Abstract
Denne rapport præsenterer to metoder til covalent immobilisering af capture-antistoffer på cellulose filter papirkvalitet No. 1 (medium-flow filter papir) diske og kvalitet No. 113 (hurtig-flow filter papir) diske. Disse cellulosepapir skiver blev podet med aminfunktionelle grupper via en silan kobling teknik før antistofferne blev immobiliseret på dem. Periodat oxidation og glutaraldehyd krydsbindingsfremgangsmåder blev anvendt til at pode indfangningsantistoffer på cellulose papirskiver. For at sikre den maksimale bindingskapacitet af indfangningsantistoffer til deres mål efter immobilisering, blev virkningerne af forskellige koncentrationer af natriumperiodat, glutaraldehyd, og indfange antistoffer på overfladen af papirskiverne undersøgt. De antistoffer, der blev overtrukket på amin-funktionaliseret cellulose papirskiver gennem et glutaraldehyd-tværbindingsmiddel udviste forøget bindingsaktivitet til målet sammenlignet med periodat oxidation metode. IgG (i muse referenceserum) blev anvendt som reference mål i denne undersøgelse for at afprøve anvendelsen af kovalent immobiliserede antistoffer gennem glutaraldehyd. En ny papirbaseret, enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA) blev med succes udviklet og valideret til påvisning af IgG. Denne metode kræver ikke udstyr, og den kan detektere 100 ng / ml IgG. Den hurtige-flow filter papir var mere følsom end medium-flow filter papir. Inkubationstiden for denne analyse var kort og krævede små prøvevolumener. Denne blotte øjne, kan kolorimetrisk immunassay udvides til at opdage andre mål, der identificeres med konventionel ELISA.
Introduction
Det point-of-care test (POCT) diagnostisk undersøgelse er vigtig for udviklingen af nye strategier for lægemidler, personlig medicin, og hjemmepleje 1. Cellulose- papirer er almindeligt anvendt som platforme i immunoassays, som de er billige, tilgængelig og velkendt for brugere 2. Desuden porøse struktur cellulosepapir besidder kraft til væskestrøm uden yderligere anslagsenergi. Registreringer af papirbaserede bioanalyse kan findes så tidligt som det 20. århundrede, hvor papirchromatografering først blev opfundet i 1952. Den mest udbredte eksempel er immunkromatografiske tests 3, såsom graviditet og diabetes teststrimler. Disse tests giver relativt hurtige assay tider og billig analyse 4. På grund af deres enkelhed, har disse konventionelle papirstrimmel tests er ofte blevet brugt i POCT diagnostik 5.
Detektionsmetoder herunder kolorimetriske 6, elektrokemiske 7, og elektrokemiluminescens 8 fremgangsmåder er blevet rapporteret til at måle mål i biologiske prøver. Ud over disse kvantitative metoder, en pålidelig metode til immobilisering af antistoffer på cellulosepapir er også vigtig for udviklingen af diagnostiske indretninger. Ikke-specifik adsorption er den vigtigste strategi til modifikation af antistoffer på overfladen af papirbaserede indretninger 9, 10 for at sikre maksimal bindingskapacitet til deres mål efter immobilisering. Men en tidligere undersøgelse viste, at antistoffer, der er adsorberet på cellulosepapir kan desorbere fra fibrene 11 med 40%. Således kan direkte adsorption af antistoffer på cellulose ikke give reproducerbare resultater 12. Covalent immobilisering af antistoffer, der er podet på papiroverflader er en alternativ metode til udvikling af effektive papirbaserede bioassays 13. Der er rapporteret forskellige fremgangsmåder til modifikation af cellulose 14, 15 12. Carbonyldiimidazol kombineret med 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluorborat 16; 1-fluor-2-nitro-4-azidobenzene gennem en UV-aktivering strategi 17, 18; en chemoenzymatic strategi baseret på xyloglucan modifikation 19; en 1,4-phenylenediisothiocyanate linking middel 20; heteropolysaccharid oxidation 21 click-kemi-22; og kationiske porphyriner 23 er blevet anvendt til kovalent immobilisering af biomolekyler på cellulosepapir. Chitosan modificeret papir har været anvendt til at udvikle papirbaseret immunodevices 24-26, da det er rigelige og biokompatibel 27. Chitosan er kationisk og klæber kraftigt til anionisk cellulose 27. Capture-antistoffer er immobiliseret på papiret gennem chitosan belægning og glutaraldehyd tværbinding. Periodatoxidation oxidation er en anden metode til podning af CAPTUre antistoffer på cellulose papir 28. Ved denne fremgangsmåde er natriumperiodat spottet på papiret for at omdanne 1,2-dihydroxyl (glycol) grupper i cellulose direkte til aldehydgrupper. Aldehydgrupperne anvendes derefter til dannelse af kovalente bindinger mellem polysaccharider og antistoffer 28. Selvom fremstillingen er enkel, er det vanskeligt fuldstændigt at udvaske natriumperiodat. Uvaskede natriumperiodat kan forårsage yderligere oxidation af antistofferne, der er immobiliseret på cellulosepapir, som påvirker aktiviteten og stabiliteten af antistofferne N -. (3-dimethylaminopropyl) - N -ethylcarbodiimide hydrochlorid og N-hydroxysuccinimid tværbindere anvendes også til covalent immobilisere antistoffer på elektrospundet poly-L-mælkesyre og celluloseacetat nanofibre for udvikling af nanofiber assays 29.
I denne undersøgelse blev en silan kobling teknik, der anvendes til at pode aminfunktionelle grupper på cellulose papir diske. Denne teknik medvirker til at bevare den oprindelige porestørrelse, vægevirkning, og filtreringshastigheden af cellulose filtrerpapir, giver maksimale lodrette gennemstrømningssystemer i immunoassays. Den silan Koblingen teknik har været meget anvendt i biosensorer til funktionalisere substratoverflader med sekundære aminogrupper, efterfulgt af yderligere modifikation under anvendelse af biomolekyler. Podning af amingrupper på matrixen overflade omfatter en kondensationsreaktion mellem -OH-grupper i de organofunktionelle silan midler og matrix substrat 30. De cellulosepapir skiver blev funktionaliseret med amingrupper efter silan kobling gennem 3-aminopropyltrimethoxysilan (APS) 31. Dette blev efterfulgt af covalent immobilisering capture-antistoffer under anvendelse af to forskellige metoder. Den første metode involverede binding af periodationer oxiderede indfangningsantistoffer til aminen funktionaliseret cellulose papirskiver. Den anden metode, der anvendes glutaraldehyd som tværbindingsmiddel til at fastgøre capture antibodies til amingruppen-funktionaliserede cellulose papir diske. Tilstedeværelsen af capture-antistoffer blev bekræftet ved kanin-anti-humant IgG-fluoresceinisothiocyanat (FITC), ved anvendelse af en fluorescens molekylær imager. Bindingsaktiviteten af kanin-anti-humant IgG-FITC til gede anti-kanin IgG blev også vurderet ved peroxidasesubstrat. Virkningerne af forskellige koncentrationer af natriumperiodat, glutaraldehyd, og indfange antistoffer blev undersøgt. Anvendelsen test af det immobiliserede indfangende antistof blev succesfuldt udført gennem påvisning af IgG serum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Podning Amine Funktionelle grupper på cellulose papir Discs
- Forbered et stykke kvadratisk papir med en dimension på 1 cm x 1 cm og 100 papirskiver fremstillet fra grad No. 1 cellulosepapir med en diameter på 6,0 mm (medium-flow filterpapir) med en hulning.
