Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

A ligação covalente de anticorpos para celulose discos de papel e suas aplicações em visível a olho nu colorimétricos imunoensaios

Published: October 21, 2016 doi: 10.3791/54111
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1School of Applied Science, Temasek Polytechnic, 2University of Applied Sciences Utrecht

Abstract

Este relatório apresenta dois métodos para a imobilização covalente de anticorpos de captura na filtro de celulose tipo de papel No. 1 (papel de filtro de médio fluxo) discos e grau No. 113 (papel de filtro fast-fluxo) discos. Estes discos de papel de celulose foram enxertado com grupos funcionais de amina através de uma técnica de acoplamento de silano antes de os anticorpos foram imobilizados sobre eles. métodos de ligação cruzada de oxidação e glutaraldeído periodato foram usadas para enxertar anticorpos de captura sobre os discos de papel de celulose. A fim de garantir a capacidade máxima de ligação dos anticorpos de captura para os seus alvos após imobilização, foram investigados os efeitos de várias concentrações de periodato de sódio, o glutaraldeído, e anticorpos de captura na superfície dos discos de papel. Os anticorpos que foram revestidas sobre os discos de papel de celulose funcionalizada com amina por meio de um agente de reticulação com glutaraldeído observado aumento na actividade de ligação ao alvo, quando comparado com o método de oxidação com periodato. IgG (no soro do rato de referência) foi usado como um alvo de referência neste estudo para testar a aplicação de anticorpos imobilizados covalentemente através de glutaraldeído. Um novo à base de papel, ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) foi desenvolvido e validado para a detecção de anticorpos IgG com sucesso. Este método não necessita de equipamento, e pode detectar de 100 ng / ml de IgG. O papel de filtro rápido de fluxo foi mais sensível do que o papel de filtro de média de fluxo. O período de incubação do presente ensaio foi de curta e necessário pequenos volumes de amostra. Este visível a olho nu, imunoensaio colorimétrica pode ser estendido para detectar outros alvos que estão identificados com ELISA convencional.

Introduction

O estudo de diagnóstico testes point-of-care (POCT) é importante para o desenvolvimento de novas estratégias para a terapêutica, medicina personalizada e atendimento domiciliar 1. Papéis de celulose são amplamente utilizados como plataformas em imunoensaios, porque são baratos, acessível, e familiar para os utilizadores 2. Além disso, a estrutura porosa de papel de celulose possui a capacidade de dirigir o fluxo de líquido sem impacto de energia adicional. Registros de bioanalysis baseado em papel pode ser encontrada já no século 20, quando a cromatografia em papel foi inventado pela primeira vez em 1952. O exemplo mais comum é os testes imunocromatográficos 3, tais como a gravidez e testes de diabetes tiras. Estes testes fornecem tempos de ensaio relativamente rápidos e análises barato 4. Devido à sua simplicidade, estes testes em tiras de papel convencionais têm sido amplamente utilizados em diagnósticos POCT 5.

Métodos de detecção, incluindo colorimétrico 6, electroquímicas 7, 8 e de electroquimioluminescência têm sido relatados métodos para medir alvos em amostras biológicas. Em adição a estes métodos quantitativos, um método fiável para a imobilização de anticorpos sobre papel de celulose também é importante para o desenvolvimento de dispositivos de diagnóstico. Adsorção não específica é a principal estratégia para modificar anticorpos na superfície dos dispositivos à base de papel 9, 10 para garantir uma capacidade de ligação máxima aos seus alvos após imobilização. No entanto, um estudo anterior mostraram que os anticorpos que são adsorvidos sobre papel de celulose pode dessorver a partir das fibras 11 em 40%. Assim, a adsorção direta de anticorpos sobre a celulose podem não fornecer resultados reproduzíveis 12. Imobilização covalente de anticorpos que são enxertadas sobre as superfícies de papel é um método alternativo para o desenvolvimento de bioensaios baseados em papel eficazes 13. Vários métodos têm sido relatados para a modificação de celulose 14, 15 12. Carbonildiimidazole combinado com tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridínio 16; 1-fluoro-2-nitro-4-azidobenzene através de uma estratégia de activação à base de UV 17, 18; quimioenzimáticas uma estratégia baseada em 19 de modificação xiloglucano; um agente de ligação 1,4-phenylenediisothiocyanate 20; heteropolysaccharide oxidação 21 click chemistry 22; e porfirinas catiónicos 23 têm sido utilizados para imobilizar biomoléculas covalentemente em papel de celulose. Papel modificado quitosano tem sido usado para desenvolver immunodevices base de papel 24-26, uma vez que é abundante e biocompatível 27. O quitosano é catiónico e adere fortemente à celulose aniónico 27. Os anticorpos de captura são imobilizadas no papel por meio de revestimento de quitosano e reticulação com glutaraldeído. oxidação por periodato é outro método para enxerto do captanticorpos Ure no papel de celulose 28. Neste método, periodato de sódio é manchada no papel para converter os grupos 1,2-di-hidroxilo (glicol) em celulose directamente para grupos aldeído. Os grupos aldeído são então utilizadas para formar ligações covalentes entre polissacarídeos e anticorpos 28. Embora o fabrico é simples, que é difícil de lavar completamente fora de periodato de sódio. O periodato de sódio não lavado pode causar oxidação adicional dos anticorpos que são imobilizadas no papel de celulose, que afectam a actividade e a estabilidade dos anticorpos N -. (3-dimetilaminopropil) - N-etilcarbodiimida e N-hidroxissuccinimida reticuladores são também utilizados para covalentemente imobilizar anticorpos em nanofibras de celulose e acetato de ácido poli-L-láctico electrospun para o desenvolvimento de ensaios baseados em nanofibras 29.

Neste estudo, uma técnica de acoplamento de silano foi usada para enxertar grupos funcionais amina sobre cellulosDiscos de papel e. Esta técnica ajuda a reter o tamanho original dos poros, em torcida, e taxa de filtração dos filtros de papel de celulose, permitindo imunoensaios verticais máximos de fluxo de passagem em. A técnica de acoplamento de silano tem sido amplamente utilizada em biossensores para funcionalizar superfícies do substrato com grupos amina secundária, seguida de modificação adicional utilizando biomoléculas. A enxertia de grupos amina sobre a superfície da matriz compreende uma reacção de condensação entre os grupos -OH de os agentes de silano organofuncional e substrato de matriz 30. Os discos de papel de celulose foram funcionalizada com grupos de amina por meio de acoplamento de silano de 3-aminopropiltrimetoxissilano (APS) 31. Isto foi seguido de anticorpos de captura covalentemente imobilizantes usando dois métodos diferentes. O primeiro método envolveu a ligação de anticorpos de captura oxidados de periodato para os discos de papel de celulose amina funcionalizada. O segundo método utilizado o glutaraldeído como agente de reticulação para ligar o antibodi capturaES para os discos de papel de celulose funcionalizada com grupos de amina. A presença de anticorpos de captura foi confirmada por coelho isotiocianato de fluoresceína IgG anti-humano (FITC), utilizando um gerador de imagens de fluorescência molecular. A actividade de ligação de anticorpo de coelho anti-IgG humana-FITC de cabra anti-IgG de coelho foi também avaliado pelo substrato da peroxidase. Foram investigados os efeitos de várias concentrações de periodato de sódio, o glutaraldeído, e anticorpos de captura. O teste de aplicação do anticorpo de captura imobilizado foi realizada com sucesso, através da detecção de IgG do soro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Os grupos funcionais amina sobre a celulose Alongamento discos de papel

