Abstract
Questo rapporto presenta due metodi per l'immobilizzazione covalente di anticorpi di cattura su filtro di cellulosa grado di carta n ° 1 (carta da filtro di media portata) dischi e di grado n ° 113 (carta da filtro rapido flusso) dischi. Questi dischi di carta di cellulosa sono stati innestati con gruppi funzionali amminici tramite una tecnica di accoppiamento silano prima gli anticorpi sono stati immobilizzati su di essi. metodi di reticolazione periodato di ossidazione e glutaraldeide sono stati usati per innestare anticorpi di cattura sui dischi di carta di cellulosa. Per garantire la massima capacità di legame degli anticorpi di cattura ai loro bersagli dopo l'immobilizzazione, sono stati studiati gli effetti di varie concentrazioni di periodato di sodio, glutaraldeide, e anticorpi di cattura sulla superficie dei dischi di carta. Gli anticorpi che sono stati rivestiti sui dischi di carta di cellulosa ammina-funzionalizzata tramite un agente reticolante glutaraldeide mostrato migliorata attività di legame al bersaglio rispetto al metodo di ossidazione periodato. IgG (nel siero riferimento mouse) è stato usato come target di riferimento in questo studio per testare l'applicazione di anticorpi immobilizzati covalentemente attraverso glutaraldeide. Un nuovo cartaceo, enzimatico test immunoenzimatico (ELISA) è stato sviluppato con successo e convalidato per l'individuazione di IgG. Questo metodo non richiede attrezzature, e può rilevare 100 ng / ml di IgG. La carta da filtro a flusso rapido era più sensibile della carta da filtro flusso medio. Il periodo di incubazione di questo test è stato breve e richiedeva piccoli volumi di campione. Questo occhio nudo, immunologico colorimetrica può essere esteso per rilevare altri obiettivi che sono identificati con ELISA convenzionale.
Introduction
Lo studio diagnostico point-of-care (POCT) è importante per lo sviluppo di nuove strategie per la terapia, la medicina personalizzata, e assistenza domiciliare 1. Carte cellulosa sono ampiamente usati come piattaforme in saggi immunologici, come sono economici, accessibili e familiare agli utenti 2. Inoltre, la struttura porosa della carta di cellulosa possiede il potere di guidare il flusso di liquido senza ulteriore impatto energetico. Le registrazioni dei bioanalisi cartaceo può essere trovato già nel 20 ° secolo, quando cromatografia su carta è stato inventato nel 1952. L'esempio più diffuso è test immunocromatografici 3, come le strisce di gravidanza e test per il diabete. Questi test forniscono tempi di analisi relativamente veloce e analisi economica 4. Grazie alla loro semplicità, questi test striscia di carta convenzionali sono stati ampiamente utilizzati in diagnostica POCT 5.
Metodi di rilevamento tra colorimetrico 6, elettroSono stati riportati chimici 7 e 8 ElettroChemiLuminescenza metodi per misurare bersagli in campioni biologici. In aggiunta a questi metodi quantitativi, un metodo affidabile per immobilizzare anticorpi su carta di cellulosa è anche importante per lo sviluppo di dispositivi diagnostici. Adsorbimento non specifico è la strategia principale per modificare gli anticorpi sulla superficie dei dispositivi cartacei 9, 10 per garantire la massima capacità di legame ai loro obiettivi dopo immobilizzazione. Tuttavia, uno studio precedente hanno dimostrato che gli anticorpi che vengono assorbiti dalla carta di cellulosa possono desorbire dalle fibre 11 del 40%. Così, adsorbimento diretta degli anticorpi su cellulosa non può fornire risultati riproducibili 12. Immobilizzazione covalente di anticorpi che si innestano sulle superfici di carta è un metodo alternativo di sviluppare efficaci biotest cartacei 13. Vari metodi sono stati segnalati per la modifica della cellulosa 14, 15 12. Carbonildiimidazolo combinato con 1-ciano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate 16; 1-fluoro-2-nitro-4-azidobenzene attraverso una strategia di attivazione UV a base 17, 18; una strategia basata su chemoenzimatica xyloglucan 19 modifica; un agente di collegamento 1,4-phenylenediisothiocyanate 20; eteropolisaccaride ossidazione 21 click chemistry 22; e porfirine cationiche 23 sono stati utilizzati per immobilizzare covalentemente biomolecole su carta di cellulosa. Chitosano carta modificato è stato usato per sviluppare immunodevices cartacei 24-26 poiché è abbondante e biocompatibile 27. Il chitosano è cationico e aderisce con forza alla cellulosa anionici 27. Gli anticorpi di cattura sono immobilizzati sulla carta attraverso rivestimento chitosano e glutaraldeide reticolazione. ossidazione periodato è un altro metodo per l'innesto del captanticorpi ure sulla carta di cellulosa 28. In questo metodo, periodato di sodio è depositata su carta per convertire gruppi 1,2-dihydroxyl (glicole) di cellulosa direttamente ai gruppi aldeidici. I gruppi aldeidici sono quindi utilizzate per formare legami covalenti tra polisaccaridi e anticorpi 28. Sebbene la fabbricazione è semplice, è difficile lavare completamente periodato di sodio. Il periodato di sodio non lavato può causare ulteriore ossidazione degli anticorpi che sono immobilizzati sulla carta di cellulosa, influenzando l'attività e la stabilità degli anticorpi N -. (3-dimetilamminopropil) - N cloridrato -ethylcarbodiimide e N linkers croce -hydroxysuccinimide sono utilizzati anche per covalentemente immobilizzare anticorpi sulla acide e acetato di cellulosa nanofibre poli-L-lattico elettrofilate per lo sviluppo di saggi nanofibre a base 29.