- At udlede -NH2-grupper på papirskiverne, bland 1 ml APS og 10 ml acetone i en 50 ml glasflaske i stinkskab. Tilføj papirskiver til frisk fremstillet APS reagensblanding, og der inkuberes i 5 timer med orbital omrøring (200 rpm) ved stuetemperatur 32.
Forsigtig: Håndter APS og acetone i stinkskab. - Dekanteres overskydende opløsning fra 50 ml glasflaske i en organisk affaldsbeholder.
- Der tilsættes 10 ml acetone til glasflaske, bland godt og dekanteres helt at fjerne eventuelle ureagerede APS og andre urenheder. Gentag dette trin to gange.
- Spred papir diske på køkkenrulle og plads i en 110 ° C varm ovn i 3 timer. Tilladpapirskiver til afkøling. Gemmer diskene i et 50 ml centrifugerør ved stuetemperatur.
- Brug Fourier transform infrarød spektroskopi (FTIR) til at kontrollere podning af amingrupper på cellulose kvadratisk papir, som beskrevet nedenfor (figur 3A).
- Tænd for computeren, og åbn FTIR spektroskopi instrumentet.
- Åbn softwaren til FTIR spektroskopi.
- Gå til "Måling → Initialiser". De rektangler for 'BS: KBr',: vil 'Lampe Infrarød "og" Laser "bliver grønne, når initialiseringen er færdig.
- Vælg "Data" under rektangler, og vælg '% Transmittans', 'Happ-Genzel', '45', '4.0', og 'Min: 400, Max: 4000' for 'Measurement Mode', 'apodiseringen', ' Ingen. af Scanner "," Resolution ", og" Range (cm-1) «.
- Klik på 'Mål'.
- Vælg "Data filen 'for baggrundsdata. Skrivened kommentarerne.
- Klik på 'BKG' for at få den baseline for baggrunden.
- Fastgør firkantede papir på filmholderen prøven.
- Vælg "Data filen 'for eksempeldataene. Skriv ned kommentarerne.
- Klik på 'Sample' for at få spektre for prøven.
- Luk FTIR spektroskopi ansøgning og slukke for computeren.
- Gentag ovenstående trin (trin 1.1 til 1.6) for at forberede amin-funktionaliserede kvalitet No. 113 cellulose firkantet papir og diske (hurtig-flow filter papir), og få FTIR spektre for den lønklasse No. 113 firkantet papir (figur 3B).
2. covalent immobilisering af antistoffer på Amine-funktionaliserede cellulosepapir Discs
Figur 1. Kovalent immobilisering af antistoffer ved to forskellige metoder.A. Antistoffer immobiliseret på amin-funktionaliseret cellulosepapir diske gennem periodat oxidation. De kulhydrat rester blev oxideret af natriumperiodat til frembringelse aldehydgrupper funktionelle grupper. Derefter blev de oxiderede antistoffer fyldt på amin-funktionaliserede cellulosepapir diske. B. Antistofferne blev derefter immobiliseret på amin-funktionaliseret cellulose papirskiver gennem glutaraldehyd. Amin-funktionaliseret cellulosepapir skiver blev nedsænket i 0,05% glutaraldehydopløsning for at indføre aldehydgrupper til papirskiverne. Efter vask blev antistofferne læsset på aldehyd funktionaliserede papir diske. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Immobilisere antistoffer på amin-funktionaliseret cellulosepapir diske gennem periodat oxidation (figur 1A).
- Bland 1 pi 2,5 mM natrium periodate med 2 pi 0,1 mg / ml kanin-anti-humant IgG-FITC og 7 pi 100 mM pH 5,5 acetatpuffer i et 1,5 ml rør, og inkuber blandingen i mørke i 30 min.
BEMÆRK: Følg denne volumenforhold at forberede mere oxiderede antistoffer, hvis nødvendigt. Ændre volumenforholdet for at optimere koncentrationen af natriumperiodat og kanin-anti-humant IgG-FITC. - Fortynd det ovennævnte antistofopløsning med 30 pi af 50 mM phosphatbuffer saltvand (PBS; pH 7,4) til et slutvolumen på 40 pi.
- Forbered tre amin-funktionaliserede medium-flow filter papir diske og tre amin-funktionaliserede hurtigt flow papir diske (som beskrevet i afsnit 1).
- Belastning 5 pi af natriumperiodat oxiderede kanin-anti-humant IgG-FITC onto hvert medium flow filterpapirskive og 8 pi på hver fast-flow filter papirskive. Opbevar disse papirskiverne i mørke i en time ved stuetemperatur.
- Vask hver af papiret disk med 0,2 ml vask buffER (50 mM Tris buffer med 0,15 M NaCl og 0,05% overfladeaktivt middel, pH 7,4). Gentag vask tre gange.
- Fotografere fluorescens billeder gennem et fluorescens molekylær imager at identificere tilstedeværelsen af antistoffer på hver cellulosepapir skive 32. Brug tomme papirskiver (behandlet med den samme koncentration af antistoffer i fravær af natriumperiodat) som en kontrol (figur S1 til figur S3).
BEMÆRK: eksperimentel optimering, ændre koncentrationen af et parameter, der skal optimeres og løse koncentrationerne af alle andre parametre. En høj fluorescensintensitet øger mængden af capture-antistoffer, der er immobiliseret på cellulose papirskiver.
- Bland 1 pi 2,5 mM natrium periodate med 2 pi 0,1 mg / ml kanin-anti-humant IgG-FITC og 7 pi 100 mM pH 5,5 acetatpuffer i et 1,5 ml rør, og inkuber blandingen i mørke i 30 min.
- Immobilisere antistoffer på amin funktionaliserede cellulose papirskiver gennem glutaraldehyd (figur 1B).
- Tilsæt tre APS behandlet medium-flow filter papir diske og de tre fast-flow filter papir diske (described i afsnit 1) til 2 ml 50 mM PBS (pH 7,4), der indeholder 0,05% glutaraldehyd i 1 time, med orbital omrøring ved stuetemperatur.
Forsigtig: Håndter glutaraldehyd i stinkskab. - Placer tre diske hver i to 1,5 ml centrifugerør. Der tilsættes 1 ml deioniseret (DI) vand til hvert rør og ryst rørene i 10 sek. Fjerne vandet ved sugning med en pipette. Gentag to gange for at fjerne eventuelt uomsat glutaraldehyd.
- Belastning 5 pi 25 ug / ml kanin-anti-humant IgG-FITC (opfangningsantistof) på hver aldehyd-funktionaliserede medium-flow filter papirskive, og tilsæt 8 pi på hver aldehyd-funktionaliserede fast-flow filter papirskive. Der inkuberes i mørke i ca. 20 minutter ved stuetemperatur. Derefter tilsættes 10 pi 50 mM PBS (pH 7,4) til hver papirskive uden at fjerne antistofferne og inkuberes i 40 min for aminen aldehyd reaktionen.
- Vask papirskiverne med 0,2 ml vaskebuffer oven på et stykke køkkenrulle. Gentagvask to gange.
- Fotografere fluorescens billeder gennem et fluorescens-molekylær imager at kontrollere for tilstedeværelsen af antistoffer på hver cellulose papir skive 33. Brug tomme papirskiver som kontrol.
BEMÆRK: I figur 4, '0' står for det blanke papir disk, der blev behandlet med den samme koncentration af FITC-antistof i fravær af glutaraldehyd; i figur 5A, blev de tomme papirskiverne behandlet med glutaraldehyd, men ingen FITC-antistoffer blev fyldt på papirskiverne.
- Tilsæt tre APS behandlet medium-flow filter papir diske og de tre fast-flow filter papir diske (described i afsnit 1) til 2 ml 50 mM PBS (pH 7,4), der indeholder 0,05% glutaraldehyd i 1 time, med orbital omrøring ved stuetemperatur.
- Tør papir skiver (fra afsnit 2.1 og 2.2) ved 37 ° C i 10 min.
- Blokere papirskiverne med 15 pi blokeringspuffer (10% skummetmælkspulver i 50 mM Tris-buffer, pH 7,4, med 0,15 M NaCl) i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Belastning 5 pi og 8 pi peroxidase-konjugeret gede-anti-kanin IgG i PBS (1: 10.000) på mellemlang flow og hurtigt flow filter papirskiver hhv. inkuber i30 minutter i mørke ved stuetemperatur.
- Vask papirskiverne med 0,2 ml vaskebuffer oven på et stykke køkkenrulle. Gentag vask tre gange.
BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at fjerne vaskebufferen da resultaterne ikke er påvirket af bufferen. - Læg en 10 pi blanding af 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) og hydrogenperoxid løsning på hver skive.
- Tag billeder af papiret skiver med et digitalt kamera eller smartphone efter 5 min inkubation.
BEMÆRK: I figur 5B, '0' står for papirskiverne, der blev behandlet med glutaraldehyd, efterfulgt af lastning antistof-HRP (peberrodsperoxidase) -konjugat i fravær af FITC-antistof.
3. Papir-baserede ELISA for IgG Detection
Figur 2. Skematisk afbildning af papirbaserede ELISA foR IgG detection. Capture antistoffer blev covalent immobiliseret på aldehydfunktionaliserede cellulose papirskiver gennem glutaraldehyd. De cellulosepapir skiver blev blokeret med blokeringsbuffer. Target IgG blev derefter tilsat til skiverne, efterfulgt af fyldning af HRP-konjugerede signal antistoffer. Endelig blev TMB og hydrogenperoxid blanding løsning læsset på hver papir disk til farven udlæsning. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Der tilsættes 5 ml 0,05% glutaraldehydopløsning (fremstillet i 50 mM PBS-buffer, pH 7,4) til en 20 ml glasflaske. Fordybe 15 amin-funktionaliseret medium-flow filter papirskiver i denne opløsning og holde i 1 time under omrystning ved stuetemperatur.
- Samtidig at gentage Trin 3.1 forberede yderligere 15 aldehyd funktionaliserede hurtigt flow filter papir diske.
Forsigtig: Håndter glutaraldehyd i røghætte.
- Samtidig at gentage Trin 3.1 forberede yderligere 15 aldehyd funktionaliserede hurtigt flow filter papir diske.
- Til fjernelse af uomsat glutaraldehyd fra papirskiverne, placere 15-medium-flow filter paper disks i en 15 ml centrifugerør, og de 15 fast-flow filter papirskiver i en anden 15 ml centrifugerør. Der tilsættes 5 ml DI-vand til hvert rør og ryst rørene i 10 sek. Fjerne vandet ved sugning med en pipette. Gentag to gange for at fjerne eventuelt uomsat glutaraldehyd.
- Tør papirskiverne i en 37 ° C varm ovn.
- Tilsæt 5 pi og 8 pi 0,025 mg / ml muse-IgG-Fc-fragment-antistoffer til hvert af de mellemstore flow og hurtigt flow filter papirskiver, henholdsvis og der inkuberes i 20 min.
- Tilsæt 10 pi 50 mM PBS (pH 7,4) til hver papirskive uden at fjerne antistofferne og inkuberes i 40 min for aminen aldehyd reaktionen.
- Vask papirskiverne med 0,2 ml vaskebuffer oven på et stykke køkkenrulle. Gentag vask tre gange.
- Tør papirskiverne i en ovn ved 37 ° C.
- Bloker papirskiverne wed 15 pi blokeringspuffer i 10 min ved stuetemperatur.
- Vask hver papirskive med 0,2 ml vaskebuffer oven på et stykke køkkenrulle. Gentag vask tre gange.
- Kør IgG standarder.
- Load 10 pi forskellige IgG-koncentrationer (fx 0, 10, 125, 250, og 500 ng / ml i PBS) på hver disk i tre eksemplarer. Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask papirskiverne med 0,2 ml vaskebuffer oven på et stykke køkkenrulle. Gentag vask tre gange.
- Load 10 pi HRP-konjugeret muse-IgG-Fc-fragment-antistoffer (1: 10.000, 10 mM PBS, pH 7,4) og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask papirskiverne med 0,2 ml vaskebuffer oven på et stykke køkkenrulle. Gentag vask tre gange.
BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at fjerne vaskebufferen da resultaterne ikke påvirkes af tilstedeværelsen af puffer. - Læg en 10 pi blanding af TMB og hydrogenperoxid på hver skive.
- Take billeder af alle papir skiver med et digitalt kamera eller smartphone efter 5 min inkubation.
BEMÆRK: I figur 6A, '0' står for papir diske behandlet med capture antistof immobilisering, og antistoffet-HRP / TMB løsning uden IgG serum. - Analyser intensiteten af hvert papir skive i billedet af Image J.
- Konverter billeder taget i trin 3.15 til ".tif" format.
- Åbn 'Billede J' software.
- Gå til 'File → Open', vælge det billede, til at analysere.
- Vælg den form knappen 'Oval «.
- Gå til 'billede → Type → 32 bit «.
- Gå til 'Rediger → Invert'.
- Gå til 'Analyser → Measure «.
- Kopier og analysere dataene i et regneark.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3. Fourier transform infrarød (FTIR) spektre af ubehandlede og APS-behandlede medium-flow filter kvadratisk papir (A) og fast-flow filter kvadratisk papir (B). A. Spektrene for ubehandlet medium-flow filter square papir var svarende til den i APS behandlet medium-flow filter kvadratisk papir. Stigningen i intensiteter på bånd af 902-1,170 cm-1 og 1,210-1,500 cm -1 for APS-behandlede firkantet papir tilhørte Si-O-cellulose og CH deformationer af SIOC-H-grupper, hhv. Tilvæksten af båndene på 1.650 cm-1 og 2,885 cm-1 hører til bøjning af NH 2 og CH 2 vibrationer fra saltvand propyl-delen hhv. B. De karakteristiske toppe i 972 til 1180 cm-1 range blev tilskrevet Si-O-Si og SO-cellulose obligationer. Toppen ved 1.003 cm-1 var forårsaget af overlapningen af Si-O-Si-binding og CO-strækning af cellulose. Alle de resultater viser, at APS lykkedes podet på cellulose firkantede papirer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tilstedeværelsen af aminfunktionelle grupper på cellulose- firkantede papirer blev bestemt ved FTIR. Figur 3 viser FTIR spektre af ubehandlede, modificeret, medium-flow og hurtigt flow filter firkantede papirer. Der var tre trin involveret i den kemiske modifikation af aminoalkylgrupper, ved hjælp APS på cellulose- overflader. Trin et involverede hydrolyse af APS til tilvejebringelse af silanol derivat af APS. Trin to involverede adsorptionen af den hydrolyserede APS derivatet på cellulosefibrene gennem hydrogenbinding af OH-grupper fra hydrolyzed APS-derivat og cellulosefibrene. Trin tre involverede kondensationen af den adsorberede APS derivat, som førte til podning af APS-derivat på cellulose fiber overflade gennem Si-OC binding og dannelse af Si-O-Si siloxanbroer 34. Som vist i figur 3A, forøgelsen af båndet ved 1.650 cm-1 blev tilskrevet bøjning af NH 2-grupper og en forøgelse af båndet ved 2,885 cm-1 svarende til CH 2 vibrationer af silan propyl-delen. For det oprindelige medium-flow filter firkantet papir, de bånd ved 902-1,170 cm-1 og 1,210-1,500 cm -1 svarede til de vibrationer af COC obligationer glycosidiske broer og CH strækker vibrationer. Efter behandling af den kvadratiske papir med APS, stigningen i intensitet ved disse to båndbredder angiver, at de hører til Si-O-cellulose og CH deformationer af SIOC-H-grupper, henholdsvis. Svarende til mellemstore flow filtrere firkantet papir, spektrene for modificerede fast-flow filter kvadratisk papir også steget i intensitet ved 1.650 cm-1 for -NH2, på grund af den kemiske modifikation med APS (figur 3B). De stærke karakteristiske toppe i 972 til 1180 cm-1 range blev tilskrevet Si-O-Si og SO-cellulose obligationer; den højeste top var på 1.003 cm-1 som følge af overlap af Si-O-Si obligation og CO strækning af cellulose 34. De karakteristiske obligationer i bølgelængdeområdet mellem 1188 og 1510 cm-1 for APS behandlede firkantet papir er forårsaget af de vibrationer af COC obligationer glycosidiske broer og CH strækker vibrationer. De CH 2 strækker vibrationer obligationer blev vist på 2,800-2,980 cm -1 og den højeste tinde blev på 2.932 cm-1 for APS behandlede firkantet papir. Som konklusion kan APS være kovalent podet til No. 1 og No. 113 filter firkantede papirer.
Figur 4. Fluorescens reaktioner på forskellige koncentrationer af glutaraldehyd i immobilisering af IgG-FITC på papirskiverne (fremgangsmåde b) Indstillinger for fluorescens molekylær imager:. Excitation, 488 nm, emission, 530 nm, opløsning, 100 mikrometer A:. Fluorescens respons på 0, 0,001%, 0,005%, 0,01% og 0,050% glutaraldehyd B:. Fluorescens respons på 0, 0,050%, 0,100%, 0,250% og 0,500% glutaraldehyd. Koncentrationen af IgG-FITC på hver skive var 0,01 mg / ml. En stigning i koncentrationen af glutaraldehyd til maksimalt 0,05% resulterede i en øget belastning mængde af IgG-FITC. Koncentrationer af glutaraldehyd over 0,05% faldt lastning mængden af IgG-FITC. Klik her for at se en større version af dennefigur.
Figur 5. Fluorescens respons (A) og kolorimetrisk resultat (B) af forskellige koncentrationer af IgG-FITC på IgG-FITC-immobiliserede medium-flow og hurtigt flow filter papirskiver (fremgangsmåde b) Indstillinger for fluorescens molekylær imager:. Excitation , 488 nm, emission, 530 nm, opløsning, 100 mikrometer. # 1 repræsenterer kvalitet No. 1, medium-flow filter papir disk, og # 113 repræsenterer kvalitet No. 113 fast-flow filtrerpapir disk. APS-modificeret papirskiver blev behandlet med 0,05% glutaraldehyd først. Derefter blev forskellige koncentrationer af IgG-FITC påført på glutaraldehyd modificeret papirskiver. Forøgelse lastning koncentrationen af IgG-FITC forhøjet den immobiliserede IgG-FITC på papirskiverne. Men forøgede koncentrationer af immobiliseret IgG-FITC ikke forbedre bindingskapacitet til antigenet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Den grundlæggende arbejdsgang for covalent immobilisering af antistoffer på amin-funktionaliseret cellulosepapir diske er vist i figur 1. Kanin-anti-humant IgG-FITC blev kovalent immobiliseret på cellulose papirskiver. Fluorescensen fra papirskiverne angivet immobilisering af antistoffer mod papirskiverne, og intensiteten af fluorescens var direkte proportional med koncentrationen af immobiliserede antistoffer. Peroxidasekonjugeret gede-anti-kanin IgG blev derefter anvendt til at bestemme bindende evne af de immobiliserede antistoffer. Sekundære aminogrupper og aldehydgrupper kan reagere med hinanden til dannelse af en Schiff-base, som har været anvendt i bioconjugation 35. De blev også brugt her til kovalent immobilisering af captureantistoffer. I fremgangsmåde A (figur 1A), -NH2 blev introduceret til cellulosepapir diske og -CHO blev afledt af kanin-anti-human IgG-FITC ved oxidation Fc-regionen af antistofferne med natriumperiodat. På samme måde, blev også analyseret virkningerne af forskellige koncentrationer af natriumperiodat og IgG-FITC-antistoffer. Som vist i figur S1 og figur S2, natriumperiodat fra koncentrationer på 0 til 1 mM, og kanin-anti-human IgG-FITC fra 0,016 til 0,16 mg / ml havde lille indvirkning på oxidationen af 0,08 mg / ml kanin-anti-humant IgG FITC. Mængden af antistoffer, som var covalent bundet til papirskiverne steg med stigende koncentration af capture-antistoffer fra 0 til 0,075 mg / ml (Figur S3A).