  1. Preparar um pedaço de papel quadrado com uma dimensão de 1 cm x 1 cm, e de 100 discos de papel feitas a partir de uma série No. papel de celulose com um diâmetro de 6,0 mm (papel de filtro de média de fluxo) utilizando um furador.
  2. Para derivar grupos -NH2 sobre os discos de papel, mistura de 1 ml APS e 10 ml de acetona num frasco de vidro de 50 ml, na hotte. Adicionar discos de papel para a mistura reagente APS recentemente preparada, e incuba-se durante 5 h com agitação orbital (200 rpm) a temperatura ambiente de 32.
    Cuidado: Pega APS e acetona na coifa.
  3. Decantar o excesso de solução do frasco de vidro de 50 ml em um recipiente de lixo orgânico.
  4. Adicionam-se 10 ml de acetona para o frasco de vidro, misturar bem e decanta-se completamente para remover quaisquer APS que não reagiram e de outras impurezas. Repita esta etapa duas vezes.
  5. Espalhe os discos de papel sobre a toalha de papel e coloque em um forno a 110 ° C durante 3 h. permitir que odiscos de papel para esfriar. Armazenar os discos em um tubo de centrífuga de 50 ml à temperatura ambiente.
  6. Use transformada de Fourier espectroscopia de infravermelho (FTIR) para verificar a enxertia de grupos amina sobre o quadrado de papel de celulose, tal como descrito abaixo (Figura 3A).
    1. Ligue o computador e abra o instrumento de espectroscopia FTIR.
    2. Abra o software para a espectroscopia FTIR.
    3. Ir para 'Measurement → Inicializar ". Os rectângulos para 'BS: KBr', 'Lamp: Infravermelho' e 'Laser' fica verde quando a inicialização é concluída.
    4. Escolha 'Dados' abaixo dos retângulos, e selecione '% Transmitância', 'Happ-Genzel', '45', '4.0', e 'Min: 400, Max: 4000 "para" Modo de Medição', 'Apodização', ' Não. de Scans ',' resolução ', e' Range (cm-1) '.
    5. Clique em 'Medida'.
    6. Selecione "arquivo de dados 'para os dados de fundo. Escrevapara baixo os comentários.
    7. Clique em 'BKG "para obter a linha de base para o fundo.
    8. Fixar o papel quadrado no suporte de amostras filme.
    9. Selecione "arquivo de dados" para os dados de exemplo. Anote os comentários.
    10. Clique "amostra" de obtenção dos espectros da amostra.
    11. Feche a aplicação espectroscopia FTIR e desligue o computador.
  7. Repita os passos acima (passos 1.1 a 1.6) para preparar grau nº 113, de celulose de papel e discos (papel de filtro fast-fluxo) quadrado amina funcionalizada, e obter o espectro de FTIR para o papel quadrado grau No. 113 (Figura 3B).

2. imobilização covalente de anticorpos em discos de papel de celulose Amine-funcionalizados

Figura 3
Figura 1. imobilização covalente de anticorpos por dois métodos diferentes.Um. Os anticorpos imobilizados sobre discos de papel de celulose funcionalizada com amina por meio de oxidação com periodato. Os resíduos de açúcar foram oxidadas por periodato de sódio para produzir grupos funcionais de aldeído. Em seguida, os anticorpos oxidados foram carregadas em discos de papel de celulose funcionalizada com amina. B. Os anticorpos foram então imobilizadas em discos de papel de celulose funcionalizada com amina por meio de glutaraldeído. Os discos de papel de celulose de amina funcionalizados foram imersos em solução de glutaraldeido a 0,05%, para introduzir grupos aldeído no discos de papel. Após a lavagem, os anticorpos foram carregados nos discos de papel aldeído funcionalizado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Imobilizar os anticorpos sobre discos de papel de celulose funcionalizada com amina por meio de oxidação com periodato (Figura 1A).
    1. Misturar 1 ul de perioda de sódio 2,5 mMte com 2 ul de 0,1 mg / ml de anticorpo de coelho anti-IgG humana-FITC e 7 ul de tampão de pH 5,5 mM de acetato de 100 em um tubo de 1,5 ml, e incubar a mistura no escuro durante 30 min.
      NOTA: Siga este rácio de volume para preparar anticorpos mais oxidados, se necessário. Alterar a relação de volume para optimizar a concentração de periodato de sódio e de coelho anti-IgG humana-FITC.
    2. Dilui-se a solução de anticorpo acima com 30 ul de 50 mM de solução salina de tampão fosfato (PBS; pH 7,4) até um volume final de 40 ul.
    3. Prepare três discos de papel de filtro de médio fluxo de amina-funcionalizados e três discos de papel de fast-fluxo funcionalizado com amina (como descrito na Seção 1).
      1. Carga de 5 ul de periodato de sódio oxidado coelho anti-IgG humana-FITC em cada disco de papel de filtro de média de fluxo e 8 ul em cada disco de papel de filtro rápido de fluxo. Manter estes discos de papel no escuro durante uma hora à temperatura ambiente.
    4. Lava-se cada do disco de papel com 0,2 ml de lavagem lustreer (tampão Tris 50 mM com NaCl 0,15 M e 0,05% de agente tensioactivo, pH 7,4). Repetir a lavagem três vezes.
    5. Fotografar as imagens de fluorescência através de um gerador de imagens de fluorescência molecular para identificar a presença de anticorpos em cada disco de papel de celulose 32. Use discos de papel em branco (tratado com a mesma concentração de anticorpos na ausência de periodato de sódio) como um controlo (Figura S1 a Figura S3).
      NOTA: Para a optimização experimental, alterar a concentração de um parâmetro que deve ser optimizado e corrigir as concentrações de todos os outros parâmetros. Uma elevada intensidade de fluorescência aumenta a quantidade de anticorpos de captura que são imobilizadas sobre os discos de papel de celulose.
  2. Imobilizar os anticorpos sobre discos de papel de celulose por meio de amina funcionalizados glutaraldeído (Figura 1B).
    1. Adicione as três APS tratada médio de fluxo discos de papel de filtro e os três discos de papel de filtro de fast-fluxo (descrita no ponto 1) a 2 ml de PBS 50 mM (pH 7,4) que contém 0,05% de glutaraldeído, durante 1 h, com agitação orbital à temperatura ambiente.
      Cuidado: Pega glutaraldeído na coifa.
    2. Coloque três discos cada um em dois 1,5 ml tubos de centrífuga. Adicionar 1 ml de água deionizada (DI) de água a cada tubo e agitar os tubos durante 10 segundos. Remover a água por aspiração com uma pipeta. Repita duas vezes mais para remover todo o glutaraldeído que não reagiu.
    3. Carga de 5 ul de 25 ug / mL de IgG de coelho-FITC (anticorpo de captura) anti-humano em cada disco de papel de filtro de fluxo médio funcionalizados com aldeo, e adicionar 8 ul em cada disco de papel de filtro rápido de fluxo funcionalizada-aldeído. Incubar no escuro durante cerca de 20 min à temperatura ambiente. Em seguida, adicionar 10 ul de PBS 50 mM (pH 7,4) a cada disco de papel sem remover os anticorpos e incubar durante 40 minutos para a reacção de amina aldeído.
    4. Lavar os discos de papel com 0,2 ml de tampão de lavagem na parte superior de uma toalha de papel. Repita olavar duas vezes.
    5. Fotografar as imagens de fluorescência através de um gerador de imagens de fluorescência molecular para verificar a presença de anticorpos em cada disco de papel de celulose 33. Use discos de papel em branco como controlo.
      NOTA: Na Figura 4, '0' está para o disco de papel em branco, que foi tratada com a mesma concentração de FITC-anticorpo na ausência de glutaraldeído; na Figura 5A, os discos de papel em branco foram tratadas com glutaraldeído, mas não há anticorpos com FITC foram carregadas para os discos de papel.
  3. Secam-se os discos de papel (a partir de secções 2.1 e 2.2) a 37 ° C durante 10 min.
  4. Bloquear os discos de papel com 15 ul de tampão de bloqueio (10% de leite desnatado em pó em tampão Tris 50 mM, pH 7,4, com NaCl a 0,15 M) durante 10 min à temperatura ambiente.
  5. Carga de 5 uL e 8 uL de IgG anti-coelho de cabra conjugado com peroxidase em PBS (1: 10000) em meio-fluxo e discos de papel de filtro rápido de fluxo, respectivamente. incubar durante30 min no escuro à temperatura ambiente.
  6. Lavar os discos de papel com 0,2 ml de tampão de lavagem na parte superior de uma toalha de papel. Repetir a lavagem três vezes.
    NOTA: Não é necessário para remover o tampão de lavagem como os resultados não são afectados pelo tampão.
  7. Carregar uma mistura de 10 ul de 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) e peróxido de hidrogénio para cada disco.
  8. Tomar imagens dos discos de papel com uma câmera digital ou telefone inteligente após 5 min de incubação.
    NOTA: Na Figura 5B, '0' significa os discos de papel que foram tratados com glutaraldeído, seguido por conjugado de carregamento na ausência de anticorpo FITC-anticorpo-HRP (peroxidase de rábano).

