Protocol
Xenopus laevis tadpoles ile Tüm deneyler Hayvan Deneyleri Etik Göttingen Üniversitesi Komitesi tarafından onaylanan kurallarına göre yapılmıştır.
1. Elektroporasyon
- Nieuwkoop ve Faber 7'ye göre aşamaları 49-54 hayvanları seçin.
- Kayıt ayarları büyük bir çalışma mesafesi ve en az 2 Hz'lik bir frekansta 20 msn için 20 V gerilim darbeleri uygulayabileceğiniz bir elektroporasyon cihazı ile bir stereomikroskopta oluşur emin olun. bunlar zarar vermeden tetarlar 'burun deliklerine sokulabilir ve böylece 200 um'lik bir kaba çaplı iki platin elektrot ile voltaj darbeleri uygulanır.
- Dekstran konjuge boyanın kristallerinin hazırlanması (örneğin, kalsiyum Yeşil 10 kDa Dekstran, ya da Alexa Fluor 647 10 kDa Dekstran) küçük damlacıklar damıtılmış suyun yaklaşık 100 ul 5 mg, tipik olarak verilen bir miktarda çözülmesi ve izin vererekParafilm bir kağıda kuru 2 ul.
Not: kristaller az bir gün içinde kurutun ve bir yıldan fazla bir süre için derin dondurucuda -18 ° C'de daha sonra saklanabilir. - o ile karakterize cerrahi anestezi durumuna ulaşana kadar 1-2 dakika süreyle% 3 Tricaine metan sülfonat içeren musluk suyu koyarak hayvanların anestezisi kalp hızı, tüm hareketlerin kaybı ve mekanik uyaranlara tepkilerin eksikliği azalmıştır.
- Saf musluk suyunda 10 sn anestezi hayvan daldırın.
- Bir jel yastık üzerinde hayvan koyun ve zarar vermeden çevresinde iğneler yerleştirerek sabitleyin.
Not: kendi deri yoluyla iğneler alay hayvan düzeltmek etmeyin. - Yavaşça doku ile burun delikleri çevresi kurulayın.
- stereomicroscope altında hayvan koyun ve burun delikleri odaklanmak.
- , Burun deliği eşleşen büyüklükte bir boya kristalini almak için forseps kullanabilir burun boşluklarının birine yerleştirin ve tamamen eriyene kadar w, bekleyinhich az 1 dakika sürer. Kristaller küçük olmaları durumunda olmayan bir saydam yüksek konsantre bir çözüm üretmek kadar, her boşluğa 2 veya 3 ekleyin.
- tadpole deri ve burun deliklerinden bir tanesinin içine anot üzerinde katot yerleştirin.
Not: Bu özel ayar adım 1.3 belirtilen boyalar için de geçerlidir. Bir farklı polaritede boyalar için, boyama sonuçları burun deliklerine katot yerleştirerek geliştirilebilir. boya kutuplarına hakkında emin, her iki elektrot burun (burun deliği başına bir) aynı anda yerleştirilebilir ve eğer polarite tek voltaj darbeleri arasında gidip. - uyarıcı aralığının yaklaşık 0.5 saniye ile 20 V ve 20 milisaniyelik altı darbeleri uygulayın.
Not: Küçük kabarcıklar elektrotlar deri ve burun deliğine çözelti ile temas halinde olmak kaydıyla elektroporasyon sırasında burun deliğine elektrod çevresinde görünmelidir. kabarcıklar görülebilir ise bağlantı kablolarını kontrol edin ve emin electroporating Dević olunE istenen gerilim darbesi teslim edilir. - İkinci burun deliği için prosedürü (1,9-1,11) tekrarlayın.
- Oda sıcaklığında musluk suyu ile dolu bir kap içine elektropore iribaş aktarın. Hayvan bilinç kavuşur ve yüzme sürdürür kadar 5 ila 10 dakika bekleyin. Onu beslemek ve boya koku ampul için koku sinir boyunca taşındığı sırasında en az 1 gün kurtarmanızı sağlar.
- En iyi görüntüleme sonuçları için elektroporasyon izleyen 1-7 gün içinde electroporated hayvanların kullanın. görüntüleme önce boya taşıma ve kurtarma için en az 24 saat zaman verin.
2. Tüm Dağı Hazırlık
- Tüm hareketler durdu ve artık mekanik uyarılara yanıt verene kadar% 3 Tricaine metan sülfonat içeren musluk suyunda hayvan anestezisi.
- Bir stereomikroskop altında bir jel yastığı iribaş aktarın ve Besin her tarafında deri yoluyla iğneler alay bunu sıkıca düzeltmekrebrain.
- onun omurilik kesilmesinin iribaş Kurban.
- Burun boşlukları, koku sinirleri ve koku ampuller (Şekil 1A) hem de içeren bir doku bloğu dışarı incelemek için bir neşter kullanın. dokunmadan-olmadan burun deliğine yakın sol ilk kesi yapmak it-ve telencephalic-diensefalik sınırında kadar sol koku sinir ve ampul yanında bıçak ileri kesim hareket ettirin. Sağ tarafta aynı şekilde yapın. telencephalon bir final cut posterior yaparak sinir sisteminin geri kalanından hazırlanmasını izole edin.
- tadpole vücudun atınız ve beyin hazırlık ventral tarafı yukarı bakacak şekilde dikkatlice ters doku bloğu çevirin.
