Protocol
Alla experiment med Xenopus laevis grodyngel utfördes enligt de riktlinjer som godkändes av Göttingen University kommittén för etik i djurförsöks.
1. Elektroporering
- Välj djur av stegen 49-54 enligt Nieuwkoop och Faber 7.
- Se till att inspelnings installationen består av ett stereomikroskop med en stor arbetsavstånd och en elektroporation anordning som kan applicera spänningspulser av 20 V under 20 ms vid en frekvens på åtminstone 2 Hz. Tillämpa spänningspulserna via två platinaelektroder med en grov diameter på 200 | j, m, så att de kan föras in i de grodyngel 'näsborrar utan att orsaka skada.
- Förbered kristaller av en dextran konjugerat färgämne (t.ex. kalcium Grön 10 kDa dextran eller Alexa Fluor 647 10 kDa dextran) genom att lösa den typiskt levererade mängden 5 mg i cirka 100 pl destillerat vatten och låta små droppar av2 pl torrt på ett ark Parafilm.
Obs: Kristallerna torka i mindre än en dag och kan lagras i efterhand vid -18 ° C i frysen under en period på över ett år. - Söva djuren genom att placera dem i kranvatten innehållande 3% Tricaine metansulfonat i 1-2 minuter tills den når den kirurgisk anestesi tillstånd som kännetecknas av minskad hjärtfrekvens, förlust av alla rörelser och brist på svar på mekaniska stimuli.
- Doppa sövda djur under 10 sekunder i rent kranvatten.
- Placera djuret på en gelkudde och fixa det genom att placera nålar runt den utan att skada den.
Obs: inte fixera djuret genom att peta nålar genom sin hud. - torka försiktigt området kring näsborrarna med en vävnad.
- Placera djuret under stereo och fokusera på näsborrarna.
- Använd pincett för att plocka ett färgämne kristall storlek matchar näsborre hål, placera den i en av näshålorna och vänta tills det löser sig fullständigt, which tar mindre än 1 min. Om kristallerna är mindre, tillsätt 2 eller 3 in i varje formrum tills de producera en icke-genomskinlig hög-koncentrerad lösning.
- Placera katoden på huden av grodynglet och anoden i en av näsborrarna.
Obs: Denna speciella inställning gäller för de färgämnen som nämns i steg 1,3. För färgämnen med olika polaritet, kan färgningsresultaten förbättras genom att placera katoden i näsborrarna. Om du är osäker om polariteten av färgämnet kan båda elektroderna placeras samtidigt i näsborrarna (en per näsborre), och polariteten växlade mellan enskilda spänningspulser. - Applicera sex pulser av 20 V och 20 ms med cirka 0,5 sek av stimulans intervall.
Notera: Små bubblor ska visas runt elektroden i näsborren under elektroporering förutsatt att elektroderna är i kontakt med huden och lösningen i näsborren. Om inga bubblor är synliga kontrollera anslutningskablar och se till att electroporating Device levererar önskad spänningspuls. - Upprepa proceduren (1,9-1,11) för andra näsborren.
- Överför electroporated grodyngel i en bägare fylld med kranvatten vid rumstemperatur. Vänta 5 till 10 minuter tills djuret återfår medvetandet och återtar sin simning. Mata den och låt den återhämta sig under minst en dag under vilken färgämnet transporteras längs luktnerven till luktbulben.
- Använd electroporated djur inom 1-7 dagar efter elektroporering för bästa bildbehandling resultat. Ge åtminstone 24 timmar tid för färg transport och återhämtning innan avbildning.
2. Hela Mount Beredning
- Söva djuret i kranvatten innehållande 3% Tricaine metansulfonat tills alla rörelser har slutat och det inte längre svarar på mekaniska stimuli.
- Överföra grodyngel till en gelkudde under ett stereomikroskop och åtgärda det tätt genom att peta nålar genom huden på varje sida av den forebrain.
- Offra grodyngel genom att bryta sin ryggmärg.
- Använda en skalpell för att dissekera ut ett block av vävnad som innehåller båda näshålorna, de luktnerv och lukt glödlampor (Figur 1A). Gör första snittet nära vänster näsborre-utan att röra den, och flytta bladet framåt skärning längs vänster luktnerven och glödlampa tills telencephalic-diencephalic gränsen. Göra detsamma på höger sida. Isolera beredningen från resten av nervsystemet genom att göra en final cut posteriort telencephalon.
- Avyttra kroppen av grodyngel och vänd försiktigt vävnaden blocket upp och ned så att den ventrala sidan av hjärnan beredningen vänd uppåt.
- Stift vävnadsblocket igen genom att sätta två nålar mellan de olfaktoriska nerver.
- Sätta en droppe av Frog Ringer-lösning (98 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 5 mM glukos, 5 mM Na-pyruvat, 10 mM HEPES, justerad till pH 7,8, osmolahet av 230 mOsmol / L) på vävnaden.
- Ta bort hjärnhinnorna täcker axonet sorteringszonen och lukt lökar genom att göra tre snitt med fina saxar. Med början från den bakre kanten av den vävnadsblock, skär caudorostrally tätt längs den vänstra luktloben tills ingångspunkten av de olfaktoriska nerver in lökarna (axonet sorteringszonen).
- Upprepa steg 2,8 för den högra hjärnhalvan.
- Höja hjärnhinnorna med pincett och göra den tredje snitt, som är vinkelrät mot de tidigare vid axonet sorteringszonen.
Obs: Den ventrala sidan av luktbulben är nu tillgänglig för avbildning och bolus lastning. - För att förbättra bildkvaliteten i den överförda ljusbild, upprepa proceduren för ryggsidan. Dessa extra steg kan underlätta navigering av mikropipett för bolus lastning, men inte absolut nödvändigt.
- Överföra provet till en inspelning kammare fylld med Frog Ringer för vidare bearbetning och avbildning. Görure att den ventrala sidan är vänd uppåt och fäst provet med ett nät av nylonfiber sträckte sig över en liten platina ram.
- För en enklare tillämpning av stimuli placera näshålorna ovanpå ett av de nylonfibrer.
3. Bolus Loading
- Lös upp 50 | j, g av kalcium AM färgämne (t.ex., Fluo-08:00) i 20 pl dimetylsulfoxid (DMSO) innehållande 20% av Pluronic F-127 (vikt / volym) för att framställa en stamlösning av AM färgämne. Frysa stamlösningarna i små alikvoter av 1-2 | j, l volym. Stamlösningen är stabil under minst ett halvår, men undvika frys-tö cykler.
- Använd en mikropipett avdragare och dra pipetter med ett motstånd av 5-8 MQ och en spetsdiameter av 1-2 pm.
- Upplösa den framställda stamlösningen av färgämnet i Frog Ringers lösning vid en koncentration av 250 till 500 ^ M.
- Lägga MK571 att nå en koncentration av 500 | iM till block multiresistens transportörer.
- Fyll mikropipett med 10 ul av lösningen med hjälp av en långsträckt pipettspets och ta bort alla luftbubblor genom att ställa mikropipett.
- Montera mikropipett i pipetten hållaren och se till att trycket kan appliceras antingen manuellt med en spruta eller en pneumatisk läkemedelsutkastningsanordning och övervaka det anbringade trycket med en mätare.
- Använd om möjligt ett mikroskop installation med möjlighet att excitera den injicerade färgämnet så att utflödet från mikropipett spets kan visualiseras och justeras. Helst använder en konfokal avbildning setup. Använd en upprätt mikroskop med en immersionsobjektiv så att vävnaden kan nås med mikropipetten.
- Placera hela montera beredning under mikroskop, följa luktnerven tills lampan och fokusera på det område av intresse i luktbulben.
- BEGJUTA färsk Ringer-lösning genom inspelningen kammaren för att öka lönsamheten av preparatet och tvätta ur färgen läckerfrån mikropipett spets.
- Sänka pipetten på ytan av luktloben, med spetsen pekande in i den rostrala riktningen av preparatet.
- Applicera en liten och konstant övertryck (~ 25 hPa) till mikropipett för att förhindra igensättning av pipetten och försiktigt in den i vävnaden.
- När pipetten har brutit de yttre vävnadsskikten, flytta den i en rostro-dorsal riktning i mitral cellskiktet. (Observera att en motfärgning av luktreceptor neuroner genom elektroporering är användbart för att justera mikropipett ståndpunkt.) Det är önskvärt, placera pipettspetsen på ett avstånd av 50 till 100 | j, m från den önskade inspelningsstället.
- För färgning den temperaturkänsliga γ-glomerulus, rikta ett område omkring 50 | j, m rostrally från positionen för den presynaptiska neuropil av γ-glomerulus.
- Applicera ett positivt tryck i området av 100 till 200 hPa. Justera tryckhållfasthet beroende på storleken avmikropipett spetsen. Bekräfta utflödet från pipetten genom att titta på små vävnadsrörelser synliga i Ljus belysning när tryck appliceras för första gången.
- Bibehålla ett konstant tryck under ca 10 min medan mikropipett kvar i vävnaden. Om möjligt, kontrollera neuropil under tiden för cellbelastning i lysrörsbelysning som framgångsrik belastning resulterar i synlig cell somata färgning med ökande intensitet över tiden.
Obs: Ofta orsaken till misslyckade belastning är pipett igensättning på grund av vävnad in i spetsen eller aggregerade färgkluster. Det är ibland möjligt att rädda pipetten genom att försiktigt bryta dess spets mot den undre ytan av inspelningen kammaren. Emellertid bör pipettspetsen inte överstiga några få mikrometer. Kompensera större pipett öppningar genom att tillämpa lägre tryck under bolus lastning. - Efter de 10 min av lastning, reducera det applicerade trycket till noll och kontrollera färgning.
Notera: Storleken på det färgade området varierar avsevärt och beror på flera parametrar såsom mängden insprutat färgämne och lokalisering av utstötningsstället. En bra färgning täcker en yta på cirka 100 pm x 100 pm. - Om det färgade området är för litet eller inte täcker det önskade inspelningsplatsen, upprepa steg från 3,10 till 3,13. Använd samma mikropipett för nästa injektion om den ännu inte har igensatt.
- Vänta minst 30 minuter efter den sista injektionen innan några experiment för att möjliggöra färgupptagning och avestring. Fortsätt att BEGJUTA inspelningen kammaren med färsk Ringer-lösning vid alla tidpunkter.
4. Measurement Settings
- Vara säker på att mätningen installationen består av ett konfokalmikroskop med tillräcklig hastighet för att spela in tredimensionella volymer. Välj en förvärvsfrekvens på minst 1 Hz per stack.
Obs: Lämpliga inställningar inkluderar till exempel linjebelysnings mikroskop scanning prov radvis istället för punkt med point. En enkel realisering av en sådan inställning har tidigare beskrivits 6. Andra alternativ snurrar skiv mikroskop. Om ingen sådan inställning är tillgänglig, är det fortfarande möjligt att mäta mindre områden med en vanlig punkt-scanning setup. - Ställ in mätparametrarna så att en volym tillräckligt stor för att passa storleken på en glomerulus kan täckas.
Obs: Den typiska tjockleken hos en inspelningsvolymen är i området av 20 | j, m, som bör täckas av åtminstone 5 skikt. - Kontrollera alla presynaptiska mätningar för blekning. Justera lasereffekt tills den genomsnittliga fluorescensintensiteten hos de inspelade bilderna inte faller under den tid under inspelningen.
- Begränsa tidmätningen och området för inspelningar på postsynaptiska sida för att undvika blekning så mycket som möjligt, även om mätningar som överstiger 20-30 sek blekning sannolikt kommer att ske.
5. Lukt Ansökan och temperatur Experiment
- pour 25ml färsk Ringer-lösning (tidigare lagrad vid 4 ° C) i ett 50 ml rör. Placera röret i en ishink.
- Övervaka temperaturen hos den kylda Ringer genom att föra in den rena sond på en termometer in i röret. Vänta tills temperaturen sjunker under en ° C före start av experimentet.
- Förbered 50 ml av L-histidin löses i Ringer-lösning vid en koncentration av 10 ^ M.
- Använd en tratt applikatorn 8 eller liknande programsystem som möjliggör stimulans leverans samtidigt till perfusion Ringer så att vattenflödet i kammaren förblir konstant och oavbrutet under utsättningen av stimulans lösning. Placera tratten på ett sådant sätt att den distala utlopp är mindre än 1 mm från det olfaktoriska epitelet.
- Placera en NiCr-Ni temperatursensor ansluten till en digital termometer nära epitelet och utloppet av tratten applikatorn. WIRE termometern utgången till en dator för att spela in och visuellt disspela spänningsförändringar återspeglar små temperaturvariationer.
- Innan du startar experimentet ansluta en annan termosensor till en standard termometer för att fastställa spänning-temperaturskalfaktor.
- Undersökning badtemperaturen i inspelningen kammaren och se till att den inte överstiger 22 ° C.
- Starta bilden förvärvet och sekventiellt applicera 200-400 jil av kall Ringers, L-histidin och rumstemperatur Ringer (20-22 ° C) via en elektronisk pipett med en interstimulus intervall på 20 till 30 sek. För en bättre kontroll av den stimulans ansökan, släpp stimulus med en triggsignal sänds av den valda avbildnings setup för att pipetten om möjligt. Upprepa applikationsprotokoll för reproducerbara resultat.
- Ta uppsättningar längre inspelningar med flera omgångar av stimulering eftersom de är att föredra för efter bildanalys med aktivitetskorrelations avbildning.
Obs: En kompromiss mellan inspelningstiden och slice livskraft haratt bli hittad. Mätningar av ca 2 min omfattar 6 stimulans applikationer ger tillräcklig aktivitet för en bra rekonstruktion av nätverket.
6. Bildbehandling Använda Aktivitets Korrelation Imaging (ACI)
- Bildbehandling av pre-synaptiska Recordings
- I inspelningar med stimulering genom kall Ringer lösning och histidin, skilja temperaturkänsliga γ-neuropil från grann histidin känsliga glomeruli genom deras olika svarsprofiler (se Kludt et al. 5).
- Skapa en maximal intensitet projektion i axiell riktning från inspelningar av hjärnan beredning i vilken Örns har elektro med två olika färger för att visualisera det bilaterala innervation av γ-glomerulus.
- Bildbehandling av postsynaptisk inspelningar med aktivitets Korrelation Imaging (ACI)
- Välj inspelningar med tillräckliga tidpunkter (mer än 100 frames) och en anständig mängd aktivitet (åtminstone två händelser).
Notera: Aktiviteten kan vara antingen spontan att avslöja processerna för enkel mitralceller eller induceras av flera tillämpningar av stimuli under samma inspelning för att avslöja de cellulära nätverken som aktiveras av de olfaktoriska stimuli. - Välj inspelningar där de uppmätta strukturerna rör sig inte mer än 2-3 pixlar över tidsförloppet av inspelningen.
Obs: Inspelningar med alltför mycket rörelse kan räddas genom att tillämpa en förskjutning korrigeringsförfarandet som beskrivs i Kludt et al 5. - Kontrollera om inspelningarna lider av blekning. Om den genomsnittliga intensiteten hos hela bilden faller över tidsförloppet av inspelningen är blekmedel korrigering nödvändig, annars hoppa över nästa två steg.
- Beräkna den linjära trenden för tidskurva för varje bildelement genom att utföra en linjär regression.
- Subtrahera resultatet från varje pixel individuellt för att eliminera den linjära COMPONENt av blekningen.
Obs: Som ett alternativ Legendre montering kan användas såsom beskrivits av Bao och Schild 9. - Hämta redo att använda MATLAB manus tillsammans med en steg-för-steg guide för aktivitet korrelations imaging (ACI) såsom beskrivits av Junek et al. 6
Obs: Följ stegen som beskrivs i Junek et al sex som ett alternativ till att använda den medföljande MATLAB manus.. - Flytta filernas aci.m "," matVis.m "och" aci_roiSelector.m "från den nedladdade behållaren till MATLAB vägen för system som används för datautvärdering.
- Ladda rådata som förvärvats i steg 5,8 som en variabel till MATLAB användar arbetsyta organiserat som en [x, y, z, t] -matris med x och y hänvisar till sidodimensioner, z, axiell riktning och t, tidsförloppet .
- Call "aci" på kommandoraden i MATLAB.
- I användargränssnittet (UI)som visas väljer du "Förbered Data" och välj sedan variabel som innehåller data och en katalog där resultaten kommer att sparas.
Obs: För en fullständig beskrivning av UI se manualen som medföljer aci skriptet. - Bläddra igenom de uppmätta z-skikt genom att flytta motsvarande reglaget i användargränssnittet för att få en överblick av variansen visade kartan.
- Ange storleken på regionen av intresse (ROI) i användargränssnittet. För en mitral cell soma justera ROI för att spänna över ungefär 10 | j, m i den laterala och 5 | j, m i den axiella riktningen. För en glomerulus, de något högre värden på 20 ^ m i sidled och 10 | j, m axiellt är lämpliga.
Obs! ROI storlek måste anges som ett antal pixlar, vilket beror på pixel skalning som valts för inspelning. - Välj en ROI som innehåller γ-glomerulus och ytterligare regioner för varje synlig soma av de omgivande mitralceller genom att klicka med mittenknappen på center av cellen / glomerulus.
- Stäng huvud UI som utlöser beräkningen av korrelationskartor för alla referensspår. Resultatet sparas automatiskt och visas.
- Välj inspelningar med tillräckliga tidpunkter (mer än 100 frames) och en anständig mängd aktivitet (åtminstone två händelser).
Representative Results
Elektroporering av luktreceptor neuroner (Örns) uppnåddes med Alexa Fluor färgämnen eller kalcium indikatorer konjugerade med dextran molekyler för antero märkning via aktiv axonal transport. Medan de tidigare färgämnen ge ljus färgning av sensoriska neuroner och deras axon terminaler förgrening i glomerulär lager av löken, den senare tillåter mätning av nervaktivitet i dessa celler (figur 1 och 2). Först positionen för värmekänsliga γ-glomeruli och dess innervation mönster visualiseras genom electroporating Alexa Fluor 647 dextran och Alexa Fluor 546 Dextran i vänster och höger lukt epitel, respektive (Figur 1A). Tjugofyra timmar efter ingreppet, de Örns i näsborrarna, de två luktnerv och glomeruli i båda halvkloten var synlig under fluorescensmikroskopi. De olika glomerulära kluster var identifiable av sina respektive ståndpunkter, särskilt litet kluster bestående av γ-glomerulus (Figur 1B). Ett litet antal kontralukt fibrer sprang genom den kontra luktloben, korsade tvärförbindelser i hjärnan och avslutas i den ipsilaterala γ-glomerulus (figur 2A).
För att kunna registrera kalciumsvaren från de presynaptiska fibrerna i γ-glomerulus ades Kalcium Grön Dextran electroporated i Orns, enligt samma förfarande. Negativa temperatur hopp inducerades vid näsborren via kontrollerad frisättning av iskall Ringers lösning (0-1 ° C). En 3D-volymen omfattande γ-glomerulus avbildades i en snabb linjebelysnings konfokalmikroskop. ΔTs av -1 ° C var tillräckligt för att utlösa kalla svar i γ-glomerulus och dess afferenter, igenkännbara som reversibla toppar i AF / F Ca2 + spår (Figur 2B </ strong>, C).
Ytterligare experimentella steg utfördes för att mäta kall-inducerad aktivitet i de mitralceller anslutna till γ-glomerulus via sina ramifying dendritiska ändelser. Dessa postsynaptiska fibrer och omgivande neuropil var effektivt färgas av bolus lastning av kalciumkänsliga färgämnet Fluo-08:00, utförde några dagar efter Alexa 647 Dextran hade elektro i Örns (Figur 3A, B). Mitralceller fylldes med Fluo-08:00, och det olfaktoriska epitelet stimulerades två gånger i enlighet med följande paradigm: kallt Ringers, histidin (10 | iM) och rumstemperatur Ringer, appliceras därefter. Två referensspår togs från regioner av intresse i den inspelade volymen, ett svar enbart temperaturen sjunker, den andra, att endast histidin. Aktivitet korrelations imaging (ACI) 6 beräknades baserat på det valda referensspår att visualisera med hög kontrast den dendritiska morfologin hos de postsynaptiska nät motsvarande antingen temperaturen eller histidin känsliga Ca2 + signal (figur 3C, D). Slutligen värmekänsliga och kemosensitivt kartor var färgkodade och överlagras på ovanpå varandra, som visar hur temperatur och kemisk information förmedlas från individ glomeruli till de olfaktoriska andra ordningens neuroner (Figur 3E). För en beskrivning av integration och bearbetning av båda typerna av information i delade lukt nätverk, se Kludt et al. 5
Figur 1: Översikt över ORN elektroporering och bolus lastning (A) luktreceptor nervceller i båda näshålorna av X.. laevis larver elektroporerades med Alexa färgämnen eller Calcium känsliga färgämnen kopplade till dextran molekyler. De fluorescerande indikatorer transporterades anterogradely tills terminalen axonal arborization. 24 timmar efter elektroporering, glomerulär lagret i båda hjärnhalvorna visade fluorescerande infärgning. (B) Schematisk bild av den cellulära organisationen av luktbulben i en halvklotet. Glomerulär lagret spänner lampan i kluster: den mediala, små, mellan och sido kluster. Olfactory information överförs från receptorn nervceller att mitralceller via excitatoriska synapser i glomeruli. Periglomerular celler och kornceller är hämmande neuroner modulerande lukt bearbetning och kodning. Den γ-glomerulus (cyan) var lätt identifieras som den lilla neuropil där ipsilaterala (röd) och kontralaterala (orange) lukt fibrer samman. (C) Bolus loading uppnåddes i närheten av γ-glomerulus för att färga den post-synaptiska neuropil som huvudsakligen består av mitralceller och deras dendritic träd förgrenar avsevärt i den glomerulära lagret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Elektroporation av Örns avslöjar strukturell och funktionell anslutning (A) Bilateral innervation av γ-glomerulus från ipsilaterala (grön) och kontralaterala (röd) luktreceptor neuroner (Örns).. Skalstreck = 50 | im. (B) Den luktloben efter elektroporering med kalciumkänsligt färgämne Kalcium Grön Dextran. Den intermedial (IMC), mediala (MC) och den lilla modul (SC) är synliga. Bilden är en maximal projektion av 100 um tjock mätvolymen. Skalstreck = 50 | im. (C) Närbild utsikt över den lilla klustret. Den inspelade volymen (12 nm) ärrepresenterade i en maximal projektion. Bilden visar den basala fluorescerande nivån i grått och färgkodade AF / F kartan som ett överlägg. Den maximala responsen på stimulering med kall Ringers lösning plottas. Den γ-glomerulus reagerade starkt medan de två grann glomeruli tiga. Den infällda bilden visar den AF / F trace för γ-glomerulus som motsvarar den indikerade regionen av intresse. Den blå stapeln representerar stimulans ansökan. Skala bar = 20 pm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Bolus lastning och ACI dissociera värmekänsligt och kemosensitivt nät (A) Axoner av Orns som slutar i den lilla klustret färgades genom elektroporation med den icke-Calcium känsligt färgämne Alexa 647 Dextran. Den streckade linjen beskriver γ-glomerulus. (B) Bild av samma region som i (A) i den andra mätningen kanalen efter bolus lastning med kalcium känsliga färgämnet Fluo-08:00. Några mitral cell somata var synliga men kontrasten var begränsad. Följa pilarna ades två svars spår plottas, vilka användes för aktivitet korrelationsavbildning (ACI). Blått, rött och svarta fält under spåren visar uppkomsten av tillämpningen av kall Ringers, histidin (10 M) och rumstemperatur Ringer som negativ kontroll, respektive. De två Ca2 + spår togs från olika områden av intresse för den uppmätta volymen. (C) ACI resultatet av spår i (B) belyser områden svarar främst för kall Ringers. (D) ACI resultatet av spår i (B) belyser områden svarar främst till histidin. (E) överlagring av de två kartor ACI. Mitralceller svarar på histidine och innerverad glomerulus (röd) var lätt att skilja från värmekänsliga mitralceller och γ-glomerulus (cyan). Alla bilder i denna siffra är maximal intensitet projektioner av en 28 um tjock volym. Skala bar = 20 pm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
De metoder som presenteras här syftar till inspelningsbearbetningstemperaturen i luktbulben av Xenopus laevis grodyngel. Protokollet fläckar första och andra ordningens neuron i luktbulben och ger en provberedning i vilken luktsystemet förblir i huvudsak intakt. Således kan aktivering av temperaturkänsliga γ-glomeruli övervakas och jämföras med cellgifter känsliga grann glomeruli. Den unika bilateral innervation av denna glomeruli visualiseras genom cell elektroporering med spektralt olika färgämnen. Dessutom möjliggör bolus lastning för färgning av mitralceller spänner en stor volym inom luktbulben. De neuronala nätverk bearbetning temperatur inducerade signaler avslöjas genom att kalcium mätningar med upprepade stimulans applikationer och därefter analysera data med aktivitetskorrelations avbildning.
Protokollet belyser två sofistikerade färgning proce anden, vilka båda kräver försiktig manipulation och praxis för att uppnå tillfredsställande och reproducerbara resultat. Under elektroporering någon skada av djuren måste undvikas, särskilt när placering av elektroderna i näsborrarna. Optimalt bör ingen kontakt med luktepitel inträffa. Observera att de djur som fortfarande lever efter elektroporering förfarandet och deras återhämtning tid måste tas i beaktande. Om färgningen fortfarande är alltför dåligt efter en runda av elektroporering, vilket kan hända beroende på de typer av färgämnen som används, kan dess intensitet ökas genom att öka färgämneskoncentrationen i näsborrarna. Eftersom dextran kopplade molekyler transporteras via flera mekanismer, inklusive långsam axonal transport (vid en hastighet av 1-2 mm / dag 10) och passiv diffusion, är ett annat alternativ att vänta 48 timmar efter elektroporering innan offra djuren. Alternativt kan elektroporering upprepas efter en dag av återhämtning.
jove_content "> Bolus lastning är ett kritiskt steg, eftersom mängden färgämne kommer in i mitralceller är svår att reglera och beror på olika parametrar såsom pipettspetsen storlek och platsen för programmet. Övervakning proceduren under ett konfokalt fluorescensmikroskop visar sig vara användbara för justera varaktigheten av färgämne tillämpning och därigenom generera liknande färgningsresultat över preparat. Dessutom tidigare electroporated grodyngel bör användas för att bestämma den bästa positionen för färgen ansökan genom att identifiera läget för litet kluster (innefattande γ-glomerulus). den mest kritiskt steg under mätningarna är att undvika både förskjutning och blekning av provet. Förskjutningen kan undvikas genom att omsorgsfullt positionera Ringer flöde under mikroskop. som för att begränsa blekning av området av intresse, bör mättiden reduceras till det väsentliga .Bolus lastning färgning med kalciumkänsliga färgämnen ger endast mycketbegränsad kontrast eftersom friska celler i allmänhet har låga kalciumnivåer och därmed svagt basal fluorescens. Tillämpa aktivitet korrelations avbildning kringgår denna begränsning genom att generera kontrast baserat på aktivitet och belyser strukturer med liknande kalciumsignaler. Detta efter förvärvet analysmetod beräknar korrelationsfaktor mellan kalciumsignalen av ett utvalt område av intresse (referens spår) och att varje enskild pixel i 3D-volymen. Därför är de erhållna resultaten starkt beroende av aktiviteten mönster valt som referens trace. Om huvudfokus är att visualisera mitral cell innervation mönster är en referenssignal härledd från spontan neuronal aktivitet föredras, och välja de mest aktiva mitralceller ger de bästa resultaten. För att avslöja de kemo- eller värmekänsliga nätverk av mitralceller bör referens spår bara innehåller svar på antingen histidin eller kall Ringers väljas. Valet av en hel glomerulus or mitral cell soma som region av intresse kan inte alltid ge en tydlig hänvisning spår, i synnerhet om de strukturer som svarar mot de två olika stimuli som ligger ovanpå varandra. I ett sådant fall är det ofta bra att välja ett mindre område av glomerulus eller cellkroppen som regionen av intresse.
Under de senaste decennierna har elektroporation beskrivits som en effektiv metod för att färga enstaka eller flera celler 11,12. Här används för att specifikt märka luktreceptor nervceller. Dextran-konjugerade molekyler ger den högsta effektiviteten, och för icke-kalciumkänsliga färgämnen, är området för val brett och täcker hela spektrat som typiskt används i fluorescensmikroskopi 13. Men kalciumkänsliga färgämnen som framgångsrikt electroporated i luktreceptor nervceller är för närvarande begränsad till kalcium-grön dextran och Fluo-4 dextran om det fortfarande kommersiellt tillgängliga. Dessutom inspelningar riktar främst superficial skikt på den ventrala ytan av endast luktloben, eftersom penetrationsdjupet av snabba mättekniker är begränsad. Två-foton avbildning kan delvis övervinna denna begränsning men ofta saknar hastighet och begränsar mängden valbara kalciumkänsliga färgämnen ytterligare.
Vi här beskrivit ett protokoll för mätning av temperatur-inducerad aktivitet i luktloben. Hjärnan neuropil skannas som en tredimensionell volym för att visualisera komplexa cellulära nätverk som deltar i lukt bearbetning av temperaturen. Mätning av temperatur-inducerad aktivitet i luktloben har nyligen rapporterats 5 och kräver ett specifikt anpassad förfarande som kombinerar olika tekniker. En stor tillgång av de tekniker som presenteras ovan är att hundratals celler avbildas i tre dimensioner i en beredning där det mesta av det olfaktoriska systemet förblir intakt. Dessa fördelar ställer höga krav på färgningsteknik samt hjärnan preparation och bildbehandling. Till exempel, cell elektroporation och bolus lastning drabbade stora mängder av celler i den olfaktoriska epitelet och glödlampa, och på så sätt göra det möjligt för visualisering av kompletta cellulära nätverk. Dessutom möjliggör leverans av kemiska indikatorer via bolus lastning i stället för genetiskt kodade fluoroforer mätningar i en potentiellt större uppsättning av arter. Andra alternativ som bad inkubation med AM färgämnen arbetar främst i skivor som skadar luktbulben allvarligt, vilket innebär att endast några hundra mikrometer av intakt vävnad. I jämförelse, hela berget preparat som används i våra protokoll säkerställer till exempel att det bilaterala innervation av γ-glomerulus förblir intakt och inspelningarna således tas i ett fortfarande operativsystemet. Slutligen är avbildning i sig gjort av linje-belysnings mikroskopi tillåter förvärvet av 3D-volymer. Line-belysning mikroskopi är en av de konfokala tekniker ger högsta möjliga förvärvspriser 6 </ Sup> som är nödvändiga för att täcka en stor del av luktbulben. Långsammare förvärvssystem kan användas, men har nackdelen att storleken på den inspelade volymen måste minskas. Under de senaste åren har andra metoder för snabb bildtagning utvecklats och kan användas som alternativ 14,15. Ändå förblir linje belysning mikroskopi ett av de enklaste metoderna för att vinna både tillräcklig hastighet och upplösning. Här följer lite information som riktlinjer för val av lämpliga avbildnings inställningar. Eftersom kalcium avbildning sker inom från tjocka hjärnpreparat, bör installationen erbjuda anständiga konfokalitet och målen bör ha bländare på 1,0 eller högre. För en referenspunkt, inspelningar som tagits med linjebelysnings mikroskop motsvarar bilder tagna med en vanlig laserskanning mikroskop med en pinhole storlek på 0,5-1 luftiga enheter. Snabb upptagningshastighet är önskvärd. En volym med en tjocklek av 20 ^ m omfattas av minst 5 layers, en lateral synfält om 100 ^ m x 100 ^ m och en pixelstorlek på 0,5 um eller mindre bör scannas vid en hastighet på minst 1 Hz per stack. Att minska konfokalitet kan öka mängden fotoner räknade och därmed möjliggör snabbare förvärv om det behövs, men har nackdelen att spela in mer out-of-fokus ljus. Eftersom ett sådant tillvägagångssätt ökar tjockleken på de optiska skivor, det kan faktiskt underlätta spårning av dendriter genom olika z-plan efter applicering av ACI 6.
De nödvändiga verktygen för att i stor utsträckning studera bearbetningstemperatur i luktloben nätverk presenteras häri. Temperatur inducerad aktivitet registreras i de första och andra ordningens neuron via kalciumkänsliga färgämnen och signaler både ankommande och avgående från γ-glomerulus. Vidare i vilken utsträckning enskilda mitralceller bearbeta både kemiska och temperaturinformation kan bedömas. Eftersom preparatet leaVes luktbulben intakt, kan ytterligare studeras roll bilaterala innervation i lukt bearbetning. Förfarandet är också användbart för att avslöja om och hur termo- och chemoinformation kodas i överlappande lukt nät 5. Slutligen tekniker som nämns ovan inte begränsad till studiet av temperatursvar i luktbulben men kan användas för en mer allmän utvärdering av luktsystemet, särskilt de cellulära bearbetningsnätverk i stora tredimensionella volymer. Bolus lastning och aktivitetskorrelations avbildning är kraftfulla verktyg för att följa och jämföra aktiviteten av dussintals nervceller, vilket gör dem som gäller för olika hjärnnätverk 16.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Sodium chloride | Merck Millipore | 1064040500 | |
| Potassium chloride | Merck Millipore | 1049360250 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1023820250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 1058330250 | |
| D(+)-Glucose | Merck Millipore | 1083371000 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| HEPES | Merck Millipore | 1101100250 | |
| Calcium Green 10 kDa Dextran | Thermo Fisher Scientific | C-3713 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | D-22914 | |
| Dextran, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | D-22911 | |
| Fluo-8 AM | TEFlabs | 203 | |
| MK571 | Alexis Biochemicals | 340-021-M005 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Pluronic acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | powder |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 53370 | |
| DMSO | Merck Millipore | 1029522500 | |
| Equipment | |||
| Electronic pipette | BrandTech | HandyStep Electronic Repeating Pipette | |
| NiCr-Ni thermocouple | Greisinger Elektronik | GTF 300 | |
| Micropipette puller | Narishige | Model PC-10 | two-step puller |
| Funnel applicator | (Custom-made) | ||
| Line-illumination microscope | (Custom-made) | otherwise, a commercially available spinning disk microscope | |
| Objective W Plan-Apochromat 63X/1.0 | Zeiss | 441470-9900-000 | |
| Objective W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | |
| Software | |||
| MATLAB | The MathWorks | from R2010b upwards |
References
- Mamasuew, K., Breer, H., Fleischer, J. Grueneberg ganglion neurons respond to cool ambient temperatures. Eur J Neurosci. 28 (9), 1775-1785 (2008).
- Brechbühl, J., Moine, F., Broillet, M. -C. Mouse Grueneberg ganglion neurons share molecular and functional features with C. elegans amphid neurons. Front. Behav. Neurosci. 7 (193), (2013).
- Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. J Comp Neurol. 489 (4), 403-424 (2005).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. J Neurosci. 35 (20), 7892-7902 (2015).
- Junek, S., Chen, T. W., Alevra, M., Schild, D. Activity correlation imaging: visualizing function and structure of neuronal populations. Biophys J. 96 (9), 3801-3809 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
- Schild, D. A computer-controlled device for the application of odors to aquatic animals. J Electrophysiol Tec. 12 (2), 71-79 (1985).
- Bao, G., Schild, D. Fast and Accurate Fitting and Filtering of Noisy Exponentials in Legendre Space. PLoSONE. 9 (3), (2014).
- Terasaki, M., Schmidek, A., Galbraith, J. A., Gallant, P. E., Reese, T. S. Transport of cytoskeletal elements in the squid giant axon. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (25), 11500-11503 (1995).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Lechleiter, J. D. Chemical Calcium Indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Salome, R., et al. Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy using acousto-optic deflectors. J Neurosci Methods. 154 (1), 161-174 (2006).
- Keller, P. J., Ahrens, M. B., Freeman, J. Light-sheet imaging for systems neuroscience. Nature Methods. 12 (1), 27-29 (2015).
- Hjorth, J. J., et al. Detection of silent cells, synchronization and modulatory activity in developing cellular networks. Dev Neurobiol. , (2015).