ELISA 3. Papel à base de Detecção de IgG

Figura 2
Figura 2. Representação esquemática do ELISA baseado em papel foOs anticorpos de detecção. captura de R IgG foram covalentemente imobilizada sobre os discos de papel de celulose funcionalizada-aldeído através de glutaraldeído. Os discos de papel de celulose foram bloqueadas com tampão de bloqueio. Alvo de IgG foi então adicionada aos discos, seguido do carregamento de sinal de anticorpos conjugados com HRP. Finalmente, a solução TMB e mistura de peróxido de hidrogênio foi carregado em cada disco de papel para a leitura de cor. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Adicionar 5 ml de solução de glutaraldeído a 0,05% (preparado em tampão PBS 50 mM, pH 7,4) para um frasco de vidro de 20 ml. Imergir 15 discos de papel de filtro de média de fluxo funcionalizado com amina nesta solução e manter durante 1 hora com agitação à temperatura ambiente.
    1. Ao mesmo tempo, repita o Passo 3.1 para preparar mais 15 aldeído discos de papel de filtro de fast-fluxo funcionalizados.
      Cuidado: Pega glutaraldeído no fumecapuz.
  2. Para remover o glutaraldeído que não reagiu a partir de discos de papel, colocar os discos de papel de filtro 15 meio de fluxo em um tubo de centrífuga de 15 ml, e os discos de papel de filtro 15 de escoamento rápido em mais 15 ml de tubo de centrifugação. Adicionar 5 ml de água DI a cada tubo e agitar os tubos durante 10 segundos. Remover a água por aspiração com uma pipeta. Repita duas vezes para remover todo o glutaraldeído que não reagiu.
  3. Secam-se os discos de papel num forno de 37 ° C.
  4. Adicionar 5 uL e 8 uL de anticorpos de fragmentos ml 0,025 mg / murganho de IgG-Fc a cada um dos discos de média de fluxo e de papel de filtro rápido de fluxo, respectivamente, e incubar durante 20 min.
  5. Adicionar 10 ul de PBS 50 mM (pH 7,4) a cada disco de papel sem remover os anticorpos e incubar durante 40 minutos para a reacção de amina aldeído.
  6. Lavar os discos de papel com 0,2 ml de tampão de lavagem na parte superior de uma toalha de papel. Repetir a lavagem três vezes.
  7. Secam-se os discos de papel numa estufa a 37 ° C.
  8. Bloquear os discos de papel wom 15 ul de tampão de bloqueio durante 10 minutos à temperatura ambiente.
  9. Lava-se cada disco de papel com 0,2 ml de tampão de lavagem na parte superior de uma toalha de papel. Repetir a lavagem três vezes.
  10. Executar padrões de IgG.
    1. Carga de 10 ul de várias concentrações de IgG (por exemplo, 0, 10, 125, 250, e 500 ng / ml em PBS) em cada disco, em triplicado. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente.
  11. Lavar os discos de papel com 0,2 ml de tampão de lavagem na parte superior de uma toalha de papel. Repetir a lavagem três vezes.
  12. Carga de 10 ul de anticorpos IgG de ratinho conjugado com HRP-Fc (fragmento 1: 10.000, de PBS 10 mM, pH 7,4), e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente.
  13. Lavar os discos de papel com 0,2 ml de tampão de lavagem na parte superior de uma toalha de papel. Repetir a lavagem três vezes.
    NOTA: Não é necessário para remover o tampão de lavagem como os resultados não são afectados pela presença de tampão.
  14. Carregar uma mistura de 10 ul de TMB e peróxido de hidrogénio para cada disco.
  15. Timagens ake de todos os discos de papel com uma câmera digital ou telefone inteligente após 5 min de incubação.
    Nota: Na figura 6A, '0' meios discos de papel tratados com imobilização do anticorpo de captura, e a solução de anticorpo-HRP / TMB sem soro IgG.
  16. Analisar a intensidade de cada disco de papel na imagem por imagem J.
    1. Converter as imagens tiradas na etapa 3.15 para o formato "tif".
    2. software Open 'Imagem J'.
    3. Ir para 'arquivo → Open', escolher a imagem a ser analisada.
    4. Escolha o botão de forma "Oval".
    5. Ir para 'Imagem → Tipo → 32 bit'.
    6. Ir para "Editar → Inverter '.
    7. Ir para "Analisar → Medida '.
    8. Copiar e analisar os dados em uma planilha.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figura 3
Figura 3. transformada de Fourier espectro de infravermelho (FTIR) de papel de filtro de média de fluxo não tratado e APS-tratado quadrado (A) e filtro de fluxo rápido-quadrado de papel (B). Uma. Os espectros de papel quadrado não tratada do filtro de média de fluxo foi semelhante ao do APS papel quadrado tratada filtro de média de fluxo. O aumento das intensidades de bandas de 902-1,170 cm -1 e 1,210-1,500 cm -1 para o papel quadrado-tratada APS pertencia a Si-O-CH celulose e deformações de grupos SiOC-H, respectivamente. O incremento das bandas a 1650 cm -1 e 2885 cm-1 pertence à flexão de -NH 2 e CH 2 vibrações a partir da porção propilo solução salina, respectivamente. B. Os picos característicos nos 972 1.180 cm-1 gama foram atribuídos ao Si-O-Si e SO-cetítulos llulose. O pico a 1.003 cm -1 foi causado pela sobreposição da ligação Si-O-Si e as emissões de CO que se estende da celulose. Todos os resultados mostram que a APS foi enxertado com êxito para os papéis quadrados de celulose. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A presença de grupos funcionais amina sobre os papéis quadrados de celulose foi determinado por FTIR. A Figura 3 mostra os espectros de FTIR do não tratado, modificado, meio de fluxo rápido e de fluxo de papéis de filtro quadrados. Havia três passos envolvidos na modificação química dos grupos aminoalquilo, utilizando APS sobre as superfícies de celulose. Passo um envolveu a hidrólise de APS para proporcionar o derivado de silanol de APS. Passo dois envolvido a adsorção do derivado hidrolisado APS sobre as fibras de celulose através de ligações de hidrogénio de grupos OH a partir de Hydrolyzed APS derivado e as fibras de celulose. Passo três envolveu a condensação do derivado de APS adsorvida, que levaram ao enxerto do derivado de APS sobre a superfície da fibra de celulose por meio de ligação Si-OC e a formação de ligações Si-O-Si pontes de siloxano 34. Como mostrado na Figura 3A, o incremento da banda em 1.650 cm-1 foi atribuído à flexão de grupos NH2 e um incremento da banda a 2885 cm-1 correspondente ao CH 2 vibrações da porção propilo silano. Para o papel quadrado filtro de médio fluxo original, as bandas em 902-1,170 cm -1 e 1,210-1,500 cm -1 corresponde às vibrações das ligações COC de pontes glicosídicas e CH vibrações de alongamento. Depois de tratar o papel quadrado com APS, o aumento em intensidade a estas duas larguras de banda indica que eles pertencem a Si-O-CH celulose e deformações de grupos SiOC-H, respectivamente. Semelhante ao de médio flow filtrar papel quadrado, os espectros de fast-fluxo de papel quadrado de filtro modificado também aumentou em intensidade a 1.650 cm -1 por NH2, devido à modificação química com APS (Figura 3B). Os fortes picos característicos nos 972 1.180 cm-1 gama foram atribuídos ao Si-O-Si e ligações SO-celulose; o pico mais alto estava em 1.003 cm -1, devido à sobreposição da ligação Si-O-Si eo CO alongamento da celulose 34. Os laços característicos na faixa de comprimento de onda entre 1.188 e 1.510 cm-1 para APS tratados papel quadrado são causadas pelas vibrações das ligações COC de pontes glicosídicas e CH vibrações de alongamento. Os CH 2 ligações de vibração de alongamento foram mostrados na 2,800-2,980 cm -1 e o pico mais alto foi de 2.932 cm -1 para o APS tratada papel quadrado. Em conclusão, a APS pode ser covalentemente enxertado para No. 1 e No. 113 papéis quadrados filtro.


Figura 4. respostas de fluorescência para diferentes concentrações de glutaraldeído na imobilização de IgG-FITC sobre os discos de papel (Método B) Definições de fluorescência Imager molecular:. A excitação, 488 nm, emissão, 530 nm, resolução, 100 micrómetro A:. Fluorescência resposta para 0, 0,001%, 0,005%, 0,01% e 0,050% glutaraldeído B:. resposta de fluorescência para 0, 0,050%, 0,100%, 0,250% e 0,500% de glutaraldeído. A concentração de IgG-FITC em cada disco foi de 0,01 mg / ml. Um aumento na concentração de glutaraldeído a um máximo de 0,05% resultou num aumento da quantidade de carga de IgG-FITC. As concentrações de glutaraldeído acima de 0,05% diminuiu a quantidade de carga de IgG-FITC. Por favor clique aqui para ver uma versão maior destafigura.

Figura 5
Figura 5. resposta de fluorescência (A) e o resultado colorimétrico (B) de diferentes concentrações de IgG-FITC sobre o meio-flow IgG-FITC imobilizado e discos de fast-fluxo de papel de filtro (Método B) Definições para imager molecular de fluorescência: Excitação. , 488 nm, emissão, 530 nm, resolução de 100 micrómetros. # 1 representa grau No. 1, disco de papel de filtro de médio fluxo e # 113 representa grau No. 113 fast-fluxo de disco de papel de filtro. Discos de papel modificado com APS foram tratados com 0,05% de glutaraldeido em primeiro lugar. Em seguida, diferentes concentrações de IgG-FITC foram carregadas para os discos de papel de glutaraldeído modificado. Aumentando a concentração de carga de IgG-FITC aumentou a quantidade do imobilizada de IgG-FITC sobre os discos de papel. No entanto, o aumento das concentrações de IgG-FITC imobilizada não melhorou a capacidade de ligação ao antigénio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O fluxo de trabalho de base para a imobilização covalente de anticorpos sobre discos de papel de celulose funcionalizada com amina é mostrado na Figura 1. O anticorpo de coelho anti-IgG humana-FITC foi covalentemente imobilizada sobre os discos de papel de celulose. A fluorescência a partir de discos de papel indicou a imobilização de anticorpos para os discos de papel, e a intensidade de fluorescência foi directamente proporcional à concentração de anticorpos imobilizados. Peroxidase IgG anti-coelho de cabra conjugado foi então aplicado para determinar a capacidade de ligação dos anticorpos imobilizados. Grupos amina secundários e grupos aldeído podem reagir uns com os outros para formar uma base de Schiff, a qual tem sido utilizado em bioconjugação 35. Eles também foram usados ​​aqui para imobilização covalente de capturaanticorpos. No método A (Figura 1A), -NH 2 foi introduzido para os discos de papel de celulose e -CHO foi derivado a partir do anticorpo de coelho anti-IgG humana-FITC por oxidação regi Fc dos anticorpos com periodato de sódio. Da mesma forma, os efeitos de várias concentrações de periodato de sódio e os anticorpos de IgG-FITC foram também analisadas. Como mostrado na Figura S1 e Figura S2, periodato de sódio a partir de concentrações de 0 a 1 mM e o anticorpo de coelho anti-IgG humana-FITC 0,016-0,16 mg / ml teve pouco efeito sobre a oxidação de IgG de 0,08 mg / ml de anticorpo de coelho anti-humano -FITC. A quantidade de anticorpos que foram covalentemente ligados aos discos de papel aumentou com uma concentração crescente de anticorpos de captura de 0 a 0.075 mg / ml (Figura S3A).