- koku sinirlerinin arasında iki iğne sokarak tekrar doku bloğu sabitleyin.
- Kurbağa Ringer çözeltisi (98 mM NaCI, 2 mM KCI bir damla koymak, 1 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 5 mM glikoz, 5 mM Na-piruvat, 10 mM HEPES, pH 7.8, osmola ayarlandıdoku üzerinde 230 mOsmol / L) lik.
- ince makas kullanarak üç kesiler yaparak akson sıralama bölgeyi kapsayan meninksler ve koku ampuller çıkarın. ampuller içine koku sinirlerinin giriş noktası (akson sıralama bölge) kadar sol koku ampul boyunca caudorostrally yakından kesilmiş, doku bloğu arka kenarından başlayarak.
- sağ hemisfer için yineleyin 2.8.
- forseps ile meninksler kaldırın ve akson sıralama bölgede önceki olanları dik, üçüncü kesim yapmak.
Not: koku ampul ventral yüzü görüntüleme ve bolus yükleme için erişilebilir. - iletilen ışık görüntüde görüntü kalitesini artırmak için, sırt tarafında prosedürünü tekrarlayın. Bu ekstra adımlar bolus yükleme için mikropipet gezmesini kolaylaştırmak, ancak kesinlikle gerekli değildir olabilir.
- daha fazla işleme ve görüntüleme için kurbağa Ringer dolu bir kayıt odasına örnek aktarın. s yapmakventral yüzü yukarı bakacak ve naylon liflerinin bir net örnek sabitleyin olduğu ure küçük bir platin çerçevesinin üzerine yayılmış.
- uyaranların daha kolay bir uygulama için naylon liflerden birinin üzerine burun boşlukları yerleştirin.
3. Bolus Yükleme
- (Ağırlık / hacim) AM boyası bir stok çözelti hazırlamak için, Pluronic F-127% 20 ihtiva eden, dimetil sülfoksit 20 ul (DMSO) içinde, kalsiyum AM boyası (örneğin, Flu-08:00) 50 ug çözündürülür. 1-2 ul hacminin küçük alikotları stok solüsyonları dondurun. Stok çözelti en az yarım yıl stabildir, ancak dondurularak-erime döngülerinden kaçınmak.
- Mikropipet çektirmenin kullanın ve 5-8 MQ bir direnç ve 1-2 mikron bir ucu çapı pipetler çekin.
- 250-500 uM bir konsantrasyonda kurbağa Ringer çözeltisi içinde boyanın hazırlanmış stok çözeltisi içinde çözülür.
- çoklu ilaç direnci taşıyıcıları engellemek için 500 uM bir konsantrasyona ulaşmak için MK571 ekleyin.
- Bir uzatılmış pipet kullanarak solüsyonu 10 ul mikropipet doldurun ve mikropipet hafifçe vurarak tüm hava kabarcıklarını çıkarmak.
- pipet tutucu mikropipet montaj ve basınç bir şırınga ya da bir pnömatik ilaç fırlatma cihazı ile ya elle uygulanan ve bir ölçü ile uygulanan basıncı izlemek olabilir emin olun.
- Mümkünse mikropipet ucundan çıkış görüntülendi ve ayarlanabilir, böylece enjekte boya heyecanlandırmak yeteneği ile bir mikroskop kurulum kullanın. İdeal olarak, bir konfokal görüntüleme kurulumu kullanın. Doku mikropipet ile ulaşılabilir böylece bir daldırma hedefi ile dik bir mikroskop kullanın.
- , Mikroskop altında tüm montaj hazırlık yerleştirin ampul kadar koku siniri takip etmek ve koku ampul ilgi alanı üzerine odaklanır.
- hazırlık canlılığı artırmak ve boya sızıntı yıkamak için kayıt odasına yoluyla taze Ringer solüsyonu serpmekmikropipet ucundan.
- ucu hazırlama rostral yöne doğru bakacak, koku ampul yüzeyine pipet indirin.
- Pipet tıkanmasını önlemek ve yavaşça dokuya eklemek için mikropipet küçük ve sabit pozitif basınç (~ 25 hPa) uygulayın.
- Pipet, dış doku katmanları ihlal sonra, mitral hücre tabakası bir Rostro dorsal yönde hareket eder. (Elektroporasyon ile olfaktör reseptör nöronların bir karşı boyama mikropipet konumunu ayarlamak için yararlı olduğunu unutmayın.) İdeal olarak, istenen kayıt sitesinden 50-100 mikron uzaklıkta pipet yerleştirin.
- ısıya duyarlı γ-glomerul boyama için, γ-glomerül presinaptik neuropil konumundan yaklaşık 50 mikron rostrally bir alanı hedef.
- 100-200 hPa aralığında bir pozitif basınç uygulayın. büyüklüğüne bağlı olarak basınç gücünü ayarlamakmikropipet ucu. Basınç ilk kez uygulanan Brightlight aydınlatma altında görünür hafif doku hareketlerini izleyerek pipetle çıkış onaylayın.
- Mikropipet dokusunda kalır yaklaşık 10 dakika boyunca sabit bir basınç sağlamak. Mümkünse başarılı yükleme zamanla yoğunluğu artan görülebilen hücre somata lekelenme neden olacağı için, floresan aydınlatma altında hücre yükleme için arada neuropil kontrol edin.