In questo studio, una tecnica di accoppiamento silano è stato usato per innestare gruppi funzionali amminici su cellulosdischi di carta e. Questa tecnica aiuta a mantenere le dimensioni originali dei pori, traspirante, e velocità di filtrazione delle carte da filtro di cellulosa, consentendo la massima verticali flow-through in saggi immunologici. La tecnica di accoppiamento silano è stato ampiamente utilizzato in biosensori per funzionalizzare superfici dei substrati con gruppi amminici secondari, seguita da un'ulteriore modifica utilizzando biomolecole. L'innesto di gruppi amminici sulla superficie matrice comprende una reazione di condensazione tra i gruppi -OH degli agenti silano organo e matrice substrato 30. I dischi di carta di cellulosa sono stati funzionalizzati con gruppi amminici di silano attraverso 3-amminopropiltrimetossisilano (APS) 31. Questa è stata seguita da anticorpi di cattura covalente immobilizzanti utilizzando due metodi diversi. Il primo metodo ha coinvolto legame di periodato anticorpi di cattura ossidati alle ammine funzionalizzate dischi di carta di cellulosa. Il secondo metodo utilizzato glutaraldeide come agente reticolante per collegare la Antibodi catturaes ai dischi di carta di cellulosa di gruppo-funzionalizzati ammina. La presenza di anticorpi di cattura è stata confermata da rabbit IgG isotiocianato-fluoresceina anti-umano (FITC), utilizzando un sensore molecolare fluorescenza. L'attività di legame di coniglio anti-IgG umane-FITC per capra anti-IgG di coniglio è stata anche valutata substrato perossidasi. Gli effetti di varie concentrazioni di periodato di sodio, glutaraldeide, e anticorpi di cattura sono stati studiati. Il test applicazione della anticorpo di cattura immobilizzato è stato eseguito con successo attraverso l'individuazione di IgG nel siero.
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Protocol
1. L'innesto Amine gruppi funzionali di cellulosa dischi di carta
- Preparare un pezzo di carta quadrato con una dimensione di 1 cm x 1 cm e 100 dischi di carta in carta di cellulosa di grado n ° 1 con un diametro di 6,0 mm (carta flusso medio filtro) utilizzando un punzone buco.
- Per derivare gruppi -NH 2 sui dischi di carta, mescolare 1 ml APS e 10 ml di acetone in una bottiglia di vetro da 50 ml sotto cappa. Aggiungere dischi di carta alla miscela APS reagente appena preparato, e incubare per 5 ore con agitazione orbitale (200 rpm) a temperatura ambiente 32.
Attenzione: maneggiare APS e acetone nella cappa. - Decantare la soluzione in eccesso dalla bottiglia di vetro da 50 ml in un contenitore di rifiuti organici.
- Aggiungere 10 ml di acetone alla bottiglia di vetro, mescolare bene e decantare completamente di togliere qualunque APS reagito e altre impurità. Ripetere questa operazione due volte.
- Stendere i dischi di carta sul tovagliolo di carta e mettere in un forno a 110 C ° per 3 ore. Lasciare che ildischi di carta per il raffreddamento. Conservare i dischi in una provetta da centrifuga da 50 ml a temperatura ambiente.
- Utilizzare trasformata di Fourier spettroscopia infrarossa (FTIR) per verificare l'innesto di gruppi amminici sulla carta quadrato di cellulosa, come descritto di seguito (Figura 3A).
- Accendere il computer e aprire lo strumento spettroscopia FTIR.
- Aprire il software per la spettroscopia FTIR.
- Vai a 'misura → Inizializzare'. I rettangoli per 'BS: KBr', 'Lampada: a raggi infrarossi' e 'Laser' diventa verde quando l'inizializzazione è terminata.
- Scegliere 'dati' al di sotto dei rettangoli, e selezionare '% di trasmissione', 'Happ-Genzel', '45', '4.0', e 'minima: 400, Max: 4000' per 'modalità di misura', 'Apodizzazione', ' No. di scansioni ',' Resolution ', e' Range (cm-1) '.
- Fare clic su 'misura'.
- Selezionare 'File di dati' per i dati di fondo. Scrivigiù i commenti.
- Fare clic su 'BKG' per ottenere la linea di base per lo sfondo.
- Fissare la carta quadrato sul supporto del campione pellicola.
- Selezionare 'File di dati' per i dati di esempio. Annotare i commenti.
- Fare clic su 'campione' per ottenere gli spettri per il campione.
- Chiudere l'applicazione della spettroscopia FTIR e spegnere il computer.
- Ripetere i passaggi precedenti (passi da 1.1 a 1.6) per preparare ammina-funzionalizzati grado No. 113 cellulosa carta quadrati e dischi (carta da filtro rapido flusso), e di ottenere gli spettri FTIR per il grado No. 113 quadrato di carta (Figura 3B).
2. immobilizzazione covalente di anticorpi su Amine-funzionalizzati dischi di carta di cellulosa
Figura 1. immobilizzazione covalente di anticorpi con due metodi differenti.Un. Gli anticorpi immobilizzati su dischi di carta di cellulosa di ammine-funzionalizzati per ossidazione periodato. I residui di carboidrati sono stati ossidati da periodato di sodio per la produzione di aldeide gruppi funzionali. Quindi, gli anticorpi ossidati sono stati caricati su dischi di carta di cellulosa ammina-funzionalizzato. B. Gli anticorpi sono stati poi immobilizzate su dischi di carta di cellulosa ammine funzionalizzate attraverso glutaraldeide. L'ammina funzionalizzato dischi di carta di cellulosa sono stati immersi in soluzione di glutaraldeide 0,05% per introdurre gruppi aldeidici ai dischi di carta. Dopo il lavaggio, gli anticorpi sono stati caricati sui aldeide funzionalizzato dischi di carta. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Immobilizzare anticorpi su dischi di carta di cellulosa ammina-funzionalizzato mediante ossidazione con periodato (Figura 1A).
- Mescolare 1 ml di perioda di sodio 2,5 mMte con 2 ml di 0,1 mg / ml di coniglio anti-IgG umane-FITC e 7 ml di 100 mM pH 5,5 tampone acetato in una provetta da 1,5 ml, e incubare la miscela al buio per 30 min.
NOTA: Seguire questa rapporto volume di preparare anticorpi più ossidate, se necessario. Modificare il rapporto volumetrico di ottimizzare la concentrazione di periodato di sodio e di coniglio anti-IgG umane-FITC. - Diluire la soluzione di anticorpi sopra con 30 ml di 50 mM tampone fosfato isotonico (PBS, pH 7,4) ad un volume finale di 40 microlitri.
- Preparare tre dischi di carta filtro medio-flow ammina-funzionalizzati e tre dischi di carta veloce flusso di ammina-funzionalizzati (come descritto nella sezione 1).
- Carico 5 ml di periodato di sodio coniglio ossidato IgG anti-umane-FITC viene eseguito su ciascun disco di carta filtro di media portata e 8 ml viene eseguito su ciascun disco di carta filtro rapido flusso. Mantenere questi dischi di carta al buio per un'ora a temperatura ambiente.
- Lavare ogni disco carta con 0,2 ml di lavaggio appassionatoer (50 mM tampone Tris 0,15 M NaCl e 0,05% di tensioattivo, pH 7,4). Ripetere il lavaggio tre volte.
- Fotografare le immagini di fluorescenza attraverso un imager molecolare di fluorescenza per identificare la presenza di anticorpi su ciascun disco di carta di cellulosa 32. Utilizzare dischi di carta in bianco (trattati con la stessa concentrazione di anticorpi in assenza di periodato di sodio) come un controllo (Figura S1 alla Figura S3).
NOTA: per l'ottimizzazione sperimentale, modificare la concentrazione di un parametro che deve essere ottimizzato e fissare le concentrazioni degli altri parametri. Una alta intensità di fluorescenza aumenta la quantità di anticorpi di cattura che sono immobilizzati sui dischi di carta di cellulosa.
- Mescolare 1 ml di perioda di sodio 2,5 mMte con 2 ml di 0,1 mg / ml di coniglio anti-IgG umane-FITC e 7 ml di 100 mM pH 5,5 tampone acetato in una provetta da 1,5 ml, e incubare la miscela al buio per 30 min.
- Immobilizzare anticorpi su dischi di carta di cellulosa funzionalizzati amminici tramite glutaraldeide (Figura 1B).
- Aggiungere i tre dischi di carta filtro APS medio-flow trattati e le tre dischi di carta filtro fast-flow (described sezione 1) a 2 ml di 50 mM PBS (pH 7,4) contenente 0,05% glutaraldeide per 1 ora, sotto agitazione orbitale a temperatura ambiente.
Attenzione: maneggiare glutaraldeide nella cappa. - Mettere tre dischi ciascuno in due da 1,5 ml provette da centrifuga. Aggiungere 1 ml di acqua deionizzata (DI) a ciascuna provetta e agitare le provette per 10 sec. Rimuovere l'acqua aspirando con una pipetta. Ripetere altre due volte per rimuovere eventuali glutaraldeide non reagito.
- Carico 5 ml di 25 mg / ml di coniglio IgG-FITC (anticorpo di cattura) anti-umano su ogni disco carta da filtro medio-flow aldeidi-funzionalizzati, e aggiungere 8 ml su ogni disco carta da filtro rapido flusso di aldeide-funzionalizzati. Incubare al buio per circa 20 min a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 10 ml di 50 mM PBS (pH 7,4) per ciascun disco di carta senza rimuovere gli anticorpi e incubare per 40 min per la reazione ammina aldeidi.
- Lavare i dischi di carta con 0,2 ml di soluzione di lavaggio sulla cima di un tovagliolo di carta. ripetere lalavare due volte.
- Fotografare le immagini di fluorescenza attraverso un imager molecolare di fluorescenza per verificare la presenza di anticorpi su ogni disco carta di cellulosa 33. Utilizzare dischi di carta bianco come controllo.
NOTA: In figura 4, '0' indica il disco di carta bianca che è stata trattata con la stessa concentrazione di FITC-anticorpo in assenza di glutaraldeide; in figura 5A, i dischi di carta vuoti sono stati trattati con glutaraldeide, ma nessun FITC-anticorpi stati caricati sul dischi di carta.
- Aggiungere i tre dischi di carta filtro APS medio-flow trattati e le tre dischi di carta filtro fast-flow (described sezione 1) a 2 ml di 50 mM PBS (pH 7,4) contenente 0,05% glutaraldeide per 1 ora, sotto agitazione orbitale a temperatura ambiente.
- Essiccare i dischi di carta (da sezioni 2.1 e 2.2) a 37 ° C per 10 min.
- Bloccare le dischi di carta con 15 microlitri di tampone di bloccaggio (10% di latte scremato in polvere in 50 mM tampone Tris, pH 7,4, con 0,15 M NaCl) per 10 min a temperatura ambiente.
- Carico 5 ml e 8 ml di perossidasi coniugato capra anti-IgG di coniglio in PBS (1: 10.000) sui rispettivamente medie di flusso e dischi di carta filtro rapido flusso,. incubare per30 min al buio a temperatura ambiente.
- Lavare i dischi di carta con 0,2 ml di soluzione di lavaggio sulla cima di un tovagliolo di carta. Ripetere il lavaggio tre volte.
NOTA: Non è necessario rimuovere il tampone di lavaggio come i risultati non sono influenzati dal buffer. - Caricare una miscela di 10 ml di 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) e perossido di idrogeno su ogni disco.
- Prendere immagini dei dischi di carta con una fotocamera digitale o telefono intelligente dopo 5 min di incubazione.
NOTA: In figura 5B, '0' significa i dischi di carta che sono stati trattati con glutaraldeide, seguita caricando anticorpo-HRP (perossidasi di rafano) coniugato in assenza di FITC-anticorpo.
3. a base di carta ELISA per il rilevamento IgG
Figura 2. Rappresentazione schematica della ELISA cartaceo for IgG rilevamento. Cattura anticorpi sono stati covalentemente immobilizzati su dischi di carta di cellulosa aldeide-funzionalizzati attraverso glutaraldeide. I dischi di carta di cellulosa sono state bloccate con tampone di bloccaggio. Obiettivo IgG è stato quindi aggiunto ai dischi, seguita dal caricamento di anticorpi segnale HRP-coniugati. Infine, la soluzione di TMB e la miscela di perossido di idrogeno è stato caricato su ogni disco di carta per la lettura del colore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Aggiungere 5 ml di soluzione di glutaraldeide 0,05% (preparato in 50 mM tampone PBS, pH 7,4) ad una bottiglia di vetro da 20 ml. Immergere 15 medio-flow dischi di carta filtro ammina-funzionalizzata in questa soluzione e conservare per 1 ora con agitazione a temperatura ambiente.
- Allo stesso tempo, ripetere il punto 3.1 per preparare un altro 15 aldeide funzionalizzati dischi di carta filtro rapido flusso.
ATTENZIONE: Maneggiare glutaraldeide nel fumecappuccio.
- Allo stesso tempo, ripetere il punto 3.1 per preparare un altro 15 aldeide funzionalizzati dischi di carta filtro rapido flusso.
- Per rimuovere glutaraldeide non reagito dai dischi di carta, posizionare i dischi di carta filtro 15 medie di flusso in un tubo da centrifuga da 15 ml, ei dischi di carta filtro 15 fast-flow in un'altra provetta da centrifuga da 15 ml. Aggiungere 5 ml di acqua deionizzata ad ogni provetta e agitare le provette per 10 sec. Rimuovere l'acqua aspirando con una pipetta. Ripetere due volte per rimuovere qualsiasi glutaraldeide non reagito.
- Asciugare i dischi di carta in un forno a 37 ° C.
- Aggiungere 5 microlitri e 8 ml di 0,025 mg / ml anticorpi frammento IgG di topo-Fc per ciascuno dei dischi di media portata e carta da filtro a flusso veloce, rispettivamente, e incubare per 20 min.
- Aggiungere 10 ml di 50 mM PBS (pH 7,4) per ciascun disco di carta senza rimuovere gli anticorpi e incubare per 40 min per la reazione ammina aldeidi.
- Lavare i dischi di carta con 0,2 ml di soluzione di lavaggio sulla cima di un tovagliolo di carta. Ripetere il lavaggio tre volte.
- Essiccare i dischi di carta in un forno a 37 ° C.
- Bloccare i dischi di carta wesima 15 ml di tampone di bloccaggio per 10 min a temperatura ambiente.
- Lavare ogni disco di carta con 0,2 ml di soluzione di lavaggio sulla cima di un tovagliolo di carta. Ripetere il lavaggio tre volte.
- Eseguire standard IgG.
- Carico 10 ml di varie concentrazioni di IgG (ad esempio, 0, 10, 125, 250, e 500 ng / ml in PBS) su ogni disco in triplicato. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare i dischi di carta con 0,2 ml di soluzione di lavaggio sulla cima di un tovagliolo di carta. Ripetere il lavaggio tre volte.
- Carico 10 ml di anticorpi HRP coniugato IgG di topo-Fc frammento (1: 10.000, 10 mM PBS, pH 7,4), e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare i dischi di carta con 0,2 ml di soluzione di lavaggio sulla cima di un tovagliolo di carta. Ripetere il lavaggio tre volte.
NOTA: Non è necessario rimuovere il tampone di lavaggio come i risultati non sono influenzati dalla presenza di tampone. - Caricare una miscela di 10 ml di TMB e perossido di idrogeno su ogni disco.
- Timmagini Ake di tutti i dischi di carta con una fotocamera digitale o telefono intelligente dopo 5 min di incubazione.
NOTA: In figura 6A, '0' sta per dischi di carta trattati con anticorpo di cattura immobilizzazione e la soluzione di anticorpo-HRP / TMB senza siero IgG. - Analizzare l'intensità di ciascun disco di carta nell'immagine da Image J.
- Convertire le immagini scattate nel passo 3.15 nel formato '.tif'.
- Aprire il software 'immagine J'.
- Vai a 'File → Open', scegliere l'immagine da analizzare.
- Scegliere il pulsante di forma 'ovale'.
- Vai a 'Immagine → Tipo → 32 bit'.
- Vai a 'Modifica → Inverti'.
- Vai a 'Analizzare → Misura'.
- Copia e analizzare i dati in un foglio di calcolo.
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Representative Results
Figura 3. trasformata di Fourier (FTIR) spettri di filtro flusso medio greggia e APS-trattata carta quadrato (A) e il filtro a flusso rapido carta quadrato (B). A. Gli spettri per non trattata filtro medio-flow quadrato di carta era simile a quella di APS trattate filtro medio-flusso di carta quadrato. L'aumento della intensità a bande di 902-1,170 cm -1 e 1,210-1,500 cm -1 per la carta quadrato APS-trattati apparteneva a Si-O-cellulosa e deformazioni CH di gruppi SiOC-H, rispettivamente. L'incremento delle bande a 1650 cm -1 e 2,885 cm -1 appartiene alla piegatura di -NH 2 e CH 2 vibrazioni porzione salina propile, rispettivamente. B. I picchi caratteristici nelle 972 a 1.180 centimetri -1 gamma sono stati attribuiti al Si-O-Si e SO-ceobbligazioni llulose. Il picco a 1.003 cm -1 è stato causato dalla sovrapposizione del legame Si-O-Si e CO allungamento della cellulosa. Tutti i risultati mostrano che APS è stato innestato con successo sui giornali quadrati di cellulosa. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
La presenza di gruppi funzionali amminici sulle carte quadrati cellulosa sono stati determinati mediante FTIR. La Figura 3 mostra gli spettri FTIR non trattato, modificato, flusso medio e veloce flusso carte quadrati filtro. Ci sono state tre fasi coinvolte nella modificazione chimica di amminoalchile gruppi, utilizzando APS sulle superfici di cellulosa. Fase uno coinvolto l'idrolisi di APS per fornire il derivato silanolo di APS. Fase due comportato l'adsorbimento del idrolizzata derivata APS sulle fibre di cellulosa attraverso legami idrogeno dei gruppi OH del hydrolyzed APS derivato e le fibre di cellulosa. Fase tre coinvolto la condensazione del derivato adsorbito APS, che ha portato l'innesto del derivato APS sulla superficie della fibra di cellulosa mediante Si-OC legame e la formazione di Si-O-Si ponti silossanici 34. Come mostrato in figura 3A, l'incremento della banda a 1650 cm -1 è stato attribuito alla piegatura di gruppi NH 2 e un incremento della banda a 2.885 cm -1 corrispondente al CH 2 vibrazioni della porzione propil silano. Per il filtro flusso medio carta quadrato originale, le bande a 902-1,170 cm -1 e 1,210-1,500 cm -1 corrispondevano alle vibrazioni dei legami COC di ponti glicosidici e CH estende vibrazioni. Dopo il trattamento la carta quadrato con APS, l'aumento dell'intensità questi due larghezze di banda indica che appartengono a Si-O-cellulosa e deformazioni CH dei gruppi SiOC-H, rispettivamente. Simile a medio-FLow filtrata carta quadrato, gli spettri per modificato flusso rapido filtro di carta quadrato anche aumentato di intensità a 1.650 cm -1 per -NH 2, a causa della modificazione chimica con APS (Figura 3B). Le forti picchi caratteristici dei 972 a 1.180 centimetri -1 gamma sono stati attribuiti al Si-O-Si e obbligazioni SO-cellulosa; il picco più alto era a 1.003 cm -1 dovuta alla sovrapposizione del legame Si-O-Si e CO allungamento della cellulosa 34. I legami caratteristici della gamma di lunghezze d'onda tra i 1.188 e 1.510 centimetri -1 per APS trattate quadrato di carta sono causati dalle vibrazioni delle obbligazioni COC di ponti glicosidici e CH di stretching vibrazioni. I CH 2 obbligazioni vibrazioni di stretching sono stati mostrati a 2,800-2,980 cm -1 e il picco più alto è stato a 2.932 cm -1 per l'APS trattata carta quadrato. In conclusione, APS può essere covalentemente innestato No. 1 e No. 113 carte quadrati filtro.
Figura 4. risposte fluorescenza a diverse concentrazioni di glutaraldeide nel immobilizzazione di IgG-FITC sui dischi di carta (Metodo B) Impostazioni per fluorescenza imager molecolare:. Eccitazione, 488 nm, emissione, 530 nm, risoluzione, 100 micrometrica. A: Fluorescenza risposta a 0, 0,001%, 0,005%, 0,01% e 0,050% glutaraldeide B: risposta di fluorescenza a 0, 0,050%, 0,100%, 0,250% e 0,500% glutaraldeide.. La concentrazione di IgG-FITC su ogni disco era 0,01 mg / ml. Un aumento della concentrazione di glutaraldeide ad un massimo dello 0,05% determinato una maggiore quantità di carico di IgG-FITC. Le concentrazioni di glutaraldeide sopra 0,05% ha diminuito la quantità di carico di IgG-FITC. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questafigura.
Figura 5. risposta di fluorescenza (A) ed il risultato colorimetrico (B) di diverse concentrazioni di IgG-FITC sul flusso medio IgG-FITC-immobilizzato e dischi veloce flusso di carta da filtro (Metodo B) Impostazioni per fluorescenza imager molecolare:. Excitation , 488 nm, emissione, 530 nm, risoluzione, 100 micrometro. # 1 rappresenta grado No. 1, disco carta da filtro di media portata, e # 113 rappresenta grado No. 113 fast-flow disco carta da filtro. dischi di carta APS-modificato sono stati trattati con 0,05% glutaraldeide prima. Poi, diverse concentrazioni di IgG-FITC stati caricati sul glutaraldeide modificato dischi di carta. Aumentando la concentrazione di carico di IgG-FITC aumentato la quantità di immobilizzato IgG-FITC sui dischi di carta. Tuttavia, l'aumento delle concentrazioni di immobilizzato IgG-FITC non ha migliorato la capacità di legame per l'antigene. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Il flusso di base per l'immobilizzazione covalente di anticorpi su dischi di carta di cellulosa ammina-funzionalizzata è mostrato in Figura 1. Il coniglio anti-IgG umane-FITC stato covalentemente immobilizzato su dischi di carta di cellulosa. La fluorescenza dai dischi di carta indicato l'immobilizzazione di anticorpi ai dischi di carta, e l'intensità della fluorescenza è direttamente proporzionale alla concentrazione di anticorpi immobilizzati. Perossidasi capra coniugato anti-IgG di coniglio è stato poi applicato per determinare la capacità di legame degli anticorpi immobilizzati. Gruppi amminici secondari e gruppi aldeidici possono reagire tra di loro per formare una base di Schiff, che è stato usato in bioconjugation 35. Sono stati utilizzati anche qui per l'immobilizzazione covalente di catturaanticorpi. Nel metodo A (Figura 1A), -NH 2 è stato introdotto per i dischi di carta di cellulosa e CHO è stato derivato dal coniglio anti-IgG umane-FITC ossidando la regione Fc degli anticorpi con periodato di sodio. Allo stesso modo, sono stati analizzati anche gli effetti di varie concentrazioni di periodato di sodio e anticorpi IgG-FITC. Come mostrato in Figura S1 e Figura S2, periodato di sodio da concentrazioni di 0 a 1 mM e il coniglio anti-IgG umane-FITC da 0,016 al 0,16 mg / ml avuto scarso effetto sulla ossidazione di IgG 0,08 mg / ml di coniglio anti-umana -FITC. La quantità di anticorpi che sono stati legati covalentemente ai dischi di carta aumentata con una concentrazione crescente di anticorpi di cattura da 0 a 0,075 mg / ml (Figura S3A).
Un cambiamento di colore tenue è stato osservato quando la capacità di legame è stata determinata mediante il saggio perossidasi. Questo potrebbe essere dovuto all'uso diperiodato di sodio in eccesso, che reagisce con gli anticorpi di cattura e provoca una perdita di attività di legame. È probabile che il periodato di sodio non può essere completamente lavato via dai dischi di carta. Ciò è stato confermato dal semplice principio che la soluzione periodato di sodio fornisce un colore giallo quando miscelato con soluzione purpald. Pertanto, gli anticorpi periodato ossidati stati caricati sul dischi di carta e incubate per 1 ora. I dischi di carta sono state lavate tre volte con PBS (contenente 0,05% Tween-20), e poi la soluzione purpald inserito in questi dischi. I dischi di carta mostravano un colore viola immediatamente, indicando la presenza di gruppi aldeidici da anticorpi periodato-ossidato. Questo colore viola cambiato colore giallo entro 10 minuti, che ha confermato la presenza di periodato di sodio sui dischi di carta.
In alternativa, un glutaraldeide reticolazione metodo (metodo B, Figura 1B) è stato utilizzato per collegare la Grou amminaps dai dischi e anticorpi carta APS-trattata. Le concentrazioni di glutaraldeide (Figura 4) e il coniglio IgG-FITC (Figura 5A) anti-umano che sono stati caricati sui dischi di carta di cellulosa sono stati ottimizzati. Come mostrato in figura 4, l'intensità di fluorescenza ha raggiunto un massimo dello 0,05% di glutaraldeide, che significa che il caricamento di coniglio anti-IgG umane-FITC si è saturato sul disco carta di cellulosa a questa concentrazione; un aumento della concentrazione di glutaraldeide al 2,5% non ha mostrato un aumento della quantità di coniglio anti-IgG umane-FITC sui dischi di carta di cellulosa (figura S4). L'intensità della fluorescenza è aumentato anche con concentrazioni crescenti di coniglio anti-IgG umane-FITC che sono stati caricati sui dischi di carta (Figura 5A). Un colore dal blu immediatamente dopo l'aggiunta della soluzione di substrato e perossido di idrogeno miscela TMB ai dischi di carta, che conteneva le peroxidasGli anticorpi coniugati e di rilevamento (Figura 5B). Inoltre, tampone bloccante che conteneva il 10% di latte scremato in polvere è stato mostrato per mantenere l'efficienza di blocco dopo 15 lavaggi (Figura S5). Metodo B è stato selezionato per testare l'applicazione degli anticorpi immobilizzati, come dimostrarono migliorata attività di legame al suo bersaglio. Quindi, una concentrazione / ml 0,025 mg di anticorpi di cattura è stato utilizzato per il rilevamento IgG.
Figura 6. Le curve di calibrazione per la determinazione delle IgG dal cartaceo ELISA. # 1 rappresenta grado No. 1, disco di carta filtro flusso medio, e # 113 rappresenta grado No. 113 a flusso rapido disco di carta filtro. Il pannello superiore A presenta la lettura del colore per le medie-flow (# 1) e veloce flusso (# 113) dischi di carta di cellulosa con differenti concentrazioni di IgG. Il pannello inferioreB presenta il risultato ELISA per diverse concentrazioni di IgG. Triplicato sono stati usati per determinare la deviazione standard (SD). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Capra anti-topo IgG-Fc anticorpo di cattura frammento, siero IgG e capra anti-topo IgG-Fc anticorpo frammento coniugato HRP sono stati usati per il saggio a sandwich. Come mostrato in Figura 6 e Figura S6, la concentrazione di siero IgG da 0 a 500 ng / ml ha una relazione lineare con intensità colorimetrica quando ogni fase è stata incubata per 1 ora. Nella Figura S6, la variazione di colore con differenti concentrazioni di IgG era evidente per 1 ora di incubazione. Tuttavia, i risultati della 10 min di incubazione non hanno mostrato un evidente cambiamento nell'intensità del colore con differenti concentrazioni di IgG. Così, i sensitivity di questo ELISA a base di carta era adatto per lo sviluppo di sperimentazione pratica point-of-care.
Figura S1. Risposte fluorescenza a diverse concentrazioni di periodato di sodio (Metodo A). Concentrazioni variabili di periodato di sodio sono stati mescolati con coniglio anti-IgG umane-FITC ad una concentrazione di 0,016 mg / ml e utilizzati per lo studio dell'attività dell'anticorpo ossidazione. Aumentando la concentrazione di periodato di sodio, la quantità di carico di IgG-FITC aumentata e ha raggiunto un massimo a 0,25 mM. È stato osservato che concentrazioni di periodato di sodio che erano superiore a questo non ha aumentato la quantità di IgG immobilizzato-FITC. Triplicato sono stati usati per determinare la deviazione standard (SD). Cliccate qui per scaricare questo file.
Figura S2. risposta fluorescenzas per diverse concentrazioni di coniglio anti-IgG umane-FITC (Metodo A). La concentrazione di periodato di sodio era di 0,25 mM nella soluzione per lo studio attività anticorpale ossidazione, e la concentrazione finale di coniglio anti-IgG umane-FITC su ogni disco era 0,016 mg / ml. Quando la concentrazione di periodato di sodio è stato fissato, la concentrazione di IgG-FITC avuto scarso effetto sulla ossidazione di IgG-FITC. Triplicato sono stati usati per determinare la deviazione standard (SD). Cliccate qui per scaricare questo file.
Figura S3. Risposta Fluorescenza e risultato colorimetrica di caricare diverse concentrazioni di coniglio ossidato anti-human IgG-FITC sui dischi di carta (Metodo A). Per l'ossidazione periodato di sodio, 0,08 mg / ml di periodato di sodio IgG-FITC e 0,25 mM sono stati utilizzati. La diluizione del coniugato con perossidasi anti-IgG di coniglio era1: 50.000. L'aumento della concentrazione di carico di IgG-FITC sui dischi di carta di cellulosa aumentato la quantità di immobilizzato IgG-FITC, ma non ha avuto un effetto sulla obiettivo vincolante. Cliccate qui per scaricare questo file.
Figura S4. Risposta fluorescenza ad alte concentrazioni di glutaraldeide nel immobilizzazione di IgG-FITC sui dischi di carta di cellulosa (Metodo B). La concentrazione di IgG-FITC su ogni disco era 0,01 mg / ml. Le concentrazioni di glutaraldeide che erano superiori a 0,25% non ha aumentato la quantità di immobilizzato IgG-FITC sui dischi di carta di cellulosa. Cliccate qui per scaricare questo file.
Figura S5. Effetto del numero di tempi di lavaggio. A: era. Hing tre volte B: lavaggio 15 volte. Anticorpi di cattura immobilizzati sulla carta quadrato di cellulosa avevano ancora una buona capacità di legame per i loro obiettivi, anche se la carta piazza era in agitazione 15 volte. Cliccate qui per scaricare questo file.
Figura S6. Cartaceo risultato ELISA per IgG. Per le concentrazioni di IgG da 0 a 500 ng / ml, i risultati di un'ora di incubazione sono meglio i risultati da 10 minuti di incubazione. Per alte concentrazioni di IgG, 10 minuti è tempo sufficiente per l'incubazione. Triplicato sono stati usati per determinare la deviazione standard (SD). Cliccate qui per scaricare questo file.
Figura S7. Microscopia elettronica a scansione (SEM) immagini di carta da filtro flusso medio a diversi ingrandimenti. A: 85X e B: 20,000X. Campo microscopia a scansione di emissione degli elettroni (FE-SEM) operante a 5 kV è stato impiegato per determinare la morfologia delle particelle. Le fibre di cellulosa sono casualmente reticolato. Cliccate qui per scaricare questo file.
Figura S8. Immagini SEM di carta da filtro rapido flusso a diversi ingrandimenti. A: 100X e B: 20,000X. Campo microscopia a scansione di emissione degli elettroni (FE-SEM) operante a 5 kV è stato impiegato per determinare la morfologia delle particelle. Le fibre di cellulosa sono casualmente reticolato. Cliccate qui per scaricare questo file.
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Discussion
dirette di verniciatura affinità purificato capra anti-mouse IgG-Fc anticorpo di cattura su dischi di carta non modificato di cellulosa è stato eseguito per rilevare le concentrazioni di IgG. I risultati hanno indicato che, ulteriormente fissaggio degli anticorpi di cattura è richiesto per la riproducibilità. La tecnica silano è stata usata con successo per introdurre gruppi funzionali amminici ai dischi di carta di cellulosa 34. La concentrazione di APS colpisce l'immobilizzazione di anticorpi. Pertanto, la quantità di APS in acetone è stata inoltre ottimizzata. 1 ml di APS in 10 ml di acetone è stata una concentrazione ottimale per l'innesto del gruppo amminico per l'immobilizzazione di anticorpi attraverso un agente di reticolazione glutaraldeide. Anticorpi sono innestati sui dischi di carta di cellulosa per ossidazione con periodato e glutaraldeide metodi di reticolazione. I nostri risultati hanno rivelato che la capacità di legame degli anticorpi immobilizzati attraverso il metodo glutaraldeide reticolazione era migliore rispetto al metodo di ossidazione periodato per medIUM-flow e dischi di carta flusso-filtro veloci. Inoltre, anticorpi di cattura, che sono stati immobilizzati su dischi di carta di cellulosa attraverso un metodo glutaraldeide reticolazione, mantenuto la loro funzione e sono state stabilmente immobilizzate anche se il documento è stato sottoposto a sollecitazioni meccaniche di 15 lavaggi nel vortex. Dieci per cento del buffer latte in polvere blocco scremato è stato trovato per mantenere la sua efficienza di blocco dopo 15 lavaggi (Figura S5).
Gli anticorpi immobilizzati covalentemente sono stati usati per eseguire un ELISA sandwich con l'individuazione di IgG. IgG ad una concentrazione di 100 ng / ml è stata rilevata ad occhio nudo questo test basato disco di carta. La concentrazione di siero IgG da 0 a 500 ng / ml ha una relazione lineare con intensità colorimetrica, quando ogni fase è stata incubata per un'ora. Il test immunologico per questo disco cartaceo ELISA richiesto meno reattivo del campione e sembrava essere più efficiente di saggi immunologici convenzionali 36 Figura S7 e S8 Figura rispettivamente. Come illustrato in queste figure, le fibre sono casualmente reticolato per entrambi i tipi di dischi di carta filtro 25. La ragione di questa elevata sensibilità potrebbe essere lo spessore del disco di carta. Per i dischi di carta filtro fast-flow lo spessore era di 420 micron rispetto ai 180 micron per la carta filtro di media portata. Così, più anticorpi di cattura sono suscettibili di essere immobilizzato su dischi di carta filtro rapido flusso, che aumenterebbero ulteriormente la sensibilità del test. Allo stesso tempo, la dimensione dei pori per i dischi di carta filtro rapido flusso (30 micron) era più grande di quella dei dischi di carta filtro flusso medio (11 e #181; m). Dopo il blocco superficie di carta, la dimensione dei pori della prima era ancora abbastanza grande per guidare il flusso di liquido senza un sistema di alimentazione addizionale. Tuttavia, la velocità di flusso per il buffer in quest'ultimo era più lenta. Pertanto, carta da filtro a flusso veloce era meglio carta da filtro flusso medio nell'applicazione dei test immunologici.
La riproducibilità degli anticorpi sui dischi di carta filtro immobilizzate è stata valutata mediante ulteriore incubazione dei dischi di carta con perossidasi coniugato IgG di capra anti-coniglio e rilevazione del risultato colorimetrica dopo il caricamento del substrato e perossido di idrogeno soluzione miscela TMB. La deviazione standard era inferiore al 10% per questo dispositivo cartaceo. La stabilità di coniglio anti-IgG umane-FITC sulle -NH 2 dischi di carta di cellulosa modificati è stato testato per due mesi. I dischi di carta che sono stati conservati a 4 ° C mantenuto la loro attività di legame al coniugato con perossidasi di IgG di capra anti-coniglio con una lieve diminuzione della loro binding attività. Tuttavia, quando i dischi di carta anticorpo immobilizzato sono stati conservati a temperatura ambiente oa 60 ° C, hanno perso la loro attività di legame a causa della secchezza e ad alta temperatura. Gli anticorpi catturati avrebbero potuto destabilizzato e denaturati in queste condizioni.
Ci sono alcuni passaggi critici nella immobilizzazione di anticorpi di cattura sui dischi di carta di cellulosa usando glutaraldeide come agente reticolante. Passo 1.2 innestare gruppi amminici sui dischi di carta è un passo fondamentale nel successo covalente immobilizzazione di anticorpi di cattura. Se questo passaggio non riesce, l'intero processo di immobilizzazione fallirà. FTIR stata utilizzata per determinare se i gruppi amminici sono stati immobilizzati successo sui dischi di carta (passo 1.6). In secondo luogo, l'innesto di gruppi aldeidici sui dischi di carta di cellulosa è un altro passo fondamentale (Fase 2.2.1 e Step 3.1). Gli anticorpi sono stati covalentemente immobilizzati su dischi di carta di cellulosa attraverso la formazione di una base di Schiff. Finalmente, Il passo di immobilizzare gli anticorpi di cattura sui dischi di carta filtro è importante (Passo 2.2.3, punto 3.4, e Step 3.5). I gruppi amminici dalle anticorpi di cattura hanno reagito con i gruppi aldeidici dai dischi di carta di cellulosa per fissare gli anticorpi sui dischi di carta. Se questo passaggio non riesce, anticorpi di cattura non avrebbero immobilizzare sui dischi di carta e tutti i test applicativi ELISA sarebbe negativo. Possiamo usare un imager molecolare di fluorescenza per determinare la presenza di anticorpi di cattura. Coniugato con perossidasi di capra anti-IgG di coniglio e reazioni colorimetriche perossidasi-based può essere utilizzata per confermare la capacità di legame di anticorpi immobilizzati.
Questo protocollo può incontrare alcuni problemi, come ad esempio un elevato background al segnale, nessun segnale o un segnale debole, e una lettura colore non uniforme. Le possibili cause di questi problemi e metodi di risoluzione dei problemi per superare questi problemi sono discussi di seguito. Alte segnali di fondo di solito si verificano due per un breve periodo di blocco. Questo può essere risolto aumentando il tempo di incubazione di blocco, lavando accuratamente i dischi di carta, ed evitando l'aggiunta di un eccesso di rilevazione dell'anticorpo coniugato enzimatico per rimuovere i segnali ad alta sfondo. Le possibili cause sono l'assenza di antigene bersaglio, nel corso di blocco, tempo di incubazione insufficiente, e un anticorpo di rilevazione enzima coniugato non funzionale. Per superare questi problemi, gli antigeni bersaglio devono essere aggiunti ed incubati per un periodo di tempo adeguato utilizzando un nuovo anticorpo coniugato e immagazzinarla come suggerito dal produttore. Si consiglia di includere un controllo positivo per il rilevamento. letture colore non uniforme sono dovuti alla sovrapposizione di dischi di carta durante il processo di innesto. Per evitare questo problema, i dischi di carta devono essere separati durante il processo di innesto APS, e l'antigene e l'individuazione di anticorpi enzima coniugato devono essere distribuite uniformemente sul disco di carta ad ogni passo.
Sebbene il dosaggio cartaceo è un semplicee conveniente metodo efficace, ci sono delle limitazioni. L'orientamento di anticorpi sulla superficie del substrato è fondamentale per le prestazioni della immunodosaggio, come agente glutaraldeide reticolante reagisce con i gruppi amminici della regione Fab e la regione Fc degli anticorpi di cattura. Pertanto, gli anticorpi immobilizzati non si verificano in modo altamente orientata. Poiché ci sono più gruppi amminici dalla regione Fab che dalla regione Fc degli anticorpi IgG, l'attività di legame degli anticorpi immobilizzati è ancora abbastanza alta per la loro applicazione.
Diversi metodi di superficie funzionalizzazione per carta di cellulosa sono stati riassunti in un recente rapporto 37. Reagenti come divinil solfone; 1,4-phenylenediisothiocyanate; 4-azido-benzendiazonio; epicloridrina; 4-azido-a-fluoro-2-nitrocyclohexane; e 4-mercapto-benzendiazonio, potrebbe essere utilizzato per immobilizzare covalentemente biomolecole su carta di cellulosa. Adsorbimento e intrappolamento sono stati anche utilizzatiper rivestire la carta di cellulosa con biomolecole. Rispetto agli altri metodi, la combinazione della tecnica silano e l'agente reticolante glutaraldeide per immobilizzazione covalente di anticorpi su carta di cellulosa è un metodo semplice. Inoltre, tale combinazione può avere scarso effetto sulle prestazioni termiche e meccaniche della carta di cellulosa, consentendo il flusso passante verticale massimo nei saggi immunologici. Questa strategia potrebbe essere esteso per immobilizzare altre biomolecole sulla carta di cellulosa.
La metodologia dimostrato qui potrebbe potenzialmente essere esteso al rilevamento di ogni analita, purché anticorpi diretti contro di esso sono disponibili. Questo metodo può anche essere usato per sviluppare rilevamento multiplex. Ad esempio, su un quadrato di carta, diverse aree si distinguono per diversi bersagli. Gli anticorpi di cattura per gli obiettivi possono essere immobilizzati attraverso un agente di cross-linking glutaraldeide al loro specifico settore. Questo può essere seguito dai ELISUna procedura per rilevare vari obiettivi. Pertanto, il metodo proposto rende l'ELISA un attrezzo versatile cartaceo per la rivelazione di altri obiettivi utilizzando occhio nudo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellulose filter paper, Grade 1 (medium flow filter paper) | GE Healthcare Pte Ltd Singapore | 1001 110 | |
| Cellulose filter paper, Grade 113 (Fast flow filter paper) | Sigma-Aldrich, Singapore | 1113-320 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Singapore | G6257 | Grade II, 25% in H2O |
| Surfactant | Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore | P2287 | |
| Bovine serum album | Sigma-Aldrich, Singapore | A2153 | |
| Skimmed milk powder | Louis François | Packed by Kitchen Capers, Singapore | |
| Tris base | Promega | H5135 | |
| Sodium periodate | Merck | 106597 | |
| Na2HPO4 | Merck | 106585 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| NaCl | CALBIOCHEM | 567441 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| HCl | Merck | 100317 | |
| phosphate buffer saline (PBS) | N/A | N/A | PBS, containing 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol/L Na2HPO4 and 1.5 mmol/L KH2PO4, is prepared with water and adjusted to pH 7.4 with 0.1 mol/L NaOH or 0.1 mol/L HCl |
| Acetone | Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore | 9005-68 | |
| Mixture of TMB and hydrogen peroxide solution | 1-Step ultra TMB-ELISA solution , Thermo Scientific Pierce | 34029 | 1 L |
| Rabbit anti-human IgG-FITC | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2278 | |
| Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2030 | |
| Affinity purified goat anti-Mouse IgG-Fc coating antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131A | |
| Mouse reference serum | Bethyl Laboratories, Inc | RS10-101-5 | 9.5 mg/ml |
| HRP conjugated goat anti-mouse IgG-Fc detection antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131P | |
| Equipment | |||
| Fourier transform infrared spectrophotometer | Shimadzu IR Prestige-21 | N/A | |
| Fluorescence molecular imager | Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore | N/A | |
| Oven | NUVE FN500 | N/A | |
| Turbo mixer VM-2000 | MYC LTD | N/A | |
| ImageJ | RGB, free download | N/A |
References
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