geschwindigkeit von 1-2 mm / Tag 10) und passive Diffusion transportiert werden, ist eine weitere Alternative von 48 Stunden nach der Elektroporation zu warten , bevor die Tiere geopfert. Alternativ kann die Elektroporation kann nach einem Tag der Erholung wiederholt.
jove_content "> Bolus Laden ist ein wichtiger Schritt, da die Menge an Farbstoff der Mitralzellen Eingabe schwierig zu regulieren und hängt von verschiedenen Parametern wie Pipettenspitze Größe und Lage der Anwendung. Die Überwachung des Verfahrens unter einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop erweist sich für nützlich zu sein Einstellen der Dauer des Farbstoffes Anwendung und somit Erzeugen ähnliche Färbungsergebnisse für Zubereitungen. Weiterhin zuvor elektroporiert Kaulquappen sollte durch die Identifizierung der Position des kleinen Cluster (bestehend aus der γ-Glomerulus), um die beste Position für den Farbstoff Anwendung bestimmt werden. die meisten kritische Schritt bei der Messung ist sowohl Verschiebung und Bleichen der Probe zu vermeiden. die Verschiebung kann durch eine sorgfältige Positionierung der Ringer Strom unter dem Mikroskop vermieden werden. Da das Bleichen der Bereich von Interesse zu begrenzen, sollte die Messzeit auf das wesentliche reduziert werden .Bolus Laden Färbung mit Calcium-sensitiven Farbstoffen bietet nur sehrgeringfügiger Kontrast, da die gesunden Zellen im Allgemeinen niedrige Kalziumkonzentrationen aufweisen und somit schwache basale Fluoreszenz. Aktivität Korrelation Imaging Anwendung umgeht diese Einschränkung durch Kontrast zu erzeugen basierend auf Aktivität und Highlights Strukturen mit ähnlichen Calcium-Signale. Diese nach dem Erwerb Analysemethode berechnet den Korrelationsfaktor zwischen dem Kalziumsignal eines ausgewählten Bereichs von Interesse (Referenzkurve), und dass jedes einzelnen Pixels in das 3D-Volumen. Daher sind die stark davon abhängen, erzielten Ergebnisse auf dem Aktivitätsmuster als Referenzspur ausgewählt. Wenn der Schwerpunkt Mitralzelle Innervationsmuster, ein Referenzsignal abgeleitet aus der spontanen neuronalen Aktivität zu visualisieren bevorzugt, und die aktivsten Mitralzellen dieser Wahl werden die besten Ergebnisse zu erzielen. Für die Chemo- oder thermosensitiven Netzwerke von Mitralzellen enthüllt, Referenzkurven nur entweder enthält Antworten Histidin oder kalt Ringer gewählt werden. Die Auswahl einer ganzen Glomerulus or Mitral Zellsoma als Region von Interesse kann nicht immer eine klare Referenzspur zur Verfügung stellen, vor allem, wenn die Strukturen auf die zwei verschiedenen Stimuli reagiert auf die aufeinander liegen. In einem solchen Fall ist es oft sinnvoll, eine kleinere Fläche des Glomerulus oder Zellkörper als interessierenden Bereich auszuwählen.
In den letzten Jahrzehnten hat sich als ein effizientes Verfahren zum Anfärben einzelne oder mehrere Zellen 11,12 Elektroporation beschrieben. Hier wird es verwendet, speziell Neuronen Geruchsrezeptor zu beschriften. Dextran-konjugierten Moleküle geben die höchste Effizienz und für Nicht-Calcium - sensitiven Farbstoffen, die Bandbreite der Auswahl ist breit und deckt das gesamte Spektrum der Regel verwendet , in der Fluoreszenzmikroskopie 13. Jedoch Calcium-sensitiven Farbstoffen, die erfolgreich elektroporierten in Riechschleimhaut werden, sind im Moment Calcium-green Dextran beschränkt und Fluo-4 Dextran wenn noch im Handel erhältlich. Außerdem zielen die Aufnahmen in erster Linie superficial Schichten auf der ventralen Oberfläche des Riechkolbens nur, da die Eindringtiefe der schnellen Messtechniken begrenzt ist. Zwei-Photonen-Imaging kann teilweise diese Einschränkung zu überwinden, aber oft fehlt Geschwindigkeit und beschränkt die Menge der auswählbaren Calcium-sensitiven Farbstoffen weiter.