Not: Genellikle başarısız yükleme nedeni ucu veya toplanmış boya kümeleri giren dokuya bağlı pipet tıkanma olduğunu. Nazikçe kayıt odasının alt yüzeyinde karşı ucu kırarak pipet kurtarmak için bazen mümkün olabilir. Bununla birlikte, pipet birkaç mikrometrelik aşmamalıdır. bolus yükleme sırasında düşük basınç uygulayarak büyük pipet deliklerini dengeleyin. - Yükleme 10 dakika sonra, sıfır uygulanan basıncı azaltmak ve lekeleme edin.
Not: Lekeli alanın büyüklüğü önemli ölçüde değişir ve enjekte boya ve fırlatma sitenin konumu miktarı gibi çeşitli parametrelere bağlıdır. İyi bir boyama yaklaşık 100 um x 100 um bir alanı kaplamaktadır. - lekeli alanı çok küçük ya da istenilen kayıt sitesine kapsamaz tekrarlayın 3.10-3.13 yineleyin. henüz tıkanmış değil ise bir sonraki enjeksiyon için aynı mikropipet kullanın.
- Boya alımı ve kusurlu enzimin izin vermek için herhangi bir deney başlamadan önce son enjeksiyondan sonra en az 30 dakika bekleyin. her zaman taze Ringer solüsyonu ile kayıt odasına serpmek devam ediyor.
4. Ölçüm Ayarları
- ölçüm düzeneği üç boyutlu hacimleri kaydetmek için yeterli hızı ile konfokal mikroskop oluşur emin olun. yığın başına en az 1 Hz'lik bir toplama oranı seçin.
Not: Uygun kurulumları örnek hattını-bilge yerine p noktasının taranması örnek hat aydınlatma mikroskoplar dahiloint. Böyle bir kurulum basit bir gerçekleşme daha önce 6 tarif edilmiştir. Diğer seçenekler, disk mikroskopları dönüyor. Böyle bir kurulum varsa, normal bir nokta-tarama kurulum ile küçük alanları ölçmek mümkündür. - Bir glomerulus boyutuna sığacak kadar büyük bir hacim kaplı böylece ölçüm parametreleri ayarlayın.
Not: Bir kayıt hacmi tipik kalınlığı en az 5 kat ile kaplanmış olmalıdır 20 um aralığındadır. - ağartma için tüm presinaptik ölçümleri kontrol edin. Kaydedilen görüntülerin ortalama floresan yoğunluğu kayıt süresi boyunca düşmezse kadar lazer gücünü ayarlayın.
- 20-30 sn ağartma aşan ölçümleri için olasılığı yüksektir, ancak mümkün olduğu kadar ağartma bilmek postsinaptik tarafında kayıtlar için ölçüm süresi ve alanı sınırlar.
5. Koku Uygulama ve Sıcaklık Deneyleri
- 25 dökünTaze Ringer solüsyonu 50 ml'lik bir tüp içinde (önceden 4 ° C'de saklanır). bir buz kovası tüp yerleştirin.
- tüp içine bir termometre Temiz probu takarak soğutulan Ringer sıcaklığını izlemek. Sıcaklık deney başlamadan önce 1 ° C'nin altına düşene kadar bekleyin.
- 10 uM'lik bir konsantrasyonda Ringer çözeltisi içinde çözülmüş L-histidin, 50 ml hazırlayın.
- Odasında su akış uyarıcı çözeltisinin serbest bırakılması sırasında sabit ve kesintisiz kalır, böylece huni aplikatör 8 veya perfüze Ringer için eş zamanlı uyarıcı teslim sağlayan benzer bir uygulama sistemlerini kullanın. Distal çıkış 1 mm'den az uzakta koku epiteli dan böyle bir şekilde huni yerleştirin.
- epitele dijital bir termometre yakın ve huni uygulayıcının çıkışına bağlı bir NiCr-Ni sıcaklık sensörü yerleştirin. kaydetmek ve görsel dis için bir bilgisayara termometre çıkış portunu telküçük sıcaklık dalgalanmaları yansıtan voltaj değişikliklerini oynarlar.
- Deneye başlamadan önce, gerilim-to-sıcaklık ölçek faktörünü kurmak için standart bir termometre başka termosensör bağlayın.
- kayıt odasına banyo sıcaklığını anket ve 22 ° C'yi geçmediğinden emin olmak.
- görüntü elde etme Başlangıç ve sırasıyla 20-30 saniyelik bir arası sürelerde bir elektronik pipetle soğukluğunda Ringer, L-histidin ve oda sıcaklığı Ringer (20-22 ° C), 200-400 ul geçerlidir. uyaran bir uygulama daha iyi kontrol için, pipet mümkünse seçilmiş görüntüleme Kur tarafından gönderilen bir tetikleme sinyali ile uyaran bırakın. tekrarlanabilir sonuçlar için uygulama protokolü tekrarlayın.
- Onlar faaliyet korelasyon görüntüleme ile post-görüntüleme analizi için tercih edilir çünkü stimülasyon birkaç tur daha uzun kayıt setleri alın.
Not: kayıt zamanı ve dilim canlılığı arasında bir uzlaşma vardırbulunmak. 6 uyaran uygulamalarını kapsayan yaklaşık 2 dakika ölçümleri ağının iyi bir rekonstrüksiyon için yeterli aktiviteyi sağlar.
6. Görüntü İşleme kullanma Etkinlik Korelasyon Görüntüleme (ACI)
- Ön sinaptik Kayıtları Görüntü İşleme
- Soğuk Ringer solüsyonu ve histidin tarafından uyarılması ile kayıtları, onların farklı tepki profilleri (Kludt ve ark. 5) tarafından komşu histidin duyarlı glomerulus gelen ısıya duyarlı γ-neuropil ayırt eder.
- ORNs γ-glomerül ikili innervasyon görselleştirmek için iki farklı boyalarla elektroporasyona edildiği beyin hazırlama kayıtları eksenel doğrultuda maksimum yoğunluk oluşturun.
- Etkinlik korelasyon Görüntüleme kullanma Post-sinaptik Kayıtları Görüntü İşleme (ACI)
- Yeterli zaman noktalarında (10'dan fazla olan Seçin kayıtları0 kare) ve faaliyet insana yakışır bir miktar (en az iki etkinlik).
Not: aktivite koku uyaranlarla aktive hücresel ağları ortaya çıkarmak için aynı kayıt sırasında uyaranların çeşitli uygulamalar tarafından tek mitral hücre süreçlerini veya uyarılmış ortaya çıkarmak için kendiliğinden olabilir. - ölçülen yapılar kayıt süresi boyunca en fazla 2-3 piksel taşımak nerede kayıtları seçin.
Not: Çok fazla hareket Kayıtlar Kludt et al bir kaydırma düzeltme prosedürü uygulanarak kurtarılabilecek 5. - kayıtları kasar muzdarip olup olmadığını kontrol edin. Tüm görüntünün ortalama yoğunluk kayıt süresi boyunca düşerse, ağartıcı düzeltme aksi sonraki iki adımı atlayın gereklidir.
- lineer regresyon gerçekleştirerek her pikselin zaman izi için doğrusal eğilim hesaplayın.
- her piksel gelen sonuç çıkarma ayrı doğrusal componen ortadan kaldırmak içinbeyazlatma t.
Not: Bao ve Schild 9 tarafından tarif edildiği gibi alternatif bir Legendre bağlantı kullanılabilir gibi. - Junek ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi faaliyet korelasyon görüntüleme için bir adım-adım kılavuz (ACI) ile birlikte hazır kullanımlı MATLAB komut indirin. 6
Not:. Resim MATLAB komut kullanılarak bir alternatif olarak Junek ark 6'da tarif edilen adımları. - Veri değerlendirmesi için kullanılan sistemin MATLAB yoluna indirilen konteyner dosyaları 'aci.m', 'matVis.m' ve 'aci_roiSelector.m' taşıyın.
- X ve y yanal boyutları, z, eksenel yönde ve t, zamanla atıfta ile [x, y, z, t] -Matris olarak düzenlenen MATLAB kullanıcı çalışma alanına bir değişken olarak adım 5.8 edinilen ham verileri yükleyin .
- MATLAB komut satırından Arama 'aci'.
- kullanıcı arabiriminde (UI)Seçin "Veri Hazırlama 'görünen, sonra verileri ve sonuçları kaydedileceği bir dizin içeren değişken seçin.
Not: UI tam bir açıklama manuel aci komut eşlik bakın. - Görüntülenen varyans haritanın bir bakış elde etmek için UI karşılık gelen kaydırıcıyı hareket ettirerek ölçülen z katmanları ilerleyin.
- UI içine ilgi alanları (ROI) bölgenin boyutunu girin. mitral hücre soma yaklaşık 10 mikron yanal ve 5 mikron eksenel yönde yayılan ROI ayarlayın. Bir glomerulus için, eksenel olarak 20 yanal um ve 10 um arasında yüksek değerlere uygundur.
Not: ROI boyutu kayıt için seçilen piksel ölçekleme bağlıdır piksel sayısı olarak girilmek zorundadır. - cente üzerine orta fare tuşu ile tıklayıp çevreleyen mitral hücrelerin her biri görünür soma için γ-glomerul ve ek bölgeleri içeren bir ROI seçinHücre / glomerulus r.
- korelasyon hesaplama bütün referans izlerini haritalar tetikleyen ana UI kapatın. Sonuç otomatik olarak kaydedilir ve görüntülenir.
- Yeterli zaman noktalarında (10'dan fazla olan Seçin kayıtları0 kare) ve faaliyet insana yakışır bir miktar (en az iki etkinlik).
Representative Results
koku verici nöronlar elektroporasyonu (ORNs) Aktif aksonal taşıma araçları ile ileriye etiketlemesi için dekstran molekülleri ile konjuge Alexa Fluor boyalar veya kalsiyum göstergeleri ile elde edilmiştir. Eski boyalar ampul glomerüler katman dallanma duyu nöronları ve akson terminalleri parlak lekelenme temin ederken, ikinci bu hücrelerin nöronal aktivitenin ölçülmesine izin (Şekil 1 ve 2). İlk olarak, ısıya γ-glomerül konumu ve innervasyon desen sol ve sağ koku epiteli, sırasıyla (Şekil 1A) Alexa Fluor 647 dekstran ve Alexa Fluor 546 Dextran electroporating görüntülendi. Yirmi dört saat işleminden sonra, burun deliklerinde ORNs, iki koku sinirler ve her iki yarımkürede de glomerulusların floresan mikroskobu altında görünür. Farklı glomerüler kümeleri identifia vardıkendi pozisyonlara göre ble, γ-glomerul (Şekil 1B) içeren özellikle küçük küme. Kontralateral koku liflerin az sayıda ön komissürü geçti ve ipsilateral γ-glomerulus (Şekil 2A) sona kontralateral koku ampul geçti.
γ-glomerül presinaptik liflerin kalsiyum yanıtları kaydetmek için, kalsiyum Yeşil Dekstran aynı prosedüre göre, ORNs elektroporasyona. Negatif sıcaklık sıçramaları buz soğukluğunda Ringer çözeltisi kontrollü salım yoluyla burun deliğinde indüklenmiştir (0-1 ° C). γ-glomerul içeren bir 3D ses hızlı hat-aydınlatma konfokal mikroskop altında görüntülendi. -1 ° C ΔTs tanınabilir kadar taşınmış / F Ca 2+ izleri geri dönüşümlü zirveleri (Şekil 2B <soğuk γ-glomerulus yanıtları ve afferentler, tetiklemek için yeterli idi/ strong> C).
Bundan başka, deneysel adımların ramifying dendritik uçları ile γ-glomerulus bağlı mitral hücrelerde soğuk bağlı aktiviteyi ölçmek için gerçekleştirildi. Bu postsinaptik elyaflar ve çevresindeki nöropil etkili kalsiyum duyarlı boya Fluo-8 am bolus yükleme ile boyandı, gerçekleştirilen birkaç gün Alexa 647 sonra, Dekstran ORNs elektropore edilmiştir (Şekil 3A, B). İki kez aşağıdaki paradigmaya göre mitral hücreler Flu-8 am doluydu ve koku epiteli uyarıldı: soğuk Ringer, histidin (10 uM) ve oda sıcaklık Ringer, sonradan uyguladı. İki referans izleri, kaydedilen ses çıkar bölgelerinden biri, sadece histidin Sıcaklık düştükçe, diğeri, münhasıran yanıt alınmıştır. Etkinlik korelasyon görüntüleme (ACI) 6 bilgisayarlı seçilen referans dayalıYüksek kontrastlı sıcaklık veya histidin duyarlı Ca 2 + sinyali (Şekil 3C, D) ya da karşılık gelen postsinaptik ağların dendritik morfolojisi görselleştirmek için izler. Son olarak, termo-ve kemosensitif haritalar renk kodlu ve sıcaklık ve kimyasal bilgi koku ikinci dereceden nöronlar (Şekil 3E) bireysel glomerulusların nakledilirken gösteren, birbirinin üstüne bindirilmiş. Paylaşılan koku ağlarda bilgilerin her iki tip entegrasyonu ve işleme bir açıklaması için, Kludt et al. 5
Şekil 1: ORN elektroporasyon ve bolus yükleme Bakış (A) X hem burun boşluklarında Koku reseptör nöronları. laevis larvaları Alexa boya veya calciu ile elktroporatlandıDekstran moleküllere bağlanmış m duyarlı boyalar. floresan göstergeler, terminal aksonal arborization kadar anterogradely taşınmıştır. 24 saat elektroporasyon sonra, her iki yarıkürede de glomerüler katman floresan boyanma gösterdi. Tek yarımkürede koku ampul hücresel organizasyonun (B) şematik. glomerüler katman kümeler halinde ampul yayılmıştır: medial küçük, orta ve yan kümeleri. Koku bilgileri glomerüllerde uyarıcı sinapsların yoluyla hücrelerin mitral reseptör nöronlardan aktarılır. Periglomerular hücreleri ve granül hücrelerinin koku işleme ve kodlama modüle inhibitör nöronlar vardır. γ-glomerulus (camgöbeği) kolayca ipsilateral (kırmızı) ve karşı (turuncu) koku lifler birleşerek küçük nöropilde olarak tespit edilmiştir. (C) Bolus yükleme öncelikle mitral hücreler ve onların dendri oluşan post-sinaptik neuropil leke γ-glomerulus çevresinde elde edildiglomerüler katman önemli ölçüde dallanma tik ağaçları. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: ORNs Elektroporasyon yapısal ve işlevsel bağlantı ortaya ipsilateral (yeşil) tarafından γ-glomerül (A) İkili innervasyon ve karşı (kırmızı) olfaktör reseptör nöronları (ORNs).. Ölçek çubuğu 50 mikron =. (B) kalsiyum duyarlı boya Kalsiyum Yeşil Dekstran ile elektroporasyon sonra koku alma ampul. intermedial (IMC), medial (MC) ve küçük küme (SC) görebilir. Görüntü 100 mikron kalınlığında ölçüm hacmi maksimum izdüşümüdür. Ölçek çubuğu 50 mikron =. (C), küçük küme Close-up görünümü. Kaydedilen hacmi (12 um) olduğumaksimum çıkıntı temsil. görüntü bir bindirme