Uma mudança de cor fraco foi observado quando a capacidade de ligação foi determinada pelo ensaio de peroxidase. Isto pode ser devido à utilização deo excesso de periodato de sódio, que reage com os anticorpos de captura e provoca uma perda de actividade de ligação. É provável que o periodato de sódio não podem ser completamente lavados a partir de discos de papel. Isto foi confirmado pela simples princípio de que uma solução de periodato de sódio fornece uma cor amarela, quando misturada com solução purpald. Portanto, os anticorpos periodato oxidadas foram carregados nos discos de papel e incubou-se durante 1 hora. Os discos de papel foram lavadas três vezes com PBS (contendo 0,05% de Tween-20), e, em seguida, solução purpald foi adicionado a estes discos. Os discos de papel mostrou uma cor púrpura imediatamente, indicando a presença de grupos de aldeído de anticorpos oxidados-periodato. Esta cor púrpura mudou para amarelo dentro de 10 minutos, o que confirmou a presença de periodato de sódio sobre os discos de papel.

Alternativamente, foi utilizada uma reticulação com glutaraldeído método (método B, Figura 1B) para conectar o grou aminaPS a partir dos discos de papel tratados com APS e anticorpos. As concentrações de glutaraldeído (Figura 4) e de coelho anti-IgG humana-FITC (Figura 5A) que foram carregados sobre os discos de papel de celulose foram optimizados. Como mostrado na Figura 4, a intensidade de fluorescência atingiu um máximo de 0,05% de glutaraldeído, o que significa que a carga de coelho anti-IgG humana-FITC ficou saturado no disco de papel de celulose com esta concentração; um aumento da concentração de glutaraldeído a 2,5% não demonstraram um aumento na quantidade de anticorpo de coelho anti-IgG humana-FITC sobre os discos de papel de celulose (Figura S4). A intensidade de fluorescência também aumentou com concentrações crescentes de IgG de coelho-FITC anti-humano que foram carregados para os discos de papel (Figura 5A). A cor azul desenvolvida imediatamente após a adição da solução de substrato e peróxido de hidrogénio a mistura de TMB para os discos de papel, o qual continha os peroxidasanticorpos e conjugados de detecção (Figura 5B). Além disso, o tampão de bloqueio que continha 10% de leite em pó desnatado foi demonstrado que retêm a eficiência de bloqueio depois de 15 lavagens (Figura S5). Método B foi seleccionado para testar a aplicação dos anticorpos imobilizados, como foi demonstrado aumentada a actividade de ligação ao seu alvo. Assim, uma concentração de 0,025 mg / ml de anticorpos de captura foi utilizado para a detecção de IgG.

Figura 6
Figura 6. Curvas de calibração para a determinação da IgG por ELISA à base de papel. # 1 representa o grau No. 1, do disco de papel de filtro de média de fluxo, e # 113 representam grau 113 No. rápido fluxo de disco de papel de filtro. O painel A apresenta a leitura superior cor-de fluxo médio (# 1) e rápido de fluxo (# 113) discos de papel de celulose com diferentes concentrações de IgG. O painel inferiorB apresenta o resultado de ELISA para diferentes concentrações de IgG. Triplicados foram utilizados para determinar o desvio padrão (SD). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Cabra anti-rato IgG-Fc de anticorpo de captura fragmento, o soro de IgG, e anticorpo de cabra anti-fragmento de IgG de ratinho conjugado com HRP-Fc foram usadas para o ensaio em sanduíche. Como mostrado na Figura 6 e Figura S6, a concentração de soro IgG de 0 a 500 ng / ml apresentaram uma relação linear com a intensidade colorimétrica quando cada passo foi incubada durante 1 hora. Na Figura S6, a variação da cor com diferentes concentrações de IgG era óbvia durante 1 hora de incubação. No entanto, os resultados da 10 minutos de incubação não mostraram uma alteração evidente na intensidade da cor com diferentes concentrações de IgG. Assim, o sensitivity deste ELISA baseado em papel era adequado para o desenvolvimento de testes práticos point-of-care.

Figura S1. Respostas de fluorescência para diferentes concentrações de periodato de sódio (Método A). As concentrações variando de periodato de sódio foram misturados com anticorpo de coelho anti-IgG humana-FITC a uma concentração de 0,016 mg / ml e utilizados para o estudo de actividade de oxidação do anticorpo. Ao aumentar a concentração do periodato de sódio, a quantidade de carga de IgG-FITC aumentou e alcançou um máximo a 0,25 mM. Observou-se que as concentrações de periodato de sódio que é mais elevado do que este não aumentou a quantidade de IgG-FITC imobilizada. Triplicados foram utilizados para determinar o desvio padrão (SD). Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

Figura S2. resposta de fluorescências para diferentes concentrações de coelho anti-IgG humana-FITC (Método A). A concentração de periodato de sódio foi de 0,25 mM na solução para o estudo de actividade de oxidação do anticorpo, e a concentração final de anticorpo de coelho anti-IgG humana-FITC em cada disco era de 0,016 mg / ml. Quando a concentração de periodato de sódio foi fixada, a concentração de IgG-FITC teve pouco efeito sobre a oxidação de IgG-FITC. Triplicados foram utilizados para determinar o desvio padrão (SD). Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

Figura S3. Foram usadas resposta de fluorescência e resultados colorimétrico de carregamento de diferentes concentrações de coelho oxidado anti-IgG humana-FITC para os discos de papel (método a). Para a oxidação por periodato de sódio, 0,08 mg / ml de periodato de sódio IgG-FITC e 0,25 mM. A diluição de anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase foi1: 50.000. O aumento da concentração de carga de IgG-FITC sobre os discos de papel de celulose aumentou a quantidade de imobilizado IgG-FITC, mas não teve efeito na ligação de destino. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