En svag farveændring blev observeret, når den bindingsevne blev bestemt ved peroxidase assay. Dette kan skyldes, at anvendelsen afoverskydende natriumperiodat, der reagerer med indfangningsantistoffer og forårsager et tab af bindingsaktivitet. Det er sandsynligt, at natriumperiodat ikke helt kan vaskes bort fra papirskiverne. Dette blev bekræftet ved den simple princip, at natriumperiodat løsning giver en gul farve ved blanding med purpald opløsning. Derfor blev periodat oxiderede antistoffer fyldt på papirskiverne og inkuberet i 1 time. Papirskiverne blev vasket tre gange med PBS (indeholdende 0,05% Tween-20), og derefter purpald opløsning blev tilsat til disse diske. Papirskiverne viste en lilla farve øjeblikkeligt, hvilket indikerer tilstedeværelsen af aldehydgrupper fra periodat-oxiderede antistoffer. Denne lilla farve skiftede til gul i løbet af 10 minutter, hvilket bekræftede tilstedeværelsen af natriumperiodat på papirskiverne.
Alternativt blev et glutaraldehyd tværbinding metode (metode B, figur 1 B) anvendes til at forbinde aminen Groups fra APS-behandlede papirskiver og antistoffer. Koncentrationerne af glutaraldehyd (figur 4) og kanin-anti-humant IgG-FITC (figur 5A), som blev læsset på cellulosepapir skiver blev optimeret. Som vist i figur 4, fluorescensintensiteten nåede et maksimum på 0,05% glutaraldehyd, hvilket betyder, at lastningen af kanin-anti-humant IgG-FITC blev mættet på cellulosepapir disken ved denne koncentration; en stigning i koncentrationen af glutaraldehyd til 2,5% viste ikke en stigning i mængden af kanin-anti-humant IgG-FITC på cellulosepapir skiver (fig S4). Fluorescensintensiteten steg også med stigende koncentrationer af kanin-anti-human IgG-FITC, der blev lastet på papirskiverne (figur 5A). En blå farve, der udvikles umiddelbart efter tilsætningen af TMB-blanding substrat og hydrogenperoxidopløsning til papirskiverne, som indeholdt peroxidase konjugerede detektionsantistoffer (figur 5B). Desuden blokerende buffer, der indeholdt 10% skummetmælkspulver blev vist at tilbageholde blokeringselementet effektivitet efter 15 vaske (Figur S5). Metode B blev udvalgt til at afprøve anvendelsen af de immobiliserede antistoffer, som det vist bedre bindingsaktivitet til sit mål. Derfor blev en 0,025 mg / ml koncentration af capture-antistoffer anvendes til IgG detektion.
Figur 6. Kalibreringskurver til bestemmelse af IgG ved papirbaserede ELISA. # 1 repræsenterer kvalitet No. 1, medium-flow filter papirskive, og # 113 betegner kvalitet No. 113 fast-flow filter papirskive. Den øverste panel A præsenterer farve udlæsning til medium-flow (# 1) og hurtigt flow (# 113) cellulose papir skiver med forskellig koncentration af IgG. BundpaneletB viser ELISA resultat for forskellige koncentrationer af IgG. Tredobbelte blev anvendt til at bestemme standardafvigelsen (SD). Klik her for at se en større version af dette tal.
Gede-anti-muse-IgG-Fc-fragment capture-antistof, IgG-serum, og gede-anti-muse-IgG-Fc-fragment-antistof konjugeret HRP blev anvendt til sandwich-assay. Som vist i figur 6 og figur S6, koncentrationen af IgG serum fra 0 til 500 ng / ml havde en lineær sammenhæng med kolorimetrisk intensitet, når hvert trin blev inkuberet i 1 time. I fig S6, farvevariationen med forskellige koncentrationer af IgG var indlysende for 1 times inkubering. Alligevel har resultaterne af 10 minutters inkubation ikke viser en tydelig ændring i farveintensiteten med forskellige koncentrationer af IgG. Således sensitivity af denne papirbaserede ELISA var egnede til at udvikle praktiske point-of-care test.
Figur S1. Fluorescens reaktioner på forskellige koncentrationer af natriumperiodat (fremgangsmåde A). Varierende koncentrationer af natriumperiodat blev blandet med kanin-anti-humant IgG-FITC i en koncentration på 0,016 mg / ml og anvendt til studiet af antistof oxidation aktivitet. Ved at øge koncentrationen af natriumperiodat, lastning mængde IgG-FITC steg og nåede et maksimum ved 0,25 mM. Det blev observeret, at koncentrationer af natriumperiodat, der var højere end dette ikke forøgede mængden af immobiliseret IgG-FITC. Tredobbelte blev anvendt til at bestemme standardafvigelsen (SD). Klik her for at downloade denne fil.
Figur S2. fluorescens responss for forskellige koncentrationer af kanin-anti-humant IgG-FITC (fremgangsmåde A). Koncentrationen af natriumperiodat var 0,25 mM i opløsningen for antistoffet oxidationsaktivitet undersøgelse, og den endelige koncentration af kanin-anti-humant IgG-FITC på hver skive var 0,016 mg / ml. Når koncentrationen af natriumperiodat blev fastsat, koncentrationen af IgG-FITC havde lille indvirkning på oxidationen af IgG-FITC. Tredobbelte blev anvendt til at bestemme standardafvigelsen (SD). Klik her for at downloade denne fil.
Figur S3. Fluorescens respons og kolorimetrisk resultat fra ilægning af forskellige koncentrationer af oxideret kanin-anti-humant IgG-FITC på papiret diske (fremgangsmåde a). For natriumperiodat oxidation, 0,08 mg / ml IgG-FITC og 0,25 mM natriumperiodat blev anvendt. Fortyndingen af peroxidase-konjugeret anti-kanin IgG var1: 50.000. Forøgelse af lastning koncentrationen af IgG-FITC på cellulose papir skiver øget mængden af immobiliseret IgG-FITC, men ikke har en effekt på målet binding. Klik her for at downloade denne fil.
Figur S4. Fluorescens respons på høje koncentrationer af glutaraldehyd i immobilisering af IgG-FITC på cellulosepapir diske (fremgangsmåde b). Koncentrationen af IgG-FITC på hver skive var 0,01 mg / ml. Koncentrationer af glutaraldehyd, der var højere end 0,25% ikke øge mængden af immobiliseret IgG-FITC på cellulose papir diske. Klik her for at downloade denne fil.
Figur S5. Virkning af antal vasketider. A: var. hing tre gange B: vask 15 gange. Capture antistoffer immobiliseret på cellulose firkantet papir stadig havde god bindingskapacitet til deres mål, selvom pladsen papir blev hvirvlet 15 gange. Klik her for at downloade denne fil.
Figur S6. Papirbaserede ELISA resultat for IgG. For koncentrationerne af IgG fra 0 til 500 ng / ml, resultaterne fra en times inkubation er bedre end resultaterne fra 10 minutters inkubation. For høje koncentrationer af IgG, 10 minutter er tilstrækkelig tid til inkubation. Tredobbelte blev anvendt til at bestemme standardafvigelsen (SD). Klik her for at downloade denne fil.
Figur S7. Scanning elektronmikroskopi (SEM) billeder af mellemstore flow filterpapir på forskellige forstørrelser. A: 85X og B: 20.000 x. Felt scanning emission elektronmikroskopi (FE-SEM), der opererer ved 5 kV blev anvendt til at bestemme partikelmorfologien. Cellulosefibrene er tilfældigt tværbundet. Klik her for at downloade denne fil.
Figur S8. SEM billeder af hurtige flow filtrerpapir på forskellige forstørrelser. A: 100X og B: 20.000 x. Felt scanning emission elektronmikroskopi (FE-SEM), der opererer ved 5 kV blev anvendt til at bestemme partikelmorfologien. Cellulosefibrene er tilfældigt tværbundet. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Direkte belægning af affinitetsoprenset gede-anti-muse-IgG-Fc capture-antistof på umodificeret cellulosepapir diske blev udført for at detektere IgG-koncentrationer. Resultaterne indikerede, at yderligere fiksering af indfangningsantistoffer er påkrævet for reproducerbarhed. Silanen teknik blev med held anvendt til at indføre aminfunktionelle grupper til cellulosepapir skiverne 34. Koncentrationen af APS påvirker immobilisering af antistoffer. Derfor blev mængden af APS i acetone også optimeres. 1 ml APS i 10 ml acetone var en optimal koncentration til podning amingruppen til immobilisering af antistoffer via en glutaraldehyd-tværbindingsmiddel. Antistoffer blev podet på cellulosepapir diske ved periodat oxidation og glutaraldehyd krydsbindingsfremgangsmåder. Vores resultater viste, at bindingskapaciteten af immobiliserede antistoffer gennem glutaraldehyd krydsbinding metode var bedre end den periodat oxidation fremgangsmåde til withium-flow og hurtige flow-filter papirskiver. Endvidere capture-antistoffer, som blev immobiliseret på cellulosepapir diske gennem et glutaraldehyd tværbindingsmetode, beholdt deres funktion og blev stabilt immobiliseret selvom papiret blev underkastet den mekaniske belastning på 15 vaske ved hvirvelbehandling. Ti procent af skummetmælkspulver blokerende buffer viste sig at bevare sin blokerende effektivitet efter 15 vaske (Figur S5).
De kovalent immobiliserede antistoffer blev anvendt til at udføre en sandwich-ELISA med påvisning af IgG. IgG ved en koncentration på 100 ng / ml blev påvist med det blotte øje ved hjælp af denne papirskive baseret assay. Koncentrationen af IgG serum fra 0 til 500 ng / ml viste en lineær sammenhæng med kolorimetrisk intensitet, når hvert trin blev inkuberet i en time. Immunassayet testning for denne papirskive baseret ELISA kræves mindre prøve reagens og syntes at være mere effektive end konventionelle immunoassays 36 figur S7 og S8 Figur hhv. Som illustreret i disse figurer er fibrene tilfældigt tværbundet for begge slags filter paper discs 25. Årsagen til denne høje følsomhed kan være tykkelsen af papiret disken. For hurtig-flow filter papir diske tykkelsen var 420 um i forhold til 180 um for mellemstore flow filtrerpapir. Således flere indfangningsantistoffer sandsynligvis ville blive immobiliseret på fast-flow filter papirskiver, hvilket yderligere vil forøge følsomheden af assayet. Samtidig, porestørrelsen for fast-flow filter papirskiver (30 um) var større end den af medium-flow filter papirskiver de (11 & #181 m). Efter papiroverfladen blokering, porestørrelsen i det tidligere var stadig stor nok til at drive væskestrømmen uden ekstra power system. Men hastigheden af flow for bufferen i sidstnævnte var langsommere. Derfor, hurtig-flow filtrerpapir var bedre end medium-flow filterpapir i anvendelsen af immunoassays.
Reproducerbarheden af antistofferne på de immobiliserede filter papirskiverne blev evalueret ved yderligere inkubation af papirskiverne med peroxidase-konjugeret gede-anti-kanin IgG og detektion af den kolorimetriske resultat efter indlæsning af TMB-substrat og hydrogenperoxid blandingsopløsning. Standardafvigelsen var mindre end 10% for dette papir-baseret enhed. Stabiliteten af kanin-anti-humant IgG-FITC på -NH 2 modificeret cellulose papirskiver blev testet i op til to måneder. Papirskiverne, der blev opbevaret ved 4 ° C opretholdt deres bindingsaktivitet til peroxidase-konjugeret gede anti-kanin IgG med et mindre fald i deres binde aktivitet. Men når antistoffet immobiliseret papirskiverne blev opbevaret ved stuetemperatur eller 60 ° C, de mistede deres bindingsaktivitet grundet tørhed og høj temperatur. De tilfangetagne antistoffer kunne have destabiliseret og denatureret under disse betingelser.