olarak gri ve renk kodlu kadar taşınmış / F haritası bazal floresan seviyesini göstermektedir. Soğuk Ringer çözeltisi ile uyarılmaya maksimum yanıt çizilir. İki komşu glomerül sessiz kalırken γ-glomerulus şiddetle tepki gösterdi. ilave ilgi gösterilen bölgeye gelen γ-glomerulus için mesafe kadar taşınmış / F iz gösterir. mavi çubuk uyaran uygulamayı temsil eder. Ölçek çubuğu = 20 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Küçük kümede sonlanan ORNs arasında Bolus yükleme ve ACI ısıya ve kemosensitif ağları ayırmak (A) Aksonlar olmayan Calci ile elektroporasyon yöntemiyle boyandıduyarlı boya Alexa 647 Dekstran um. noktalı çizgi γ-glomerul özetliyor. Kalsiyuma-hassas boya Fluo-8 AM bolus yüklemeden sonra ikinci bir ölçüm kanalında (A) ile aynı bölgede (B) Görüntü. Bazı mitral hücre somata görünür ama kontrast sınırlı oldu. okları ardından iki cevap izleri aktivitesi korelasyon görüntüleme (ACI) için kullanılmış olan, çizilmiştir. Mavi, izleri aşağıda kırmızı ve siyah çubuklar soğukluğunda Ringer, histidin (10 uM), sırasıyla oda sıcaklığında Ringer negatif kontrol, uygulama başlangıcını tasvir etmektedir. İki Ca 2+ izleri ölçülen hacim ilgi farklı bölgelerinden alındı. (C), soğuk Ringer baskın yanıt alanları vurgulayarak iz (B) ACI sonucu. (D) histidin baskın yanıt alanları vurgulayarak iz (B) ACI sonucu. İki ACI haritaları (E) Yerleşimi. h yanıt mitral hücrelerinistidine ve inerve glomerulus (kırmızı) ısıya mitral hücreler ve γ-glomerulus (camgöbeği) kolayca ayırt edildi. Bu rakamın tüm görüntüleri 28 mikron kalınlığında hacminin maksimum yoğunluk projeksiyonları vardır. Ölçek çubuğu = 20 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Xenopus koku alma ampul Kurbağa yavrularını laevis, burada sunulan yöntemler kayıt sıcaklık işleme hedefliyoruz. İlk protokol lekeleri ve koku alma ampul ikinci dereceden nöronlar ve koku alma sistemi esas bozulmadan kalır hangi bir örnek hazırlık sağlar. Böylece, sıcaklığa duyarlı γ-glomerulus aktivasyonu izlenir ve kemo-duyarlı bir komşu glomerül ile karşılaştırılabilir. Bu glomerulus benzersiz ikili innervasyonu spektral farklı boyalarla hücre elektroporasyon ile görüntülenmiştir. Ayrıca, büyük hap yükleme koku ampul içinde büyük miktarda kapsayan mitral hücre boyama sağlar. nöronal ağ işleme sıcaklığı kaynaklı sinyaller tekrarlanan uyaran uygulamaları ile kalsiyum ölçümleri alarak ve daha sonra etkinlik korelasyon görüntüleme verileri analiz edilerek ortaya çıkar.
protokol iki sofistike boyama proce vurgulamaktadır tatmin edici ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için dikkatli manipülasyon ve uygulama gerektiren her ikisi de DURES. elektroporasyon sırasında hayvanların herhangi bir yaralanma burun içine elektrotlar konumlandırma, özellikle kaçınılması gereken olmuştur. Optimal, koku epiteli ile hiçbir temas meydana gelmelidir. hayvanlar hala elektroporasyon işlemden sonra yaşayan ve iyileşme süresi dikkate alınması gerektiğini unutmayın. boyama kullanılan boyaların tiplerine bağlı olarak ortaya çıkabilir elektroporasyon bir tur, sonra çok zayıf kalırsa, onun yoğunluğu burun boya konsantrasyonu artırarak artırılabilir. Dekstran çiftli moleküller ve pasif difüzyon (1-2 mm / gün 10 hızında) yavaş aksonal taşıma gibi çeşitli mekanizmalar üzerinden taşınan olduğundan, başka bir alternatif hayvanlar kurban edilmeden önce elektroporasyon sonra 48 saat beklemek. Seçenek olarak ise, elektroporasyon iyileşme bir gün sonra tekrar edilebilir.
jove_content "> Bolus yükleme konfokal floresan mikroskop altında prosedürü izleme. mitral hücrelerin giren düzenleyen zordur ve uygulama pipet boyutu ve konumu gibi çeşitli parametrelere bağlıdır boya miktarı beri kritik bir adımdır için yararlı olduğunu kanıtlıyor boya uygulama süresini ayarlayarak ve bu şekilde preparasyonlar arasında benzer boyama sonuçları üretilmesi. Ayrıca, daha önce elektroporasyona tadpoles. (γ-glomerul içeren) küçük bir kümenin konumunu belirleyerek boya uygulama için en iyi konumu belirlemek için gereken en ölçümler sırasında kritik adım numunenin hem shift ve ağartma kaçınmaktır. kayması özenle mikroskop altında Ringer akışını konumlandırarak önlenebilir. ilgi alanı beyazlatma sınırlamak için olduğu gibi, ölçüm süresi esas düşürülmelidir .Kalsiyum duyarlı boyalar ile bolus yükleme boyama sadece çok sağlarSınırlı kontrast sağlıklı hücreler genellikle böylece düşük kalsiyum düzeyleri ve o zamandan beri zayıf bazal floresan göstermektedir. etkinlik korelasyon görüntüleme uygulanarak benzer kalsiyum sinyalleri ile faaliyet ve golleri yapılara dayalı kontrast oluşturarak bu sınırlama circumvents. Bu alım sonrası analizi yöntemi kalsiyum faiz (referans iz) bir seçilen bölgenin sinyal ve 3D hacmi her pikselin arasındaki korelasyon katsayısı hesaplar. Bu nedenle, güçlü Elde edilen sonuçlar, referans iz olarak seçilen aktivite desen bağlıdır. Ana odak mitral hücre innervasyon desen görselleştirmek için ise, spontan nöronal aktivitenin türetilen bir referans sinyal tercih ve en iyi sonuçları üretecek en aktif mitral hücrelerin seçmektir. mitral hücrelerin kemo ya da ısı duyarlı ağlar ortaya için, yalnızca histidin veya soğuk Ringer birine yanıt içeren referans izi seçilmelidir. bütün bir glomerulus o seçimiher zaman iki farklı uyaranlara yanıt yapılar birbirinin üstüne yalan, özellikle açık bir referans iz sağlamayabilir ilgi bölge olarak r mitral hücre soma. Böyle bir durumda, ilgi bölgesi olarak glomerüllerden veya hücre vücudun daha küçük bir alanı seçmek için genellikle yararlı olur.
Son birkaç on yılda, elektroporasyon, tek veya birden çok hücre 11,12 leke için etkili bir yöntem olarak tarif edilmiştir. Burada özellikle olfaktör reseptör nöronların etiketlemek için kullanılır. Dekstran-konjuge moleküller en yüksek verimliliği vermek ve non-kalsiyum duyarlı boyalar için, seçim aralığı geniş olan ve tipik olarak floresan mikroskobu 13 kullanılan tam spektrumu kapsar. Ancak, başarılı bir olfaktör reseptör nöronların içine electroporated kalsiyum duyarlı boyalar kalsiyum yeşil dekstran sınırlı şu anda, ve Flu-4 dekstran hala eğer piyasada mevcut. Bunun yanı sıra, kayıtlar esas superficia hedefSadece koku ampul ventral yüzeyinde l katmanları, hızlı ölçüm teknikleri penetrasyon derinliği sınırlı olduğundan. İki foton görüntüleme kısmen bu sınırlamanın üstesinden ancak genellikle hız yoksun ve daha fazla seçilebilir kalsiyum duyarlı boyalar miktarını kısıtlar olabilir.
Bu koku ampul ısı kaynaklı aktivitesini ölçmek için bir protokol tarif. Beyin neuropil sıcaklık koku işleme katılan kompleks hücresel ağlar görselleştirmek için üç boyutlu bir hacim olarak taranır. Koku ampul sıcaklık kaynaklı etkinliğinin ölçülmesi çok yakın 5 bildirilen ve farklı teknikleri birleştirerek bir özel özelleştirilmiş prosedürü gerektirir olmuştur. Yukarıda belirtilen tekniklerin büyük bir aktif hücrelerin yüz koku sisteminin en bozulmadan kalan bir hazırlık üç boyutlu olarak görüntülenmiş olmasıdır. Bu avantajlar beyin p yanı sıra boyama teknikleri yüksek talepleri koymakonarım ve görüntüleme. Örneğin, hücre elektroporasyon ve bolus yükleme koku epiteli ve ampul hücrelerin büyük miktarlarda vurmak ve böylece tam hücresel ağlar görselleştirme sağlar. Ayrıca, yerine genetik olarak kodlanmış fluorophores bolus yükleme yoluyla kimyasal göstergeler teslim türlerinin potansiyel büyük set ölçümleri sağlar. AM boyalarla banyo inkübasyon gibi diğer alternatifler öncelikle sağlam doku sadece birkaç yüz mikrometre bırakarak, ciddi koku ampul zarar dilimler halinde çalışır. γ-glomerül ikili innervasyon bozulmadan kalır ve kayıtları böylece hala ameliyat sistemde alınır karşılaştırıldığında, bizim protokolde kullanılan tüm montaj hazırlık örneğin sağlar. Son olarak, görüntüleme kendisi 3D hacimleri edinimi sağlayan hat-aydınlatma mikroskobu ile yapılır. Line-aydınlatma mikroskobu mümkün olan en yüksek alım hızları 6 sağlayan konfokal tekniklerden biridir </ Sup> gerekli olan koku ampul büyük bir kısmını kapsayacak. Yavaş toplama sistemleri kullanılabilir, ancak kaydedilen hacminin büyüklüğü azaltılması gerekmektedir dezavantaja sahiptir olabilir. Son yıllarda, hızlı görüntü elde etmek için diğer yöntemler geliştirilmiştir ve alternatif 14,15 olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, hat-aydınlatma mikroskobu yeterli hız ve çözünürlük hem de kazanmak için en kolay yöntemlerden biridir. Burada uygun görüntüleme kurulumları seçiminde yol gösterici olarak bazı bilgiler izler. kalsiyum görüntüleme kalın beyin hazırlıkları içinde yapılır yana, kurulum iyi confocality vermelidir ve hedefler 1.0 veya daha yüksek sayısal deliklere sahip olmalıdır. bir referans noktası, satır aydınlatma mikroskop ile çekilen kayıtlar 0.5-1 havadar birimlerinin iğne deliği boyutu ile standart bir lazer tarama mikroskobu ile çekilen görüntülere karşılık gelir. Hızlı kazanım hızı arzu edilir. 20 um kalınlığında bir birim, en az 5 L kapsadığıAyers, 100 um x 100 um bakış bir yanal alanı ve 0.5 um veya daha küçük bir piksel boyutu yığın başına 1 Hz, minimum hızda taranmalıdır. confocality azaltılması sayılan fotonların miktarını artırmak ve gerekirse böylece daha hızlı satın almalar için izin verir, ama daha out-of-odak ışığını kayıt dezavantajı vardır yapabilirsiniz. Bu tür bir yaklaşım, optik dilimlerin kalınlığı artırdığından, ancak, aslında ACI 6 uygulanmasından sonra farklı Z-düzlemleri boyunca dendritler izleme kolaylaştırabilir.
gerekli araçları yoğun burada sunulmaktadır koku alma ampul ağlarında sıcaklık işleme incelemek için. Sıcaklık kaynaklı etkinlik kalsiyum duyarlı boyalar ve sinyallerin ulaşan ve γ-glomerulus ayrılmaksızın her ikisi ile, birinci ve ikinci dereceden nöronlarda kaydedilir. Bundan başka, ne ölçüde bağımsız mitral hücrelerinin her iki kimya ve sıcaklık bilgisi değerlendirilebilir işlem. Hazırlık lea yanakoku alma ampul sağlam ves, koku işleme bilateral innervasyon rolü daha ele alınabilir. Işlem aynı zamanda koku ağları 5 örtüşen kodlanmış nasıl termo ve chemoinformation olsun ve ifşa için yararlıdır. Son olarak, yukarıda belirtilen teknikler koku ampul ısı tepkilerinin çalışma ile sınırlı değildir, ancak koku alma sisteminin bir genel değerlendirme büyük üç boyutlu bir hacim, özellikle hücresel işleme ağları için de uygulanabilir. Bolus yükleme ve aktivite korelasyon görüntüleme farklı beyin ağları 16 onları uygulanabilir hale gözlemlemek ve nöronların onlarca aktivitesini karşılaştırmak için güçlü araçlardır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Sodium chloride | Merck Millipore | 1064040500 | |
| Potassium chloride | Merck Millipore | 1049360250 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1023820250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 1058330250 | |
| D(+)-Glucose | Merck Millipore | 1083371000 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| HEPES | Merck Millipore | 1101100250 | |
| Calcium Green 10 kDa Dextran | Thermo Fisher Scientific | C-3713 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | D-22914 | |
| Dextran, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | D-22911 | |
| Fluo-8 AM | TEFlabs | 203 | |
| MK571 | Alexis Biochemicals | 340-021-M005 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Pluronic acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | powder |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 53370 | |
| DMSO | Merck Millipore | 1029522500 | |
| Equipment | |||
| Electronic pipette | BrandTech | HandyStep Electronic Repeating Pipette | |
| NiCr-Ni thermocouple | Greisinger Elektronik | GTF 300 | |
| Micropipette puller | Narishige | Model PC-10 | two-step puller |
| Funnel applicator | (Custom-made) | ||
| Line-illumination microscope | (Custom-made) | otherwise, a commercially available spinning disk microscope | |
| Objective W Plan-Apochromat 63X/1.0 | Zeiss | 441470-9900-000 | |
| Objective W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | |
| Software | |||
| MATLAB | The MathWorks | from R2010b upwards |
References
- Mamasuew, K., Breer, H., Fleischer, J. Grueneberg ganglion neurons respond to cool ambient temperatures. Eur J Neurosci. 28 (9), 1775-1785 (2008).
- Brechbühl, J., Moine, F., Broillet, M. -C. Mouse Grueneberg ganglion neurons share molecular and functional features with C. elegans amphid neurons. Front. Behav. Neurosci. 7 (193), (2013).
- Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. J Comp Neurol. 489 (4), 403-424 (2005).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. J Neurosci. 35 (20), 7892-7902 (2015).
- Junek, S., Chen, T. W., Alevra, M., Schild, D. Activity correlation imaging: visualizing function and structure of neuronal populations. Biophys J. 96 (9), 3801-3809 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
- Schild, D. A computer-controlled device for the application of odors to aquatic animals. J Electrophysiol Tec. 12 (2), 71-79 (1985).
- Bao, G., Schild, D. Fast and Accurate Fitting and Filtering of Noisy Exponentials in Legendre Space. PLoSONE. 9 (3), (2014).
- Terasaki, M., Schmidek, A., Galbraith, J. A., Gallant, P. E., Reese, T. S. Transport of cytoskeletal elements in the squid giant axon. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (25), 11500-11503 (1995).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Lechleiter, J. D. Chemical Calcium Indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Salome, R., et al. Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy using acousto-optic deflectors. J Neurosci Methods. 154 (1), 161-174 (2006).
- Keller, P. J., Ahrens, M. B., Freeman, J. Light-sheet imaging for systems neuroscience. Nature Methods. 12 (1), 27-29 (2015).
- Hjorth, J. J., et al. Detection of silent cells, synchronization and modulatory activity in developing cellular networks. Dev Neurobiol. , (2015).