Figura S4. Fluorescência resposta a concentrações elevadas de glutaraldeído na imobilização de IgG-FITC sobre os discos de papel de celulose (método B). A concentração de IgG-FITC em cada disco foi de 0,01 mg / ml. As concentrações de glutaraldeído que foram maiores que 0,25% não aumentou a quantidade de imobilizado IgG-FITC sobre os discos de papel de celulose. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

Figura S5. Efeito do número de vezes de lavagem. A: Foi. hing três vezes B: lavagem 15 vezes. Anticorpos de captura imobilizadas no papel quadrado de celulose ainda tinha boa capacidade de ligação aos seus alvos, embora o papel quadrado foi submetida a vórtice 15 vezes. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

Figura S6. -Papel baseado nos resultados de ELISA para a IgG. Para as concentrações de IgG a partir de 0 a 500 ng / ml, os resultados de uma hora de incubação são melhores do que os resultados a partir de 10 minutos de incubação. Para concentrações elevadas de IgG, 10 minutos, tempo suficiente para a incubação. Triplicados foram utilizados para determinar o desvio padrão (SD). Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

Figura S7. Microscopia eletrônica de varredura (SEM) imagens de papel de filtro de médio fluxo em diferentes ampliações. A: 85X e B: 20,000X. A microscopia electrónica de varrimento de emissão de campo (FE-SEM), operando a 5 kV foi empregue para determinar a morfologia das partículas. As fibras de celulose são aleatoriamente reticulado. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

Figura S8. Imagens SEM de papel de filtro fast-fluxo em diferentes ampliações. A: 100X e B: 20,000X. A microscopia electrónica de varrimento de emissão de campo (FE-SEM), operando a 5 kV foi empregue para determinar a morfologia das partículas. As fibras de celulose são aleatoriamente reticulado. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

revestimento directo de captura de anticorpo purificado por afinidade de cabra anti-IgG de rato-Fc em discos de papel de celulose não modificado foi realizado para detectar concentrações de IgG. Os resultados indicaram que, adicionalmente a fixação dos anticorpos de captura é necessário para reprodutibilidade. A técnica de silano foi utilizado com sucesso para introduzir grupos funcionais de amina para os discos de papel de celulose 34. A concentração de EPA afecta a imobilização dos anticorpos. Portanto, a quantidade de APS em acetona também foi otimizado. 1 ml de APS em 10 ml de acetona foi uma concentração óptima para o enxerto do grupo amina para a imobilização de anticorpos por meio de um agente de reticulação de glutaraldeído. Os anticorpos foram enxertadas sobre os discos de papel de celulose por oxidação com periodato e glutaraldeído métodos de ligação cruzada. Os nossos resultados mostraram que a capacidade de ligação de anticorpos imobilizados através do método de reticulação com glutaraldeído foi melhor do que o método de oxidação com periodato para Medio-fluxo e discos de papel de filtro de fluxo rápido. Além disso, os anticorpos de captura, que foram imobilizadas em discos de papel de celulose por meio de um método de reticulação com glutaraldeído, retiveram a sua função e foram estavelmente imobilizada mesmo que o papel foi sujeito a tensão mecânica de 15 lavagens em vórtice. Dez por cento do tampão de bloqueamento de leite em pó desnatado foi encontrada para manter a sua eficiência de bloqueio depois de 15 lavagens (Figura S5).

Os anticorpos covalentemente imobilizados foram usados ​​para executar um ELISA de sanduíche com a detecção de anticorpos IgG. IgG a uma concentração de 100 ng / ml foi detectado a olho nu, usando este ensaio baseado em disco de papel. A concentração de soro IgG de 0 a 500 ng / ml apresentaram uma relação linear com a intensidade colorimétrica, quando cada passo foi incubada durante uma hora. O teste de imunoensaio para este disco de papel com base ELISA exigia menos reagente amostra e parecia ser mais eficiente do que os imunoensaios convencionais 36 Figura e Figura S7 S8, respectivamente. Tal como ilustrado nestas figuras, as fibras são aleatoriamente reticulado para ambos os tipos de discos de papel de filtro 25. A razão para esta elevada sensibilidade pode ser a espessura do disco de papel. Para discos de papel de filtro de fast-fluxo a espessura foi de 420 mm em comparação com 180 mm para papel de filtro de médio fluxo. Assim, mais anticorpos de captura eram susceptíveis de ser imobilizadas em discos de papel de filtro rápido de fluxo, o que iria aumentar ainda mais a sensibilidade do ensaio. Ao mesmo tempo, o tamanho dos poros para os discos de papel de filtro rápido de fluxo (30 uM) foi maior do que o dos discos de papel de filtro de média de fluxo (11 & #181; m). Após o bloqueio da superfície de papel, a dimensão dos poros da primeira ainda era grande o suficiente para dirigir o fluxo de líquido, sem um sistema de energia extra. No entanto, a taxa de fluxo para o tampão no último foi mais lenta. Portanto, papel de filtro rápido de fluxo era melhor do que o papel de filtro de média de fluxo na aplicação de imunoensaios.

A reprodutibilidade dos anticorpos sobre os discos de papel de filtro imobilizadas foi avaliada por incubação adicional dos discos de papel com IgG de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase e detecção colorimétrica do resultado depois de carregar a solução de mistura de substrato TMB e de peróxido de hidrogénio. O desvio padrão foi inferior a 10% para este dispositivo baseado em papel. A estabilidade de coelho anti-IgG humana-FITC sobre os discos de papel de celulose modificados -NH 2 foi testada por até dois meses. Os discos de papel que foram armazenadas a 4 ° C mantiveram a sua actividade de ligação para conjugado com peroxidase de IgG de cabra anti-coelho com uma ligeira diminuição da sua binding atividade. No entanto, quando os discos de papel de anticorpo imobilizada foram armazenados à temperatura ambiente ou 60 ° C, que perderam a sua actividade de ligação devido à secura e alta temperatura. Os anticorpos capturados poderia ter desestabilizado e desnaturado sob estas condições.

Existem alguns passos críticos na imobilização de anticorpos de captura sobre os discos de papel de celulose utilizando glutaraldeído como agente de reticulação. Passo 1.2 para enxertar grupos amina sobre os discos de papel é um passo crítico no sucesso imobilização covalente de anticorpos de captura. Se este passo falhar, todo o processo de imobilização irá falhar. FTIR foi utilizado para determinar se os grupos de amina foram imobilizadas com sucesso sobre os discos de papel (passo 1.6). Em segundo lugar, a enxertia de grupos aldeído nos discos de papel de celulose é um passo crítico (Passo 2.2.1 e Passo 3.1). Os anticorpos foram covalentemente imobilizada sobre os discos de papel de celulose através da formação de uma base de Schiff. Finalmente, O passo para imobilizar anticorpos de captura sobre os discos de papel de filtro é importante (Passo 2.2.3, Passo 3.4, e Passo 3.5). Os grupos amina dos anticorpos de captura reagiu com os grupos de aldeído a partir de discos de papel de celulose para fixar os anticorpos sobre os discos de papel. Se este passo não foi bem sucedido, os anticorpos de captura não seria imobilizar sobre os discos de papel e todos os testes de ELISA de aplicação seria negativo. Podemos utilizar um gerador de imagens de fluorescência molecular para determinar a presença de anticorpos de captura. Conjugado com peroxidase de IgG de cabra anti-coelho e reacções colorimétricas à base de peroxidase pode ser usado para confirmar a capacidade de ligação dos anticorpos imobilizados.

