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Biochemistry

सहसंयोजक सेल्यूलोज कागज डिस्क और नग्न आंखों की Colorimetric Immunoassays में अपने आवेदन के लिए एंटीबॉडी का बंधन

Published: October 21, 2016 doi: 10.3791/54111
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1School of Applied Science, Temasek Polytechnic, 2University of Applied Sciences Utrecht

Abstract

इस रिपोर्ट में सेल्यूलोज फिल्टर पेपर ग्रेड नंबर 1 (मध्यम प्रवाह फिल्टर पेपर) डिस्क और ग्रेड नं 113 (तेज प्रवाह फिल्टर पेपर) डिस्क पर कब्जा एंटीबॉडी के सहसंयोजक स्थिरीकरण के लिए दो तरीके प्रस्तुत करता है। ये सेलुलोज कागज डिस्क एक silane युग्मन तकनीक के माध्यम से अमाइन कार्य समूहों के साथ grafted थे इससे पहले एंटीबॉडी उन पर स्थिर रहे थे। Periodate ऑक्सीकरण और glutaraldehyde पार से जोड़ने के तरीकों सेलुलोज कागज डिस्क पर कब्जा एंटीबॉडी भ्रष्टाचार के लिए इस्तेमाल किया गया। आदेश स्थिरीकरण के बाद अपने लक्ष्य के लिए कब्जा एंटीबॉडी की अधिकतम बाध्यकारी क्षमता सुनिश्चित करने के लिए सोडियम periodate, glutaraldehyde, और कागज डिस्क की सतह पर कब्जा एंटीबॉडी के विभिन्न सांद्रता के प्रभावों की जांच कर रहे थे। एंटीबॉडी कि एक glutaraldehyde पार से जोड़ने एजेंट के माध्यम से अमाइन-क्रियाशील सेलुलोज कागज डिस्क पर लेपित किया गया लक्ष्य के लिए बाध्यकारी गतिविधि बढ़ाया पता चला जब periodate ऑक्सीकरण विधि की तुलना। आईजीजी (माउस संदर्भ में सीरम) glutaraldehyde के माध्यम से covalently स्थिर एंटीबॉडी के आवेदन का परीक्षण करने के लिए इस अध्ययन में एक संदर्भ के लक्ष्य के रूप में इस्तेमाल किया गया था। एक नया कागज आधारित, एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) को सफलतापूर्वक विकसित और आईजीजी का पता लगाने के लिए मान्य किया गया था। इस विधि को उपकरण की आवश्यकता नहीं है, और यह आईजीजी के 100 एनजी / एमएल पता लगा सकते हैं। तेजी से प्रवाह फिल्टर पेपर मध्यम प्रवाह फिल्टर पेपर की तुलना में अधिक संवेदनशील था। इस परख के ऊष्मायन अवधि कम था और छोटा सा नमूना संस्करणों की आवश्यकता है। यह नग्न आंखों की, वर्णमिति प्रतिरक्षा अन्य लक्ष्य है कि पारंपरिक एलिसा के साथ की पहचान कर रहे हैं पता लगाने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

Introduction

बिंदु का ध्यान परीक्षण (POCT) नैदानिक अध्ययन चिकित्सा विज्ञान के लिए नई रणनीति का विकास, व्यक्तिगत चिकित्सा, और घर की देखभाल 1 के लिए महत्वपूर्ण है। सेल्यूलोज कागजात व्यापक रूप से immunoassays में प्लेटफॉर्म के रूप में इस्तेमाल किया, क्योंकि वे सस्ते, सुलभ, और उन से 2 परिचित हो रहे हैं। इसके अलावा, सेल्यूलोज कागज के झरझरा संरचना अतिरिक्त ऊर्जा प्रभाव के बिना तरल के प्रवाह को ड्राइव करने के लिए बिजली के पास। कागज आधारित bioanalysis के रिकार्ड के रूप में जल्दी 20 वीं सदी है, जब कागज क्रोमैटोग्राफी पहले का आविष्कार किया गया था 1952 में सबसे अधिक प्रचलित उदाहरण ऐसे गर्भावस्था और मधुमेह परीक्षण स्ट्रिप्स के रूप में इम्यूनोक्रोमैटोग्राफिक परीक्षण 3, के रूप में पाया जा सकता है। इन परीक्षणों अपेक्षाकृत तेजी से परख बार और सस्ती विश्लेषण 4 प्रदान करते हैं। उनकी सादगी के कारण, इन पारंपरिक कागज पट्टी परीक्षण व्यापक रूप से POCT निदान 5 में इस्तेमाल किया गया है।

वर्णमिति 6, विद्युत सहित पता लगाने के तरीकोंरासायनिक 7, और 8 electrochemiluminescence तरीकों जैविक नमूने में लक्ष्य को मापने के लिए सूचित किया गया है। इन मात्रात्मक तरीकों के अलावा, सेल्यूलोज कागज पर एंटीबॉडी immobilizing के लिए एक विश्वसनीय विधि भी नैदानिक ​​उपकरणों के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। गैर विशिष्ट सोखना कागज आधारित उपकरणों 9, 10 की सतह पर एंटीबॉडी को संशोधित करने के स्थिरीकरण के बाद अपने लक्ष्य के लिए अधिकतम बाध्यकारी क्षमता को सुनिश्चित करने के लिए मुख्य रणनीति है। हालांकि, पिछले एक अध्ययन पता चला है कि एंटीबॉडी कि सेल्यूलोज कागज पर adsorbed कर रहे हैं 40% से फाइबर 11 से desorb कर सकते हैं। इस प्रकार, सेल्यूलोज पर एंटीबॉडी के प्रत्यक्ष सोखना प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम 12 प्रदान नहीं कर सकते। एंटीबॉडी के सहसंयोजक स्थिरीकरण कि कागज पर सतहों grafted कर रहे हैं प्रभावी कागज आधारित bioassays 13 के विकास का एक वैकल्पिक तरीका है। विभिन्न तरीकों सेल्यूलोज 14, 15 के संशोधन के लिए सूचित किया गया है 12 के बाद अपने मूल कार्यक्षमता को बनाए रखने चाहिए। Carbonyldiimidazole 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate 16 के साथ संयुक्त; एक यूवी-आधारित रणनीति सक्रियण 17, 18 के माध्यम से 1-फ्लोरो-2-नाइट्रो-4-azidobenzene; एक chemoenzymatic रणनीति xyloglucan संशोधन 19 के आधार पर; एक 1,4-phenylenediisothiocyanate जोड़ने एजेंट 20; heteropolysaccharide ऑक्सीकरण 21 क्लिक रसायन शास्त्र 22; और cationic porphyrins 23 covalently सेलुलोज कागज पर biomolecules स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। Chitosan संशोधित कागज आधारित immunodevices 24-26 विकसित करने के लिए है, क्योंकि यह प्रचुर मात्रा में और biocompatible 27 है इस्तेमाल किया गया है। Chitosan cationic है और ऋणात्मक सेल्यूलोज 27 को दृढ़ता से पालन करता है। कब्जा एंटीबॉडी chitosan कोटिंग और glutaraldehyde पार से जोड़ने के माध्यम से कागज पर स्थिर रहे हैं। Periodate ऑक्सीकरण कैप्टन ग्राफ्टिंग के लिए एक और तरीका हैसेल्यूलोज कागज 28 पर Ure एंटीबॉडी। इस विधि में, सोडियम periodate कागज पर देखा जाता है एल्डिहाइड समूहों को सीधे सेलुलोज में 1,2-dihydroxyl (ग्लाइकोल) समूह में परिवर्तित करने के लिए। एल्डिहाइड समूहों तो polysaccharides और एंटीबॉडी 28 के बीच सहसंयोजक बांड फार्म का उपयोग किया जाता है। हालांकि निर्माण सरल है, यह पूरी तरह से सोडियम periodate बाहर धोने के लिए मुश्किल है। मैला सोडियम periodate एंटीबॉडी कि सेल्यूलोज कागज पर स्थिर कर रहे हैं की आगे ऑक्सीकरण पैदा कर सकता है, गतिविधि और एंटीबॉडी की स्थिरता को प्रभावित एन -। (3-dimethylaminopropyl) - एन -ethylcarbodiimide हाइड्रोक्लोराइड और एन -hydroxysuccinimide पार linkers भी करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं covalently nanofiber आधारित assays 29 के विकास के लिए Electrospun पाली एल लैक्टिक एसिड और सेलूलोज एसीटेट nanofibers पर एंटीबॉडी स्थिर करना।

इस अध्ययन में, एक silane युग्मन तकनीक cellulos पर अमाइन कार्य समूहों भ्रष्टाचार के लिए इस्तेमाल किया गया थाई पेपर डिस्क। इस तकनीक को अधिकतम खड़ी प्रवाह के माध्यम से में immunoassays की अनुमति के मूल में छेद के आकार, बाती, और सेल्यूलोज फिल्टर कागजात की निस्पंदन दर को बनाए रखने में मदद करता है। silane युग्मन तकनीक का व्यापक रूप से biosensors में इस्तेमाल किया गया है माध्यमिक amine समूहों के साथ सब्सट्रेट सतहों functionalize करने biomolecules का उपयोग करते हुए आगे संशोधन द्वारा पीछा किया। मैट्रिक्स सतह पर amine समूहों की कलम बांधने का काम organofunctional silane एजेंटों की ओह समूहों और मैट्रिक्स सब्सट्रेट 30 के बीच एक संक्षेपण प्रतिक्रिया शामिल हैं। सेल्यूलोज कागज डिस्क 3-aminopropyltrimethoxysilane (ए पी) 31 के माध्यम से silane युग्मन द्वारा अमाइन समूहों के साथ क्रियाशील थे। यह दो अलग अलग तरीकों का उपयोग कर covalently immobilizing कब्जा एंटीबॉडी द्वारा पीछा किया गया था। पहली विधि अमाइन क्रियाशील सेलुलोज कागज डिस्क के लिए periodate ऑक्सीकरण कब्जा एंटीबॉडी के बंधन शामिल किया गया। दूसरी विधि एक पार से जोड़ने एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया glutaraldehyde कब्जा antibodi संलग्न करने के लिएएमाइन समूह-क्रियाशील सेलुलोज कागज डिस्क के लिए तों। कब्जा एंटीबॉडी की उपस्थिति खरगोश विरोधी मानव आईजीजी fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) द्वारा पुष्टि की गई है, एक प्रतिदीप्ति आणविक इमेजर का उपयोग कर। खरगोश विरोधी मानव आईजीजी FITC के बंधन गतिविधि विरोधी खरगोश आईजीजी बकरी को भी peroxidase सब्सट्रेट द्वारा मूल्यांकन किया गया था। सोडियम periodate, glutaraldehyde, और कब्जा एंटीबॉडी के विभिन्न सांद्रता के प्रभावों की जांच कर रहे थे। स्थिर कब्जा एंटीबॉडी के आवेदन परीक्षण सफलतापूर्वक आईजीजी सीरम का पता लगाने के माध्यम से प्रदर्शन किया गया था।

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Protocol

1. पर सेल्यूलोज कागज डिस्क ग्राफ्टिंग अमाइन कार्यात्मक समूह

  1. 1 सेमी × 1 सेमी, और 100 पेपर डिस्क 6.0 मिमी (मध्यम प्रवाह फिल्टर पेपर) की एक व्यास के साथ ग्रेड नंबर 1 सेलुलोज कागज से बने एक छेद पंच का उपयोग करने का एक आयाम के साथ वर्ग के कागज का एक टुकड़ा तैयार करें।
  2. कागज डिस्क पर राष्ट्रीय राजमार्ग 2 समूहों प्राप्त करने के लिए, धूआं हुड में एक 50 मिलीलीटर कांच की बोतल में 1 मिलीलीटर ए पी एस और 10 मिलीलीटर एसीटोन मिश्रण। हौसले से तैयार ए पी अभिकर्मक मिश्रण करने के लिए कागज डिस्क जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 32 कक्षीय सरगर्मी (200 आरपीएम) के साथ 5 घंटे के लिए सेते हैं।
    सावधानी: धूआं हुड में ए पी एस और एसीटोन संभाल लेना।
  3. एक कार्बनिक अपशिष्ट कंटेनर में 50 मिलीलीटर कांच की बोतल से अतिरिक्त समाधान छानना।
  4. कांच की बोतल के लिए एसीटोन के 10 मिलीलीटर जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से और पूरी तरह से छानना किसी भी unreacted ए पी एस और अन्य अशुद्धियों को दूर करने के लिए। इस चरण को दोहराएँ दो बार।
  5. 3 घंटे के लिए एक 110 डिग्री सेल्सियस ओवन में कागज तौलिया और जगह पर कागज डिस्क बिखरा हुआ है। अनुमति देंकागज डिस्क शांत करने के लिए। कमरे के तापमान पर एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में डिस्क स्टोर।
  6. फूरियर का प्रयोग के रूप में नीचे (चित्रा 3 ए) में वर्णित है, सेल्यूलोज वर्ग कागज पर amine समूहों की ग्राफ्टिंग की जाँच करने के अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी (FTIR) बदलना।
    1. कंप्यूटर को चालू करें और FTIR स्पेक्ट्रोस्कोपी साधन खुला।
    2. FTIR स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए सॉफ्टवेयर खोलें।
    3. 'मापन → प्रारंभ "जाना चाहिए। 'बी एस: KBR' के लिए आयत, 'दीपक: इन्फ्रारेड' और 'लेजर' हरी जब प्रारंभ के समाप्त हो गया है बंद हो जाएगा।
    4. आयतों नीचे 'डाटा' चुनें, और '% संप्रेषण', 'Happ-Genzel', '45', '4.0', और 'न्यूनतम: 400, मैक्स: 4000' का चयन 'माप मोड' के लिए, 'Apodization', ' नहीं। स्कैन ',' संकल्प ', और' रेंज (सेमी -1) 'की।
    5. 'उपाय' पर क्लिक करें।
    6. पृष्ठभूमि डेटा के लिए 'डेटा फ़ाइल' का चयन करें। लिखनाटिप्पणी के नीचे।
    7. पृष्ठभूमि के लिए आधारभूत पाने के लिए 'BKG' पर क्लिक करें।
    8. फिल्म नमूना धारक पर वर्ग कागज को ठीक करें।
    9. नमूना डेटा के लिए 'डेटा फ़ाइल' का चयन करें। टिप्पणी नीचे लिखें।
    10. नमूने के लिए स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए 'नमूना' पर क्लिक करें।
    11. FTIR स्पेक्ट्रोस्कोपी अनुप्रयोग बंद करें और कंप्यूटर बंद कर देते हैं।
  7. उपरोक्त कदम (1.6 करने के लिए 1.1 कदम) अमाइन-क्रियाशील ग्रेड नं 113 सेल्यूलोज वर्ग कागज और डिस्क (तेजी से प्रवाह फिल्टर पेपर) तैयार करने के लिए दोहराएँ, और ग्रेड नं 113 वर्ग कागज (चित्रा 3 बी) के लिए FTIR स्पेक्ट्रा प्राप्त करते हैं।

पर Amine-क्रियाशील सेल्यूलोज कागज डिस्क एंटीबॉडी की 2. सहसंयोजक स्थिरीकरण

चित्र तीन
दो अलग अलग तरीकों से चित्रा 1. एंटीबॉडी के सहसंयोजक स्थिरीकरण।एक। Periodate ऑक्सीकरण के माध्यम से अमाइन-क्रियाशील सेलुलोज कागज डिस्क पर स्थिर एंटीबॉडी। कार्बोहाइड्रेट अवशेषों सोडियम periodate द्वारा ऑक्सीकरण थे एल्डिहाइड कार्य समूहों का उत्पादन। फिर, ऑक्सीकरण एंटीबॉडी अमाइन-क्रियाशील सेलुलोज कागज डिस्क पर भरी हुई थी। बी। एंटीबॉडी तो glutaraldehyde के माध्यम से अमाइन-क्रियाशील सेलुलोज कागज डिस्क पर स्थिर रहे थे। अमाइन क्रियाशील सेलुलोज कागज डिस्क 0.05% glutaraldehyde समाधान में डूब गए थे पेपर डिस्क के लिए एल्डिहाइड समूहों को पेश करने के लिए। धोने के बाद, एंटीबॉडी एल्डिहाइड क्रियाशील कागज डिस्क पर भरी हुई थी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. Periodate ऑक्सीकरण (चित्रा 1 ए) के माध्यम से अमाइन-क्रियाशील सेलुलोज कागज डिस्क पर एंटीबॉडी स्थिर।
    1. 2.5 मिमी सोडियम perioda के 1 μl मिक्स0.1 मिलीग्राम के 2 μl के साथ ते / एमएल खरगोश विरोधी मानव आईजीजी FITC और एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 100 मिमी पीएच 5.5 एसीटेट बफर के 7 μl, और 30 मिनट के लिए अंधेरे में मिश्रण सेते हैं।
      नोट: यदि आवश्यक हो तो अधिक ऑक्सीकरण एंटीबॉडी तैयार करने के लिए इस मात्रा के अनुपात का पालन करें। मात्रा अनुपात बदल सोडियम periodate और खरगोश विरोधी मानव आईजीजी FITC की एकाग्रता अनुकूलन करने के लिए।
    2. 40 μl के अंतिम मात्रा के लिए, (7.4 पीएच पीबीएस) 50 मिमी फॉस्फेट बफर खारा के 30 μl के साथ ऊपर एंटीबॉडी समाधान पतला।
    3. तीन अमाइन-क्रियाशील मध्यम प्रवाह फिल्टर पेपर डिस्क और तीन अमाइन-क्रियाशील तेजी से प्रवाह कागज डिस्क (धारा 1 में वर्णित के रूप में) तैयार करें।
      1. लोड प्रत्येक मध्यम प्रवाह फिल्टर पेपर डिस्क पर सोडियम periodate ऑक्सीकरण खरगोश विरोधी मानव आईजीजी FITC के 5 μl और प्रत्येक तेजी से प्रवाह फिल्टर पेपर डिस्क पर 8 μl। कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए अंधेरे में इन कागज डिस्क रखें।
    4. कपड़े धोने के कीड़े के 0.2 मिलीलीटर के साथ कागज डिस्क के प्रत्येक धोनेईआर (50 मिमी Tris 0.15 एम NaCl और 0.05% surfactant, पीएच 7.4 के साथ बफर)। धोने तीन बार दोहराएँ।
    5. एक प्रतिदीप्ति आणविक इमेजर के माध्यम से प्रतिदीप्ति छवियों की तस्वीर प्रत्येक सेलुलोज कागज डिस्क 32 पर एंटीबॉडी की उपस्थिति की पहचान करने के लिए। एक नियंत्रण (चित्रा एस 1 S3 चित्रा) के रूप में कोरा कागज डिस्क (सोडियम periodate के अभाव में एंटीबॉडी का एक ही एकाग्रता के साथ इलाज) का प्रयोग करें।
      नोट: प्रयोगात्मक अनुकूलन के लिए, एक पैरामीटर है कि अनुकूलित और अन्य सभी मापदंडों की सांद्रता को ठीक करने की जरूरत है की एकाग्रता बदल जाते हैं। एक उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता कब्जा एंटीबॉडी की राशि है कि सेल्यूलोज कागज डिस्क पर स्थिर रहे हैं बढ़ जाती है।
  2. Glutaraldehyde (चित्रा 1 बी) के माध्यम से अमाइन क्रियाशील सेलुलोज कागज डिस्क पर एंटीबॉडी स्थिर।
    1. तीन ए पी इलाज किया मध्यम प्रवाह फिल्टर पेपर डिस्क और तीन तेज प्रवाह फिल्टर पेपर डिस्क जोड़ें (des50 मिमी पीबीएस (7.4 पीएच) है कि 1 घंटे के लिए 0.05% glutaraldehyde शामिल हैं, कमरे के तापमान पर कक्षीय सरगर्मी के साथ के 2 मिलीलीटर के लिए धारा 1) में cribed।
      सावधानी: धूआं हुड में glutaraldehyde संभाल लेना।
    2. तीन डिस्क प्रत्येक दो 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें। प्रत्येक ट्यूब विआयनीकृत (डीआई) पानी की 1 मिलीलीटर जोड़ें और 10 सेकंड के लिए ट्यूबों हिला। एक विंदुक के साथ श्वास से पानी निकाल दें। किसी भी unreacted glutaraldehyde दूर करने के लिए दो बार दोहराएँ।
    3. लोड 25 माइक्रोग्राम / एमएल खरगोश विरोधी मानव आईजीजी FITC (कब्जा एंटीबॉडी) प्रत्येक एल्डिहाइड-क्रियाशील मध्यम प्रवाह फिल्टर पेपर डिस्क पर की 5 μl, और प्रत्येक एल्डिहाइड-क्रियाशील तेजी से प्रवाह फिल्टर पेपर डिस्क पर 8 μl जोड़ें। कमरे के तापमान पर लगभग 20 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं। फिर, एंटीबॉडी को हटाने के बिना प्रत्येक पेपर डिस्क के लिए 50 मिमी पीबीएस (7.4 पीएच) के 10 μl जोड़ें और अमाइन एल्डिहाइड प्रतिक्रिया के लिए 40 मिनट के लिए सेते हैं।
    4. एक कागज तौलिया के शीर्ष पर कपड़े धोने बफर के 0.2 मिलीलीटर के साथ कागज डिस्क धो लें। दोहराएँदो बार धो लो।
    5. प्रत्येक सेलुलोज कागज डिस्क 33 पर एंटीबॉडी की उपस्थिति के लिए जाँच करने के लिए एक प्रतिदीप्ति आणविक इमेजर के माध्यम से प्रतिदीप्ति छवियों तस्वीर। एक नियंत्रण के रूप में कोरा कागज डिस्क का प्रयोग करें।
      नोट: चित्रा 4 में, '0' कोरा कागज डिस्क कि glutaraldehyde के अभाव में FITC एंटीबॉडी का एक ही एकाग्रता के साथ इलाज किया गया था के लिए खड़ा है; चित्रा 5 ए में, कोरा कागज डिस्क glutaraldehyde साथ इलाज किया गया, लेकिन कोई FITC-एंटीबॉडी कागज डिस्क पर भरी हुई थी।
  3. 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर (धारा 2.1 और 2.2 से) कागज डिस्क सूखी।
  4. बफर अवरुद्ध के 15 μl के साथ कागज डिस्क ब्लॉक कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए (10% 50 मिमी Tris बफर, 7.4 पीएच में स्किम्ड दूध पाउडर, 0.15 एम NaCl के साथ)।
  5. लोड 5 μl और पीबीएस में peroxidase संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी के 8 μl (1: 10,000) मध्यम प्रवाह और तेज प्रवाह फिल्टर पेपर डिस्क, क्रमशः पर। के लिए सेतेकमरे के तापमान पर अंधेरे में 30 मिनट।
  6. एक कागज तौलिया के शीर्ष पर कपड़े धोने बफर के 0.2 मिलीलीटर के साथ कागज डिस्क धो लें। धोने तीन बार दोहराएँ।
    नोट: यह धोने बफर दूर करने के लिए के रूप में परिणाम बफर से प्रभावित नहीं हैं जरूरी नहीं है।
  7. प्रत्येक डिस्क पर 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) और हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान की एक 10 μl मिश्रण लोड।
  8. ऊष्मायन के 5 मिनट के बाद एक डिजिटल कैमरा या स्मार्ट फोन के साथ एक कागज डिस्क की छवियों को ले लो।
    नोट: चित्रा 5 ब में, '0' कागज डिस्क है कि glutaraldehyde साथ इलाज किया गया, लोड हो रहा है एंटीबॉडी एचआरपी (घोड़ा मूली peroxidase) FITC एंटीबॉडी के अभाव में साधना के द्वारा पीछा के लिए खड़ा है।

3. कागज आधारित आईजीजी पता लगाने के लिए एलिसा

चित्र 2
चित्रा 2 के लिए कागज पर आधारित एलिसा की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्वआर आईजीजी का पता लगाने। कब्जा एंटीबॉडी covalently glutaraldehyde के माध्यम से एल्डिहाइड-क्रियाशील सेलुलोज कागज डिस्क पर स्थिर रहे थे। सेल्यूलोज कागज डिस्क बफर को रोकने के साथ अवरुद्ध किया गया। लक्ष्य आईजीजी तो एचआरपी संयुग्मित संकेत एंटीबॉडी की लोडिंग के द्वारा पीछा डिस्क को जोड़ा गया है। अंत में, TMB और हाइड्रोजन पेरोक्साइड मिश्रण समाधान रंग readout के लिए प्रत्येक पेपर डिस्क पर लोड किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. एक 20 मिलीलीटर कांच की बोतल के लिए 0.05% glutaraldehyde समाधान (50 मिमी पीबीएस बफर, 7.4 पीएच में तैयार) के 5 मिलीलीटर जोड़ें। 15 amine-क्रियाशील मध्यम प्रवाह इस समाधान में फिल्टर पेपर डिस्क को विसर्जित कर दिया और कमरे के तापमान पर झटकों के साथ 1 घंटे के लिए रख सकते हैं।
    1. समवर्ती, दोहराने कदम 3.1 एक और 15 एल्डिहाइड क्रियाशील तेजी से प्रवाह फिल्टर पेपर डिस्क तैयार करने के लिए।
      सावधानी: धूआं में glutaraldehyde हैंडलहुड।
  2. कागज डिस्क से unreacted glutaraldehyde को निकालने के लिए एक और 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 15 मध्यम प्रवाह फिल्टर पेपर डिस्क, और 15 तेजी से प्रवाह फिल्टर पेपर डिस्क जगह है। प्रत्येक ट्यूब डि पानी के 5 मिलीलीटर जोड़ें और 10 सेकंड के लिए ट्यूबों हिला। एक विंदुक के साथ श्वास से पानी निकाल दें। किसी भी unreacted glutaraldehyde दूर करने के लिए दो बार दोहराएँ।
  3. एक 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में कागज डिस्क सूखी।
  4. 5 μl और मध्यम प्रवाह और तेज प्रवाह फिल्टर पेपर डिस्क, क्रमशः से प्रत्येक के लिए 0.025 मिलीग्राम / एमएल माउस आईजीजी एफसी टुकड़ा एंटीबॉडी के 8 μl जोड़ें, और 20 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. एंटीबॉडी को हटाने के बिना प्रत्येक पेपर डिस्क के लिए 50 मिमी पीबीएस (7.4 पीएच) के 10 μl जोड़ें और अमाइन एल्डिहाइड प्रतिक्रिया के लिए 40 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. एक कागज तौलिया के शीर्ष पर कपड़े धोने बफर के 0.2 मिलीलीटर के साथ कागज डिस्क धो लें। धोने तीन बार दोहराएँ।
  7. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में कागज डिस्क सूखी।
  8. कागज डिस्क डब्ल्यू ब्लॉककमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए बफर अवरुद्ध के ith 15 μl।
  9. एक कागज तौलिया के शीर्ष पर कपड़े धोने बफर के 0.2 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक पेपर डिस्क धो लें। धोने तीन बार दोहराएँ।
  10. आईजीजी मानकों चलाएँ।
    1. लोड विभिन्न आईजीजी सांद्रता के 10 μl (जैसे, 0, 10, पीबीएस में 125, 250, और 500 एनजी / एमएल) के तीन प्रतियों में प्रत्येक डिस्क पर। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  11. एक कागज तौलिया के शीर्ष पर कपड़े धोने बफर के 0.2 मिलीलीटर के साथ कागज डिस्क धो लें। धोने तीन बार दोहराएँ।
  12. लोड एचआरपी संयुग्मित माउस आईजीजी एफसी टुकड़ा एंटीबॉडी (1: 10,000, 10 मिमी पीबीएस, 7.4 पीएच) के 10 μl, और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  13. एक कागज तौलिया के शीर्ष पर कपड़े धोने बफर के 0.2 मिलीलीटर के साथ कागज डिस्क धो लें। धोने तीन बार दोहराएँ।
    नोट: यह धोने बफर दूर करने के लिए के रूप में परिणाम बफर की उपस्थिति से प्रभावित नहीं कर रहे हैं आवश्यक नहीं है।
  14. प्रत्येक डिस्क पर TMB की एक 10 μl मिश्रण और हाइड्रोजन पेरोक्साइड लोड।
  15. टीएक डिजिटल कैमरा या ऊष्मायन के 5 मिनट के बाद स्मार्ट फोन के साथ सभी कागज डिस्क की AKE छवियों।
    नोट: चित्रा 6A में, '0' कब्जा एंटीबॉडी स्थिरीकरण के साथ इलाज कागज डिस्क के लिए खड़ा है, और आईजीजी सीरम बिना एंटीबॉडी एचआरपी / TMB समाधान।
  16. छवि जे द्वारा छवि में प्रत्येक पेपर डिस्क की तीव्रता का विश्लेषण करें
    1. '.tif' प्रारूप करने के लिए कदम 3.15 में लिया छवियों कन्वर्ट।
    2. 'छवि जे' सॉफ्टवेयर खुला।
    3. 'फ़ाइल → ओपन' के लिए जाओ का विश्लेषण करने के लिए छवि चुनें।
    4. आकार बटन 'ओवल' चुनें।
    5. करने के लिए 'छवि → प्रकार → 32 बिट' जाओ।
    6. 'संपादन → पलटना "जाना चाहिए।
    7. '→ उपाय, विश्लेषण "जाना चाहिए।
    8. कॉपी और एक स्प्रेडशीट में डेटा का विश्लेषण।

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Representative Results

चित्र तीन
चित्रा 3. फूरियर अवरक्त (FTIR) इलाज और ए पी इलाज मध्यम वर्ग प्रवाह फिल्टर पेपर (ए) और तेजी से प्रवाह फिल्टर वर्ग कागज (बी)। ए के स्पेक्ट्रा। इलाज मध्यम वर्ग प्रवाह फिल्टर पेपर के लिए स्पेक्ट्रा ए पी इलाज किया मध्यम वर्ग प्रवाह फिल्टर पेपर के समान था। 902-1,170 सेमी -1 और 1,210-1,500 सेमी -1 ए पी इलाज वर्ग कागज के लिए के बैंड पर तीव्रता में वृद्धि क्रमश: सी-ओ-सेल्यूलोज और SiOC-एच समूहों के सीएच विकृतियों के थे। 1650 सेमी -1 और 2885 सेमी -1 में बैंड की वेतन वृद्धि क्रमश: खारा propyl आधा भाग से राष्ट्रीय राजमार्ग 2 और सीएच 2 कंपन के झुकने के अंतर्गत आता है। बी। 972 1,180 सेमी में विशेषता चोटियों -1 रेंज सी-ओ-सी और तो सीई लिए जिम्मेदार ठहराया गयाllulose बांड। 1,003 सेमी में चोटी -1 सी-ओ-सी बंधन और सीओ सेल्यूलोज की खींच के ओवरलैप की वजह से हुई। परिणाम के सभी चलता है कि ए पी सफलतापूर्वक सेल्यूलोज वर्ग के कागजात पर ग्राफ्ट किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सेल्यूलोज वर्ग के कागजात पर अमाइन कार्य समूहों की उपस्थिति FTIR द्वारा निर्धारित किया गया है। चित्रा 3 अनुपचारित, संशोधित, मध्यम प्रवाह और तेजी से प्रवाह फिल्टर वर्ग के कागजात की FTIR स्पेक्ट्रा से पता चलता है। वहाँ तीन चरणों aminoalkyl समूहों की रासायनिक संशोधन में शामिल है, पर सेल्यूलोज सतहों ए पी उपयोग कर रहे थे। एक कदम ए पी एस की hydrolysis शामिल ए पी एस की silanol व्युत्पन्न प्रदान करने के लिए। दो कदम ज से ओह समूहों के माध्यम से हाइड्रोजन संबंध सेलूलोज फाइबर पर hydrolyzed ए पी व्युत्पन्न की सोखना शामिलydrolyzed ए पी व्युत्पन्न और सेल्यूलोज फाइबर। तीन कदम adsorbed ए पी व्युत्पन्न का संक्षेपण, जो सी-OC संबंध के माध्यम से सेलूलोज फाइबर की सतह पर ए पी व्युत्पन्न की कलम बांधने का काम और सी-ओ-सी siloxane पुलों 34 के गठन के लिए नेतृत्व में शामिल किया गया। जैसा कि चित्र 3 ए, 1650 सेमी में बैंड की वेतन वृद्धि में दिखाया गया -1 2885 सेमी -1 सीएच करने के लिए इसी silane propyl आधा भाग के 2 कंपन में राष्ट्रीय राजमार्ग 2 समूहों के झुकने और बैंड की एक वेतन वृद्धि के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था। मूल मध्यम वर्ग प्रवाह फिल्टर पेपर के लिए, 902-1,170 सेमी -1 और 1,210-1,500 सेमी में बैंड -1 glycosidic पुलों और सीएच खींच कंपन की COC बांड के कंपन करने के लिए पत्राचार किया। ए पी एस के साथ वर्ग कागज के इलाज के बाद, इन दो बैंड चौड़ाई पर तीव्रता में वृद्धि का संकेत है कि वे सी-ओ-सेल्यूलोज और SiOC-एच समूहों के सीएच विकृतियों के हैं, क्रमशः। मध्यम फ्लोरिडा के लिए इसी प्रकारओउ वर्ग कागज, संशोधित तेजी से प्रवाह फिल्टर वर्ग कागज भी ए पी (चित्रा 3 बी) के साथ रासायनिक संशोधन की वजह से, 1650 सेमी -1 पर तीव्रता में वृद्धि हुई राष्ट्रीय राजमार्ग 2 के लिए के लिए स्पेक्ट्रा फिल्टर। 972 1,180 सेमी में मजबूत विशेषता चोटियों -1 रेंज सी-ओ-एसआई के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था और इतना सेल्यूलोज बांड; सबसे ऊंची चोटी 1,003 सेमी -1 सी-ओ-सी बंधन और सीओ सेल्यूलोज 34 की खींच के ओवरलैप के कारण पर था। तरंगदैर्ध्य रेंज में विशेषता बांड 1,188 और 1,510 के बीच सेमी -1 ए पी एस के लिए वर्ग कागज इलाज किया glycosidic पुलों और सीएच खींच कंपन की COC बांड के कंपन के कारण होता है। सीएच 2 खींच कंपन बांड 2,800-2,980 सेमी -1 और सबसे ऊंची चोटी पर दिखाया गया था 2932 सेमी -1 के लिए ए पी वर्ग कागज का इलाज किया। अंत में, ए पी covalently नंबर 1 और नंबर 113 फिल्टर वर्ग के कागजात के लिए grafted जा सकता है।


चित्रा 4. कागज डिस्क (विधि बी) पर आईजीजी FITC के स्थिरीकरण में glutaraldehyde के विभिन्न सांद्रता के लिए प्रतिदीप्ति प्रतिक्रियाओं प्रतिदीप्ति आणविक इमेजर के लिए सेटिंग:। उत्तेजना, 488 एनएम, उत्सर्जन, 530 एनएम, संकल्प, 100 माइक्रोमीटर एक:। प्रतिदीप्ति । 0 करने के लिए प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया, 0.050%, 0.100%, 0.250% और 0.500% glutaraldehyde: 0, 0.001%, 0.005%, 0.01% और 0.050% glutaraldehyde बी के जवाब। प्रत्येक डिस्क पर आईजीजी FITC की एकाग्रता 0.01 मिलीग्राम था / एमएल। 0.05% की एक अधिकतम करने के लिए glutaraldehyde की एकाग्रता में वृद्धि आईजीजी FITC का एक बढ़ा लोड हो रहा है राशि में हुई। 0.05% ऊपर glutaraldehyde की सांद्रता आईजीजी FITC की लोडिंग राशि में कमी आई। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंचित्रा।

चित्रा 5
चित्रा 5. प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया (ए) और वर्णमिति परिणाम (बी) आईजीजी FITC-स्थिर मध्यम प्रवाह और तेज प्रवाह फिल्टर पेपर डिस्क (विधि बी) प्रतिदीप्ति आणविक इमेजर के लिए सेटिंग्स पर आईजीजी FITC के विभिन्न सांद्रता की। उत्तेजना , 488 एनएम, उत्सर्जन, 530 एनएम, संकल्प, 100 माइक्रोमीटर। # 1 ग्रेड नंबर 1, मध्यम प्रवाह फिल्टर पेपर डिस्क का प्रतिनिधित्व करता है, और # 113 ग्रेड नं 113 तेजी से प्रवाह फिल्टर पेपर डिस्क का प्रतिनिधित्व करता है। ए पी एस संशोधित कागज डिस्क 0.05% glutaraldehyde के साथ पहली बार इलाज किया गया। फिर, आईजीजी FITC के विभिन्न सांद्रता glutaraldehyde संशोधित कागज डिस्क पर भरी हुई थी। आईजीजी FITC की लोडिंग एकाग्रता बढ़ाने से कागज डिस्क पर स्थिर आईजीजी FITC की राशि में वृद्धि हुई। हालांकि, स्थिर आईजीजी FITC की वृद्धि की सांद्रता प्रतिजन के लिए बाध्यकारी क्षमता में सुधार नहीं किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अमाइन-क्रियाशील सेलुलोज कागज डिस्क पर एंटीबॉडी के सहसंयोजक स्थिरीकरण के लिए बुनियादी कार्यप्रवाह चित्र 1 में दिखाया गया है। खरगोश विरोधी मानव आईजीजी FITC covalently सेलुलोज कागज डिस्क पर स्थिर था। कागज डिस्क से प्रतिदीप्ति कागज डिस्क के लिए एंटीबॉडी की स्थिरीकरण संकेत दिया है, और प्रतिदीप्ति की तीव्रता सीधे स्थिर एंटीबॉडी की एकाग्रता के लिए आनुपातिक था। Peroxidase संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी तो था स्थिर एंटीबॉडी के बंधन क्षमता का निर्धारण करने के लिए लागू होता है। माध्यमिक amine समूहों और एल्डिहाइड समूहों को एक Schiff आधार है, जो bioconjugation 35 में इस्तेमाल किया गया है के रूप में करने के लिए एक दूसरे के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं। उन्होंने यह भी कब्जा के सहसंयोजक स्थिरीकरण के लिए यहां इस्तेमाल किया गयाएंटीबॉडी। विधि ए (चित्रा 1 ए) में, राष्ट्रीय राजमार्ग 2 सेलुलोज कागज डिस्क के लिए पेश किया गया था और -CHO सोडियम periodate साथ एंटीबॉडी के एफसी क्षेत्र ऑक्सीकरण द्वारा खरगोश विरोधी मानव आईजीजी FITC से निकाली थी। उसी तरह, सोडियम periodate और आईजीजी FITC एंटीबॉडी के विभिन्न सांद्रता के प्रभाव का भी विश्लेषण किया गया। चित्रा एस 1 और एस 2 चित्रा, 0.16 मिलीग्राम / एमएल के लिए 1 मिमी और खरगोश विरोधी मानव 0.016 से आईजीजी FITC 0 की सांद्रता से सोडियम periodate में दिखाया गया है 0.08 मिलीग्राम / एमएल खरगोश विरोधी मानव आईजीजी के ऑक्सीकरण पर खास असर नहीं पड़ा -FITC। एंटीबॉडी की राशि है कि covalently कागज डिस्क के लिए बाध्य किया गया 0 0.075 मिलीग्राम / एमएल (चित्रा S3A) से कब्जा एंटीबॉडी के एक बढ़ती हुई एकाग्रता के साथ वृद्धि हुई है।

एक बेहोश रंग बदलने मनाया गया जब बाध्यकारी क्षमता peroxidase परख द्वारा निर्धारित किया गया था। इस के उपयोग के कारण हो सकता हैअतिरिक्त सोडियम periodate, जो कब्जा एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया करता है और बाध्यकारी गतिविधि का एक नुकसान का कारण बनता है। यह संभावना है कि सोडियम periodate पूरी तरह से कागज डिस्क से धुल नहीं किया जा सकता है। यह सरल सिद्धांत है कि सोडियम periodate समाधान जब purpald समाधान के साथ मिश्रित एक पीले रंग प्रदान करता है के द्वारा पुष्टि की गई। इसलिए, periodate ऑक्सीकरण एंटीबॉडी कागज डिस्क पर लादा और 1 घंटे के लिए incubated रहे थे। कागज डिस्क पीबीएस (युक्त 0.05% बीच 20) के साथ तीन बार धोया गया, और फिर purpald समाधान के लिए इन डिस्क के लिए जोड़ा गया है। कागज डिस्क तुरंत एक बैंगनी रंग दिखाया, periodate-ऑक्सीकरण एंटीबॉडी से एल्डिहाइड समूहों की उपस्थिति का संकेत है। इस बैंगनी रंग 10 मिनट के भीतर पीले करने के लिए बदल गया है, जो कागज डिस्क पर सोडियम periodate की उपस्थिति की पुष्टि की।

वैकल्पिक रूप से, एक glutaraldehyde पार से जोड़ने की विधि (विधि बी, चित्रा 1 बी) अमाइन चल मैदान से जोड़ने के लिए इस्तेमाल किया गया थाए पी इलाज कागज डिस्क और एंटीबॉडी से भज। Glutaraldehyde की सांद्रता (चित्रा 4) और खरगोश विरोधी मानव आईजीजी FITC (चित्रा 5 ए) कि सेल्यूलोज कागज डिस्क पर भरी हुई थी अनुकूलित किया गया। के रूप में चित्रा 4 में दिखाया गया है, प्रतिदीप्ति तीव्रता glutaraldehyde का 0.05% है, जिसका अर्थ है कि खरगोश विरोधी मानव आईजीजी FITC की लोडिंग इस एकाग्रता में सेलूलोज कागज डिस्क पर संतृप्त हो गया की एक अधिकतम पर पहुंच गया; 2.5% glutaraldehyde की एकाग्रता में वृद्धि सेलुलोज कागज डिस्क (चित्रा S4) पर खरगोश विरोधी मानव आईजीजी FITC की राशि में वृद्धि नहीं दिखा था। प्रतिदीप्ति तीव्रता भी खरगोश विरोधी मानव आईजीजी FITC की सांद्रता बढ़ रही है कि कागज डिस्क (चित्रा 5 ए) पर लादा गया था के साथ वृद्धि हुई है। एक नीले रंग के कागज डिस्क के लिए TMB सब्सट्रेट और हाइड्रोजन पेरोक्साइड मिश्रण समाधान है, जो peroxidas निहित के अलावा पर तुरंत विकसितई संयुग्मित का पता लगाने के एंटीबॉडी (चित्रा 5 ब)। इसके अलावा, बफर अवरुद्ध 10% स्किम्ड दूध पाउडर 15 washes (चित्रा S5) के बाद अवरुद्ध दक्षता बनाए रखने के लिए दिखाया गया था कि निहित। विधि बी, स्थिर एंटीबॉडी के आवेदन का परीक्षण करने के लिए चयनित किया गया था के रूप में यह अपने लक्ष्य के लिए बाध्यकारी गतिविधि बढ़ाया प्रदर्शन किया। इसलिए, एक 0.025 मिलीग्राम कब्जा एंटीबॉडी के / एमएल एकाग्रता आईजीजी का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

चित्रा 6
चित्रा 6 से कागज आधारित एलिसा। # 1 आईजीजी के निर्धारण के लिए अंशांकन घटता ग्रेड नंबर 1, मध्यम प्रवाह फिल्टर पेपर डिस्क का प्रतिनिधित्व करता है, और # 113 ग्रेड नं 113 तेजी से प्रवाह फिल्टर पेपर डिस्क का प्रतिनिधित्व करता है। ऊपरी पैनल एक मध्यम-प्रवाह (# 1) और तेजी से प्रवाह (# 113) आईजीजी के विभिन्न एकाग्रता के साथ सेलुलोज कागज डिस्क के लिए रंग readout प्रस्तुत करता है। नीचे पैनलबी आईजीजी के विभिन्न एकाग्रता के लिए एलिसा परिणाम प्रस्तुत करता है। Triplicates मानक विचलन (एसडी) निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बकरी विरोधी माउस आईजीजी एफसी टुकड़ा कब्जा एंटीबॉडी, आईजीजी सीरम, और बकरी विरोधी माउस आईजीजी एफसी टुकड़ा एंटीबॉडी संयुग्मित एचआरपी सैंडविच परख के लिए इस्तेमाल किया गया। जैसा कि चित्र 6 और चित्रा S6, 0 से 500 एनजी / एमएल से आईजीजी सीरम की एकाग्रता में दिखाया गया वर्णमिति तीव्रता के साथ एक रैखिक संबंध था जब हर कदम 1 घंटे के लिए incubated था। चित्रा S6 में, आईजीजी के विभिन्न सांद्रता के साथ रंग भिन्नता ऊष्मायन के 1 घंटे के लिए स्पष्ट किया गया था। फिर भी, 10 मिनट ऊष्मायन के परिणामों आईजीजी के विभिन्न सांद्रता के साथ रंग तीव्रता में एक स्पष्ट परिवर्तन नहीं दिखा था। इस प्रकार, Sensइस पत्र के आधार पर एलिसा के itivity व्यावहारिक बिंदु का ध्यान परीक्षण विकसित करने के लिए उपयुक्त था।

चित्रा एस 1। सोडियम periodate (विधि ए) के विभिन्न सांद्रता के लिए प्रतिदीप्ति हिमायती हैं। सोडियम periodate के अलग सांद्रता में 0.016 मिलीग्राम / एमएल और एंटीबॉडी ऑक्सीकरण गतिविधि के अध्ययन के लिए इस्तेमाल की एकाग्रता में खरगोश विरोधी मानव आईजीजी FITC के साथ मिलाया गया। सोडियम periodate की एकाग्रता में वृद्धि करके, आईजीजी FITC की लोडिंग राशि में वृद्धि हुई और 0.25 मिमी पर एक अधिकतम पर पहुंच गया। यह देखा गया है कि सोडियम periodate की सांद्रता है कि इस से अधिक थे स्थिर आईजीजी FITC की मात्रा में वृद्धि नहीं की थी। Triplicates मानक विचलन (एसडी) निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा S2। प्रतिदीप्ति प्रतिक्रियाखरगोश विरोधी मानव आईजीजी FITC (विधि ए) के विभिन्न सांद्रता के लिए है। सोडियम periodate की एकाग्रता एंटीबॉडी ऑक्सीकरण गतिविधि के अध्ययन के लिए समाधान में 0.25 मिमी था, और प्रत्येक डिस्क पर खरगोश विरोधी मानव आईजीजी FITC के अंतिम एकाग्रता 0.016 मिलीग्राम / एमएल था। जब सोडियम periodate की एकाग्रता तय की गई थी, आईजीजी FITC की एकाग्रता आईजीजी FITC के ऑक्सीकरण पर खास असर नहीं पड़ा। Triplicates मानक विचलन (एसडी) निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा S3। प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया और कागज डिस्क (विधि एक) पर ऑक्सीकरण खरगोश विरोधी मानव आईजीजी FITC के विभिन्न सांद्रता लोड करने से वर्णमिति नतीजा है। सोडियम periodate ऑक्सीकरण, 0.08 मिलीग्राम / आईजीजी FITC और 0.25 मिमी सोडियम periodate मिलीलीटर के लिए इस्तेमाल किया गया। peroxidase संयुग्मित विरोधी खरगोश आईजीजी के कमजोर पड़ने था1: 50,000। सेल्यूलोज कागज डिस्क पर आईजीजी FITC की लोडिंग एकाग्रता बढ़ाने से स्थिर आईजीजी FITC की राशि में वृद्धि हुई है, लेकिन लक्ष्य बाध्यकारी पर असर नहीं था। कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा एस 4। सेल्यूलोज कागज डिस्क (विधि बी) पर आईजीजी FITC के स्थिरीकरण में glutaraldehyde की उच्च सांद्रता के लिए प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया। प्रत्येक डिस्क पर आईजीजी FITC की एकाग्रता 0.01 मिलीग्राम / एमएल था। Glutaraldehyde है कि अधिक से अधिक 0.25% सेलुलोज कागज डिस्क पर स्थिर आईजीजी FITC की मात्रा में वृद्धि नहीं था थे की सांद्रता। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा S5। कपड़े धोने बार की संख्या का प्रभाव। एक: था। हिंग तीन बार बी: 15 बार धोने। कैद सेल्यूलोज वर्ग कागज पर स्थिर एंटीबॉडी अभी भी अपने लक्ष्य के लिए अच्छा बाध्यकारी क्षमता थी, भले ही वर्ग पेपर 15 बार vortexed किया गया था। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा S6। कागज आधारित आईजीजी के लिए एलिसा नतीजा है। 0 से 500 एनजी / एमएल से आईजीजी की सांद्रता के लिए, ऊष्मायन के एक घंटे से परिणाम ऊष्मायन के 10 मिनट से परिणाम की तुलना में बेहतर कर रहे हैं। आईजीजी की उच्च सांद्रता के लिए, 10 मिनट ऊष्मायन के लिए पर्याप्त समय है। Triplicates मानक विचलन (एसडी) निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा S7। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) विभिन्न आवर्धन पर मध्यम प्रवाह फिल्टर पेपर की छवियों। एक: 85X और बी: 20,000X। फील्ड उत्सर्जन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (FE-SEM) 5 केवी पर परिचालन कण आकृति विज्ञान निर्धारित करने के लिए नियुक्त किया गया था। सेलूलोज फाइबर बेतरतीब ढंग से पार से जुड़े रहे हैं। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा S8। विभिन्न आवर्धन पर तेजी से प्रवाह फिल्टर पेपर के SEM छवियों। एक: 100X और बी: 20,000X। फील्ड उत्सर्जन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (FE-SEM) 5 केवी पर परिचालन कण आकृति विज्ञान निर्धारित करने के लिए नियुक्त किया गया था। सेलूलोज फाइबर बेतरतीब ढंग से पार से जुड़े रहे हैं। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

आत्मीयता शुद्ध बकरी विरोधी माउस आईजीजी एफसी कब्जा असंशोधित सेलुलोज कागज डिस्क पर एंटीबॉडी के प्रत्यक्ष कोटिंग आईजीजी सांद्रता का पता लगाने के लिए किया गया था। परिणाम संकेत दिया कि, कब्जा एंटीबॉडी के आगे निर्धारण reproducibility के लिए आवश्यक है। Silane तकनीक को सफलतापूर्वक सेलुलोज कागज डिस्क से 34 अमाइन कार्य समूहों को पेश करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। ए पी एस की एकाग्रता एंटीबॉडी की स्थिरीकरण को प्रभावित करता है। इसलिए, एसीटोन में ए पी एस की राशि भी अनुकूलित किया गया था। एसीटोन के 10 मिलीलीटर में ए पी एस के 1 मिलीलीटर एक glutaraldehyde पार से जोड़ने एजेंट के माध्यम से एंटीबॉडी के स्थिरीकरण के लिए एमाइन समूह ग्राफ्टिंग के लिए एक इष्टतम एकाग्रता था। एंटीबॉडी periodate ऑक्सीकरण और glutaraldehyde पार से जोड़ने तरीकों से सेलुलोज कागज डिस्क पर grafted किया गया। हमारे परिणामों से पता चला है कि glutaraldehyde पार से जोड़ने की विधि के माध्यम से स्थिर एंटीबॉडी के बंधन क्षमता मेड के लिए periodate ऑक्सीकरण विधि की तुलना में बेहतर थाIUM-प्रवाह और तेज प्रवाह फिल्टर पेपर डिस्क। इसके अलावा, कब्जा एंटीबॉडी, जो एक glutaraldehyde पार से जोड़ने की विधि के माध्यम से सेलुलोज कागज डिस्क पर स्थिर रहे थे, उनके कार्य को बनाए रखा और स्थिरतापूर्वक भी स्थिर रहे थे, हालांकि कागज vortexing द्वारा 15 washes के यांत्रिक तनाव के अधीन था। स्किम्ड दूध पाउडर अवरुद्ध बफर के दस प्रतिशत 15 washes (चित्रा S5) के बाद अपनी अवरुद्ध दक्षता बनाए रखने के लिए मिला था।

covalently स्थिर एंटीबॉडी आईजीजी का पता लगाने के साथ एक सैंडविच एलिसा प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। 100 एनजी / एमएल की एकाग्रता में आईजीजी नग्न आंखों इस पत्र डिस्क आधारित परख का उपयोग के साथ पाया गया। 0 से 500 एनजी / एमएल से आईजीजी सीरम की एकाग्रता वर्णमिति तीव्रता, जब हर कदम एक घंटे के लिए incubated किया गया था के साथ एक रैखिक संबंध दिखाया। इस पत्र के आधार एलिसा डिस्क के लिए प्रतिरक्षा परीक्षण की आवश्यकता कम नमूना अभिकर्मक और पारंपरिक immunoassays 36 से अधिक कुशल हो दर्शन चित्रा S7 और चित्रा S8 में दिखाया जाता है। जैसा कि इन आंकड़ों में सचित्र, फाइबर बेतरतीब ढंग से पार से जुड़े फिल्टर पेपर डिस्क 25 के दोनों प्रकार के लिए कर रहे हैं। इस उच्च संवेदनशीलता के लिए कारण कागज डिस्क की मोटाई हो सकता है। तेजी से प्रवाह फिल्टर पेपर डिस्क के लिए मोटाई 420 माइक्रोन मध्यम प्रवाह फिल्टर पेपर के लिए 180 माइक्रोन की तुलना में था। इस प्रकार, अधिक पर कब्जा एंटीबॉडी तेजी से प्रवाह फिल्टर पेपर डिस्क, जो आगे परख की संवेदनशीलता में वृद्धि होगी पर स्थिर होने की संभावना थे। एक ही समय में, तेजी से प्रवाह फिल्टर पेपर डिस्क (30 माइक्रोन) के लिए ताकना आकार मध्यम प्रवाह फिल्टर पेपर डिस्क की तुलना में बड़ा था (11 & #181, एम)। कागज की सतह अवरुद्ध करने के बाद, पूर्व के छेद के आकार अभी भी काफी बड़े के लिए एक अतिरिक्त बिजली की व्यवस्था के बिना तरल के प्रवाह को ड्राइव करने के लिए किया गया था। हालांकि, बाद में बफर के लिए प्रवाह की दर धीमी थी। इसलिए, तेजी से प्रवाह फिल्टर पेपर immunoassays के आवेदन में मध्यम प्रवाह फिल्टर पेपर से बेहतर था।

स्थिर फिल्टर पेपर डिस्क पर एंटीबॉडी के reproducibility TMB सब्सट्रेट और हाइड्रोजन पेरोक्साइड मिश्रण समाधान लोड करने के बाद peroxidase संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी और वर्णमिति परिणाम का पता लगाने के साथ कागज डिस्क के आगे ऊष्मायन द्वारा मूल्यांकन किया गया था। मानक विचलन इस कागज आधारित डिवाइस के लिए कम से कम 10% थी। राष्ट्रीय राजमार्ग 2 संशोधित सेलुलोज कागज डिस्क पर खरगोश विरोधी मानव आईजीजी FITC की स्थिरता के लिए दो महीने के लिए परीक्षण किया गया था। कागज डिस्क है कि 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया है उनके द्वि में मामूली कमी के साथ peroxidase संयुग्मित को बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी उनके बंधन गतिविधि को बनाए रखागतिविधि nding। हालांकि, जब एंटीबॉडी स्थिर कागज डिस्क या 60 डिग्री सेल्सियस कमरे के तापमान पर संग्रहित किया गया है, वे अपने बाध्यकारी गतिविधि सूखापन और उच्च तापमान के कारण खो दिया है। पर कब्जा कर लिया एंटीबॉडी अस्थिर और इन परिस्थितियों में विकृत हो सकता था।

वहाँ सेलुलोज कागज एक पार से जोड़ने एजेंट के रूप में glutaraldehyde का उपयोग कर डिस्क पर कब्जा एंटीबॉडी के स्थिरीकरण में कुछ महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। 1.2 कदम कागज डिस्क पर amine समूहों भ्रष्टाचार के लिए कब्जा एंटीबॉडी के सफल सहसंयोजक स्थिरीकरण में एक महत्वपूर्ण कदम है। इस कदम के विफल रहता है, पूरे स्थिरीकरण की प्रक्रिया असफल हो जायेगी। FTIR निर्धारित करने के लिए कि क्या एमाइन समूह सफलतापूर्वक कागज डिस्क (1.6 चरण) पर स्थिर रहे थे इस्तेमाल किया गया था। दूसरा, सेल्यूलोज कागज डिस्क पर एल्डिहाइड समूहों की ग्राफ्टिंग के एक और महत्वपूर्ण कदम (चरण 2.2.1 और 3.1 चरण) है। एंटीबॉडी covalently एक Schiff आधार के गठन के माध्यम से सेलुलोज कागज डिस्क पर स्थिर रहे थे। आखिरकारफिल्टर पेपर डिस्क पर कब्जा एंटीबॉडी स्थिर करने के लिए कदम महत्वपूर्ण (चरण 2.2.3, 3.4 कदम है, और 3.5 चरण) है। कब्जा एंटीबॉडी से amine समूहों सेलुलोज कागज डिस्क से एल्डिहाइड समूहों के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की कागज डिस्क पर एंटीबॉडी ठीक करने के लिए। यदि यह कदम असफल रहा था, कब्जा एंटीबॉडी कागज डिस्क पर स्थिर नहीं होता और एलिसा आवेदन के परीक्षण के सभी नकारात्मक होगा। हम पर कब्जा एंटीबॉडी की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए एक प्रतिदीप्ति आणविक इमेजर का उपयोग कर सकते हैं। Peroxidase संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी और peroxidase आधारित वर्णमिति प्रतिक्रियाओं स्थिर एंटीबॉडी के बंधन क्षमता पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में इस तरह के संकेत करने के लिए एक उच्च पृष्ठभूमि, कोई संकेत या एक कमजोर संकेत, और एक असमान रंग readout के रूप में कुछ समस्या है, आ सकती है। इन समस्याओं और इन समस्याओं पर काबू पाने के लिए समस्या निवारण विधियों के संभावित कारणों से नीचे चर्चा कर रहे हैं। उच्च पृष्ठभूमि संकेतों आमतौर पर पाए जाते हैं डुएक छोटी अवरुद्ध समय के लिए ई। यह अवरुद्ध ऊष्मायन समय बढ़ रही है, कागज डिस्क को अच्छी तरह से धोने, और उच्च पृष्ठभूमि संकेतों को दूर करने के लिए अतिरिक्त पता लगाने के एंटीबॉडी साधना एंजाइम के अलावा बचने के द्वारा हल किया जा सकता है। संभावित कारणों लक्ष्य प्रतिजन का अभाव, अवरुद्ध से अधिक है, अपर्याप्त ऊष्मायन समय है, और एक गैर कार्यात्मक का पता लगाने के एंटीबॉडी एंजाइम साधना शामिल हैं। इन मुद्दों पर काबू पाने के लिए, लक्ष्य एंटीजन जोड़ा और एक नई एंटीबॉडी साधना का उपयोग कर के रूप में और निर्माता ने सुझाव दिया है कि यह भंडारण के लिए एक उपयुक्त समय अवधि के लिए incubated किया जाना चाहिए। यह पता लगाने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण शामिल करने की सलाह दी जाती है। असमान रंग readouts कलम बांधने का काम प्रक्रिया के दौरान कागज डिस्क की स्टैकिंग के कारण हैं। इस समस्या से बचने के लिए, कागज डिस्क ए पी कलम बांधने का काम प्रक्रिया के दौरान अलग किया जाना चाहिए, और प्रतिजन और पता लगाने के एंटीबॉडी साधना एंजाइम हर कदम पर कागज डिस्क पर समान रूप से फैल जाना चाहिए।

हालांकि कागज पर आधारित परख एक सरल हैऔर लागत प्रभावी तरीका है, वहाँ सीमाएं हैं। के रूप में glutaraldehyde पार से जोड़ने एजेंट फैब क्षेत्र और कब्जा एंटीबॉडी के एफसी क्षेत्र से amine समूहों के साथ प्रतिक्रिया करता सब्सट्रेट सतह पर एंटीबॉडी के उन्मुखीकरण, प्रतिरक्षा के प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, स्थिर एंटीबॉडी एक अत्यधिक उन्मुख ढंग से नहीं होती है। के बाद से वहाँ आईजीजी के एफसी क्षेत्र से अधिक से फैब क्षेत्र से अधिक एमाइन समूह हैं, स्थिर एंटीबॉडी के बंधन गतिविधि अभी भी अपने आवेदन के लिए काफी अधिक है।

सेल्यूलोज अखबार के लिए अलग अलग सतह functionalization तरीकों एक ताजा रिपोर्ट में 37 में संक्षेप किया गया। ऐसे divinyl sulfone के रूप में अभिकर्मकों; 1,4-phenylenediisothiocyanate; 4-azido-benzenediazonium; epichlorohydrin; 4-azido-ए-फ्लोरो-2-nitrocyclohexane; और 4-mercapto-benzenediazonium, covalently सेलुलोज कागज पर biomolecules स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सोखना और फंसाने का भी उपयोग किया गयाकोट करने के लिए जैविक अणुओं के सेलुलोज कागज। अन्य तरीकों की तुलना में, silane तकनीक और सेल्यूलोज कागज पर एंटीबॉडी के सहसंयोजक स्थिरीकरण के लिए glutaraldehyde पार से जोड़ने एजेंट के संयोजन के लिए एक सरल तरीका है। इसके अलावा, इस संयोजन सेलुलोज कागज के थर्मल और यांत्रिक प्रदर्शन पर खास असर नहीं, immunoassays में अधिकतम खड़ी प्रवाह के माध्यम से की अनुमति के हो सकते हैं। इस रणनीति के सेलुलोज कागज पर अन्य biomolecules स्थिर करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

कार्यप्रणाली यहां प्रदर्शन संभावित रूप में लंबे समय के रूप में इसके खिलाफ प्रत्यक्ष एंटीबॉडी उपलब्ध हैं, किसी भी analyte का पता लगाने के लिए बढ़ाया जा सकता है। इस विधि को भी मल्टीप्लेक्स का पता लगाने के लिए विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक वर्ग कागज पर, विभिन्न क्षेत्रों के विभिन्न लक्ष्यों के लिए प्रतिष्ठित किया जा सकता है। लक्ष्य के लिए कब्जा एंटीबॉडी उनकी विशिष्ट क्षेत्र पर एक glutaraldehyde पार से जोड़ने एजेंट के माध्यम से स्थिर किया जा सकता है। इस ELIS द्वारा पीछा किया जा सकताएक प्रक्रिया विभिन्न ठिकानों का पता लगाने के लिए। इस प्रकार, प्रस्तावित विधि नग्न आंखों का उपयोग अन्य ठिकानों का पता लगाने के लिए कागज पर आधारित एलिसा एक बहुमुखी उपकरण बनाती है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellulose filter paper, Grade 1 (medium flow filter paper) GE Healthcare Pte Ltd Singapore  1001 110
Cellulose filter paper, Grade 113 (Fast flow filter paper) Sigma-Aldrich, Singapore 1113-320
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich, Singapore G6257 Grade II, 25% in H2O
Surfactant Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore P2287
Bovine serum album  Sigma-Aldrich, Singapore A2153
Skimmed milk powder Louis François  Packed by Kitchen Capers, Singapore
Tris base Promega H5135
Sodium periodate Merck 106597
Na2HPO4 Merck 106585
KH2PO4 Merck 104873
NaCl CALBIOCHEM 567441
NaOH Merck 106462
HCl Merck 100317
phosphate buffer saline (PBS) N/A N/A PBS, containing 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol⁠/⁠L Na2HPO4 and 1.5 mmol/L KH2PO4, is prepared with water and adjusted to pH 7.4 with 0.1 mol/L NaOH or 0.1 mol/L HCl
Acetone Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore 9005-68
Mixture of TMB and hydrogen peroxide solution  1-Step ultra TMB-ELISA solution , Thermo Scientific Pierce 34029 1 L
Rabbit anti-human IgG-FITC TWC/Bio Pte Ltd Singapore sc-2278
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG TWC/Bio Pte Ltd Singapore sc-2030
Affinity purified goat anti-Mouse IgG-Fc coating antibody Bethyl Laboratories, Inc A90-131A
Mouse reference serum Bethyl Laboratories, Inc RS10-101-5 9.5 mg/ml
HRP conjugated goat anti-mouse IgG-Fc detection antibody Bethyl Laboratories, Inc A90-131P
Equipment
Fourier transform infrared spectrophotometer Shimadzu IR Prestige-21  N/A
Fluorescence molecular imager Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore N/A
Oven NUVE FN500 N/A
Turbo mixer VM-2000 MYC LTD N/A
ImageJ RGB, free download N/A

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References

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जैव रसायन अंक 116 सेल्यूलोज कागज डिस्क silane तकनीक सहसंयोजक स्थिरीकरण glutaraldehyde आईजीजी का पता लगाने प्रतिरक्षा
सहसंयोजक सेल्यूलोज कागज डिस्क और नग्न आंखों की Colorimetric Immunoassays में अपने आवेदन के लिए एंटीबॉडी का बंधन
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Peng, Y., Gelder, V. V., Amaladoss,… More

Peng, Y., Gelder, V. V., Amaladoss, A., Patel, K. H. Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays. J. Vis. Exp. (116), e54111, doi:10.3791/54111 (2016).

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