Wir hier beschrieben ein Protokoll für die Temperatur-induzierte Aktivität im Riechkolben messen. Das Gehirn neuropil ist als ein dreidimensionales Volumen abgetastet, um die komplexen zellulären Netzwerke im olfaktorischen Verarbeitung von Temperatur beteiligt zu visualisieren. Messung von Temperatur-induzierten Aktivität im Riechkolben in jüngster 5 wurde berichtet , und erfordert eine speziell angepasste Verfahren die Kombination verschiedener Techniken. Ein großer Vorteil der Techniken, die oben dargestellt ist, dass Hunderte von Zellen in drei Dimensionen in einer Zubereitung abgebildet werden, wo der größte Teil des olfaktorischen Systems intakt bleibt. Diese Vorteile stellen hohe Anforderungen an die Färbetechniken sowie das Gehirn pWiedergutmachung und Bildgebung. Zum Beispiel Zelle Elektroporation und Bolus-Laden getroffen große Mengen von Zellen im Riechepithel und Birne und somit die Visualisierung von kompletten Mobilfunknetze ermöglichen. Darüber hinaus ermöglicht die Bereitstellung von chemischen Indikatoren via Bolus Laden statt genetisch codierten Fluorophore Messungen in einer potenziell größeren Satz von Arten. Andere Alternativen wie Bad Inkubation mit AM-Farbstoffe in erster Linie in Scheiben arbeiten, die stark die Riechkolben beschädigen, nur wenige hundert Mikrometer von intaktem Gewebe zu verlassen. Im Vergleich sorgt zum Beispiel der ganze Berg Vorbereitung in unserem Protokoll, dass die bilaterale Innervation des γ-glomerulus bleibt intakt und die Aufnahmen sind somit in einem nach wie vor Betriebssystem genommen. Schließlich ist die Bildgebung selbst wird durch Line-Beleuchtung Mikroskopie ermöglicht die Erfassung von 3D-Volumen durchgeführt. Line-Beleuchtung Mikroskopie ist eine der konfokalen Techniken , um die höchstmögliche Erfassungsraten bietet 6 </ Sup>, die notwendig sind, einen großen Anteil des Riechkolbens zu bedecken. Langsamer Erfassungssysteme können verwendet werden, aber den Nachteil, dass die Größe des aufgenommenen Volumens reduziert werden muss. In den letzten Jahren wurden andere Verfahren für die schnelle Bildaufnahme entwickelt worden und können als Alternativen 14,15 verwendet werden. Dennoch Line-Beleuchtung Mikroskopie bleibt eine der einfachsten Methoden, sowohl ausreichend Geschwindigkeit und Auflösung zu gewinnen. Hier folgt einige Informationen als Richtlinien für geeignete Bildgebungs Setups auswählen. Da Kalzium-Imaging innerhalb von dicken Gehirn Vorbereitungen abgeschlossen ist, sollte die Einrichtung anständige konfokale bieten und die Ziele sollten numerische Aperturen von 1,0 oder höher aufweisen. Für einen Bezugspunkt genommen werden die Aufnahmen mit dem Linienbeleuchtung Mikroskop entsprechen Bilder mit einem Standard-Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Lochgröße von 0,5-1 luftig Einheiten gemacht. Schnelle Erfassungsgeschwindigkeit ist wünschenswert. Ein Volumen mit einer Dicke von 20 & mgr; m von mindestens 5 l bedecktAyers, ein seitliches Sichtfeld von 100 um · 100 um und eine Pixelgröße von 0,5 um oder kleiner sollte bei einer Mindestgeschwindigkeit von 1 Hz pro Stapel gescannt werden. die Konfokalität Verringerung kann die Menge der Photonen gezählt erhöhen und ermöglicht somit schnellere Akquisitionen falls erforderlich, hat aber den Nachteil, mehr out-of-focus Licht aufgezeichnet wird. Da jedoch ein solcher Ansatz die Dicke der optischen Scheiben erhöht, kann es tatsächlich die Verfolgung von Dendriten durch verschiedene z-Ebenen nach der Anwendung von ACI 6 erleichtern.
Die notwendigen Werkzeuge, um ausgiebig Temperaturverarbeitung in Bulbus olfactorius Netzwerke studieren hier vorgestellt. Temperatur-induzierte Aktivität in der ersten und zweiten Ordnung Neuronen über Calcium-sensitiven Farbstoffen und Signale sowohl einlaufen und aus dem γ-glomerulus aufgezeichnet. Darüber hinaus verarbeiten das Ausmaß, in dem einzelne Mitralzellen sowohl chemische als auch Temperaturinformationen beurteilt werden kann. Da die Vorbereitung leaves der Riechkolben intakt ist, kann die Rolle des bilateralen Innervation in der Duftverarbeitung weiter untersucht werden. Das Verfahren ist auch nützlich für enthüllt , ob und wie Thermo- und chemoinformation in überlappenden Netzwerken olfaktorischen 5 codiert wird. Schließlich können die oben erwähnten Techniken sind nicht auf die Untersuchung der Temperaturreaktionen in den Riechkolben begrenzt, sondern kann für eine allgemeine Bewertung des olfaktorischen Systems, insbesondere die Zellverarbeitungsnetzwerken in großen dreidimensionalen Volumina angewendet werden. Bolus Belastung und Aktivität Korrelation Bildgebung sind leistungsfähige Werkzeuge zu beobachten und die Aktivität von Dutzenden von Neuronen zu vergleichen, so dass sie für unterschiedliche Gehirnnetzwerken 16 zu machen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Sodium chloride | Merck Millipore | 1064040500 | |
| Potassium chloride | Merck Millipore | 1049360250 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1023820250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 1058330250 | |
| D(+)-Glucose | Merck Millipore | 1083371000 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| HEPES | Merck Millipore | 1101100250 | |
| Calcium Green 10 kDa Dextran | Thermo Fisher Scientific | C-3713 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | D-22914 | |
| Dextran, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | D-22911 | |
| Fluo-8 AM | TEFlabs | 203 | |
| MK571 | Alexis Biochemicals | 340-021-M005 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Pluronic acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | powder |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 53370 | |
| DMSO | Merck Millipore | 1029522500 | |
| Equipment | |||
| Electronic pipette | BrandTech | HandyStep Electronic Repeating Pipette | |
| NiCr-Ni thermocouple | Greisinger Elektronik | GTF 300 | |
| Micropipette puller | Narishige | Model PC-10 | two-step puller |
| Funnel applicator | (Custom-made) | ||
| Line-illumination microscope | (Custom-made) | otherwise, a commercially available spinning disk microscope | |
| Objective W Plan-Apochromat 63X/1.0 | Zeiss | 441470-9900-000 | |
| Objective W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | |
| Software | |||
| MATLAB | The MathWorks | from R2010b upwards |
References
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