Este protocolo pode encontrar alguns problemas, tais como uma elevada interferência de fundo para o sinal, nenhum sinal ou um sinal fraco, e uma leitura de cor desigual. As possíveis causas desses problemas e métodos de resolução de problemas para superar esses problemas são discutidos abaixo. sinais de fundo elevados ocorrem geralmente due a um tempo de bloqueio curto. Isto pode ser resolvido aumentando o tempo de incubação de bloqueio, lavagem dos discos de papel completamente, e evitando a adição de excesso de anticorpo de detecção conjugado enzima para remover os sinais de fundo elevado. As causas possíveis incluem uma ausência de antigénio alvo, ao longo do bloqueio, tempo de incubação suficiente, e um anticorpo de detecção conjugado de enzima não-funcional. Para superar esses problemas, juntam-se os antigénios alvo e incubadas durante um período de tempo adequado, utilizando um novo conjugado de anticorpo e armazenando-o, tal como sugerido pelo fabricante. É aconselhável incluir um controlo positivo para a detecção. leituras de cor desigual são devido ao empilhamento de discos de papel durante o processo de enxerto. Para evitar este problema, os discos de papel têm de ser separados durante o processo de enxerto APS, e o enzima conjugado do anticorpo ao antigénio e de detecção devem ser distribuídos uniformemente sobre o disco de papel de cada etapa.

Embora o ensaio com base em papel é um simplese custo método eficaz, há limitações. A orientação de anticorpos na superfície do substrato é crítica para o desempenho do imunoensaio, como o agente de reticulação de glutaraldeído reage com os grupos amina da região de Fab e a região Fc dos anticorpos de captura. Assim, os anticorpos imobilizados não ocorrem de forma altamente orientados. Uma vez que existem mais grupos de amina a partir da região do que o Fab da região Fe dos anticorpos IgG, a actividade de ligação dos anticorpos imobilizados é ainda suficientemente elevada para a sua aplicação.

Diferentes métodos de funcionalização da superfície de papel de celulose foram resumidos em um relatório recente 37. Reagentes tais como divinil sulfona; 1,4-phenylenediisothiocyanate; 4-azido-benzenodiazónio; epicloridrina; 4-azido-a-fluoro-2-nitrocyclohexane; e 4-mercapto-benzenodiazónio, poderia ser usado para imobilizar biomoléculas covalentemente em papel de celulose. Adsorção e aprisionamento também foram utilizadospara revestir o papel de celulose com biomoléculas. Em comparação com os outros métodos, a combinação da técnica de silano e o agente de reticulação de glutaraldeído para a imobilização covalente de anticorpos em papel de celulose é um método simples. Além disso, esta combinação pode ter pouco efeito sobre o desempenho térmico e mecânico do papel de celulose, permitindo o fluxo de passagem vertical máxima em imunoensaios. Esta estratégia poderia ser estendido para imobilizar outras biomoléculas no papel de celulose.

A metodologia aqui demonstrada pode potencialmente ser alargado para a detecção de qualquer analito, desde que anticorpos contra directos que estão disponíveis. Este método também pode ser utilizado para desenvolver detecção multiplex. Por exemplo, em um papel quadrado, diferentes áreas podem ser distinguidos vários alvos. Os anticorpos de captura para os alvos podem ser imobilizados por meio de um agente de reticulação de glutaraldeído na sua área específica. Isto pode ser seguido pelos ELISUm procedimento para detectar vários alvos. Assim, o método proposto faz com que o ELISA um instrumento versátil à base de papel para a detecção de outros alvos usando a olho nu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellulose filter paper, Grade 1 (medium flow filter paper) GE Healthcare Pte Ltd Singapore  1001 110
Cellulose filter paper, Grade 113 (Fast flow filter paper) Sigma-Aldrich, Singapore 1113-320
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich, Singapore G6257 Grade II, 25% in H2O
Surfactant Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore P2287
Bovine serum album  Sigma-Aldrich, Singapore A2153
Skimmed milk powder Louis François  Packed by Kitchen Capers, Singapore
Tris base Promega H5135
Sodium periodate Merck 106597
Na2HPO4 Merck 106585
KH2PO4 Merck 104873
NaCl CALBIOCHEM 567441
NaOH Merck 106462
HCl Merck 100317
phosphate buffer saline (PBS) N/A N/A PBS, containing 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol⁠/⁠L Na2HPO4 and 1.5 mmol/L KH2PO4, is prepared with water and adjusted to pH 7.4 with 0.1 mol/L NaOH or 0.1 mol/L HCl
Acetone Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore 9005-68
Mixture of TMB and hydrogen peroxide solution  1-Step ultra TMB-ELISA solution , Thermo Scientific Pierce 34029 1 L
Rabbit anti-human IgG-FITC TWC/Bio Pte Ltd Singapore sc-2278
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG TWC/Bio Pte Ltd Singapore sc-2030
Affinity purified goat anti-Mouse IgG-Fc coating antibody Bethyl Laboratories, Inc A90-131A
Mouse reference serum Bethyl Laboratories, Inc RS10-101-5 9.5 mg/ml
HRP conjugated goat anti-mouse IgG-Fc detection antibody Bethyl Laboratories, Inc A90-131P
Equipment
Fourier transform infrared spectrophotometer Shimadzu IR Prestige-21  N/A
Fluorescence molecular imager Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore N/A
Oven NUVE FN500 N/A
Turbo mixer VM-2000 MYC LTD N/A
ImageJ RGB, free download N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). J. Virol. Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
  2. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M. Simple telemedicine for developing regions: camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis. Anal. Chem. 80 (10), 3699-3707 (2008).
  3. Lode, P. V. Point-of-care immunotesting: approaching the analytical performance of central laboratory methods. Clin. Biochem. 38 (7), 591-606 (2005).
  4. Posthuma-Trumpie, G. A., Amerongen, A. V., Korf, J., Berkel, W. J. V. Perspectives for on-site monitoring of progesterone. Trends Biotechnol. 27 (11), 652-660 (2009).
  5. Lim, D. V., Simpson, J. M., Kearns, E. A., Kramer, M. F. Current and developing technologies for monitoring agents of bioterrorism and biowarfare. Clin. Microbiol. Rev. 18 (4), 583-607 (2005).
  6. Li, X., Tian, J., Shen, W. Progress in patterned paper sizing for fabrication of paperbased microfluidic sensors. Cellulose. 17 (3), 649-659 (2010).
  7. Nie, Z., et al. Electrochemical sensing in paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 10, 477-483 (2010).
  8. Delaney, J. L., Hogan, C. F., Tian, J., Shen, W. Electrogenerated chemiluminescence detection in paper-based microfluidic sensors. Anal. Chem. 83 (4), 1300-1306 (2011).
  9. Oh, Y. K., Joung, H. A., Kim, S., Kim, M. G. Vertical flow immunoassay (VFA) biosensor for a rapid one-step immunoassay. Lab Chip. 13 (5), 768-772 (2013).
  10. Cheng, C. M., et al. Paper-based ELISA. Angew. Chem. 122 (28), 4881-4884 (2010).
  11. Jarujamrus, P., Tian, J., Li, X., Siripinyanond, A., Shiowatana, J., Shen, W. Mechanisms of red blood cells agglutination in antibody-treated paper. Analyst. 137 (9), 2205-2210 (2012).
  12. Credou, J., Volland, H., Dano, J., Berthelot, T. A one-step and biocompatible cellulose functionalization for covalent antibody immobilization on immunoassay membranes. J. Mat. Chem. B. 1, 3277-3286 (2013).
  13. Kong, F., Hu, Y. F. Biomolecule immobilization techniques for bioactive paper fabrication. Anal. Bioanal. Chem. 403, 7-13 (2012).
  14. Orelma, H., Teerinen, T., Johansson, L. S., Holappa, S., Laine, J. CMC-modified cellulose biointerface for antibody conjugation. Biomacromolecules. 13, 1051-1058 (2013).
  15. Yu, A., et al. Biofunctional paper via covalent modification of cellulose. Langmuir. 28 (30), 11265-11273 (2012).
  16. Stollner, D., Scheller, F. W., Warsinke, A. Activation of cellulose membranes with 1,1′-carbonyldiimidazole or 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate as a basis for the development of immunosensors. Anal Biochem. 304 (2), 157-165 (2002).
  17. Bora, U., Sharma, P., Kannan, K., Nahar, P. Photoreactive cellulose membrane - a novel matrix for covalent immobilization of biomolecules. J. Biotechnol. 126 (2), 220-229 (2006).
  18. Sharma, P., Basir, S. F., Nahar, P. Photoimmobilization of unmodified carbohydrates on activated surface. J Colloid Interface Sci. 342 (1), 202-204 (2010).
  19. Brumer, H., Zhou, Q., Baumann, M. J., Carlsson, K., Teeri, T. T. Activation of crystalline cellulose surfaces through the chemoenzymatic modification of xyloglucan. J. Am. Chem. Soc. 126 (18), 5715-5721 (2004).
  20. Araujo, A. C., Song, Y., Lundeberg, J., Stahl, P. L., Brumer, H. Activated paper surfaces for the rapid hybridization of DNA through capillary transport. Anal Chem. 84 (7), 3311-3317 (2012).
  21. Xu, C., Spadiut, O., Araujo, A. C., Nakhai, A., Brumer, H. Chemo-enzymatic Assembly of Clickable Cellulose Surfaces via Multivalent Polysaccharides. ChemSusChem. 5 (4), 661-665 (2012).
  22. Filpponen, I., et al. Generic method for modular surface modification of cellulosic materials in aqueous medium by sequential "click" reaction and adsorption. Biomacromolecules. 13 (3), 736-742 (2012).
  23. Feese, E., Sadeghifar, H., Gracz, H. S., Argyropoulos, D. S., Ghiladi, R. A. Photobactericidal porphyrin-cellulose nanocrystals: synthesis, characterization, and antimicrobial properties. Biomacromolecules. 12 (10), 3528-3539 (2011).
  24. Zang, D., Ge, L., Yan, M., Song, X., Yu, J. Electrochemical immunoassay on a 3D microfluidic paper-based device. Chem. Commun. 48 (39), 4683-4685 (2012).
  25. Ge, L., Yan, J. X., Song, X. R., Yan, M., Ge, S. J., Yu, J. H. Three-dimensional paper-based electrochemiluminescence immunodevice for multiplexed measurement of biomarkers and point-of-care testing. Biomaterials. 33 (4), 1024-1031 (2012).
  26. Wang, S., et al. Paper-based chemiluminescence ELISA: lab-on-paper based on chitosan modified paper device and wax-screen-printing. Biosens. Bioelectron. 31 (1), 212-218 (2012).
  27. Koev, S. T., et al. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
  28. Wang, S. M., et al. Simple and covalent fabrication of a paper device and its application in sensitive chemiluminescence immunoassay. Analyst. 137 (16), 3821-3827 (2012).
  29. Sadira, S., Prabhakaranc, M. P., Wicaksonob, D. H. B., Ramakrishna, S. Fiber based enzyme-linked immunosorbent assay for C-reactive protein. Sensor Actuat B-Chem. 205, 50-60 (2014).
  30. Koga, H., Kitaoka, T., Isogai, A. In situ modification of cellulose paper with amino groups for catalytic applications. J. Mater. Chem. 21, 9356-9361 (2011).
  31. Klemm, D., Heublein, B., Fink, H. P., Bohn, A. Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material. Angew. Chem., Int. Ed. 44 (22), 3358-3393 (2005).
  32. Fernandes, S. C. M., et al. Bioinspired antimicrobial and biocompatible bacterial cellulose membranes obtained by surface functionalization with aminoalkyl groups. ACS Appl. Mater. Interfaces. 5 (8), 3290-3297 (2013).
  33. Pharos FX plus molecular imager instructions, Catalog Number 170-9460. , (2005).
  34. Tee, Y. B., Talib, R. A., Abdan, K., Chin, N. L., Basha, R. K., Yunos, K. F. M. Aminosilane-grafted cellulose. BioResourses. 8 (3), 4468-4483 (2013).
  35. Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nat Protoc. 2, 1152-1165 (2007).
  36. Guidi, A., Laricchia-Robbio, L., Gianfaldoni, D., Revoltella, R., Del Bono, G. Comparison of a conventional immunoassay (ELISA) with a surface plasmon resonance-based biosensor for IGF-1 detection in cows' milk. Biosens Bioelectron. 16, 971-977 (2001).
  37. Ahmed, S., Bui, M. N., Abbas, A. Paper-based chemical and biological sensors: Engineering aspects. Biosens Bioelectron. 77, 249-263 (2016).

Tags

Biochemistry 116 Edição discos de papel de celulose técnica de silano imobilização covalente glutaraldeído a detecção de IgG imunoensaio
A ligação covalente de anticorpos para celulose discos de papel e suas aplicações em visível a olho nu colorimétricos imunoensaios
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peng, Y., Gelder, V. V., Amaladoss,… More

Peng, Y., Gelder, V. V., Amaladoss, A., Patel, K. H. Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays. J. Vis. Exp. (116), e54111, doi:10.3791/54111 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter