Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

التساهمية ملزم من الأجسام المضادة لالسليلوز أقراص الورق وتطبيقاتها في العين المجردة اللونية يمونواسايس

Published: October 21, 2016 doi: 10.3791/54111
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1School of Applied Science, Temasek Polytechnic, 2University of Applied Sciences Utrecht

Abstract

ويعرض هذا التقرير طريقتين لتجميد التساهمية من الأجسام المضادة القبض على مرشح السليلوز ورقة الصف رقم 1 (ورق الترشيح المتوسط ​​التدفق) أقراص والصف رقم 113 (تدفق سريع ورقة فلتر) أقراص. والمطعمة هذه الأقراص رقة السليلوز مع المجموعات الوظيفية أمين من خلال تقنية اقتران سيلاني قبل أن يجمد الأجسام المضادة عليها. تم استخدام طرق ربط عبر بريودات الأكسدة وغلوتارالدهيد إلى الكسب غير المشروع الأجسام المضادة القبض على أقراص رقة السليلوز. من أجل ضمان أقصى قدر من القدرة ملزمة من الأجسام المضادة القبض على أهدافها بعد الشلل، وقد تم التحقيق آثار تركيزات مختلفة من بريودات الصوديوم، غلوتارالدهيد، والأجسام المضادة القبض على سطح الأقراص الورق. الأجسام المضادة التي تم المغلفة على أقراص رقة السليلوز functionalized أمين من خلال وكيل غلوتارالدهيد عبر ربط أظهرت تعزيز النشاط ملزما للهدف بالمقارنة مع طريقة الأكسدة بريودات. وقد استخدم مفتش (في الماوس المصل المرجعية) كهدف الإشارة في هذه الدراسة إلى اختبار التطبيق من الأجسام المضادة يجمد تساهمي من خلال غلوتارالدهيد. والورقية، انزيم مرتبط المناعي فحص جديد (ELISA) وضعت بنجاح والتحقق من صحتها للكشف عن مفتش. لا يتطلب هذا الأسلوب المعدات، ويمكن الكشف عن 100 نانوغرام / مل من مفتش. وكانت ورقة فلتر تدفق سريع أكثر حساسية من ورق الترشيح المتوسطة التدفق. كانت فترة حضانة هذا الاختبار قصيرة وتتطلب كميات عينة صغيرة. هذا بالعين المجردة، المناعية اللونية يمكن أن تمتد إلى كشف الأهداف الأخرى التي تم تحديدها مع إليسا التقليدية.

Introduction

الدراسة التشخيصية نقطة الرعاية السريرية (POCT) مهمة لتطوير استراتيجيات جديدة لعلاجات وأدوية شخصية، والرعاية المنزلية 1. وتستخدم أوراق السيلولوز على نطاق واسع منصات في المناعية، لأنها رخيصة، يمكن الوصول إليها، ومألوفة للمستخدمين 2. وبالإضافة إلى ذلك، فإن بنية مسامية من الورق السليلوز يملك القدرة على دفع تدفق السائل دون تأثير طاقة إضافية. سجلات التحاليل الطبية الورقية يمكن العثور في وقت مبكر من القرن ال 20، عندما اخترع اللوني ورقة لأول مرة في عام 1952. والمثال الأكثر انتشارا هو الاختبارات المناعي 3، مثل الحمل واختبار السكري شرائط. توفر هذه الاختبارات مرات فحص سريع نسبيا وتحليل غير مكلفة 4. نظرا لبساطتها، وقد استخدمت على نطاق واسع هذه الاختبارات قطاع الورقية التقليدية في التشخيص POCT 5.

طرق الكشف بما في ذلك اللونية 6، الكهربائيةوقد تم الإبلاغ عن مادة كيميائية 7، وelectrochemiluminescence 8 طرق لقياس أهداف في العينات البيولوجية. وبالإضافة إلى هذه الأساليب الكمية، وهي طريقة يمكن الاعتماد عليها لشل حركة الأجسام المضادة على ورق السيلولوز مهم لتطوير أجهزة التشخيص أيضا. الامتزاز غير محددة هو الاستراتيجية الرئيسية لتعديل الأجسام المضادة على سطح الأجهزة الورقية 9 و 10 لضمان قدرة ملزمة القصوى لأهدافها بعد الشلل. ومع ذلك، فإن دراسة سابقة أظهرت أن الأجسام المضادة التي كثف على ورق السيلولوز يمكن يلتفظ من الألياف 11 بنسبة 40٪. وهكذا، والامتزاز المباشر من الأجسام المضادة على السليلوز قد لا توفر نتائج استنساخه 12. التساهمية تجميد الأجسام المضادة التي يتم زرعها على أسطح الورقة هو طريقة بديلة لتطوير اختبارات بيولوجية الورقية فعالة 13. وقد تم الإبلاغ عن أساليب مختلفة لتعديل السليلوز 14، 15 12. Carbonyldiimidazole جنبا إلى جنب مع 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium رباعي فلوروبورات 16؛ 1-الفلورية-2-نيترو-4-azidobenzene من خلال القائمة على الأشعة فوق البنفسجية استراتيجية تفعيل 17، 18؛ استراتيجية chemoenzymatic على أساس 19 تعديل xyloglucan. على 1،4-phenylenediisothiocyanate عامل ربط 20؛ عديد السكاريدات المتغاير الأكسدة 21 نقرة الكيمياء 22؛ والبروفيرين الموجبة 23 استخدمت لشل حركة تساهمي الجزيئات الحيوية على ورق السيلولوز. وقد استخدم الشيتوزان رقة معدلة لتطوير immunodevices الورقية 24-26 لأنها وفيرة وحيويا 27. الشيتوزان هو الموجبة وتتمسك بقوة إلى السليلوز الأنيونية 27. ويجمد الأجسام المضادة القبض على الورق من خلال طلاء الشيتوزان وغلوتارالدهيد عبر ربط. الأكسدة بريودات هي طريقة أخرى لتطعيم الكابتنأجسام مضادة لدى عودتهم على ورقة السليلوز 28. في هذه الطريقة، يتم رصدت بريودات الصوديوم على ورقة لتحويل مجموعة 1،2-dihydroxyl (جلايكول) في السليلوز مباشرة إلى مجموعة ألدهيد. ثم يتم استخدام مجموعة ألدهيد لتشكيل روابط تساهمية بين السكريات والأجسام المضادة 28. على الرغم من أن التصنيع هو بسيط، فمن الصعب أن يغسل تماما بريودات الصوديوم. وبريودات الصوديوم غير مغسولة يمكن أن يسبب المزيد من أكسدة الأجسام المضادة التي ثبتوا على ورقة السليلوز، مما يؤثر على النشاط والاستقرار من الأجسام المضادة N - (3-dimethylaminopropyl) - N هيدروكلوريد -ethylcarbodiimide وN تستخدم linkers عبر -hydroxysuccinimide أيضا تساهميا شل الأجسام المضادة على حامض وخلات السليلوز ألياف النانو بولي-L-اللبنيك electrospun لتطوير المقايسات القائمة على ألياف نانوية 29.

في هذه الدراسة، تم استخدام تقنية اقتران سيلاني إلى الكسب غير المشروع المجموعات الوظيفية أمين على cellulosأقراص البريد ورقة. هذه التقنية تساعد على الإبقاء على الحجم الأصلي المسام، فتل، ومعدل الترشيح للأوراق الترشيح السليلوز، مما يتيح أقصى العمودية المناعية تدفق من خلال في. وقد استخدمت هذه التقنية سيلاني اقتران على نطاق واسع في أجهزة الاستشعار لfunctionalize السطوح الركيزة مع مجموعات أمين الثانوية، تليها مزيد من التعديل باستخدام الجزيئات الحيوية. تطعيم الفئات أمين على سطح مصفوفة يتألف رد فعل التكثيف بين الجماعات أوه من وكلاء سيلاني organofunctional ومصفوفة الركيزة 30. تم functionalized الأقراص رقة السليلوز مع مجموعات أمين كتبها اقتران سيلاني من خلال 3-aminopropyltrimethoxysilane (APS) 31. وأعقب ذلك الأجسام المضادة القبض على شل حركة تساهميا باستخدام طريقتين مختلفتين. تشارك الطريقة الأولى ملزم من بريودات الأجسام المضادة القبض المؤكسد إلى أمين functionalized أقراص ورق السليلوز. استخدام الطريقة الثانية غلوتارالدهيد كعامل عبر ربط إرفاق antibodi القبضوفاق لأقراص أمين ورق السيلولوز functionalized المجموعة. وأكد وجود أجسام مضادة أسر أرنب مكافحة الإنسان ثيوسيانات مفتش-فلوريسئين (FITC)، وذلك باستخدام مضان تصوير الجزيئي. تم تقييم النشاط ملزمة الأرنب مكافحة الإنسان مفتش-FITC إلى الماعز المضادة للأرنب مفتش أيضا الركيزة البيروكسيداز. تمت دراسة تأثير تركيزات مختلفة من بريودات الصوديوم، غلوتارالدهيد، والأجسام المضادة القبض عليه. تم إجراء اختبار التطبيق من الأجسام المضادة القبض يجمد بنجاح من خلال الكشف عن مفتش المصل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. مسمار أمين المجموعات الوظيفية على السليلوز ورقة أقراص

  1. إعداد قطعة واحدة من الورق مربع مع البعد من 1 سم × 1 سم، و 100 أقراص الورق المصنوع من الصف رقم (1) ورقة السليلوز التي يبلغ قطرها 6.0 مم (ورق الترشيح متوسط ​​التدفق) باستخدام لكمة ثقب.
  2. لاشتقاق -NH 2 المجموعات على أقراص الورق، وخلط 1 مل و 10 مل وكالة الأنباء الجزائرية الأسيتون في زجاجة 50 مل في غطاء الدخان. إضافة أقراص الورق إلى الطازجة خليط APS الكاشف، واحتضان لمدة 5 ساعة مع التحريك المداري (200 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة (32).
    تحذير: التعامل مع وكالة الأنباء الجزائرية والأسيتون في غطاء الدخان.
  3. صب حل الزائدة من زجاجة 50 مل في وعاء النفايات العضوية.
  4. إضافة 10 مل من الاسيتون للزجاجة، وتخلط جيدا وصب تماما لإزالة أي APS غير المتفاعل وغيرها من الشوائب. كرر هذه الخطوة مرتين.
  5. نشر أقراص رقة على منشفة ورقية ومكان في C فرن 110 درجة لمدة 3 ساعة. السماح للأقراص رقة لتبرد. تخزين الأقراص في أنبوب 50 مل الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة.
  6. استخدام تحويل فورييه الطيفي بالأشعة تحت الحمراء (FTIR) للتحقق من تطعيم مجموعات أمين على ورقة مربع السليلوز، كما هو موضح أدناه (الشكل 3A).
    1. تشغيل الكمبيوتر وفتح أداة FTIR الطيفي.
    2. فتح البرنامج لFTIR الطيفي.
    3. انتقل إلى 'قياس → تهيئة. المستطيلات ل"BS: كي بي آر"،: سوف "مصباح الأشعة تحت الحمراء" و "الليزر" يتحول إلى اللون الأخضر عند الانتهاء من التهيئة.
    4. اختيار "بيانات" أسفل المستطيلات، واختر '٪ النفاذية'، 'هاب-Genzel'، '45'، '4.0'، و 'الحد الأدنى: 400، الحد الأقصى: 4000' ل 'الوضع القياس'، 'Apodization'، ' لا. من المسح '،' القرار '، و' المدى (سم-1).
    5. انقر على "قياس".
    6. اختر "ملف البيانات" للبيانات الخلفية. كتابةمن أهمية هذه التصريحات.
    7. انقر على "BKG" للحصول على خط الأساس للخلفية.
    8. إصلاح ورقة مربع على صاحب العينة الفيلم.
    9. اختر "ملف البيانات" للبيانات العينة. كتابة تعليق.
    10. انقر على "عينة" للحصول على الأطياف للعينة.
    11. إغلاق التطبيق الطيفي FTIR وإيقاف تشغيل الكمبيوتر.
  7. كرر الخطوات المذكورة أعلاه (الخطوات 1،1-1،6) للتحضير-أمين functionalized الصف رقم 113 السليلوز ورقة مربع، وأقراص (تدفق سريع ورق الترشيح)، والحصول على أطياف FTIR لورقة مربع الصف رقم 113 (الشكل 3B).

2. التساهمية الشلل من الأجسام المضادة على functionalized أمين-السليلوز ورقة أقراص

الشكل (3)
الشكل 1. التساهمية تجميد الأجسام المضادة من قبل اثنين من أساليب مختلفة.A. الأجسام المضادة يجمد على السليلوز أقراص الورق functionalized أمين عن طريق الأكسدة بريودات. تم أكسدة مخلفات الكربوهيدرات التي كتبها بريودات الصوديوم لإنتاج المجموعات الوظيفية ألدهيد. ثم، تم تحميل الأجسام المضادة المؤكسد على السليلوز أقراص الورق functionalized أمين. ب. وثم يجمد الأجسام المضادة على أقراص ورق السيلولوز functionalized أمين من خلال غلوتارالدهيد. كانت مغمورة أمين functionalized أقراص ورق السيلولوز في 0.05٪ محلول غلوتارالدهيد لتقديم مجموعة ألدهيد إلى أقراص الورق. بعد الغسيل، وتحميل الأجسام المضادة على ألدهيد functionalized أقراص الورق. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. لشل حركة الأجسام المضادة على السليلوز أقراص الورق functionalized أمين عن طريق الأكسدة بريودات (الشكل 1A).
    1. مزيج 1 ميكرولتر من 2.5 ملي perioda الصوديومالشركة المصرية للاتصالات مع 2 ميكرولتر من 0.1 ملغ / مل أرنب المضادة للبشرية مفتش-FITC و 7 ميكرولتر من 100 ملي درجة الحموضة 5.5 عازلة خلات في أنبوب 1.5 مل، واحتضان الخليط في الظلام لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: اتبع هذه النسبة حجم لإعداد الأجسام المضادة أكثر المؤكسد إذا لزم الأمر. تغيير نسبة حجم لتحسين تركيز بريودات الصوديوم والأرانب مكافحة الإنسان مفتش-FITC.
    2. تمييع الحل الضد أعلاه مع 30 ميكرولتر من 50 ملي الفوسفات المالحة العازلة (PBS، ودرجة الحموضة 7.4) إلى الحجم النهائي من 40 ميكرولتر.
    3. إعداد ثلاث مرشح المتوسطة تدفق أقراص الورق أمين-functionalized وثلاثة تدفق سريع أقراص الورق functionalized أمين (كما هو موضح في القسم 1).
      1. تحميل 5 ميكرولتر من بريودات الصوديوم أكسدة أرنب مكافحة الإنسان مفتش-FITC على كل أسطوانة ورق الترشيح المتوسط ​​تدفق و 8 ميكرولتر على كل أسطوانة ورقة مرشح تدفق سريع. حافظ على هذه الأقراص ورقة في الظلام لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    4. يغسل كل من القرص ورقة مع 0.2 مل من غسل برتقاليإيه (50 ملي تريس العازلة مع 0.15 M كلوريد الصوديوم و 0.05٪ السطحي، ودرجة الحموضة 7.4). تكرار غسل ثلاث مرات.
    5. تصوير الصور مضان من خلال تصوير الجزيئي مضان لتحديد وجود أجسام مضادة في كل السليلوز ورقة القرص 32. استخدام أقراص رقة بيضاء (تعامل مع نفس تركيز الأجسام المضادة في حالة عدم وجود بريودات الصوديوم) كعنصر تحكم (الشكل S1 إلى الشكل S3).
      ملاحظة: للحصول على تحسين التجريبية، تغيير التركيز من معلمة واحدة يحتاج إلى أن يكون الأمثل وتحديد تركيزات جميع المعلمات الأخرى. وكثافة عالية مضان يزيد من كمية من الأجسام المضادة القبض على أن يجمد على أقراص رقة السليلوز.
  2. لشل حركة الأجسام المضادة على أمين أقراص ورق السيلولوز functionalized من خلال غلوتارالدهيد (الشكل 1B).
    1. إضافة ثلاثة APS تعامل المتوسطة تدفق أقراص ورق الترشيح وتدفق سريع أقراص ورق الترشيح الثلاثة (ديسcribed في القسم 1) إلى 2 مل من 50 ملي برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) الذي يحتوي على 0.05٪ غلوتارالدهيد لمدة 1 ساعة، مع التحريك المداري في درجة حرارة الغرفة.
      تحذير: التعامل مع غلوتارالدهيد في غطاء الدخان.
    2. وضع ثلاثة أقراص في كل من اثنين من 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي. إضافة 1 مل من الماء (DI) منزوع الأيونات إلى كل أنبوب ويهز الأنابيب لمدة 10 ثانية. إزالة المياه من خلال الشفط مع ماصة. كرر مرتين أخريين لإزالة أي غلوتارالدهيد غير المتفاعل.
    3. تحميل 5 ميكرولتر من 25 ميكروغرام / مل أرنب مكافحة الإنسان مفتش-FITC (التقاط الأجسام المضادة) على كل المتوسطة تدفق القرص ورقة مرشح functionalized ألدهيد، وإضافة 8 ميكرولتر على كل تدفق سريع القرص ورقة مرشح functionalized ألدهيد. احتضان في الظلام لمدة حوالي 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم، إضافة 10 ميكرولتر من 50 ملي برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) إلى كل أسطوانة ورقة دون إزالة الأجسام المضادة واحتضان لمدة 40 دقيقة للتفاعل الأمينات ألدهيد.
    4. غسل أقراص الورق مع 0.2 مل من غسل العازلة على رأس منشفة ورقية. تكرارغسل مرتين.
    5. تصوير الصور مضان من خلال تصوير الجزيئي مضان للتأكد من وجود أجسام مضادة في كل السليلوز ورقة القرص 33. استخدام أقراص رقة بيضاء كمجموعة تحكم.
      ملاحظة: في الشكل (4)، '0' لتقف على القرص الورق الفارغ الذي تعامل مع نفس التركيز من FITC الأجسام المضادة في حالة عدم وجود غلوتارالدهيد. في الشكل 5A، تم علاج الأقراص ورقة بيضاء مع غلوتارالدهيد، ولكن تم تحميل أي الأجسام المضادة FITC على أقراص الورق.
  3. تجفيف أقراص الورق (من أقسام 2.1 و 2.2) عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  4. منع أقراص الورق مع 15 ميكرولتر من عرقلة العازلة (10٪ منزوع الدسم مسحوق الحليب في 50 العازلة ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.4، 0.15 م كلوريد الصوديوم) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. تحميل 5 ميكرولتر و 8 ميكرولتر من البيروكسيديز مترافق الماعز المضادة للأرنب مفتش في برنامج تلفزيوني (1: 10000) على متوسط ​​تدفق وتدفق سريع أقراص ورق الترشيح، على التوالي. احتضان ل30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
  6. غسل أقراص الورق مع 0.2 مل من غسل العازلة على رأس منشفة ورقية. تكرار غسل ثلاث مرات.
    ملاحظة: ليس من الضروري إزالة غسل العازلة كما لا تتأثر النتائج وفقا المخزن المؤقت.
  7. تحميل مزيج 10 ميكرولتر من 3،3 '، 5،5'-tetramethylbenzidine (TMB) ومحلول فوق أكسيد الهيدروجين على كل أسطوانة.
  8. التقاط صور للأقراص الورق مع الكاميرا الرقمية أو الهواتف الذكية بعد 5 دقائق من الحضانة.
    ملاحظة: في الشكل 5B، '0' وتقف على أقراص الورق التي كانت تعامل مع غلوتارالدهيد، تليها تحميل المترافقة في غياب FITC الضد الضد HRP (حصان الفجل البيروكسيديز).

إليسا 3. الورقية للكشف مفتش

الشكل 2
الشكل 2. تمثيل تخطيطي للELISA الورقية FOويجمد ص مفتش الكشف. التقاط الأجسام المضادة تساهميا على أقراص رقة السليلوز functionalized ألدهيد من خلال غلوتارالدهيد. تم حظر أقراص رقة السليلوز مع عازلة تمنع. ثم أضاف الهدف مفتش للأقراص، تليها تحميل الأجسام المضادة إشارة HRP مترافق. وأخيرا، تم تحميل حل تمب وخليط بيروكسيد الهيدروجين على كل أسطوانة ورقة للقراءة اللون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. إضافة 5 مل من محلول غلوتارالدهيد 0.05٪ (المعد في 50 العازلة ملي برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4) لزجاجة 20 مل. تزج 15 متوسطة تدفق أقراص ورق الترشيح-functionalized أمين في هذا الحل وإبقاء لمدة 1 ساعة مع اهتزاز عند درجة حرارة الغرفة.
    1. وفي الوقت نفسه، كرر الخطوة 3.1 لإعداد 15 ألدهيد functionalized تدفق سريع أقراص الورق مرشح آخر.
      الحذر: التعامل مع غلوتارالدهيد في الدخانالغطاء.
  2. لإزالة غلوتارالدهيد غير المتفاعل من أقراص الورق، ووضع 15 متوسطة تدفق أقراص ورق الترشيح في أنبوب الطرد المركزي 15 مل، و15 التدفق السريع أقراص ورق الترشيح في أنبوب آخر الطرد المركزي 15 مل. إضافة 5 مل من الماء DI إلى كل أنبوب ويهز الأنابيب لمدة 10 ثانية. إزالة المياه من خلال الشفط مع ماصة. كرر مرتين لإزالة أي غلوتارالدهيد غير المتفاعل.
  3. تجفيف أقراص الورق في 37 درجة مئوية الفرن.
  4. إضافة 5 ميكرولتر و 8 ميكرولتر من 0.025 ملغ / مل الأجسام المضادة جزء الماوس مفتش-FC إلى كل من متوسط ​​التدفق ورقة الترشيح تدفق سريع أقراص، على التوالي، واحتضان لمدة 20 دقيقة.
  5. إضافة 10 ميكرولتر من 50 ملي برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) إلى كل أسطوانة ورقة دون إزالة الأجسام المضادة واحتضان لمدة 40 دقيقة للتفاعل الأمينات ألدهيد.
  6. غسل أقراص الورق مع 0.2 مل من غسل العازلة على رأس منشفة ورقية. تكرار غسل ثلاث مرات.
  7. تجفيف أقراص رقة في الفرن عند 37 درجة مئوية.
  8. منع أقراص رقة ثإيث 15 ميكرولتر من عرقلة العازلة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  9. يغسل كل أسطوانة ورقة مع 0.2 مل من غسل العازلة على رأس منشفة ورقية. تكرار غسل ثلاث مرات.
  10. تشغيل معايير مفتش.
    1. تحميل 10 ميكرولتر من تركيزات مختلفة مفتش (على سبيل المثال، 0، 10، 125، 250، و 500 نانوغرام / مل في برنامج تلفزيوني) على كل أسطوانة في ثلاث نسخ. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  11. غسل أقراص الورق مع 0.2 مل من غسل العازلة على رأس منشفة ورقية. تكرار غسل ثلاث مرات.
  12. تحميل 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة HRP مترافق الماوس مفتش-FC جزء (1: 10000، 10 ملي برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4)، واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  13. غسل أقراص الورق مع 0.2 مل من غسل العازلة على رأس منشفة ورقية. تكرار غسل ثلاث مرات.
    ملاحظة: ليس من الضروري إزالة غسل العازلة كما لا تتأثر نتائج من خلال وجود العازلة.
  14. تحميل مزيج 10 ميكرولتر من تمب وبيروكسيد الهيدروجين على كل أسطوانة.
  15. تصور أك جميع أقراص الورق مع الكاميرا الرقمية أو الهواتف الذكية بعد 5 دقائق من الحضانة.
    ملاحظة: في الشكل 6A، '0' لتقف على أقراص رقة تعامل مع تجميد التقاط الأجسام المضادة، والحل الضد HRP / TMB دون مفتش المصل.
  16. تحليل كثافة كل قرص الورق في صورة من صورة J.
    1. تحويل الصور الملتقطة في خطوة 3.15 إلى تنسيق ". TIF.
    2. فتح 'صورة J' البرمجيات.
    3. انتقل إلى 'ملف → فتح'، واختيار صورة لتحليلها.
    4. اختر زر شكل "البيضاوي".
    5. انتقل إلى 'صورة → → نوع 32 بت.
    6. انتقل إلى 'تحرير → المقلوب ".
    7. انتقل إلى 'تحليل → التدبير.
    8. نسخ وتحليل البيانات في جدول بيانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الشكل (3)
الشكل 3. تحويل فورييه الأشعة تحت الحمراء (FTIR) أطياف غير المعالجة أو المعالجة APS-فلتر المتوسط تدفق ورقة مربع (A) وتدفق سريع مرشح ورقة مربع (B). A. كان الأطياف لغير المعالجة مرشح المتوسطة تدفق رقة مربع مماثلة لتلك التي من وكالة الأنباء الجزائرية تعامل مرشح المتوسطة تدفق ورقة مربع. الزيادة في شدة على عصابات 902-1،170 سم -1 و1،210-1،500 سم -1 لورقة مربع تعامل APS-تنتمي إلى سي-O-السليلوز والتشوهات CH الجماعات SiOC-H، على التوالي. الزيادة من العصابات في 1650 سم -1 و 2885 سم -1 ينتمي إلى الانحناء لل-NH 2 و CH 2 الاهتزازات من شاردة المالحة بروبيل، على التوالي. ب. ونسبت القمم مميزة في 972 إلى 1180 سم -1 مجموعة إلى سي-O-سي وSO-مالسندات llulose. كان سبب الذروة في 1003 سم -1 من خلال التداخل من السندات سي-O-سي وCO تمتد من السليلوز. عرض كل النتائج التي APS تم زرعها بنجاح على أوراق السليلوز مربع. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم تحديد وجود مجموعات وظيفية أمين على أوراق مربع السليلوز من قبل FTIR ويبين الشكل 3 الأطياف FTIR من دون علاج أو تعديل أو متوسطة تدفق وتدفق سريع أوراق الترشيح مربع. كانت هناك ثلاث خطوات المشاركة في التعديل الكيميائي للaminoalkyl الجماعات، وذلك باستخدام وكالة الأنباء الجزائرية على أسطح السليلوز. خطوة واحدة شملت التحلل من وكالة الأنباء الجزائرية لتوفير المشتقات silanol وكالة الأنباء الجزائرية. الخطوة الثانية شملت امتصاص للمشتقات وكالة الأنباء الجزائرية تحلل على ألياف السيليلوز من خلال الرابطة الهيدروجينية مجموعات OH من حydrolyzed وكالة الأنباء الجزائرية مشتق وألياف السليلوز. الخطوة الثالثة شملت التكثيف للمشتقات وكالة الأنباء الجزائرية كثف، والتي أدت إلى تطعيم للمشتقات وكالة الأنباء الجزائرية على سطح ألياف السليلوز من خلال الترابط سي OC وتشكيل سي-O-سي الجسور siloxane 34. كما هو مبين في الشكل 3A، وزيادة الفرقة في 1650 سم -1 يعزى إلى الانحناء للجماعات NH 2 وزيادة قدرها الفرقة في 2885 سم -1 المقابلة لCH 2 الاهتزازات شاردة بروبيل سيلاني. لتصفية المتوسطة تدفق رقة مربع الأصلي، والعصابات في 902-1،170 سم -1 و1،210-1،500 سم -1 يتفق مع الاهتزازات من السندات COC الجسور غليكوزيدية وCH الاهتزازات تمتد. بعد علاج ورقة مربع مع وكالة الأنباء الجزائرية، والزيادة في كثافة في هذه الاعراض الفرقة اثنين يدل على أنهم ينتمون إلى سي-O-السليلوز والتشوهات CH الجماعات SiOC-H، على التوالي. على غرار المتوسطة فلوريدا آه تصفية ورقة مربع، وأطياف لتعديل تدفق سريع مرشح ورقة مربع زادت أيضا في كثافة في 1650 سم -1 ل-NH 2، ويرجع ذلك إلى التعديل الكيميائي مع وكالة الأنباء الجزائرية (الشكل 3B). ونسبت القمم مميزة قوية في 972 إلى 1180 سم -1 مجموعة إلى سي-O-سي والسندات SO-السليلوز. وكانت أعلى قمة في 1003 سم -1 نظرا للتداخل من السندات سي-O-سي وCO تمتد من السليلوز 34. هي سبب السندات مميزة في نطاق الطول الموجي بين 1188 و 1510 سم -1 لAPS تعامل رقة مربع من الاهتزازات من السندات انبا الجسور غليكوزيدية وCH الاهتزازات تمتد. عرضت تمتد السندات الاهتزاز CH 2 في 2،800-2،980 سم -1 وأعلى قمة كان في 2932 سم -1 لوكالة الأنباء الجزائرية تعامل رقة مربع. في الختام، وكالة الأنباء الجزائرية يمكن المطعمة تساهميا إلى رقم 1 ورقم 113 أوراق الترشيح مربع.

الآثار البيئية-together.within الصفحات = "1"> الشكل (4)
الرقم 4. ردود الإسفار لتركيزات مختلفة من غلوتارالدهيد في تجميد مفتش-FITC على أقراص الورق (الطريقة ب) إعدادات لمضان تصوير الجزيئي: الإثارة، 488 نانومتر، والانبعاثات، 530 نانومتر، القرار، و 100 ميكرومتر ج: الإسفار ردا على 0، 0.001٪، 0.005٪، 0.01٪ و 0.050٪ غلوتارالدهيد ب: استجابة الإسفار إلى 0، 0.050٪، 0.100٪، 0.250٪ و 0.500٪ غلوتارالدهيد. وكان تركيز مفتش-FITC على كل أسطوانة 0.01 ملغ / مل. أدت زيادة في تركيز غلوتارالدهيد إلى حد أقصى قدره 0.05٪ في زيادة كمية التحميل من مفتش-FITC. تركيزات غلوتارالدهيد فوق 0.05٪ وانخفضت كمية تحميل مفتش-FITC. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذاالشكل.

الرقم 5
الرقم 5. استجابة الإسفار (A) ونتيجة اللونية (ب) من تركيزات مختلفة من مفتش-FITC على يجمد مفتش-FITC متوسطة تدفق وتدفق سريع أقراص ورق الترشيح (الطريقة ب) إعدادات لمضان تصوير الجزيئي: الإثارة ، 488 نانومتر، والانبعاثات، 530 نانومتر، والقرار، 100 ميكرون. # 1 يمثل الصف رقم (1)، متوسط ​​تدفق القرص ورق الترشيح، ورقم 113 يمثل الصف رقم 113 تدفق سريع القرص ورق الترشيح. وعولج أقراص الورقة المعدلة وكالة الأنباء الجزائرية مع 0.05٪ غلوتارالدهيد أولا. ثم، تم تحميل تركيزات مختلفة من مفتش-FITC على غلوتارالدهيد تعديل أقراص الورق. زيادة تركيز تحميل مفتش-FITC زيادة مبلغ يجمد مفتش-FITC على أقراص الورق. ومع ذلك، فإن زيادة تركيزات يجمد مفتش-FITC لم تتحسن قدرة ملزمة للمستضد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ويرد العمل الأساسية اللازمة لتجميد التساهمية من الأجسام المضادة على السليلوز أقراص الورق functionalized أمين في الشكل 1. وقد ثبتوا الأرنب مكافحة الإنسان مفتش-FITC تساهميا على أقراص رقة السليلوز. وأشار مضان من أقراص الورقة تجميد الأجسام المضادة للأقراص الورق، وكانت كثافة مضان يتناسب طرديا مع تركيز الأجسام المضادة يجمد. كان البيروكسيد الماعز مترافق المضادة للأرنب مفتش ثم تطبيقها لتحديد قدرة ملزم من الأجسام المضادة يجمد. ويمكن لمجموعات الأمينات الثانوية ومجموعة ألدهيد تتفاعل مع بعضها البعض لتشكل قاعدة شيف، الذي استخدم في bioconjugation 35. وكانت تستخدم أيضا هنا لتجميد التساهمية من القبض علىالأجسام المضادة. في طريقة ألف (الشكل 1A)، وقدم -NH 2 إلى أقراص ورق السيلولوز واستمد -CHO من الأرنب مكافحة الإنسان مفتش-FITC عن طريق أكسدة المنطقة التيسير من الأجسام المضادة مع بريودات الصوديوم. في نفس الطريق، كما تم تحليل آثار تركيزات مختلفة من بريودات الصوديوم والأجسام المضادة-FITC. كما هو مبين في الشكل S1 والشكل S2، بريودات الصوديوم من تركيزات 0-1 ملم والأرنب مكافحة الإنسان مفتش-FITC ،016-0،16 ملغ / مل يكن لها أثر يذكر على أكسدة مفتش 0.08 ملغ / مل أرنب مكافحة الإنسان -FITC. زيادة كمية الأجسام المضادة التي كان لا بد تساهميا إلى أقراص الورق مع زيادة تركيز الأجسام المضادة القبض 0-،075 ملغ / مل (الشكل S3A).

ولوحظ وجود تغير لون خافت الذي تم فيه تحديد قدرة ملزم من قبل فحص البيروكسيديز. قد يكون هذا بسبب استخدامبريودات الصوديوم الزائدة، والذي يتفاعل مع الأجسام المضادة القبض على ويسبب فقدان النشاط ملزم. ومن المرجح أن بريودات الصوديوم لا يمكن غسلها تماما بعيدا عن الأقراص ورقة. وهذا ما أكده مبدأ بسيط وهو أن حل بريودات الصوديوم يوفر اللون الأصفر عند مزجه مع حل purpald. لذلك، تم تحميل الأجسام المضادة أكسدة بريودات على أقراص الورق والمحتضنة لمدة 1 ساعة. تم غسلها الأقراص رقة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني (التي تحتوي على 0.05٪ توين-20)، ثم أضيف حل purpald لهذه الأقراص. أظهرت أقراص رقة اللون الأرجواني على الفور، مشيرا إلى وجود جماعات ألدهيد من الأجسام المضادة أكسدة بريودات. هذا اللون الأرجواني تغير إلى اللون الأصفر في غضون 10 دقيقة، والتي أكدت وجود بريودات الصوديوم على أقراص الورق.

بدلا من ذلك، تم استخدام غلوتارالدهيد عبر ربط الأسلوب (أسلوب B، الشكل 1B) لربط جروب أمينملاحظة من أقراص رقة المعالجة وكالة الأنباء الجزائرية والأجسام المضادة. تم ضبط تركيزات غلوتارالدهيد (الشكل 4) والأرنب مكافحة الإنسان مفتش-FITC (الشكل 5A) التي تم تحميلها على أقراص ورق السليلوز. كما هو مبين في الشكل (4)، وصلت كثافة مضان بحد أقصى 0.05٪ من غلوتارالدهيد، وهو ما يعني أن تحميل أرنب مكافحة الإنسان مفتش-FITC أصبحت مشبعة على القرص ورق السيلولوز في هذا التركيز. ولم زيادة في تركيز غلوتارالدهيد إلى 2.5٪ لا تظهر زيادة في كمية الأرانب مكافحة الإنسان مفتش-FITC على أقراص رقة السليلوز (الشكل S4). زيادة كثافة مضان أيضا مع زيادة تركيزات أرنب مكافحة الإنسان مفتش-FITC التي تم تحميلها على أقراص الورق (الشكل 5A). أما اللون الأزرق وضعت فور إضافة تمب حل الركيزة وبيروكسيد الهيدروجين خليط إلى أقراص الورق، والتي تحتوي على peroxidasالبريد الأجسام المضادة كشف مترافق (الشكل 5B). وبالإضافة إلى ذلك، عرقلة العازلة التي تحتوي على 10٪ منزوع الدسم ظهر مسحوق حليب للاحتفاظ كفاءة عرقلة بعد 15 يغسل (الشكل S5). وقد تم اختيار أسلوب B لاختبار التطبيق من الأجسام المضادة يجمد، كما يتجلى ذلك تعزيز النشاط ملزم إلى هدفه. وبالتالي، تم استخدام 0.025 ملغ تركيز / مل من الأجسام المضادة لالتقاط كشف مفتش.

الشكل (6)
الشكل 6. منحنيات المعايرة لتحديد مفتش كتبها الورقية ELISA # 1 يمثل الصف رقم (1)، متوسط تدفق القرص ورق الترشيح، ورقم 113 يمثل الصف رقم 113 تدفق سريع القرص ورق الترشيح. ويعرض لوحة العلوي وقراءات لون المتوسطة تدفق (رقم 1) وسريع التدفق (# 113) أقراص ورق السيلولوز مع تركيز مختلفة من مفتش. لوحة أسفليقدم B نتيجة ELISA لتراكيز مختلفة من مفتش. استخدمت يثلث لتحديد الانحراف المعياري (SD). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

واستخدمت الماعز المضادة للماوس مفتش-FC التقاط جزء الأجسام المضادة، مفتش مصل، والماعز المضادة للماوس مفتش-FC جزء الأجسام المضادة مترافق برنامج الصحة الإنجابية للمقايسة شطيرة. كما هو مبين في الشكل (6) والشكل S6، وتركيز مفتش المصل 0-500 نانوغرام / مل كان على علاقة خطية مع شدة اللونية عندما حضنت كل خطوة لمدة 1 ساعة. في الشكل S6، كان التغير في اللون مع تركيزات مختلفة من مفتش واضح لمدة 1 ساعة من الحضانة. ومع ذلك فإن النتائج الحضانة 10 دقيقة لا تظهر تغيرا واضحا في شدة اللون مع تركيزات مختلفة من مفتش. وهكذا، فإن السناتوركان itivity هذا ELISA الورقية مناسبة لتطوير عملية اختبار نقطة من الرعاية.

شخصية S1. وتباينت ردود مضان لتركيزات مختلفة من بريودات الصوديوم (الطريقة A). تركيزات مختلفة من بريودات الصوديوم مع الأرنب مكافحة الإنسان مفتش-FITC بتركيز 0.016 ملغ / مل واستخدامها لدراسة النشاط الأجسام المضادة الأكسدة. عن طريق زيادة تركيز بريودات الصوديوم، وكمية تحميل مفتش-FITC زيادة وصلت إلى الحد الأقصى عند 0.25 ملم. ولوحظ أن تركيزات الصوديوم بريودات التي كانت أعلى من هذا لم يزد مبلغ يجمد مفتش-FITC. استخدمت يثلث لتحديد الانحراف المعياري (SD). يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الرقم S2. استجابة مضانالصورة لتركيزات مختلفة من الأرانب مكافحة الإنسان مفتش-FITC (الطريقة A). وكان تركيز بريودات الصوديوم 0.25 ملم في حل لدراسة النشاط الأجسام المضادة الأكسدة، وتركيز النهائي من الأرانب مكافحة الإنسان مفتش-FITC على كل أسطوانة كان 0،016 ملغ / مل. عندما تم إصلاح تركيز بريودات الصوديوم، وكان تركيز مفتش-FITC تأثير يذكر على أكسدة مفتش-FITC. استخدمت يثلث لتحديد الانحراف المعياري (SD). يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل S3. واستخدمت استجابة مضان ونتيجة اللونية من تحميل تركيزات مختلفة من الأرانب أكسدة مكافحة الإنسان مفتش-FITC على أقراص الورق (الطريقة A). للأكسدة بريودات الصوديوم، 0.08 ملغ / مل من مفتش-FITC و 0.25 ملي بريودات الصوديوم. وكان التخفيف من-البيروكسيديز مترافق المضادة للأرنب مفتش1: 50000. زيادة تركيز تحميل مفتش-FITC على أقراص رقة السليلوز زيادة كمية يجمد مفتش-FITC، ولكن لم يكن لديها تأثير على هدف ملزم. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل S4. وكان رد مضان لتركيزات عالية من غلوتارالدهيد في تجميد مفتش-FITC على أقراص رقة السليلوز (الطريقة ب) تركيز مفتش-FITC على كل أسطوانة 0.01 ملغ / مل. تركيزات غلوتارالدهيد التي كانت أعلى من 0.25٪ لا يزيد من كمية يجمد مفتش-FITC على أقراص رقة السليلوز. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل S5. تأثير عدد مرات الغسيل. ج: كان. هينج ثلاث مرات ب: غسل 15 مرة. الأجسام المضادة القبض ثبتوا على ورقة السليلوز مربع لا تزال لديها قدرة ملزمة جيدة إلى أهدافهم، على الرغم من أن ورقة مربع وvortexed 15 مرة. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل S6. إليسا نتيجة لمفتش الورقية. وبالنسبة للتركيزات مفتش 0-500 نانوغرام / مل، والنتائج من ساعة واحدة من الحضانة هي أفضل من نتائج من 10 دقيقة من الحضانة. لتركيزات عالية من IgG و 10 دقيقة من الوقت ما يكفي للحضانة. استخدمت يثلث لتحديد الانحراف المعياري (SD). يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الرقم S7. مسح المجهر الإلكتروني (SEM) وصور من ورق الترشيح المتوسطة تدفق في تكبير مختلفة. ج: 85X وباء: 20،000X. كان يعمل الحقل المجهر انبعاث الإلكترون (FE-SEM) التي تعمل على 5 كيلو فولت لتحديد مورفولوجيا الجسيمات. ألياف السليلوز هي عبر ربط بشكل عشوائي. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الرقم S8. الصور SEM من ورق الترشيح تدفق سريع في تكبير مختلفة. ج: 100X و B: 20،000X. كان يعمل الحقل المجهر انبعاث الإلكترون (FE-SEM) التي تعمل على 5 كيلو فولت لتحديد مورفولوجيا الجسيمات. ألياف السليلوز هي عبر ربط بشكل عشوائي. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم تنفيذ طلاء المباشر للتقارب تنقية الماعز المضادة للماوس مفتش-FC التقاط الأجسام المضادة على أقراص ورق السيلولوز معدلة للكشف عن تركيزات مفتش. وأشارت النتائج أن زيادة تثبيت الأجسام المضادة القبض على مطلوب للاستنساخ. استخدمت تقنية سيلاني بنجاح لإدخال المجموعات الوظيفية أمين إلى أقراص ورق السيلولوز 34. تركيز وكالة الأنباء الجزائرية يؤثر على تجميد الأجسام المضادة. لذلك، تم تحسين أيضا على كمية من وكالة الأنباء الجزائرية في الأسيتون. كانت 1 مل من وكالة الأنباء الجزائرية في 10 مل من الاسيتون تركيز الأمثل للتطعيم مجموعة أمين لتجميد الأجسام المضادة من خلال غلوتارالدهيد كيل عبر ربط. والمطعمة الأجسام المضادة على أقراص رقة السليلوز عن طريق الأكسدة بريودات وغلوتارالدهيد الطرق عبر ربط. كشفت نتائجنا أن قدرة ملزمة من الأجسام المضادة يجمد من خلال أسلوب غلوتارالدهيد عبر ربط كان أفضل من طريقة الأكسدة بريودات لميدالبوتاسيوم التدفق وسريعة أقراص رقة تدفق فلتر. وعلاوة على ذلك، والأجسام المضادة الطبيعية، التي ثبتوا على أقراص ورق السيلولوز من خلال طريقة غلوتارالدهيد عبر ربط، الإبقاء على وظيفتها وكان يجمد مستقر على الرغم من تعرض الورقة إلى إجهاد ميكانيكي من 15 يغسل من قبل vortexing. تم العثور على عشرة في المئة من المخزن المؤقت مسحوق الحليب منزوع الدسم حجب للاحتفاظ كفاءة عرقلة في الدقيقة 15 من يغسل (الشكل S5).

تم استخدام الأجسام المضادة يجمد تساهمي لإجراء ELISA شطيرة مع الكشف عن مفتش. تم الكشف عن مفتش في تركيز 100 نانوغرام / مل بالعين المجردة باستخدام هذا الاختبار على أساس القرص الورق. أظهر تركيز مفتش المصل 0-500 نانوغرام / مل وجود علاقة خطية مع شدة اللونية، عندما حضنت كل خطوة لمدة ساعة واحدة. اختبار المقايسة المناعية لهذا القرص الورقية ELISA يتطلب أقل عينة كاشف، وبدا أن تكون أكثر كفاءة من المناعية التقليدية 36 الشكل S7 و S8 الشكل، على التوالي. كما هو موضح في هذه الأرقام، والألياف هي عبر ربط لكلا النوعين من أقراص ورق الترشيح 25 عشوائيا. والسبب في ذلك حساسية عالية قد يكون سمك القرص الورق. لتدفق سريع أقراص ورق الترشيح كان سمك 420 ميكرون مقارنة مع 180 ميكرون للورق الترشيح المتوسطة التدفق. وبالتالي، من المرجح أن يجمد على تدفق سريع أقراص ورق الترشيح، التي من شأنها زيادة حساسية الفحص المزيد من الأجسام المضادة القبض عليه. وفي الوقت نفسه، كان حجم المسام للتدفق السريع أقراص ورق الترشيح (30 ميكرون) أكبر من ذلك من أقراص ورق الترشيح المتوسطة تدفق (11 & #181؛ م). بعد حجب سطح الورق، وكان لا يزال حجم المسام من السابق كبيرة بما يكفي لدفع جريان السائل بدون نظام الطاقة الزائدة. ومع ذلك، كان معدل تدفق لعازلة في الأخير أبطأ. ولذلك، كان تدفق سريع رقة الترشيح أفضل من ورق الترشيح متوسط ​​التدفق في تطبيق المناعية.

تم تقييم استنساخ الأجسام المضادة على أقراص ورق الترشيح يجمد قبل حضانة أخرى من الأقراص رقة مع البيروكسيديز مترافق مفتش الماعز المضادة للأرنب والكشف عن نتيجة اللونية بعد تحميل تمب الركيزة وبيروكسيد الهيدروجين حل الخليط. كان الانحراف المعياري أقل من 10٪ لهذا الجهاز الورقية. تم اختبار استقرار أرنب مكافحة الإنسان مفتش-FITC على -NH 2 تعديل أقراص ورق السليلوز لمدة تصل إلى شهرين. أقراص الورق التي تم تخزينها في 4 درجات مئوية حافظت النشاط ملزمة لالبيروكسيديز مترافق مفتش الماعز المضادة للأرنب مع انخفاض طفيف في ثنائية بهمالاكتشاف النشاط. ومع ذلك، عندما تم تخزينها الأجسام المضادة يجمد أقراص الورق في درجة حرارة الغرفة أو 60 درجة مئوية، وأنها فقدت النشاط ملزمة لهم نتيجة لجفاف وارتفاع في درجة الحرارة. قد زعزعت استقرار الأجسام المضادة القبض على والتشويه والتحريف في ظل هذه الظروف.

هناك بعض الخطوات الحاسمة في شل حركة الأجسام المضادة القبض على أقراص رقة السليلوز باستخدام غلوتارالدهيد كعامل عبر ربط. الخطوة 1.2 إلى الكسب غير المشروع مجموعات أمين على أقراص الورق هو خطوة حاسمة في نجاح تجميد التساهمية من الأجسام المضادة القبض عليه. إذا فشلت هذه الخطوة، سوف تفشل عملية تجميد كامل. وقد استخدم FTIR لتحديد ما إذا كانت المجموعات أمين يجمد بنجاح على أقراص الورق (الخطوة 1.6). ثانيا، تطعيم مجموعات ألدهيد على أقراص رقة السليلوز هو خطوة حاسمة أخرى (الخطوة 2.2.1 والخطوة 3.1). وقد ثبتوا الأجسام المضادة تساهميا على أقراص رقة السليلوز من خلال تشكيل قاعدة شيف. أخيرا، فإن الخطوة لشل حركة الأجسام المضادة القبض على أقراص ورق الترشيح مهمة (الخطوة 2.2.3، خطوة 3.4، والخطوة 3.5). المجموعات أمين من الأجسام المضادة القبض تفاعلت مع مجموعة ألدهيد من أقراص رقة السليلوز لإصلاح الأجسام المضادة على أقراص الورق. إذا كانت هذه الخطوة ناجحة، فإن الأجسام المضادة القبض على عدم شل على أقراص الورق وكافة الاختبارات تطبيق ELISA سيكون سلبيا. يمكننا استخدام جهاز تصوير الجزيئي مضان لتحديد وجود الأجسام المضادة القبض عليه. يمكن استخدام البيروكسيد-مترافق الماعز المضادة للأرنب مفتش وردود الفعل اللونية القائمة على البيروكسيديز لتأكيد قدرة ملزم من الأجسام المضادة يجمد.

هذا البروتوكول قد تواجه بعض المشاكل، مثل خلفية عالية للإشارة، أي إشارة أو إشارة ضعيفة، وقراءات اللون متفاوتة. وتناقش الأسباب المحتملة لهذه المشاكل وطرق استكشاف الأخطاء وإصلاحها من أجل التغلب على هذه المشاكل أدناه. إشارات خلفية عالية وعادة ما تحدث دوه إلى وقت حجب قصيرة. هذا يمكن حلها عن طريق زيادة عرقلة فترة حضانة، وغسل أقراص الورق بدقة، وتجنب إضافة الزائد الكشف عن انزيم الأجسام المضادة المترافقة لإزالة إشارات خلفية عالية. وتشمل الأسباب المحتملة غياب المستضد الهدف، على الحجب، وعدم كفاية الوقت الحضانة، وغير وظيفية الكشف عن الأجسام المضادة انزيم المترافقة. للتغلب على هذه القضايا، يجب إضافة المضادات الهدف وحضنت لفترة زمنية مناسبة باستخدام المترافقة الأجسام المضادة جديد وتخزينها كما اقترح من قبل الشركة المصنعة. فإنه من المستحسن لتشمل مراقبة إيجابية للكشف. ومن المقرر أن التراص من أقراص الورق أثناء عملية ترقيع قراءات اللون متفاوتة. لتجنب هذه المشكلة، يجب فصل الأقراص رقة أثناء عملية التطعيم وكالة الأنباء الجزائرية، ويجب أن تنتشر مستضد والكشف عن الأجسام المضادة انزيم المترافقة بشكل موحد على القرص ورقة في كل خطوة.

على الرغم من أن الفحص الورقية هو بسيطوتكلفة طريقة فعالة، وهناك قيود. اتجاه الأجسام المضادة على سطح الركيزة أمر بالغ الأهمية لأداء المناعية، كما يتفاعل الوكيل غلوتارالدهيد عبر ربط مع مجموعات أمين من منطقة فاب والمنطقة التيسير من الأجسام المضادة القبض عليه. وهكذا، فإن الأجسام المضادة يجمد لا تحدث بطريقة والموجهة للغاية. وبما أن هناك مجموعة من أمين من المنطقة فاب من من منطقة التيسير من الأجسام المضادة، والنشاط ملزم من الأجسام المضادة يجمد لا يزال مرتفعا بما فيه الكفاية لتطبيقها.

وقد لخصت وسائل functionalization سطح مختلفة للورق السيلولوز في تقرير حديث 37. الكواشف مثل السولفون ثنائي الفاينيل. 1،4-phenylenediisothiocyanate. 4-azido-benzenediazonium. epichlorohydrin. 4-azido واحد في الفلوري-2-nitrocyclohexane. و4 mercapto-benzenediazonium، يمكن أن تستخدم لشل حركة تساهمي الجزيئات الحيوية على ورق السيلولوز. استخدمت الامتزاز وانحباس أيضاإلى معطف ورقة السليلوز مع الجزيئات الحيوية. بالمقارنة مع الطرق الأخرى، فإن الجمع بين تقنية سيلاني وكيل غلوتارالدهيد عبر ربط لتجميد التساهمية من الأجسام المضادة على ورق السيلولوز هو طريقة بسيطة. وبالإضافة إلى ذلك، قد يكون هذا المزيج تأثير يذكر على الأداء الحراري والميكانيكي ورقة السليلوز، والسماح للأقصى الرأسي من خلال تدفق في المناعية. ويمكن تمديد هذه الاستراتيجية لشل حركة الجزيئات الحيوية الأخرى على ورق السيلولوز.

