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Neuroscience

की घ्राण बल्ब में कैल्शियम परिवर्तन की निगरानी के माध्यम से रिकॉर्डिंग तापमान प्रेरित neuronal गतिविधि Published: June 3, 2016 doi: 10.3791/54108
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2,4, 1,2,3
1Institute of Neurophysiology and Cellular Biophysics, Georg-August-Universität Göttingen, 2Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, Georg-August-Universität Göttingen, 3DFG Excellence Cluster 171, Georg-August-Universität Göttingen, 4German Hearing Center Hannover
* These authors contributed equally

Protocol

Xenopus laevis टैडपोल के साथ सभी प्रयोगों के दिशा-निर्देशों पशु प्रयोग में नैतिकता के गौटिंगेन विश्वविद्यालय समिति द्वारा अनुमोदित के अनुसार प्रदर्शन किया गया।

1. Electroporation

  1. Nieuwkoop और फैबर 7 चरणों के अनुसार 49-54 के जानवरों को चुनें।
  2. सुनिश्चित करें कि रिकॉर्डिंग सेटअप एक बड़ा काम दूरी और एक electroporation उपकरण है जो कम से कम 2 हर्ट्ज की एक आवृत्ति पर 20 मिसे के लिए 20 वी की वोल्टेज दालों लागू कर सकते हैं के साथ एक stereomicroscope के होते हैं बनाओ। 200 माइक्रोन का एक मोटा व्यास के साथ दो प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के माध्यम से वोल्टेज दालों लागू करें ताकि वे नुकसान के कारण के बिना टैडपोल 'नाक में डाला जा सकता है।
  3. एक dextran संयुग्मित डाई के क्रिस्टल तैयार (जैसे, कैल्शियम हरी 10 केडीए dextran, या एलेक्सा स्त्राव 647 10 केडीए dextran) आसुत जल के बारे में 100 μl में 5 मिलीग्राम की आम तौर पर वितरित की राशि भंग और की छोटी बूंदों की अनुमति के द्वाराParafilm के एक पत्रक पर सूखी 2 μl।
    नोट: क्रिस्टल कम से कम एक दिन में सूखा और एक वर्ष से अधिक की अवधि के लिए ठंडे बस्ते में -18 डिग्री सेल्सियस पर बाद में संग्रहित किया जा सकता है।
  4. उन्हें 1-2 मिनट के लिए 3% Tricaine मीथेन सल्फ़ोनेट युक्त जब तक यह शल्य चिकित्सा संज्ञाहरण राज्य की विशेषता पहुंचता है पानी के नल में रखकर जानवरों anesthetize हृदय गति, सभी आंदोलनों के नुकसान और यांत्रिक उत्तेजनाओं को प्रतिक्रियाओं की कमी की कमी हुई।
  5. शुद्ध पानी के नल में 10 सेकंड के लिए anesthetized जानवर विसर्जित कर दिया।
  6. एक जेल गद्दी पर पशु प्लेस और यह नुकसान पहुँचाने के बिना यह चारों ओर सुइयों रखकर यह तय कर लो।
    ध्यान दें: अपनी त्वचा के माध्यम से सुई poking द्वारा पशु ठीक नहीं है।
  7. धीरे से एक ऊतक के साथ नाक आसपास के क्षेत्र में सूखी।
  8. stereomicroscope के तहत पशु प्लेस और नाक पर ध्यान केंद्रित।
  9. , नथुने छेद मिलान के आकार का एक डाई क्रिस्टल लेने के लिए संदंश का प्रयोग नाक cavities में से एक में डाल दिया है और इंतजार जब तक यह पूरी तरह घुल, which कम से कम 1 मिनट लगते हैं। क्रिस्टल छोटे होते हैं, तो प्रत्येक गुहा में 2 या 3 जोड़ने जब तक वे एक गैर-पारदर्शी उच्च केंद्रित समाधान का उत्पादन।
  10. मेढक की त्वचा और नाक में से एक में एनोड पर कैथोड रखें।
    नोट: यह विशेष रूप से स्थापित रंगों 1.3 चरण में उद्धृत करने के लिए लागू होता है। एक अलग polarity के साथ रंगों के लिए, धुंधला परिणाम नाक में कैथोड रखकर सुधार किया जा सकता है। डाई के polarity के बारे में अनिश्चित हैं, दोनों इलेक्ट्रोड नाक (नथुने प्रति एक) में एक साथ रखा जा सकता है, तो और polarity एकल वोल्टेज दालों के बीच alternated।
  11. उत्तेजना अंतराल के लगभग 0.5 सेकंड के साथ 20 वी और 20 मिसे के छह दालों लागू करें।
    नोट: छोटे बुलबुले नथुने में इलेक्ट्रोड के आसपास बशर्ते कि इलेक्ट्रोड त्वचा और नथुने में समाधान के साथ संपर्क में हैं electroporation के दौरान दिखाई देनी चाहिए। कोई बुलबुले दिखाई दे रहे हैं, तो केबल को जोड़ने की जाँच करें और सुनिश्चित करें कि electroporating devic बनानाई वांछित वोल्टेज पल्स देते है।
  12. दूसरे नथुने के लिए प्रक्रिया (1.9-1.11) दोहराएँ।
  13. कमरे के तापमान पर नल के पानी से भरा एक बीकर में electroporated मेढक स्थानांतरण। 5 से 10 मिनट तक इंतजार पशु चेतना आएगा और इसकी तैराकी शुरू। इसे फ़ीड और यह कम से कम 1 दिन के दौरान जो डाई घ्राण बल्ब के लिए घ्राण तंत्रिका साथ ले जाया जाता है के लिए वसूली करते हैं।
  14. सबसे अच्छा इमेजिंग परिणाम के लिए electroporation निम्नलिखित 1-7 दिनों के भीतर electroporated जानवरों का प्रयोग करें। डाई परिवहन और वसूली इमेजिंग से पहले कम से कम 24 घंटा समय दीजिए।

2. पूरा पर्वत तैयारी

  1. 3% Tricaine मीथेन सल्फ़ोनेट युक्त जब तक सभी आंदोलनों बंद कर दिया है और यह लंबे समय तक कोई यांत्रिक stimulations के लिए जवाब है नल के पानी में पशु anesthetize।
  2. एक stereomicroscope के तहत एक जेल तकिया के लिए मेढक स्थानांतरण और इसके लिए के प्रत्येक पक्ष पर त्वचा के माध्यम से सुई poking द्वारा कसकर ठीकrebrain।
  3. अपनी रीढ़ की हड्डी विच्छेद करके मेढक बलिदान।
  4. दोनों नाक cavities, घ्राण नसों और घ्राण बल्ब (चित्रा 1 ए) युक्त ऊतक का एक ब्लॉक काटना करने के लिए एक छुरी का प्रयोग करें। पहले चीरा बाईं ओर करीब बना छू नथुने-बिना यह और बाईं घ्राण तंत्रिका और बल्ब telencephalic-diencephalic सीमा तक साथ ब्लेड आगे काटने चले जाते हैं। सही पक्ष पर वैसा ही करो। telencephalon करने के लिए एक अंतिम कट पीछे बनाकर तंत्रिका तंत्र के बाकी हिस्सों से तैयारी अलग।
  5. मेढक के शरीर के निपटान के लिए और ध्यान से उल्टा ऊतक ब्लॉक फ्लिप इतना है कि मस्तिष्क की तैयारी के उदर की ओर ऊपर की तरफ चेहरे।
  6. घ्राण नसों के बीच दो सुइयों डालने से फिर से ऊतक ब्लॉक पिन।
  7. मेंढक घंटी समाधान (98 मिमी NaCl, 2 मिमी KCl की एक बूंद रखो, 1 मिमी 2 CaCl, 2 मिमी MgCl 2, 5 मिमी ग्लूकोज, 5 मिमी ना-पाइरूवेट, 10 मिमी HEPES, पीएच 7.8, osmola के लिए निकाला230 mOsmol / एल) ऊतक पर की rity।
  8. ठीक कैंची का उपयोग कर तीन चीरों बनाकर तानिका अक्षतंतु छँटाई क्षेत्र को कवर करने और घ्राण बल्ब निकालें। ऊतक ब्लॉक के पीछे किनारे से शुरू, बल्ब में घ्राण नसों के प्रवेश द्वार बिंदु (अक्षतंतु छँटाई क्षेत्र) तक caudorostrally बारीकी कटौती छोड़ दिया घ्राण बल्ब के साथ।
  9. दाएँ गोलार्द्ध के लिए दोहराएँ चरण 2.8।
  10. संदंश के साथ तानिका उठाएँ और अक्षतंतु छँटाई क्षेत्र में तीसरे कटौती करने, पिछले वालों को सीधा।
    नोट: घ्राण बल्ब के उदर पक्ष अब इमेजिंग और सांस में लोड करने के लिए सुलभ है।
  11. प्रेषित प्रकाश छवि में छवि गुणवत्ता में सुधार करने के लिए, पृष्ठीय पक्ष के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ। ये अतिरिक्त कदम सांस में लोड करने के लिए micropipette के नेविगेशन की सुविधा है, लेकिन सख्ती जरूरी नहीं हैं।
  12. एक रिकॉर्डिंग आगे की प्रक्रिया और इमेजिंग के लिए मेंढक घंटी के साथ भरा चैम्बर के लिए नमूना हस्तांतरण। बनाता हैUre कि उदर की ओर ऊपर की तरफ का सामना करना पड़ और नायलॉन फाइबर का शुद्ध के साथ नमूना सुरक्षित है एक छोटा सा प्लैटिनम फ्रेम पर फैला है।
  13. उत्तेजनाओं का एक आसान आवेदन के लिए नायलॉन फाइबर से एक के शीर्ष पर नाक cavities जगह है।

3. सांस लोड हो रहा है

  1. (डब्ल्यू / वी) AM डाई के एक शेयर समाधान तैयार करने के लिए (DMSO) डाइमिथाइल sulfoxide के 20 μl Pluronic एफ 127 में से 20% से युक्त में कैल्शियम AM डाई (जैसे, Fluo-8 बजे) की 50 ग्राम भंग। 1-2 μl की मात्रा के छोटे aliquots में स्टॉक समाधान रुक। शेयर समाधान कम से कम आधे से एक वर्ष के लिए स्थिर है लेकिन फ्रीज पिघलना चक्र से बचें।
  2. एक micropipette खींचने का प्रयोग करें और 5-8 MΩ की एक प्रतिरोध और 1-2 माइक्रोन के एक टिप व्यास के साथ pipettes खींच।
  3. 250-500 माइक्रोन की एकाग्रता पर मेंढक घंटी समाधान में डाई के लिए तैयार शेयर समाधान भंग।
  4. MK571 बहुऔषध प्रतिरोध ट्रांसपोर्टरों को ब्लॉक करने के लिए 500 माइक्रोन की एकाग्रता तक पहुँचने के लिए जोड़ें।
  5. एक लम्बी विंदुक टिप का उपयोग समाधान के 10 μl के साथ micropipette भरें और micropipette flicking द्वारा सभी हवाई बुलबुले को हटा दें।
  6. पिपेट धारक में micropipette माउंट और सुनिश्चित करें कि दबाव एक सिरिंज या एक साँस दवा इंजेक्शन डिवाइस के साथ या तो स्वयं लागू किया जा सकता है और एक गेज के साथ लागू दबाव की निगरानी करते हैं।
  7. यदि संभव हो तो, इंजेक्शन डाई उत्तेजित करने के लिए क्षमता के साथ एक माइक्रोस्कोप सेटअप का उपयोग इतना है कि micropipette टिप से बहिर्वाह कल्पना और समायोजित किया जा सकता है। आदर्श रूप में, एक confocal इमेजिंग सेटअप का उपयोग करें। एक विसर्जन उद्देश्य के साथ एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग करें तो यह है कि ऊतक micropipette के साथ पहुंचा जा सकता है।
  8. माइक्रोस्कोप के तहत पूरे माउंट तैयारी प्लेस, बल्ब तक घ्राण तंत्रिका का पालन करें और घ्राण बल्ब में रुचि के क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित।
  9. आदेश में रिकार्डिंग कक्ष के माध्यम से ताजा घंटी समाधान छिड़कना तैयारी की व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए और डाई लीक बाहर धोने के लिएmicropipette टिप से।
  10. घ्राण बल्ब की सतह पर पिपेट लोअर, टिप तैयारी के व्याख्यान चबूतरे दिशा में इशारा कर के साथ।
  11. पिपेट के clogging रोकने के लिए और धीरे ऊतक में डालने के लिए micropipette करने के लिए एक छोटा सा और निरंतर सकारात्मक दबाव (~ 25 एचपीए) को लागू करें।
  12. एक बार पिपेट बाहरी ऊतक परतों को पार कर गया है, एक rostro-पृष्ठीय दिशा में यह कदम माइट्रल सेल परत में। (ध्यान दें कि electroporation द्वारा घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स की एक काउंटर धुंधला micropipette की स्थिति को समायोजित करने के लिए उपयोगी है।) आदर्श रूप में, वांछित रिकॉर्डिंग साइट से 50-100 माइक्रोन की दूरी पर विंदुक टिप जगह है।
    1. तापमान के प्रति संवेदनशील γ-glomerulus धुंधला के लिए, γ-glomerulus के प्रीसानेप्टिक neuropil की स्थिति से लगभग 50 माइक्रोन rostrally एक क्षेत्र को लक्षित।
  13. 100-200 एचपीए की रेंज में एक सकारात्मक दबाव लागू करें। के आकार के आधार दबाव ताकत को समायोजितmicropipette टिप। Brightlight रोशनी जब दबाव पहली बार के लिए लागू किया जाता है के तहत दिखाई मामूली ऊतक आंदोलनों के लिए देख द्वारा पिपेट से बहिर्वाह की पुष्टि करें।
  14. लगभग 10 मिनट के लिए एक लगातार दबाव बनाए रखने के समय micropipette ऊतक में रहता है। यदि संभव हो तो, फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत सेल लोड करने के लिए बीच में neuropil जाँच के रूप में सफल लोड हो रहा है समय के साथ तीव्रता में वृद्धि के साथ दिखाई सेल somata धुंधला में परिणाम होगा।
    नोट: अक्सर असफल लोड करने के लिए कारण ऊतक टिप या एकत्रित डाई समूहों में प्रवेश करने के कारण पिपेट clogging है। यह कभी कभी धीरे रिकार्डिंग कक्ष के निचले सतह के खिलाफ अपनी टिप तोड़कर पिपेट को बचाने के लिए संभव है। हालांकि, पिपेट टिप में कुछ माइक्रोमीटर से अधिक नहीं होनी चाहिए। सांस में लोडिंग के दौरान कम दबाव लागू करने से बड़ा पिपेट उद्घाटन क्षतिपूर्ति।
  15. लोडिंग के 10 मिनट के बाद, शून्य करने के लिए लागू दबाव को कम करने और धुंधला की जाँच करें।
    ध्यान दें: दाग क्षेत्र का आकार काफी भिन्न होता है और इंजेक्शन डाई और इंजेक्शन साइट के स्थान की राशि की तरह कई मापदंडों पर निर्भर करता है। एक अच्छा धुंधला के बारे में 100 माइक्रोन x 100 माइक्रोन का एक क्षेत्र शामिल हैं।
  16. अगर दाग क्षेत्र बहुत छोटा है या वांछित रिकॉर्डिंग साइट को कवर नहीं करता, दोहराने 3.10-3.13 कदम। अगले इंजेक्शन के लिए एक ही micropipette का उपयोग करता है, तो यह अभी तक भरा नहीं गया है।
  17. डाई तेज और deesterification अनुमति देने के लिए किसी भी प्रयोगों शुरू करने से पहले पिछले इंजेक्शन के बाद कम से कम 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें। हर समय ताजा घंटी समाधान के साथ रिकार्डिंग कक्ष छिड़कना के लिए आगे बढ़ें।

4. मापन सेटिंग

  1. सुनिश्चित करें कि माप सेटअप तीन आयामी मात्रा में रिकॉर्ड करने के लिए पर्याप्त गति के साथ एक confocal खुर्दबीन के होते हैं बनाओ। ढेर अनुसार कम से कम 1 हर्ट्ज की एक अधिग्रहण दर चुनें।
    नोट: उपयुक्त setups उदाहरण लाइन रोशनी नमूना लाइन के लिहाज से पी द्वारा बिंदु के बजाय सूक्ष्मदर्शी स्कैनिंग के लिए शामिलoint। इस तरह के एक सेटअप का एक सरल प्राप्ति के पहले 6 वर्णित किया गया है। अन्य विकल्प डिस्क सूक्ष्मदर्शी कताई रहे हैं। अगर ऐसी कोई सेटअप उपलब्ध है, यह अभी भी एक सामान्य बात स्कैनिंग सेटअप के साथ छोटे क्षेत्रों को मापने के लिए संभव है।
  2. माप मानकों इतना है कि एक मात्रा काफी बड़े एक glomerulus के आकार फिट करने के लिए शामिल किया जा सकता सेट करें।
    ध्यान दें: एक रिकॉर्डिंग मात्रा के विशिष्ट मोटाई 20 माइक्रोन की श्रृंखला है जो कम से कम 5 परतों द्वारा कवर किया जाना चाहिए है।
  3. विरंजन के लिए सभी प्रेस्य्नाप्तिक माप की जाँच करें। जब तक दर्ज की छवियों की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता रिकॉर्डिंग के समय के पाठ्यक्रम पर नहीं छोड़ देता है लेजर शक्ति को समायोजित करें।
  4. सीमा माप समय और पोस्टअन्तर्ग्रथनी तरफ रिकॉर्डिंग जितना संभव हो उतना विरंजन से बचने के लिए क्षेत्र की है, हालांकि से अधिक 20-30 सेकंड विरंजन मापन के लिए होने की संभावना है।

5. गंध आवेदन और तापमान प्रयोगों

  1. 25 डालोताजा घंटी समाधान के मिलीलीटर एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में (पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत)। एक बर्फ बाल्टी में ट्यूब रखें।
  2. ट्यूब में एक थर्मामीटर की साफ जांच डालने से ठंडा घंटी के तापमान पर नजर रखने। जब तक तापमान में प्रयोग शुरू करने से पहले 1 डिग्री सेल्सियस नीचे चला जाता है रुको।
  3. 10 माइक्रोन की एकाग्रता पर एल हिस्टिडीन घंटी समाधान में भंग की 50 मिलीलीटर की तैयारी।
  4. एक कीप applicator 8 या इसी तरह के आवेदन प्रणाली perfusing घंटी को प्रोत्साहन वितरण समन्वित रूप से अनुमति का उपयोग इतना है कि चैम्बर में पानी का प्रवाह निरंतर और निर्बाध प्रोत्साहन समाधान की रिहाई के दौरान बनी हुई है। इस तरह से कीप स्थिति यह है कि बाहर का आउटलेट कम से कम 1 मिमी घ्राण उपकला से दूर है।
  5. एक NiCr-नी तापमान उपकला के लिए एक डिजिटल थर्मामीटर करीब है और कीप applicator की दुकान से जुड़े सेंसर रखें। रिकॉर्ड और नेत्रहीन जिले के लिए एक कंप्यूटर के लिए थर्मामीटर उत्पादन बंदरगाह तारछोटे से तापमान में उतार-चढ़ाव को दर्शाती वोल्टेज परिवर्तन खेलते हैं।
  6. प्रयोग शुरू करने से पहले, वोल्टेज करने वाली तापमान पैमाने कारक स्थापित करने के लिए एक मानक थर्मामीटर के लिए एक और thermosensor कनेक्ट।
  7. रिकॉर्डिंग कक्ष में स्नान तापमान सर्वेक्षण और सुनिश्चित करें कि यह 22 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं है।
  8. छवि अधिग्रहण शुरू करें और क्रमिक रूप से 20-30 सेकंड के एक interstimulus अंतराल के साथ एक इलेक्ट्रानिक पिपेट के माध्यम से ठंड घंटी, एल हिस्टिडीन और कमरे के तापमान की घंटी (20-22 डिग्री सेल्सियस) के 200-400 μl लागू होते हैं। प्रोत्साहन आवेदन का एक बेहतर नियंत्रण के लिए, यदि संभव हो तो पिपेट करने के लिए चुना इमेजिंग सेटअप द्वारा भेजे गए एक ट्रिगर संकेत के साथ प्रोत्साहन जारी। प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के लिए आवेदन प्रोटोकॉल दोहराएँ।
  9. उत्तेजना के कई दौर के बाद से वे गतिविधि सह-संबंध इमेजिंग के साथ पोस्ट-इमेजिंग विश्लेषण के लिए बेहतर कर रहे हैं के साथ लंबे समय तक रिकॉर्डिंग के सेट ले लो।
    नोट: रिकॉर्डिंग समय और टुकड़ा व्यवहार्यता के बीच एक समझौता हैमिलना। सीए 2 से 6 प्रोत्साहन अनुप्रयोगों को कवर मिनट की माप नेटवर्क का एक अच्छा पुनर्निर्माण के लिए पर्याप्त गतिविधि प्रदान करते हैं।

6. छवि संसाधन का उपयोग गतिविधि सहसंबंध इमेजिंग (एसीआई)

  1. पूर्व synaptic रिकॉर्डिंग की इमेज प्रोसेसिंग
    1. ठंड घंटी समाधान और हिस्टिडीन द्वारा उत्तेजना के साथ रिकॉर्डिंग में, उनके अलग प्रतिक्रिया प्रोफाइल (Kludt एट अल। 5 देखें) द्वारा पड़ोसी हिस्टिडीन के प्रति संवेदनशील glomerulus से तापमान के प्रति संवेदनशील γ-neuropil भेद।
    2. मस्तिष्क तैयारी जिसमें ORNs γ-glomerulus की द्विपक्षीय इन्नेर्वतिओन कल्पना करने के लिए दो अलग अलग रंगों के साथ electroporated किया गया है की रिकॉर्डिंग से अक्षीय दिशा में एक अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण बनाएँ।
  2. गतिविधि सहसंबंध इमेजिंग का उपयोग बाद synaptic रिकॉर्डिंग की इमेज प्रोसेसिंग (एसीआई)
    1. पर्याप्त समय अंक (10 से अधिक के साथ रिकॉर्डिंग का चयन0 फ्रेम) और गतिविधि की एक सभ्य राशि (कम से कम दो घटनाओं)।
      नोट: गतिविधि या तो घ्राण उत्तेजनाओं से सक्रिय सेलुलर नेटवर्क प्रकट करने के लिए एक ही रिकॉर्डिंग के दौरान उत्तेजनाओं के कई अनुप्रयोगों द्वारा एकल माइट्रल कोशिकाओं की प्रक्रियाओं या प्रेरित प्रकट करने के लिए सहज हो सकता है।
    2. रिकॉर्डिंग चुनें जहां मापा संरचनाओं रिकॉर्डिंग के समय के पाठ्यक्रम पर ले जाने के लिए कोई 2-3 की तुलना में अधिक पिक्सेल।
      नोट: बहुत ज्यादा आंदोलन के साथ रिकॉर्डिंग Kludt एट अल में वर्णित एक पारी सुधार प्रक्रिया को लागू करने से बचाया जा सकता है 5।
    3. चेक रिकॉर्डिंग विरंजन से ग्रस्त हैं। पूरी छवि की औसत तीव्रता रिकॉर्डिंग के समय के पाठ्यक्रम पर आ जाता है, ब्लीच सुधार आवश्यक है, अन्यथा अगले दो कदम को छोड़।
    4. एक रेखीय प्रतिगमन प्रदर्शन से प्रत्येक पिक्सेल के समय का पता लगाने के लिए रेखीय प्रवृत्ति की गणना।
    5. प्रत्येक पिक्सेल से परिणाम घटाना व्यक्तिगत रूप से रेखीय componen समाप्त करने के लिएविरंजन के टी।
      नोट: एक विकल्प के रूप में Legendre फिटिंग बाओ और Schild 9 से वर्णित किया जा सकता है।
    6. तैयार करने के लिए उपयोग MATLAB स्क्रिप्ट एक साथ डाउनलोड गतिविधि सह-संबंध इमेजिंग के लिए एक कदम दर कदम गाइड (एसीआई) के रूप में Junek एट अल द्वारा वर्णित के साथ। 6
      नोट:। कदम प्रदान की MATLAB स्क्रिप्ट का उपयोग करने के लिए एक विकल्प के रूप Junek एट अल 6 में वर्णित का पालन करें।
    7. डेटा मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया प्रणाली के MATLAB पथ पर डाउनलोड कंटेनर से फाइल 'aci.m', 'matVis.m' और 'aci_roiSelector.m' हटो।
    8. एक्स और वाई पार्श्व आयाम, जेड, अक्षीय दिशा और टी, समय पाठ्यक्रम की चर्चा करते हुए एक साथ [एक्स, वाई, जेड, टी] मैट्रिक्स के रूप में आयोजित MATLAB के उपयोगकर्ता कार्यक्षेत्र के लिए एक चर के रूप में कदम 5.8 में अधिग्रहण कच्चे डेटा लोड ।
    9. MATLAB कमांड लाइन से कॉल 'एसीआई'।
    10. यूजर इंटरफेस में (यूआई)जो दिखाई देता है, का चयन 'डेटा तैयार' है, तो डेटा और एक निर्देशिका में जो परिणाम सहेजा जाएगा युक्त चर का चयन करें।
      नोट: यूआई का पूरा विवरण मैनुअल के साथ एसीआई स्क्रिप्ट देखें।
    11. यूआई में इसी स्लाइडर चलती विचरण नक्शा प्रदर्शित का अवलोकन प्राप्त करने से मापा जेड परतों के माध्यम से स्क्रॉल करें।
    12. ब्याज (आरओआई) यूआई में से उस क्षेत्र का आकार दर्ज करें। एक माइट्रल सेल सोम के लिए लगभग 10 माइक्रोन पार्श्व में और 5 माइक्रोन अक्षीय दिशा में अवधि के लिए लागत पर लाभ को समायोजित। एक glomerulus के लिए, laterally 20 माइक्रोन और 10 माइक्रोन अक्षीय रूप से थोड़ा अधिक मूल्यों उपयुक्त हैं।
      नोट: रॉय आकार पिक्सल के एक संख्या है, जो रिकॉर्डिंग के लिए चुना पिक्सेल स्केलिंग पर निर्भर करता है के रूप में दर्ज हो गया है।
    13. Cente पर मध्य माउस बटन के साथ क्लिक करके एक रॉय आसपास के माइट्रल कोशिकाओं में से प्रत्येक दिखाई सोमा के लिए γ-glomerulus और अतिरिक्त क्षेत्रों युक्त चयनसेल / glomerulus के आर।
    14. मुख्य यूआई जो चलाता सहसंबंध की गणना के सभी संदर्भ निशान के लिए नक्शे को बंद करें। परिणाम स्वचालित रूप से सहेजा और प्रदर्शित किया जाता है।

Representative Results

घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स की electroporation (ORNs) एलेक्सा स्त्राव रंगों या कैल्शियम संकेतक सक्रिय axonal परिवहन के माध्यम से अग्रगामी लेबलिंग के लिए Dextran अणुओं के साथ संयुग्मित के साथ हासिल की थी। पूर्व रंगों संवेदी न्यूरॉन्स और उनके अक्षतंतु टर्मिनल बल्ब की glomerular परत में शाखाओं में बंटी के उज्ज्वल धुंधला प्रदान करते हैं, बाद इन कोशिकाओं में neuronal गतिविधि की माप की अनुमति (आंकड़े 1 और 2)। सबसे पहले, थर्मल γ-glomerulus की स्थिति और उसके तंत्रिका वितरण पैटर्न छोड़ दिया और सही घ्राण epithelia, क्रमशः (चित्रा 1 ए) में एलेक्सा स्त्राव 647 Dextran और एलेक्सा स्त्राव 546 Dextran electroporating द्वारा कल्पना की गई थी। प्रक्रिया के बाद चौबीस घंटा, नाक में ORNs, दो घ्राण नसों और दोनों गोलार्द्धों में केशिकागुच्छ फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के तहत दिखाई दे रहे थे। अलग अलग समूहों glomerular identifia थेउनके संबंधित पदों से ble, विशेष रूप से छोटे-γ glomerulus (चित्रा 1 बी) शामिल क्लस्टर। Contralateral घ्राण फाइबर की एक छोटी संख्या contralateral घ्राण बल्ब के माध्यम से भाग गया, पूर्वकाल संयोजिका पार किया और ipsilateral γ-glomerulus (2A चित्रा) में समाप्त हुई।

आदेश γ-glomerulus के प्रीसानेप्टिक फाइबर की कैल्शियम प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए, कैल्शियम हरी Dextran ORNs में electroporated किया गया था, एक ही प्रक्रिया के अनुसार। (0-1 डिग्री सेल्सियस) नकारात्मक तापमान कूदता ठंडा घंटी समाधान के नियंत्रित रिहाई के माध्यम से नथुने से प्रेरित थे। γ-glomerulus जिसमें एक 3 डी की मात्रा एक तेजी से लाइन रोशनी confocal खुर्दबीन के नीचे imaged किया गया था। -1 डिग्री सेल्सियस ΔTs ΔF / एफ सीए 2 निशान में प्रतिवर्ती चोटियों (चित्रा 2 बी <रूप में पहचानने योग्य γ-glomerulus में ठंड प्रतिक्रियाओं और उसके afferents, गति प्रदान करने के लिए पर्याप्त थे/ strong>, सी)।

इसके अलावा प्रायोगिक कदम से बाहर किए गए उनकी ramifying वृक्ष के समान अंत के माध्यम से γ-glomerulus से जुड़े माइट्रल कोशिकाओं में ठंड प्रेरित गतिविधि को मापने के लिए। ये पोस्टअन्तर्ग्रथनी फाइबर और आसपास के neuropil प्रभावी रूप से कैल्शियम के प्रति संवेदनशील डाई Fluo-8 बजे के सांस में लोडिंग से दाग थे, प्रदर्शन के कुछ ही दिनों के बाद एलेक्सा 647 Dextran ORNs में electroporated किया गया था (चित्रा 3 ए, बी)। माइट्रल कोशिकाओं के साथ Fluo-8 AM भरे थे, और घ्राण उपकला प्रेरित किया गया था दो बार निम्न प्रतिमान के अनुसार: ठंड घंटी, हिस्टिडीन (10 माइक्रोन) के और कमरे के तापमान घंटी, बाद में आवेदन किया। दो संदर्भ निशान, एक ही हिस्टिडीन को तापमान बूँदें, एक दूसरे को, विशेष रूप से जवाब दर्ज की मात्रा में रुचि के क्षेत्रों से ले जाया गया। गतिविधि सह-संबंध इमेजिंग (एसीआई) 6 अभिकलन चयनित संदर्भ पर आधारित थाउच्च विपरीत के साथ तापमान या हिस्टिडीन उत्तरदायी सीए 2 संकेत (चित्रा -3 सी, डी) के लिए या तो इसी पोस्टअन्तर्ग्रथनी नेटवर्क के वृक्ष के समान आकृति विज्ञान कल्पना करने के लिए बताते हैं। अंत में, थर्मल और chemosensitive नक्शे कलर-कोडेड थे और एक दूसरे के शीर्ष पर मढ़ा, दिखा कैसे तापमान और रासायनिक जानकारी घ्राण दूसरे क्रम न्यूरॉन्स (चित्रा 3E) के लिए अलग-अलग केशिकागुच्छ से अवगत करा दिया है। एकीकरण और साझा घ्राण नेटवर्क में जानकारी के दोनों प्रकार के प्रसंस्करण का एक विवरण के लिए, Kludt एट अल देखें। 5

आकृति 1
चित्रा 1: ORN electroporation और सांस में लोडिंग का अवलोकन (ए) एक्स के दोनों नाक cavities में घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स। laevis लार्वा एलेक्सा रंजक या calciu साथ electroporated थेमीटर के प्रति संवेदनशील रंगों Dextran अणुओं के लिए युग्मित। फ्लोरोसेंट संकेतक टर्मिनल axonal द्रुमायण तक anterogradely पहुंचा दिया गया। electroporation के बाद 24 घंटे, दोनों गोलार्द्धों में glomerular परत फ्लोरोसेंट धुंधला दिखाया। (बी) के एक गोलार्द्ध में घ्राण बल्ब के सेलुलर संगठन के योजनाबद्ध। glomerular परत तक फैला समूहों में बल्ब: औसत दर्जे का छोटा सा, मध्यवर्ती और पार्श्व समूहों। घ्राण जानकारी केशिकागुच्छ में उत्तेजक synapses के माध्यम से कोशिकाओं को माइट्रल रिसेप्टर न्यूरॉन्स से स्थानांतरित कर रहा है। Periglomerular कोशिकाओं और दाना कोशिकाओं निरोधात्मक घ्राण प्रसंस्करण और एन्कोडिंग नियमन न्यूरॉन्स होते हैं। γ-glomerulus (सियान) आसानी से छोटे neuropil जहां ipsilateral (लाल) और contralateral (नारंगी) घ्राण फाइबर विलय कर के रूप में पहचान की थी। (सी) सांस लोड हो रहा है γ-glomerulus के आसपास के क्षेत्र में हासिल की थी बाद synaptic मुख्य रूप से माइट्रल कोशिकाओं और उनके dendri से मिलकर neuropil दागटिक पेड़ glomerular परत में काफी शाखाओं में बंटी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: ORNs के electroporation संरचनात्मक और कार्यात्मक कनेक्टिविटी का पता चलता है (ए) द्विपक्षीय ipsilateral (हरा) द्वारा γ-glomerulus के तंत्रिका वितरण और contralateral (लाल) घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स (ORNs)।। स्केल बार 50 माइक्रोन =। (बी) कैल्शियम के प्रति संवेदनशील डाई कैल्शियम ग्रीन dextran के साथ electroporation के बाद घ्राण बल्ब। बिचला (आईएमसी), औसत दर्जे का (एमसी) और छोटे क्लस्टर (अनुसूचित जाति) दिखाई दे रहे हैं। छवि के 100 माइक्रोन मोटी माप मात्रा की अधिकतम प्रक्षेपण है। स्केल बार 50 माइक्रोन =। (सी) बंद हुआ छोटे समूह का दृश्य। दर्ज की गई मात्रा (12 माइक्रोन) हैएक अधिक से अधिक प्रक्षेपण में प्रतिनिधित्व किया। छवि आच्छादन के रूप में ग्रे और कलर-कोडेड ΔF / एफ नक्शे में बेसल फ्लोरोसेंट स्तर को दर्शाया गया है। ठंड घंटी समाधान के साथ उत्तेजना के लिए अधिकतम प्रतिक्रिया साजिश रची है। γ-glomerulus कड़ी प्रतिक्रिया व्यक्त करते हुए दो पड़ोसी केशिकागुच्छ चुप रहते हैं। इनसेट γ-glomerulus ब्याज का संकेत क्षेत्र के लिए इसी के लिए ΔF / एफ ट्रेस दिखाता है। नीली पट्टी प्रोत्साहन आवेदन का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार = 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। सांस लोडिंग और एसीआई थर्मल और chemosensitive नेटवर्क को अलग कर देना (ए) छोटे समूह में समाप्त ORNs के axons गैर Calci साथ electroporation द्वारा दाग थेउम संवेदनशील डाई एलेक्सा 647 Dextran। बिंदीदार रेखा γ-glomerulus रूपरेखा। (बी) दूसरा माप चैनल कैल्शियम के प्रति संवेदनशील डाई Fluo-8 AM साथ सांस में लदान के बाद में (ए) के रूप में एक ही क्षेत्र की छवि। कुछ माइट्रल सेल somata दिखाई दे रहे थे लेकिन इसके विपरीत सीमित था। तीरों के बाद, दो निशान प्रतिक्रिया प्लॉट किए जाते थे, जो गतिविधि के सहसंबंध इमेजिंग (एसीआई) के लिए इस्तेमाल किया गया। नीले, लाल और काले रंग के निशान से नीचे सलाखों ठंड घंटी, हिस्टिडीन (10 माइक्रोन) के और कमरे के तापमान घंटी के रूप में नकारात्मक नियंत्रण, क्रमशः के आवेदन की शुरुआत को दर्शाती है। दो सीए 2 निशान मापा मात्रा के हित के विभिन्न क्षेत्रों से ले जाया गया। (सी) में ट्रेस (बी) ठंड घंटी करने के लिए मुख्य रूप से जवाब क्षेत्रों पर प्रकाश डाला के एसीआई नतीजा है। (डी) में ट्रेस (बी) हिस्टिडीन करने के लिए मुख्य रूप से जवाब क्षेत्रों पर प्रकाश डाला के एसीआई नतीजा है। (ई) के दो एसीआई नक्शे का ओवरले। माइट्रल ज का जवाब कोशिकाओंistidine और इन्नेर्वतेद glomerulus (लाल) थर्मल माइट्रल कोशिकाओं और γ-glomerulus (सियान) से आसानी से अलग पहचाना थे। यह आंकड़ा की सभी छवियों को एक 28 माइक्रोन मोटी मात्रा की अधिकतम तीव्रता अनुमानों हैं। स्केल बार = 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

इस के साथ साथ प्रस्तुत तरीकों रिकॉर्डिंग तापमान प्रसंस्करण पर लक्ष्य में Xenopus की घ्राण बल्ब टैडपोल laevis। प्रोटोकॉल दाग पहली और घ्राण बल्ब में दूसरे क्रम न्यूरॉन्स और एक नमूना तैयार करने में जो घ्राण प्रणाली मुख्य रूप से बरकरार है। इस प्रकार, तापमान के प्रति संवेदनशील γ-glomerulus के सक्रियण पर नजर रखी और उसके केमो-संवेदनशील पड़ोसी केशिकागुच्छ साथ तुलना की जा सकती है। इस glomerulus की अनूठी द्विपक्षीय इन्नेर्वतिओन प्रेतसंबंधी विभिन्न रंगों के साथ सेल electroporation द्वारा कल्पना की है। इसके अलावा, सांस में लोड हो रहा है घ्राण बल्ब के भीतर एक बड़ी मात्रा में फैले माइट्रल कोशिकाओं के धुंधला के लिए अनुमति देता है। न्यूरोनल नेटवर्क प्रसंस्करण तापमान प्रेरित संकेतों दोहराया प्रोत्साहन अनुप्रयोगों के साथ कैल्शियम माप लेने और बाद में गतिविधि सह-संबंध इमेजिंग के साथ डेटा का विश्लेषण करने से पता चला है।

प्रोटोकॉल पर प्रकाश डाला गया दो परिष्कृत धुंधला प्रक्रिया dures, जो दोनों के लिए संतोषजनक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने में सतर्क हेरफेर और अभ्यास की आवश्यकता है। electroporation के दौरान पशुओं के किसी भी चोट को टाला जा सकता है, नाक में इलेक्ट्रोड स्थिति खासकर जब। बेहतर, घ्राण उपकला के साथ कोई संपर्क नहीं हो जाना चाहिए। ध्यान दें कि जानवरों को अभी भी electroporation प्रक्रिया के बाद से रह रहे हैं और उनके ठीक होने के समय को ध्यान में रखा जाना चाहिए। धुंधला electroporation का एक दौर, इस्तेमाल रंगों के प्रकार के आधार पर हो सकता है जिसके बाद भी कमजोर बनी हुई है, तो इसकी तीव्रता नाक में डाई एकाग्रता बढ़ाने के द्वारा बढ़ाया जा सकता है। चूंकि dextran युग्मित अणुओं और निष्क्रिय प्रसार (1-2 मिमी / 10 दिन की गति से) धीमी गति से axonal परिवहन सहित कई तंत्रों के माध्यम से ले जाया जाता है, एक और विकल्प जानवरों को छोड़ने से पहले electroporation के बाद 48 घंटे इंतजार करने के लिए है। वैकल्पिक रूप से, electroporation वसूली के एक दिन बाद दोहराया जा सकता है।

jove_content "> सांस लोडिंग डाई की राशि के बाद से एक महत्वपूर्ण कदम है माइट्रल कोशिकाओं में प्रवेश को विनियमित करने के लिए मुश्किल है और विंदुक टिप आकार और आवेदन के स्थान जैसे विभिन्न मानकों पर निर्भर करता है। एक confocal प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे प्रक्रिया की निगरानी के लिए उपयोगी साबित होता है डाई आवेदन की अवधि का समायोजन है और इस तरह की तैयारी भर में इसी तरह धुंधला परिणाम पैदा होता है। इसके अलावा, पहले से electroporated टैडपोल छोटे समूह की स्थिति (γ-glomerulus शामिल) की पहचान के द्वारा डाई आवेदन के लिए सबसे अच्छी स्थिति निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। सबसे माप के दौरान महत्वपूर्ण कदम दोनों पारी और नमूने के विरंजन से बचने के लिए है। शिफ्ट सावधानी से स्थिति खुर्दबीन के नीचे घंटी प्रवाह से बचा जा सकता है। रूप में ब्याज की क्षेत्र के विरंजन सीमित करने, माप समय आवश्यक करने के लिए कम किया जाना चाहिए ।

कैल्शियम के प्रति संवेदनशील रंगों के साथ सांस में लोडिंग धुंधला केवल बहुत प्रदान करता हैसीमित विपरीत स्वस्थ कोशिकाओं को आम तौर पर कम कैल्शियम का स्तर है और इस प्रकार के बाद से कमजोर बेसल प्रतिदीप्ति दिखा। लागू करने गतिविधि सह-संबंध इमेजिंग समान कैल्शियम संकेतों के साथ गतिविधि और प्रकाश डाला गया संरचनाओं के आधार पर विपरीत उत्पन्न करके इस सीमा में गतिरोध उत्पन्न। इस अधिग्रहण के बाद विश्लेषण विधि ब्याज (संदर्भ ट्रेस) के एक चयनित क्षेत्र के कैल्शियम संकेत और 3 डी की मात्रा में प्रत्येक व्यक्ति पिक्सेल के बीच संबंध कारक गणना करता है। इसलिए, दृढ़ता से प्राप्त परिणामों के संदर्भ का पता लगाने के रूप में चयनित गतिविधि के पैटर्न पर निर्भर करते हैं। मुख्य ध्यान माइट्रल सेल इन्नेर्वतिओन पैटर्न कल्पना करने के लिए है, तो एक संदर्भ सहज neuronal गतिविधि से निकाली गई संकेत पसंद है, और सबसे अधिक सक्रिय माइट्रल कोशिकाओं को चुनने का सबसे अच्छा परिणाम का उत्पादन होगा। माइट्रल कोशिकाओं के chemo- या थर्मामीटरों संवेदनशील नेटवर्क खुलासा करने के लिए, संदर्भ केवल या तो हिस्टिडीन या ठंडे घंटी के लिए प्रतिक्रियाओं युक्त निशान चयन किया जाना चाहिए। एक पूरे glomerulus ओ का चयनब्याज हमेशा के लिए एक स्पष्ट संदर्भ ट्रेस नहीं प्रदान कर सकता है, खासकर अगर संरचनाओं दो अलग उत्तेजनाओं का जवाब देने के लिए एक दूसरे के शीर्ष पर झूठ बोल रहे हैं के क्षेत्र के रूप में आर माइट्रल सेल सोम। ऐसे एक मामले में, यह अक्सर glomerulus या हित के क्षेत्र के रूप में सेल शरीर के एक छोटे क्षेत्र का चयन करने के लिए उपयोगी है।

पिछले दशकों में, electroporation एक कारगर तरीका एक या एकाधिक कोशिकाओं 11,12 दाग के रूप में वर्णित किया गया है। यहां यह विशेष रूप से घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स लेबल करने के लिए प्रयोग किया जाता है। Dextran संयुग्मित अणुओं उच्चतम क्षमता दे, और गैर कैल्शियम संवेदनशील रंगों के लिए, चयन की सीमा व्यापक है और पूरा स्पेक्ट्रम आम तौर पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 13 में इस्तेमाल शामिल किया गया है। हालांकि, कैल्शियम के प्रति संवेदनशील रंगों जो सफलतापूर्वक घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स में electroporated कर रहे हैं पल कैल्शियम हरी dextran के लिए सीमित कर रहे हैं, और अगर अब भी Fluo 4 dextran व्यावसायिक रूप से उपलब्ध। इसके अलावा, रिकॉर्डिंग मुख्य रूप से superficia लक्ष्यकेवल घ्राण बल्ब के उदर सतह पर एल परतों, के बाद से तेजी से माप तकनीक के प्रवेश गहराई तक ही सीमित है। दो photon इमेजिंग आंशिक रूप से इस सीमा को पार कर सकते हैं, लेकिन अक्सर गति का अभाव है और आगे चयन कैल्शियम के प्रति संवेदनशील रंगों की राशि प्रतिबंधित।

हम यहाँ घ्राण बल्ब में तापमान प्रेरित गतिविधि को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया। मस्तिष्क neuropil एक तीन आयामी मात्रा तापमान की घ्राण प्रसंस्करण में शामिल जटिल सेलुलर नेटवर्क कल्पना करने के लिए के रूप में जांच होती है। घ्राण बल्ब में मापने तापमान प्रेरित गतिविधि बहुत हाल ही में सूचना दी गई है 5 और विभिन्न तकनीकों के संयोजन एक विशेष रूप से अनुकूलित प्रक्रिया की आवश्यकता है। ऊपर प्रस्तुत तकनीक का एक प्रमुख परिसंपत्ति है कि कोशिकाओं के सैकड़ों एक तैयारी जहां घ्राण प्रणाली के सबसे बरकरार है में तीन आयामों में imaged रहे हैं। ये लाभ मस्तिष्क पी के रूप में रूप में अच्छी तरह धुंधला तकनीक पर उच्च मांगों डालमरम्मत और इमेजिंग। उदाहरण के लिए, सेल electroporation और सांस में लोड हो रहा है घ्राण उपकला और बल्ब में कोशिकाओं की बड़ी मात्रा में मारा, और इस तरह पूरा सेलुलर नेटवर्क के दृश्य के लिए सक्षम है। इसके अलावा, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorophores की बजाय सांस में लोडिंग के माध्यम से रासायनिक संकेतक का वितरण प्रजातियों में से एक संभावित बड़ा सेट में माप सक्षम बनाता है। AM रंगों के साथ स्नान ऊष्मायन जैसे अन्य विकल्पों मुख्य रूप से स्लाइस जो घ्राण बल्ब गंभीर रूप से नुकसान में काम करते हैं, बरकरार ऊतक के केवल कुछ सौ माइक्रोमीटर जा रही है। इसकी तुलना में, पूरे माउंट तैयारी हमारे प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है कि γ-glomerulus की द्विपक्षीय इन्नेर्वतिओन बरकरार है और रिकॉर्डिंग इस प्रकार अभी भी एक सहकारी प्रणाली में लिया जाता है, उदाहरण के लिए सुनिश्चित करता है। अंत में, इमेजिंग में ही लाइन रोशनी माइक्रोस्कोपी 3 डी की मात्रा के अधिग्रहण की अनुमति के द्वारा किया जाता है। रेखा रोशनी माइक्रोस्कोपी confocal उच्चतम संभव अधिग्रहण की दर 6 उपलब्ध कराने तकनीकों में से एक है </ Sup> जो जरूरी हैं घ्राण बल्ब का एक बड़ा अंश को कवर करने के लिए। धीमी अधिग्रहण प्रणाली का इस्तेमाल किया है, लेकिन नुकसान यह है कि दर्ज की गई मात्रा का आकार कम किया जाना चाहिए किया जा सकता है। हाल के वर्षों में तेजी से छवि अधिग्रहण के लिए अन्य तरीकों का विकास किया गया है और विकल्प 14,15 रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। फिर भी, लाइन-रोशनी माइक्रोस्कोपी के लिए सबसे आसान तरीकों दोनों पर्याप्त गति और संकल्प हासिल करने के लिए की बनी हुई है। यहाँ उपयुक्त इमेजिंग setups के चयन के लिए दिशा निर्देशों के रूप में कुछ जानकारी इस प्रकार है। चूंकि कैल्शियम इमेजिंग मोटी मस्तिष्क की तैयारियों से भीतर किया जाता है, सेटअप सभ्य confocality प्रदान करना चाहिए और उद्देश्यों को 1.0 या अधिक की संख्यात्मक छिद्र होनी चाहिए। एक संदर्भ बिंदु के लिए, रिकॉर्डिंग लाइन रोशनी माइक्रोस्कोप के साथ लिया 0.5-1 हवादार इकाइयों के एक पिनहोल आकार के साथ एक मानक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के साथ लिया छवियों के अनुरूप हैं। तेजी से अधिग्रहण की गति वांछनीय है। 20 माइक्रोन की मोटाई के साथ एक मात्रा कम से कम 5 एल द्वारा कवरAyers, 100 माइक्रोन x 100 माइक्रोन के दृश्य के एक पार्श्व क्षेत्र और 0.5 माइक्रोन या छोटे के एक पिक्सेल आकार ढेर प्रति 1 हर्ट्ज की एक न्यूनतम गति से स्कैन किया जाना चाहिए। confocality को कम करने में गिना फोटॉनों की मात्रा में वृद्धि कर सकते हैं और इस प्रकार यदि आवश्यक हो तो तेजी से अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है, लेकिन और अधिक जानकारी का ध्यान केंद्रित प्रकाश रिकॉर्डिंग की खामी है। हालांकि, बाद से इस तरह के एक दृष्टिकोण ऑप्टिकल स्लाइस की मोटाई बढ़ जाती है, यह वास्तव में अलग-जेड विमानों के माध्यम से dendrites की ट्रेसिंग एसीआई 6 के आवेदन के बाद सुविधा कर सकते हैं।

आवश्यक उपकरण बड़े पैमाने पर घ्राण बल्ब नेटवर्क में तापमान प्रसंस्करण का अध्ययन करने के साथ साथ प्रस्तुत कर रहे हैं। तापमान प्रेरित गतिविधि कैल्शियम के प्रति संवेदनशील रंगों और संकेतों दोनों आ रहा है और γ-glomerulus से प्रस्थान के माध्यम से पहले और दूसरे आदेश न्यूरॉन्स में दर्ज की गई है। इसके अलावा, किस हद तक अलग-अलग माइट्रल कोशिकाओं पर कार्रवाई करने के लिए दोनों रासायनिक और तापमान जानकारी का आकलन किया जा सकता है। तैयारी ए के बाद सेVes घ्राण बल्ब बरकरार, घ्राण प्रसंस्करण में द्विपक्षीय इन्नेर्वतिओन की भूमिका आगे का अध्ययन किया जा सकता है। प्रक्रिया भी खुलासा कि क्या और कैसे थर्मामीटरों और chemoinformation घ्राण नेटवर्क 5 ओवरलैपिंग में इनकोडिंग है के लिए उपयोगी है। अंत में, जैसा कि ऊपर उल्लेख तकनीक घ्राण बल्ब में तापमान प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए सीमित नहीं हैं, लेकिन घ्राण प्रणाली के एक अधिक सामान्य मूल्यांकन, विशेष रूप से बड़े तीन आयामी मात्रा में सेलुलर प्रोसेसिंग नेटवर्क के लिए आवेदन किया जा सकता है। सांस में लोड हो रहा है और गतिविधि के सहसंबंध इमेजिंग, शक्तिशाली उपकरण निरीक्षण और न्यूरॉन्स के दर्जनों की गतिविधि की तुलना कर रहे हैं उन्हें अलग मस्तिष्क नेटवर्क 16 के लिए लागू कर रही है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Sodium chloride Merck Millipore 1064040500
Potassium chloride Merck Millipore 1049360250
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore 1023820250
Magnesium chloride hexahydrate Merck Millipore 1058330250
D(+)-Glucose Merck Millipore 1083371000
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
HEPES Merck Millipore 1101100250
Calcium Green 10 kDa Dextran Thermo Fisher Scientific C-3713
Dextran, Alexa Fluor 647 Thermo Fisher Scientific D-22914
Dextran, Alexa Fluor 546 Thermo Fisher Scientific D-22911
Fluo-8 AM TEFlabs 203
MK571 Alexis Biochemicals 340-021-M005
MS-222 Sigma-Aldrich E10521
Pluronic acid F-127 Sigma-Aldrich P2443 powder
L-Histidine monohydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich 53370
DMSO Merck Millipore 1029522500
Equipment
Electronic pipette BrandTech HandyStep Electronic Repeating Pipette
NiCr-Ni thermocouple Greisinger Elektronik GTF 300
Micropipette puller Narishige Model PC-10 two-step puller
Funnel applicator (Custom-made)
Line-illumination microscope (Custom-made) otherwise, a commercially available spinning disk microscope
Objective W Plan-Apochromat 63X/1.0  Zeiss 441470-9900-000
Objective W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC Zeiss 441452-9900-000
Software
MATLAB The MathWorks from R2010b upwards

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 112 तंत्रिका विज्ञान कैल्शियम इमेजिंग तापमान घ्राण बल्ब घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स माइट्रल कोशिकाओं गतिविधि सह-संबंध इमेजिंग, सांस में लोडिंग electroporation
की घ्राण बल्ब में कैल्शियम परिवर्तन की निगरानी के माध्यम से रिकॉर्डिंग तापमान प्रेरित neuronal गतिविधि<em&gt; Xenopus laevis</em
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Brinkmann, A., Okom, C., Kludt, E.,… More

Brinkmann, A., Okom, C., Kludt, E., Schild, D. Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (112), e54108, doi:10.3791/54108 (2016).

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