Der er nogle kritiske trin i immobiliseringen af indfangningsantistoffer på cellulosepapir diske med glutaraldehyd som tværbindingsmiddel. Trin 1.2 at pode aminogrupper på papiret diske er et afgørende skridt i den vellykkede kovalente immobilisering af capture-antistoffer. Hvis dette trin mislykkes, vil hele immobilisering processen mislykkes. FTIR blev anvendt til at bestemme, om amingrupper med succes blev immobiliseret på papirskiverne (trin 1.6). For det andet, podning af aldehydgrupper på cellulosepapir diske er endnu et kritisk trin (trin 2.2.1 og trin 3.1). Antistofferne blev kovalent immobiliseret på cellulose papirskiverne gennem dannelsen af en Schiff-base. Endelig, Det skridt for at immobilisere capture-antistoffer på filtrerpapiret diske er vigtigt (trin 2.2.3, trin 3.4, og trin 3.5). Amingrupperne fra opsamling antistoffer reagerede med aldehydgrupperne fra cellulose papirskiverne at fastsætte antistofferne på papiret diske. Hvis dette trin mislykkedes, ville fange antistoffer ikke immobilisere på papiret diske og alle de ELISA ansøgning test ville være negativ. Vi kan bruge en fluorescens molekylær imager at bestemme tilstedeværelsen af capture-antistoffer. Peroxidase-konjugeret gede anti-kanin IgG og peroxidase-baserede kolorimetriske reaktioner kan anvendes til at bekræfte bindingskapaciteten af de immobiliserede antistoffer.
Denne protokol kan støde på nogle problemer, såsom en høj baggrund til signalet, intet signal eller et svagt signal, og en ujævn farve udlæsning. De mulige årsager til disse problemer og metoder til fejlfinding til at overvinde disse problemer er diskuteret nedenfor. signaler høj baggrund opstår normalt due til en kort spærretid. Dette kan løses ved at øge blokerende inkubationstid, vask papirskiverne grundigt, og undgå tilsætning af overskud af påvisning antistofkonjugat enzym for at fjerne høje baggrundssignaler. De mulige årsager omfatter et fravær af målantigen over blokering, utilstrækkelig inkubationstid, og et ikke-funktionelt detektionsantistof enzymkonjugat. For at overvinde disse problemer, skal målantigener tilføjes og inkuberes i et passende tidsrum under anvendelse af en ny antistofkonjugat og lagring som foreslået af producenten. Det er tilrådeligt at inkludere en positiv kontrol til påvisning. Ujævne farve readouts skyldes stabling af papir diske under podningsprocessen. For at undgå dette problem, skal papirskiverne adskilles under APS podning proces, og antigenet og påvisning antistofkonjugat enzym skal spredes ensartet på papiret disken ved hvert trin.
Selvom den papirbaserede assay er en simpelog omkostningseffektiv metode, der er begrænsninger. Orienteringen af antistoffer på substratoverfladen er kritisk for udførelsen af immunoassay, som glutaraldehyd tværbindingsmiddel reagerer med amingrupper fra Fab-region og Fc-området af indfangningsantistoffer. Således har de immobiliserede antistoffer ikke forekommer i en meget orienteret måde. Da der er mere amingrupper fra Fab-region end fra Fc-regionen af IgG-antistoffer, bindingsaktiviteten af de immobiliserede antistoffer stadig er høj nok til deres anvendelse.
Forskellige overfladefunktionalisering metoder til cellulose papir blev sammenfattet i en nylig rapport 37. Reagenser, såsom divinylsulfon; 1,4-phenylenediisothiocyanate; 4-azido-benzenediazonium; epichlorhydrin; 4-azido-a-fluor-2-nitrocyclohexane; og 4-mercapto-benzenediazonium, kunne anvendes til kovalent immobilisering af biomolekyler på cellulosepapir. Adsorption og indeslutning blev også anvendtat coate cellulosepapir med biomolekyler. Sammenlignet med de andre metoder, kombinationen af silanen teknik og glutaraldehyd tværbindingsmiddel til kovalent immobilisering af antistoffer på cellulosepapir er en simpel metode. Endvidere kan denne kombination har ringe effekt på den termiske og mekaniske ydeevne af cellulosepapir, hvilket tillader den maksimale lodrette gennemstrømning i immunoassays. Denne strategi kan udvides til at immobilisere andre biomolekyler på cellulosepapir.
Den metode demonstreret her potentielt kunne udvides til påvisning af enhver analyt, så længe direkte antistoffer mod det er til rådighed. Denne metode kan også anvendes til at udvikle multipleks detektering. For eksempel på en kvadratisk papir, kan forskellige områder skelnes for forskellige mål. De capture antistoffer til målene kan immobiliseres gennem en glutaraldehyd krydsbinding agent på deres specifikke område. Dette kan efterfølges af de ELISEn procedure til påvisning forskellige mål. Således er den foreslåede metode gør den papirbaserede ELISA et alsidigt værktøj til påvisning af andre mål med anvendelse det blotte øje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellulose filter paper, Grade 1 (medium flow filter paper) | GE Healthcare Pte Ltd Singapore | 1001 110 | |
| Cellulose filter paper, Grade 113 (Fast flow filter paper) | Sigma-Aldrich, Singapore | 1113-320 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Singapore | G6257 | Grade II, 25% in H2O |
| Surfactant | Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore | P2287 | |
| Bovine serum album | Sigma-Aldrich, Singapore | A2153 | |
| Skimmed milk powder | Louis François | Packed by Kitchen Capers, Singapore | |
| Tris base | Promega | H5135 | |
| Sodium periodate | Merck | 106597 | |
| Na2HPO4 | Merck | 106585 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| NaCl | CALBIOCHEM | 567441 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| HCl | Merck | 100317 | |
| phosphate buffer saline (PBS) | N/A | N/A | PBS, containing 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol/L Na2HPO4 and 1.5 mmol/L KH2PO4, is prepared with water and adjusted to pH 7.4 with 0.1 mol/L NaOH or 0.1 mol/L HCl |
| Acetone | Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore | 9005-68 | |
| Mixture of TMB and hydrogen peroxide solution | 1-Step ultra TMB-ELISA solution , Thermo Scientific Pierce | 34029 | 1 L |
| Rabbit anti-human IgG-FITC | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2278 | |
| Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2030 | |
| Affinity purified goat anti-Mouse IgG-Fc coating antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131A | |
| Mouse reference serum | Bethyl Laboratories, Inc | RS10-101-5 | 9.5 mg/ml |
| HRP conjugated goat anti-mouse IgG-Fc detection antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131P | |
| Equipment | |||
| Fourier transform infrared spectrophotometer | Shimadzu IR Prestige-21 | N/A | |
| Fluorescence molecular imager | Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore | N/A | |
| Oven | NUVE FN500 | N/A | |
| Turbo mixer VM-2000 | MYC LTD | N/A | |
| ImageJ | RGB, free download | N/A |
References
- Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). J. Virol. Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M. Simple telemedicine for developing regions: camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis. Anal. Chem. 80 (10), 3699-3707 (2008).
- Lode, P. V. Point-of-care immunotesting: approaching the analytical performance of central laboratory methods. Clin. Biochem. 38 (7), 591-606 (2005).
- Posthuma-Trumpie, G. A., Amerongen, A. V., Korf, J., Berkel, W. J. V. Perspectives for on-site monitoring of progesterone. Trends Biotechnol. 27 (11), 652-660 (2009).
- Lim, D. V., Simpson, J. M., Kearns, E. A., Kramer, M. F. Current and developing technologies for monitoring agents of bioterrorism and biowarfare. Clin. Microbiol. Rev. 18 (4), 583-607 (2005).
- Li, X., Tian, J., Shen, W. Progress in patterned paper sizing for fabrication of paperbased microfluidic sensors. Cellulose. 17 (3), 649-659 (2010).
- Nie, Z., et al. Electrochemical sensing in paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 10, 477-483 (2010).
- Delaney, J. L., Hogan, C. F., Tian, J., Shen, W. Electrogenerated chemiluminescence detection in paper-based microfluidic sensors. Anal. Chem. 83 (4), 1300-1306 (2011).
- Oh, Y. K., Joung, H. A., Kim, S., Kim, M. G. Vertical flow immunoassay (VFA) biosensor for a rapid one-step immunoassay. Lab Chip. 13 (5), 768-772 (2013).
- Cheng, C. M., et al.
- Jarujamrus, P., Tian, J., Li, X., Siripinyanond, A., Shiowatana, J., Shen, W. Mechanisms of red blood cells agglutination in antibody-treated paper. Analyst. 137 (9), 2205-2210 (2012).
- Credou, J., Volland, H., Dano, J., Berthelot, T. A one-step and biocompatible cellulose functionalization for covalent antibody immobilization on immunoassay membranes. J. Mat. Chem. B. 1, 3277-3286 (2013).
- Kong, F., Hu, Y. F. Biomolecule immobilization techniques for bioactive paper fabrication. Anal. Bioanal. Chem. 403, 7-13 (2012).
- Orelma, H., Teerinen, T., Johansson, L. S., Holappa, S., Laine, J. CMC-modified cellulose biointerface for antibody conjugation. Biomacromolecules. 13, 1051-1058 (2013).
- Yu, A., et al. Biofunctional paper via covalent modification of cellulose. Langmuir. 28 (30), 11265-11273 (2012).
- Stollner, D., Scheller, F. W., Warsinke, A. Activation of cellulose membranes with 1,1′-carbonyldiimidazole or 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate as a basis for the development of immunosensors. Anal Biochem. 304 (2), 157-165 (2002).
- Bora, U., Sharma, P., Kannan, K., Nahar, P. Photoreactive cellulose membrane - a novel matrix for covalent immobilization of biomolecules. J. Biotechnol. 126 (2), 220-229 (2006).
- Sharma, P., Basir, S. F., Nahar, P. Photoimmobilization of unmodified carbohydrates on activated surface. J Colloid Interface Sci. 342 (1), 202-204 (2010).
- Brumer, H., Zhou, Q., Baumann, M. J., Carlsson, K., Teeri, T. T. Activation of crystalline cellulose surfaces through the chemoenzymatic modification of xyloglucan. J. Am. Chem. Soc. 126 (18), 5715-5721 (2004).
- Araujo, A. C., Song, Y., Lundeberg, J., Stahl, P. L., Brumer, H. Activated paper surfaces for the rapid hybridization of DNA through capillary transport. Anal Chem. 84 (7), 3311-3317 (2012).
- Xu, C., Spadiut, O., Araujo, A. C., Nakhai, A., Brumer, H. Chemo-enzymatic Assembly of Clickable Cellulose Surfaces via Multivalent Polysaccharides. ChemSusChem. 5 (4), 661-665 (2012).
- Filpponen, I., et al. Generic method for modular surface modification of cellulosic materials in aqueous medium by sequential "click" reaction and adsorption. Biomacromolecules. 13 (3), 736-742 (2012).
- Feese, E., Sadeghifar, H., Gracz, H. S., Argyropoulos, D. S., Ghiladi, R. A. Photobactericidal porphyrin-cellulose nanocrystals: synthesis, characterization, and antimicrobial properties. Biomacromolecules. 12 (10), 3528-3539 (2011).
- Zang, D., Ge, L., Yan, M., Song, X., Yu, J. Electrochemical immunoassay on a 3D microfluidic paper-based device. Chem. Commun. 48 (39), 4683-4685 (2012).
- Ge, L., Yan, J. X., Song, X. R., Yan, M., Ge, S. J., Yu, J. H. Three-dimensional paper-based electrochemiluminescence immunodevice for multiplexed measurement of biomarkers and point-of-care testing. Biomaterials. 33 (4), 1024-1031 (2012).
- Wang, S., et al. Paper-based chemiluminescence ELISA: lab-on-paper based on chitosan modified paper device and wax-screen-printing. Biosens. Bioelectron. 31 (1), 212-218 (2012).
- Koev, S. T., et al. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
- Wang, S. M., et al. Simple and covalent fabrication of a paper device and its application in sensitive chemiluminescence immunoassay. Analyst. 137 (16), 3821-3827 (2012).
- Sadira, S., Prabhakaranc, M. P., Wicaksonob, D. H. B., Ramakrishna, S. Fiber based enzyme-linked immunosorbent assay for C-reactive protein. Sensor Actuat B-Chem. 205, 50-60 (2014).
- Koga, H., Kitaoka, T., Isogai, A. In situ modification of cellulose paper with amino groups for catalytic applications. J. Mater. Chem. 21, 9356-9361 (2011).
- Klemm, D., Heublein, B., Fink, H. P., Bohn, A. Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material. Angew. Chem., Int. Ed. 44 (22), 3358-3393 (2005).
- Fernandes, S. C. M., et al. Bioinspired antimicrobial and biocompatible bacterial cellulose membranes obtained by surface functionalization with aminoalkyl groups. ACS Appl. Mater. Interfaces. 5 (8), 3290-3297 (2013).
- Pharos FX plus molecular imager instructions, Catalog Number 170-9460. , (2005).
- Tee, Y. B., Talib, R. A., Abdan, K., Chin, N. L., Basha, R. K., Yunos, K. F. M.
- Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nat Protoc. 2, 1152-1165 (2007).
- Guidi, A., Laricchia-Robbio, L., Gianfaldoni, D., Revoltella, R., Del Bono, G. Comparison of a conventional immunoassay (ELISA) with a surface plasmon resonance-based biosensor for IGF-1 detection in cows' milk. Biosens Bioelectron. 16, 971-977 (2001).
- Ahmed, S., Bui, M. N., Abbas, A. Paper-based chemical and biological sensors: Engineering aspects. Biosens Bioelectron. 77, 249-263 (2016).