من المحتمل أن تمتد منهجية أثبتت هنا للكشف عن أي تحليلها، طالما الأجسام المضادة مباشرة ضدها متوفرة. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتطوير الكشف متعددة. على سبيل المثال، على ورقة مربع، ويمكن للمناطق المختلفة تمييزها عن أهداف مختلفة. الأجسام المضادة لالتقاط الأهداف يمكن أن يجمد من خلال غلوتارالدهيد كيل عبر ربط على منطقة محددة. وهذا يمكن أن يتبعها ELISإجراء للكشف عن أهداف مختلفة. وهكذا، فإن الطريقة المقترحة يجعل ELISA أداة الورقية متعددة للكشف عن أهداف أخرى باستخدام العين المجردة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellulose filter paper, Grade 1 (medium flow filter paper) GE Healthcare Pte Ltd Singapore  1001 110
Cellulose filter paper, Grade 113 (Fast flow filter paper) Sigma-Aldrich, Singapore 1113-320
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich, Singapore G6257 Grade II, 25% in H2O
Surfactant Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore P2287
Bovine serum album  Sigma-Aldrich, Singapore A2153
Skimmed milk powder Louis François  Packed by Kitchen Capers, Singapore
Tris base Promega H5135
Sodium periodate Merck 106597
Na2HPO4 Merck 106585
KH2PO4 Merck 104873
NaCl CALBIOCHEM 567441
NaOH Merck 106462
HCl Merck 100317
phosphate buffer saline (PBS) N/A N/A PBS, containing 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol⁠/⁠L Na2HPO4 and 1.5 mmol/L KH2PO4, is prepared with water and adjusted to pH 7.4 with 0.1 mol/L NaOH or 0.1 mol/L HCl
Acetone Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore 9005-68
Mixture of TMB and hydrogen peroxide solution  1-Step ultra TMB-ELISA solution , Thermo Scientific Pierce 34029 1 L
Rabbit anti-human IgG-FITC TWC/Bio Pte Ltd Singapore sc-2278
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG TWC/Bio Pte Ltd Singapore sc-2030
Affinity purified goat anti-Mouse IgG-Fc coating antibody Bethyl Laboratories, Inc A90-131A
Mouse reference serum Bethyl Laboratories, Inc RS10-101-5 9.5 mg/ml
HRP conjugated goat anti-mouse IgG-Fc detection antibody Bethyl Laboratories, Inc A90-131P
Equipment
Fourier transform infrared spectrophotometer Shimadzu IR Prestige-21  N/A
Fluorescence molecular imager Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore N/A
Oven NUVE FN500 N/A
Turbo mixer VM-2000 MYC LTD N/A
ImageJ RGB, free download N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). J. Virol. Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
  2. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M. Simple telemedicine for developing regions: camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis. Anal. Chem. 80 (10), 3699-3707 (2008).
  3. Lode, P. V. Point-of-care immunotesting: approaching the analytical performance of central laboratory methods. Clin. Biochem. 38 (7), 591-606 (2005).
  4. Posthuma-Trumpie, G. A., Amerongen, A. V., Korf, J., Berkel, W. J. V. Perspectives for on-site monitoring of progesterone. Trends Biotechnol. 27 (11), 652-660 (2009).
  5. Lim, D. V., Simpson, J. M., Kearns, E. A., Kramer, M. F. Current and developing technologies for monitoring agents of bioterrorism and biowarfare. Clin. Microbiol. Rev. 18 (4), 583-607 (2005).
  6. Li, X., Tian, J., Shen, W. Progress in patterned paper sizing for fabrication of paperbased microfluidic sensors. Cellulose. 17 (3), 649-659 (2010).
  7. Nie, Z., et al. Electrochemical sensing in paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 10, 477-483 (2010).
  8. Delaney, J. L., Hogan, C. F., Tian, J., Shen, W. Electrogenerated chemiluminescence detection in paper-based microfluidic sensors. Anal. Chem. 83 (4), 1300-1306 (2011).
  9. Oh, Y. K., Joung, H. A., Kim, S., Kim, M. G. Vertical flow immunoassay (VFA) biosensor for a rapid one-step immunoassay. Lab Chip. 13 (5), 768-772 (2013).
  10. Cheng, C. M., et al. Paper-based ELISA. Angew. Chem. 122 (28), 4881-4884 (2010).
  11. Jarujamrus, P., Tian, J., Li, X., Siripinyanond, A., Shiowatana, J., Shen, W. Mechanisms of red blood cells agglutination in antibody-treated paper. Analyst. 137 (9), 2205-2210 (2012).
  12. Credou, J., Volland, H., Dano, J., Berthelot, T. A one-step and biocompatible cellulose functionalization for covalent antibody immobilization on immunoassay membranes. J. Mat. Chem. B. 1, 3277-3286 (2013).
  13. Kong, F., Hu, Y. F. Biomolecule immobilization techniques for bioactive paper fabrication. Anal. Bioanal. Chem. 403, 7-13 (2012).
  14. Orelma, H., Teerinen, T., Johansson, L. S., Holappa, S., Laine, J. CMC-modified cellulose biointerface for antibody conjugation. Biomacromolecules. 13, 1051-1058 (2013).
  15. Yu, A., et al. Biofunctional paper via covalent modification of cellulose. Langmuir. 28 (30), 11265-11273 (2012).
  16. Stollner, D., Scheller, F. W., Warsinke, A. Activation of cellulose membranes with 1,1′-carbonyldiimidazole or 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate as a basis for the development of immunosensors. Anal Biochem. 304 (2), 157-165 (2002).
  17. Bora, U., Sharma, P., Kannan, K., Nahar, P. Photoreactive cellulose membrane - a novel matrix for covalent immobilization of biomolecules. J. Biotechnol. 126 (2), 220-229 (2006).
  18. Sharma, P., Basir, S. F., Nahar, P. Photoimmobilization of unmodified carbohydrates on activated surface. J Colloid Interface Sci. 342 (1), 202-204 (2010).
  19. Brumer, H., Zhou, Q., Baumann, M. J., Carlsson, K., Teeri, T. T. Activation of crystalline cellulose surfaces through the chemoenzymatic modification of xyloglucan. J. Am. Chem. Soc. 126 (18), 5715-5721 (2004).
  20. Araujo, A. C., Song, Y., Lundeberg, J., Stahl, P. L., Brumer, H. Activated paper surfaces for the rapid hybridization of DNA through capillary transport. Anal Chem. 84 (7), 3311-3317 (2012).
  21. Xu, C., Spadiut, O., Araujo, A. C., Nakhai, A., Brumer, H. Chemo-enzymatic Assembly of Clickable Cellulose Surfaces via Multivalent Polysaccharides. ChemSusChem. 5 (4), 661-665 (2012).
  22. Filpponen, I., et al. Generic method for modular surface modification of cellulosic materials in aqueous medium by sequential "click" reaction and adsorption. Biomacromolecules. 13 (3), 736-742 (2012).
  23. Feese, E., Sadeghifar, H., Gracz, H. S., Argyropoulos, D. S., Ghiladi, R. A. Photobactericidal porphyrin-cellulose nanocrystals: synthesis, characterization, and antimicrobial properties. Biomacromolecules. 12 (10), 3528-3539 (2011).
  24. Zang, D., Ge, L., Yan, M., Song, X., Yu, J. Electrochemical immunoassay on a 3D microfluidic paper-based device. Chem. Commun. 48 (39), 4683-4685 (2012).
  25. Ge, L., Yan, J. X., Song, X. R., Yan, M., Ge, S. J., Yu, J. H. Three-dimensional paper-based electrochemiluminescence immunodevice for multiplexed measurement of biomarkers and point-of-care testing. Biomaterials. 33 (4), 1024-1031 (2012).
  26. Wang, S., et al. Paper-based chemiluminescence ELISA: lab-on-paper based on chitosan modified paper device and wax-screen-printing. Biosens. Bioelectron. 31 (1), 212-218 (2012).
  27. Koev, S. T., et al. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
  28. Wang, S. M., et al. Simple and covalent fabrication of a paper device and its application in sensitive chemiluminescence immunoassay. Analyst. 137 (16), 3821-3827 (2012).
  29. Sadira, S., Prabhakaranc, M. P., Wicaksonob, D. H. B., Ramakrishna, S. Fiber based enzyme-linked immunosorbent assay for C-reactive protein. Sensor Actuat B-Chem. 205, 50-60 (2014).
  30. Koga, H., Kitaoka, T., Isogai, A. In situ modification of cellulose paper with amino groups for catalytic applications. J. Mater. Chem. 21, 9356-9361 (2011).
  31. Klemm, D., Heublein, B., Fink, H. P., Bohn, A. Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material. Angew. Chem., Int. Ed. 44 (22), 3358-3393 (2005).
  32. Fernandes, S. C. M., et al. Bioinspired antimicrobial and biocompatible bacterial cellulose membranes obtained by surface functionalization with aminoalkyl groups. ACS Appl. Mater. Interfaces. 5 (8), 3290-3297 (2013).
  33. Pharos FX plus molecular imager instructions, Catalog Number 170-9460. , (2005).
  34. Tee, Y. B., Talib, R. A., Abdan, K., Chin, N. L., Basha, R. K., Yunos, K. F. M. Aminosilane-grafted cellulose. BioResourses. 8 (3), 4468-4483 (2013).
  35. Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nat Protoc. 2, 1152-1165 (2007).
  36. Guidi, A., Laricchia-Robbio, L., Gianfaldoni, D., Revoltella, R., Del Bono, G. Comparison of a conventional immunoassay (ELISA) with a surface plasmon resonance-based biosensor for IGF-1 detection in cows' milk. Biosens Bioelectron. 16, 971-977 (2001).
  37. Ahmed, S., Bui, M. N., Abbas, A. Paper-based chemical and biological sensors: Engineering aspects. Biosens Bioelectron. 77, 249-263 (2016).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 116، وأقراص ورقة السليلوز، تقنية سيلاني، التساهمية الشلل، غلوتارالدهيد، كشف مفتش، المناعي
التساهمية ملزم من الأجسام المضادة لالسليلوز أقراص الورق وتطبيقاتها في العين المجردة اللونية يمونواسايس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peng, Y., Gelder, V. V., Amaladoss,… More

Peng, Y., Gelder, V. V., Amaladoss, A., Patel, K. H. Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays. J. Vis. Exp. (116), e54111, doi:10.3791/54111 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter