Abstract
Denna rapport presenterar två metoder för kovalent immobilisering av infångningsantikroppar på cellulosa filterpapperskvalitet nr 1 (medelflödesfilterpapper) skivor och kvalitet nr 113 (snabbt flöde filterpapper) skivor. Dessa cellulosapappersskivor transplanterades med aminfunktionella grupper genom ett silankopplingsteknik innan antikropparna immobiliserade på dem. Perjodatoxidation och glutaraldehyd tvärbindningsmetoder användes för att ympa infångande antikroppar på cellulosapappersskivor. För att säkerställa den maximala bindningskapaciteten av de infångningsantikroppar till sina mål efter immobilisering, undersöktes effekterna av olika koncentrationer av natriumperjodat, glutaraldehyd, och infångande antikroppar på ytan av pappersskivorna undersöktes. Antikropparna som var belagda på de aminfunktionaliserade cellulosapappersskivor genom ett glutaraldehyd tvärbindningsmedel uppvisade förbättrad bindningsaktivitet till målet jämfört med perjodatoxidation metoden. IgG (i mus referensserum) användes som ett referensmål i denna studie för att testa programmet för kovalent immobiliserade antikroppar genom glutaraldehyd. En ny pappersbaserad, enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) med framgång utvecklats och validerats för detektion av IgG. Denna metod kräver inte utrustning, och den kan upptäcka 100 ng / ml IgG. Den snabba flödesfilterpapper var mer känslig än den medelflödesfilterpapper. Inkubationstiden för denna analys var kort och krävde små provvolymer. Denna blotta ögat, kan kolorimetrisk immun utökas för att upptäcka andra mål som identifieras med konventionell ELISA.
Introduction
Point-of-care testning (POCT) diagnostisk undersökning är viktig för utvecklingen av nya strategier för läkemedel, personlig medicin, och vårdhem 1. Cellulosa papper används ofta som plattformar i immun, eftersom de är billiga, lättillgängliga, och bekant för användare 2. Dessutom kan den porösa strukturen hos cellulosapapper besitter kraften för att driva vätskeflöde utan ytterligare energipåverkan. Register över pappersbaserade bioanalys kan hittas så tidigt som den 20: e århundradet, när papper kromatografi först uppfanns 1952. vanligaste exemplet är immunokromatografiska tester 3, såsom graviditet och diabetes testremsor. Dessa tester ger relativt snabba analystider och billig analys 4. På grund av sin enkelhet, har dessa konventionella pappersremsa tester använts i stor utsträckning POCT diagnostik 5.
Detektionsmetoder, inklusive kolorimetriska 6, electrokemiska 7, och elektrokemiluminiscensen 8 metoder har rapporterats för att mäta mål i biologiska prover. Förutom dessa kvantitativa metoder, är också viktig för utvecklingen av diagnostiska anordningar en tillförlitlig metod för att immobilisera antikroppar på cellulosapapper. Icke-specifik adsorption är huvudstrategin för att modifiera antikroppar på ytan av pappersbaserade enheter 9, 10 för att säkerställa maximal bindningskapacitet till sina mål efter immobilisering. Emellertid en tidigare studie visade att antikroppar som är adsorberade på cellulosapapper kan desorbera från fibrerna 11 med 40%. Således kan direkt adsorption av antikroppar på cellulosa inte ge reproducerbara resultat 12. Kovalent immobilisering av antikroppar som är ympade på pappersytor är en alternativ metod för att utveckla effektiva pappersbaserade bioanalyser 13. Olika metoder har rapporterats för modifiering av cellulosa 14, 15 12. Karbonyldiimidazol i kombination med en-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborat 16; 1-fluoro-2-nitro-4-azidobenzene genom en UV-baserad aktiveringsstrategi 17, 18; en chemoenzymatic strategi baserad på xyloglukan ändring 19; en 1,4-phenylenediisothiocyanate bindningsmedlet 20; heteropolysackarid oxidation 21 klick kemi 22; och katjoniska porfyriner 23 har använts för att kovalent immobilisera biomolekyler på cellulosapapper. Kitosan modifierat papper har använts för att utveckla pappersbaserade immunodevices 24-26 eftersom det är riklig och biokompatibel 27. Chitosan är katjoniska och fäster starkt till anjoniska cellulosa 27. De infångande antikroppar är immobiliserade på papperet genom kitosan beläggning och glutaraldehyd tvärbindning. Perjodatoxidation är en annan metod för ympning capture antikroppar på cellulosapapper 28. I denna metod, är natriumperjodat fläckvis på papperet för att omvandla 1,2-dihydroxi (glykol) -grupper i cellulosan direkt till aldehydgrupper. Aldehydgrupperna används sedan för att bilda kovalenta bindningar mellan polysackarider och antikroppar 28. Även om tillverkningen är enkel, är det svårt att helt tvätta ut natriumperjodat. Det otvättade natriumperjodat kan orsaka ytterligare oxidation av antikroppar som är immobiliserade på cellulosapapper, som påverkar aktivitet och stabilitet av antikropparna N -. (3-dimetylaminopropyl) - N -ethylcarbodiimide hydroklorid och N-hydroxisuccinimid tvärbindare används också för att kovalent immobilisera antikroppar på electrospun poly-L-mjölksyra och cellulosaacetat nanofibrer för utveckling av nanofiber-baserade analyser 29.
I denna studie var ett silankopplingsteknik som används för att ympa aminfunktionella grupper på cellulose pappersskivor. Denna teknik hjälper till att behålla den ursprungliga porstorleken, uppsugning, och filtreringshastighet av cellulosafilterpapper, så att maximala vertikala genomströmnings i immunanalyser. Silankopplingsteknik har använts i stor utsträckning i biosensorer för att funktionalisera substratytor med sekundära amingrupper, följt av ytterligare modifiering med hjälp av biomolekyler. Ympning av amingrupper på matrisytan innefattar en kondensationsreaktion mellan OH-grupperna i de organofunktionella silan agenter och matrissubstratet 30. De cellulosapapper skivorna funktion med amingrupper av silankopplings till 3-aminopropyltrimetoxisilan (APS) 31. Detta följdes av kovalent immobilisering av infångningsantikroppar med användning av två olika metoder. Den första metoden involverade bindning av perjodatoxiderad infångnings antikroppar mot aminfunktionaliserade cellulosapappersskivor. Den andra metoden användes glutaraldehyd som tvärbindningsmedel för att fästa den infångnings antibodies till amingruppen-funktionaliserad cellulosa pappersskivor. Närvaron av infångningsantikroppar bekräftades genom kanin-anti-human-IgG-fluoresceinisotiocyanat (FITC), med användning av en fluorescensmolekyl imager. Bindningsaktiviteten av kanin-anti-human-IgG-FITC till get anti-kanin IgG utvärderades också genom peroxidassubstrat. Effekterna av olika koncentrationer av natriumperjodat, glutaraldehyd, och infångande antikroppar undersöktes. Tillämpningen testet av den immobiliserade infångningsantikroppen genomfördes framgångsrikt genom detektion av IgG-serum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förlängning aminfunktionella grupper på cellulosapapper skivor
- Förbered en bit av fyrkantiga papper med en dimension av 1 cm x 1 cm och 100 pappersskivor gjorda av klass nr 1 cellulosapapper med en diameter på 6,0 mm (medelflödesfilterpapper) med ett hålslag.
- Att härleda -NH2-grupper på pappersskivorna, blanda 1 ml APS och 10 ml aceton i en 50 ml glasflaska i dragskåp. Lägg pappersskivor till nygjord reagens APS blandning, och inkubera i 5 timmar med orbital omrörning (200 rpm) vid rumstemperatur 32.
Försiktighet: Handtag APS och aceton i dragskåpet. - Dekantera överflödig lösning från 50 ml glasflaska i en avfallsbehållare organisk.
- Tillsätt 10 ml aceton till glasflaskan, blanda väl och dekantera helt för att avlägsna eventuella oreagerade APS och andra orenheter. Upprepa detta steg två gånger.
- Sprid pappersskivor på pappersduk och placeras i en ugn vid 110 ° under 3 timmar. tillåtapappersskivor svalna. Lagra skivorna i en 50 ml centrifugrör vid rumstemperatur.
- Använda FTIR (FTIR) för att kontrollera ympning av amingrupper på cellulosan fyrkantiga papper, såsom beskrivs nedan (figur 3A).
- Slå på datorn och öppna FTIR spektroskopi instrumentet.
- Öppna programvaran för FTIR spektroskopi.
- Gå till "Mätning → Initiera". Rektanglar för 'BS: KBr ": kommer" Lamp Infraröd "och" Laser "lyser grönt när initieringen är klar.
- Välj "Data" under rektanglar, och välj "% transmittans", "Happ-Genzel", "45", "4,0" och "Min: 400 Max: 4000" för "Measurement läge", "Apodization", " Nej. av Scans "," Resolution "och" Range (cm-1).
- Klicka på "Measure".
- Välj "Datafil" för bakgrundsdata. Skrivaner kommentarerna.
- Klicka på "BKG" för att få baslinjen för bakgrunden.
- Fäst kvadratiska papper på filmprovhållaren.
- Välj "Datafil" för exempeldata. Skriv ner kommentarerna.
- Klicka på "Sample" för att erhålla spektra för provet.
- Stäng FTIR spektroskopi ansökan och stänga av datorn.
- Upprepa ovanstående steg (steg från 1,1 till 1,6) för framställning av aminfunktionaliserat kvalitet nr 113 cellulosa fyrkantiga papper och skivor (snabbt flöde filterpapper), och få FTIR spektra för betyget nr 113 kvadrat papper (Figur 3B).
2. Kovalent immobilisering av antikroppar på Aminfunktioncellulosapapper skivor
Figur 1. Kovalent immobilisering av antikroppar med två olika metoder.A. Antikroppar immobiliserade på aminfunktionaliserade cellulosapappersskivor genom perjodatoxidation. De kolhydratrester oxiderades genom natriumperjodat för att producera aldehydprodukter funktionella grupper. Därefter fick de oxiderade antikropparna lastas på aminfunktionaliserade cellulosapappersskivor. B. Antikropparna sedan immobiliserade på aminfunktionaliserade cellulosapappersskivor genom glutaraldehyd. Aminfunktionaliserade cellulosapappersskivor nedsänktes i 0,05% -ig glutaraldehydlösning för att införa aldehydgrupper till pappersskivorna. Efter tvättning antikroppar lastas på de aldehydfunktionaliserade pappersskivor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Immobilisera antikroppar på aminfunktionaliserade cellulosapappersskivor genom perjodatoxidation (Figur 1A).
- Blanda 1 ni av 2,5 mM natrium periodate med 2 | il av 0,1 mg / ml kanin-anti-human-IgG-FITC och 7 | j, l av 100 mM pH 5,5 acetatbuffert i en 1,5 ml-rör, och inkubera blandningen i mörker under 30 min.
OBS: Följ denna volymförhållande för att förbereda mer oxiderade antikroppar vid behov. Ändra volymförhållandet för att optimera koncentrationen av natriumperjodat och kanin-anti-human-IgG-FITC. - Späd ovanstående lösning antikroppen med 30 pl 50 mM fosfatbuffert-saltlösning (PBS; pH 7,4) till en slutlig volym av 40 pl.
- Förbered tre aminfunktionmedelflödesfilterpappersskivor och tre aminfunktionaliserade snabbt flöde skivor papper (som beskrivs i avsnitt 1).
- Last 5 pl av natriumperjodat oxiderade kanin-anti-human-IgG-FITC på varje medelflödesfilterpappersskiva och 8 | il på varje snabb flödesfilterpappersskiva. Förvara dessa pappersskivor i mörker under en timme vid rumstemperatur.
- Tvätta varje pappersskiva med 0,2 ml av tvätt buffer (50 mM Tris-buffert med 0,15 M NaCl och 0,05% ytaktivt medel, pH 7,4). Upprepa tvätta tre gånger.
- Fotografera fluorescensbilder genom en fluorescens molekylär kameran för att identifiera närvaron av antikroppar på varje cellulosapappersskiva 32. Använda tomma pappersskivor (som behandlats med samma koncentration av antikroppar i frånvaro av natriumperjodat) som en kontroll (Figur S1 till figur S3).
OBS: För experimentell optimering, ändra koncentrationen av en parameter som måste optimeras och fixera koncentrationerna av alla andra parametrar. En hög fluorescensintensitet ökar mängden infångande antikroppar som är immobiliserade på cellulosapappersskivor.
- Blanda 1 ni av 2,5 mM natrium periodate med 2 | il av 0,1 mg / ml kanin-anti-human-IgG-FITC och 7 | j, l av 100 mM pH 5,5 acetatbuffert i en 1,5 ml-rör, och inkubera blandningen i mörker under 30 min.
- Immobilisera antikroppar på aminfunktionaliserade cellulosapappersskivor genom glutaraldehyd (Figur 1B).
- Tillsätt tre APS behandlat medelflödes skivor filterpapper och de tre snabba flödes skivor filterpapper (desfaktorer beskrivs i avsnitt 1) till 2 ml 50 mM PBS (pH 7,4) som innehåller 0,05% glutaraldehyd under 1 h, med orbital omrörning vid rumstemperatur.
Varning: Hantera glutaraldehyd i dragskåp. - Placera tre skivor vardera i två 1,5 ml centrifugrör. Tillsätt 1 ml avjoniserat (DI) vatten till varje rör och skaka rören för 10 sek. Avlägsna vattnet genom att aspirera med en pipett. Upprepa ytterligare två gånger för att avlägsna eventuell oreagerad glutaraldehyd.
- Belastning 5 pl av 25 mikrogram / ml kanin-anti-humant IgG-FITC (infångningsantikropp) på varje aldehyd-funktionmedelflödesfilterpappersskiva, och lägga till 8 l på varje aldehyd-funktionaliserade fasta flödesfilterpappersskiva. Inkubera i mörker under ca 20 min vid rumstemperatur. Sedan, tillsätt 10 | il av 50 mM PBS (pH 7,4) till varje pappersskiva utan att ta bort antikropparna och inkubera i 40 min för aminen aldehyd-reaktion.
- Tvätta pappersskivor med 0,2 ml av tvättbuffert på toppen av en pappershandduk. Upprepatvätta två gånger.
- Fotografera fluorescensbilder genom en fluorescens molekylär kameran för att kontrollera förekomsten av antikroppar på varje cellulosapappersskiva 33. Använd tomma pappersskivor som en kontroll.
OBS: I figur 4, "0" står för den tomma pappersskivan som behandlades med samma koncentration av FITC-antikropp i frånvaro av glutaraldehyd; i figur 5A, var de tomma pappersskivor behandlade med glutaraldehyd, men inga FITC-antikroppar lastades på det pappersskivor.
- Tillsätt tre APS behandlat medelflödes skivor filterpapper och de tre snabba flödes skivor filterpapper (desfaktorer beskrivs i avsnitt 1) till 2 ml 50 mM PBS (pH 7,4) som innehåller 0,05% glutaraldehyd under 1 h, med orbital omrörning vid rumstemperatur.
- Torka pappersskivor (från avsnitt 2.1 och 2.2) vid 37 ° C under 10 minuter.
- Blockera de pappersskivor med 15 | il av blockeringsbuffert (10% skummjölkspulver i 50 mM Tris-buffert, pH 7,4, med 0,15 M NaCl) under 10 min vid rumstemperatur.
- Last 5 | j, l och 8 pl av peroxidaskonjugerad get-anti-kanin-IgG i PBS (1: 10000) på medelflöde och snabb-flödes skivor filterpapper, respektive. inkubera under30 minuter i mörker vid rumstemperatur.
- Tvätta pappersskivor med 0,2 ml av tvättbuffert på toppen av en pappershandduk. Upprepa tvätta tre gånger.
OBS: Det är inte nödvändigt att ta bort tvättbufferten eftersom resultaten inte påverkas av bufferten. - Ladda en 10 | il blandning av 3,3 ', 5,5'-tetrametylbensidin (TMB) och väteperoxid lösningen på varje skiva.
- Ta bilder av pappersskivor med en digitalkamera eller smart telefon efter 5 min av inkubation.
OBS: I figur 5B, '0' står för skivorna pappers som behandlades med glutaraldehyd, följt genom att ladda antikropp-HRP (pepparrotsperoxidas) -konjugat i frånvaro av FITC-antikropp.
3. Pappersbaserade ELISA för IgG Detection
Figur 2. Schematisk bild av det pappersbaserade ELISA for IgG upptäckt. Fånga antikroppar kovalent immobiliserade på aldehyd-funktionaliserade cellulosapappersskivor genom glutaraldehyd. Cellulosapappersskivor blockerades med blockeringsbuffert. Mål-IgG tillsattes sedan till skivorna, följt av laddning av HRP-konjugerade signal antikroppar. Slutligen TMB och väteperoxid blandning lösning laddas på varje pappersskiva för färgvisning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Tillsätt 5 ml 0,05% glutaraldehyd-lösning (framställd i 50 mM PBS-buffert, pH 7,4) till en 20 ml glasflaska. Doppa 15 amin-funktionaliserade medelflödes skivor filterpapper i denna lösning och hålla under 1 h med skakning vid rumstemperatur.
- Samtidigt att upprepa steg 3,1 förbereda ytterligare 15 aldehydfunktionaliserade snabbt flöde skivor filterpapper.
Varning: Hantera glutaraldehyd i draghuva.
- Samtidigt att upprepa steg 3,1 förbereda ytterligare 15 aldehydfunktionaliserade snabbt flöde skivor filterpapper.
- För att ta bort oreagerad glutaraldehyd från pappersskivor, placera 15 medelflödes skivor filterpapper i en 15 ml centrifugrör, och 15 snabbflödes skivor filterpapper i en annan 15 ml centrifugrör. Tillsätt 5 ml DI-vatten till varje rör och skaka rören för 10 sek. Avlägsna vattnet genom att aspirera med en pipett. Upprepa två gånger för att avlägsna eventuell oreagerad glutaraldehyd.
- Torka pappersskivorna i en ugn vid 37 °.
- Lägg 5 | j, l och 8 pl av 0,025 mg / ml mus-IgG-Fc-fragment antikroppar till var och en av de medelflödes och snabb flödesfilterpappersskivor, respektive, och inkubera i 20 min.
- Tillsätt 10 | il av 50 mM PBS (pH 7,4) till varje pappersskiva utan att ta bort antikropparna och inkubera i 40 min för aminen aldehyd-reaktion.
- Tvätta pappersskivor med 0,2 ml av tvättbuffert på toppen av en pappershandduk. Upprepa tvätta tre gånger.
- Torka pappersskivorna i en ugn vid 37 ° C.
- Blockera pappersskivorna wed 15 | il blockeringsbuffert under 10 min vid rumstemperatur.
- Tvätta varje pappersskiva med 0,2 ml av tvättbuffert på toppen av en pappershandduk. Upprepa tvätta tre gånger.
- Köra IgG-standarder.
- Belastning 10 | il av olika IgG-koncentrationer (t ex, 0, 10, 125, 250, och 500 ng / ml i PBS) på varje skiva i triplikat. Inkubera under en timme vid rumstemperatur.
- Tvätta pappersskivor med 0,2 ml av tvättbuffert på toppen av en pappershandduk. Upprepa tvätta tre gånger.
- Belastning 10 pl HRP konjugerad mus-IgG-Fc-fragment-antikroppar (1: 10000, 10 mM PBS, pH 7,4), och inkubera under en timme vid rumstemperatur.
- Tvätta pappersskivor med 0,2 ml av tvättbuffert på toppen av en pappershandduk. Upprepa tvätta tre gånger.
OBS: Det är inte nödvändigt att ta bort tvättbufferten eftersom resultaten inte påverkas av närvaron av bufferten. - Ladda en 10 pl blandning av TMB och väteperoxid på varje skiva.
- TAKE bilder av alla pappers skivor med en digitalkamera eller smart telefon efter 5 min inkubation.
OBS: I figur 6A, "0" står för skivor papper som behandlats med antikroppsinfångnings immobilisering, och antikropp-HRP / TMB lösning utan IgG-serum. - Analysera intensiteten i varje pappersskiva i bilden från Image J.
- Konvertera bilder tagna i steg 3,15 till ".tif" format.
- Öppna "Bild J" programvara.
- Gå till "Arkiv → Öppna", välj bilden att analysera.
- Välj form knappen "Oval".
- Gå till "Bild → Typ → 32 bit.
- Gå till "Redigera → Invertera".
- Gå till "Analysera → Mät".
- Kopiera och analysera data i ett kalkylblad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3. Fourier transform infraröd (FTIR) spektra av obehandlat och APS-behandlade medelflödesfilter fyrkantiga papper (A) och snabb-flödesfilter fyrkantiga papper (B). A. Spektra för obehandlat medelflödesfilter fyrkantiga papper var liknande den för APS behandlat medelflödesfilter fyrkantiga papper. Ökningen av intensiteter vid band av 902-1,170 cm-1 och 1,210-1,500 cm-1 för den APS-behandlade fyrkantiga papper hörde Si-O-cellulosa och CH deformationer av SIOC-H-grupper, respektive. Ökningen av banden vid 1.650 cm -1 och 2,885 cm -1 tillhör böjning av -NH2 och CH 2 vibrationer från salt propyl delen, respektive. B. De karakteristiska topparna i 972 till 1180 cm -1 range tillskrevs Si-O-Si och SO-cellulose obligationer. Toppen vid 1003 cm -1 orsakades av överlappningen av Si-O-Si-bindning och CO-sträckningen av cellulosa. Alla resultaten visar att APS framgångsrikt ympade på cellulosa fyrkantiga papper. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Närvaron av aminfunktionella grupper på cellulosa fyrkantiga papper bestämdes med FTIR. Figur 3 visar FTIR-spektra av obehandlat, modifierat, medelflöde och snabb-flödesfilter fyrkantiga papper. Det fanns tre steg som ingår i den kemiska modifieringen av aminoalkylgrupper, med användning av APS på cellulosan ytorna. Steg ett involverade hydrolys av APS för att ge silanol derivatet av APS. Steg två involverade adsorptionen av den hydrolyserade derivatet APS på cellulosafibrerna genom vätebindning av OH-grupper från hydrolyzed APS-derivatet och cellulosafibrerna. Steg tre involverade kondensationen av den adsorberade derivatet APS, vilket ledde till ympning av derivat APS på cellulosafiber yta genom Si-OC bindning och bildandet av Si-O-Si siloxan bryggor 34. Såsom visas i fig 3A, inkrementet av bandet vid 1650 cm -1 tillskrevs böjningen av NH2-grupper och ett inkrement av bandet vid 2,885 cm-1 motsvarar den CH 2 vibrationer hos silan propyl-delen. För den ursprungliga medelflödesfilter fyrkantiga papper, banden på 902-1,170 cm -1 och 1,210-1,500 cm -1 motsvarade vibrationerna av COC obligationer i glykosidiska broar och CH stretching vibrationer. Efter behandling av fyrkantiga papper med APS, indikerar ökningen i intensitet vid dessa två bandbredder att de tillhör Si-O-cellulosa och CH deformationer av SIOC-H-grupper, respektive. I likhet med medel flow filtrera fyrkantiga papper, spektra för modifierade snabb-flödesfilter fyrkantiga papper ökade också i intensitet vid 1.650 cm-1 för -NH 2, på grund av den kemiska modifieringen med APS (figur 3B). De starka karakteristiska toppar i 972 till 1180 cm -1 range tillskrevs Si-O-Si och SO-cellulosabindningar; den högsta toppen var vid 1,003 cm-1 på grund av överlappningen av Si-O-Si-bindning och CO-sträckningen av cellulosa 34. De karakteristiska obligationer i våglängdsområdet mellan 1188 och 1510 cm -1 för APS behandlade fyrkantiga papper orsakas av vibrationer i COC obligationer av glykosidiska broar och CH stretching vibrationer. CH 2 stretching vibrationer obligationer visades på 2,800-2,980 cm -1 och den högsta topp på 2,932 cm -1 för APS behandlade fyrkantiga papper. Sammanfattningsvis kan APS kovalent ympade till nr 1 och nr 113 filter fyrkantiga papper.
Figur 4. Fluorescens svar på olika koncentrationer av glutaraldehyd i immobilisering av IgG-FITC på pappersskivor (metod B) Inställningar för fluorescens molekyl imager:. Excitation, 488 nm, emission, 530 nm, upplösning, 100 mikrometer A:. Fluorescens svar på 0, 0,001%, 0,005%, 0,01% och 0,050% glutaraldehyd B:. Fluorescence svar på 0, 0,050%, 0,100%, 0,250% och 0,500% glutaraldehyd. Koncentrationen av IgG-FITC på varje skiva var 0,01 mg / ml. En ökning av koncentrationen av glutaraldehyd till ett maximum av 0,05% resulterade i en ökad belastning mängden IgG-FITC. Koncentrationer av glutaraldehyd över 0,05% minskade laddnings mängden IgG-FITC. Klicka här för att se en större version av dennafigur.
Figur 5. Fluorescens respons (A) och kolorimetrisk resultat (B) av olika koncentrationer av IgG-FITC på IgG-FITC-immobiliserad medelflöde och snabb-flödes skivor filterpapper (Metod B) Inställningar för fluorescens molekyl imager:. Excitation , 488 nm, emission, 530 nm, upplösning, 100 mikrometer. # 1 representerar grad nr 1, medelflödesfilterpappersskiva, och # 113 representerar kvalitet nr 113 snabbt flödesfilterpappersskiva. APS-modifierad pappersskivor behandlades med 0,05% glutaraldehyd först. Därefter tillsattes olika koncentrationer av IgG-FITC lastas på glutaraldehyden modifierad pappersskivorna. En ökning av laddningskoncentration av IgG-FITC ökade mängden av den immobiliserade IgG-FITC på pappersskivorna. Däremot har ökade koncentrationer av immobiliserad IgG-FITC inte att förbättra bindningsförmåga till antigenet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den grundläggande arbetsflödet för kovalent immobilisering av antikroppar på aminfunktionaliserade cellulosapappersskivor visas i fig 1. Den kanin-anti-human-IgG-FITC var kovalent immobiliserat på cellulosapappersskivor. Fluorescensen från pappersskivorna indikerade immobilisering av antikroppar mot pappersskivorna, och intensiteten av fluorescens var direkt proportionell mot koncentrationen av immobiliserade antikroppar. Peroxidaskonjugerad get-anti-kanin-IgG applicerades sedan för att bestämma bindningsförmågan hos de immobiliserade antikropparna. Sekundära amingrupper och aldehydgrupper kan reagera med varandra för att bilda en Schiff-bas, som har använts i biokonjugering 35. De användes också här för kovalent immobilisering av infångningsantikroppar. I metod A (Figur 1 A), -NH 2 introducerades till cellulosapappersskivor och -CHO härleddes från kanin-anti-human-IgG-FITC genom oxidation av Fc-regionen av antikropparna med natriumperjodat. På samma sätt, undersöktes effekterna av olika koncentrationer av natriumperjodat och IgG-FITC-antikroppar också analyseras. Såsom visas i figur S1 och figur S2, natriumperjodat från koncentrationer av 0 till 1 mM och kanin-anti-human-IgG-FITC 0,016-0,16 mg / ml hade liten effekt på oxidationen av 0,08 mg / ml kanin-anti-humant IgG -FITC. Mängden antikroppar som var kovalent bunden till pappersskivorna ökade med en ökande koncentration av infångningsantikroppar från 0 till 0,075 mg / ml (Figur S3A).
En svag färgförändring observerades när bindningsförmåga bestämdes genom peroxidas-analysen. Detta kan vara på grund av användningen avöverskott natriumperjodat, som reagerar med infångningsantikroppar och orsakar en förlust av bindningsaktivitet. Det är troligt att den natriumperjodat inte helt kan tvättas bort från de pappersskivorna. Detta bekräftades av den enkla principen att natriumperiodat lösning ger en gul färg när den blandas med PURPALD lösning. Därför ingick perjodat oxiderade antikroppar laddades på pappersskivorna och inkuberades under 1 timme. Pappersskivorna tvättades tre gånger med PBS (innehållande 0,05% Tween-20) och sedan PURPALD-lösning tillsattes till dessa skivor. Pappersskivorna visade en lila färg omedelbart, vilket indikerar närvaron av aldehydgrupper från perjodat-oxiderade antikroppar. Denna purpurfärgade färgen ändrades till gul inom 10 minuter, vilket bekräftade närvaron av natriumperjodat på pappersskivorna.
Alternativt framställdes ett glutaraldehyd tvärbindningsmetoden (metod B, figur 1 B) används för att länka aminen groups från APS-behandlade pappersskivor och antikroppar. Koncentrationerna av glutaraldehyd (Figur 4) och kanin-anti-human-IgG-FITC (figur 5A) som lastades på det cellulosapappersskivor optimerades. Såsom visas i fig 4, nådde fluorescensintensiteten högst 0,05% av glutaraldehyd, vilket innebär att lastningen av kanin-anti-human-IgG-FITC blev mättad på cellulosapappersskiva vid denna koncentration; en ökning av koncentrationen av glutaraldehyd till 2,5% visade inte en ökning i mängden av kanin-anti-human-IgG-FITC på cellulosapappersskivor (Figur S4). Fluorescensintensiteten ökade också med ökande koncentrationer av kanin-anti-human-IgG-FITC som lastades på det pappersskivor (figur 5A). En blå färg utvecklades omedelbart efter tillsatsen av TMB-substrat och väteperoxid blandningslösning till pappersskivorna, som innehöll peroxidase konjugerade antikroppar upptäckt (Figur 5B). Dessutom blockeringsbuffert som innehöll 10% skummjölkspulver visade sig behålla den blockerande effektivitet efter 15 tvättar (Figur S5). Metod B valdes för att testa programmet för de immobiliserade antikropparna, som det demonstrerade förbättrad bindningsaktivitet till sitt mål. Följaktligen tillsattes en 0,025 mg / ml koncentration av infångningsantikroppar används för IgG detektion.
Figur 6. Kalibreringskurvor för bestämning av IgG från pappersbaserade ELISA. # 1 representerar grad nr 1, medelflödesfilterpappersskiva, och # 113 representerar kvalitet nr 113 snabbt flödesfilterpappersskiva. Den övre panelen A presenterar färg avläsning för medelflöde (# 1) och snabbt flöde (# 113) cellulosapappersskivor med olika koncentration av IgG. Den nedre panelenB presenterar ELISA resultat för olika koncentration av IgG. Triplikat användes för att bestämma standardavvikelsen (SD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Get-anti-mus-IgG-Fc-fragment infångningsantikropp, IgG-serum, och get-anti-mus-IgG-Fc-fragment-antikropp konjugerad HRP användes för sandwich-analys. Såsom visas i figur 6 och figur S6, koncentrationen av IgG-serum från 0 till 500 ng / ml hade en linjär relation med kolorimetrisk intensitet när varje steg inkuberades under 1 timme. I figur S6, färgen variation med olika koncentrationer av IgG var uppenbart för en timmes inkubation. Ännu, har resultaten av 10 min inkubation visar inte en tydlig förändring i färgintensiteten med olika koncentrationer av IgG. Således sensitivity av denna pappersbaserade ELISA var lämplig för att utveckla praktiska point-of-care testning.
Figur S1. Fluorescens svar på olika koncentrationer av natriumperjodat (metod a). Varierande koncentrationer av natriumperjodat blandades med kanin-anti-human-IgG-FITC vid en koncentration av 0,016 mg / ml och användes för studien av antikropp oxidationsaktivitet. Genom att öka koncentrationen av natriumperjodat, lastnings mängden IgG-FITC ökade och nådde ett maximum vid 0,25 mM. Det observerades att koncentrationer av natriumperjodat som var högre än denna ökade inte mängden av immobiliserad IgG-FITC. Triplikat användes för att bestämma standardavvikelsen (SD). Klicka här för att ladda ner filen.
Figur S2. fluorescenssvars till olika koncentrationer av kanin-anti-human-IgG-FITC (metod A). Koncentrationen av natriumperjodat var 0,25 mM i lösningen för antikroppen oxidationsaktivitet studien och den slutliga koncentrationen av kanin-anti-human-IgG-FITC på varje skiva var 0,016 mg / ml. När koncentrationen av natrium-perjodat fastställdes, koncentrationen av IgG-FITC hade liten effekt på oxidationen av IgG-FITC. Triplikat användes för att bestämma standardavvikelsen (SD). Klicka här för att ladda ner filen.
Figur S3. Fluorescenssvar och kolorimetrisk resultat från fyller på olika koncentrationer av oxiderad kanin-anti-human-IgG-FITC på pappersskivorna (Metod A). För natriumperjodat oxidation, 0,08 mg / ml av IgG-FITC och 0,25 mM natriumperiodat användes. Utspädningen av peroxidas-konjugerad anti-kanin-IgG var1: 50000. Ökning av last koncentrationen av IgG-FITC på cellulosapappersskivor ökade mängden immobiliserade IgG-FITC, men inte har en effekt på målbindande. Klicka här för att ladda ner filen.
Figur S4. Fluorescens svar på höga koncentrationer av glutaraldehyd i immobilisering av IgG-FITC på cellulosapappersskivor (metod B). Koncentrationen av IgG-FITC på varje skiva var 0,01 mg / ml. Koncentrationerna av glutaraldehyd som var högre än 0,25% ökade inte mängden immobiliserade IgG-FITC på cellulosapappersskivor. Klicka här för att ladda ner filen.
Figur S5. Effekt av antal tvättider. A: var. Hing tre gånger B: tvätt 15 gånger. Infångande antikroppar immobiliserade på cellulosa fyrkantiga papper hade fortfarande god bindningskapacitet till sina mål, även om kvadratiska papper virvlades 15 gånger. Klicka här för att ladda ner filen.
Figur S6. Pappersbaserade ELISA resultat för IgG. För koncentrationerna av IgG från 0 till 500 ng / ml, resultaten från en timmes inkubation är bättre än resultaten från 10 minuter av inkubation. För höga koncentrationer av IgG, finns tillräckligt med tid för inkubation 10 minuter. Triplikat användes för att bestämma standardavvikelsen (SD). Klicka här för att ladda ner filen.
Figur S7. Svepelektronmikroskopi (SEM) bilder av medelflödesfilterpapper vid olika förstoringar. A: 85X och B: 20.000. Fältsvepemissionselektronmikroskop (FE-SEM) som arbetar vid 5 kV användes för att bestämma den partikelmorfologi. Cellulosafibrerna är slumpmässigt tvärbundna. Klicka här för att ladda ner filen.
Figur S8. SEM-bilder av snabbflödesfilterpapper vid olika förstoringar. A: 100X och B: 20.000. Fältsvepemissionselektronmikroskop (FE-SEM) som arbetar vid 5 kV användes för att bestämma den partikelmorfologi. Cellulosafibrerna är slumpmässigt tvärbundna. Klicka här för att ladda ner filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Direkt beläggning av affinitetsrenad get-anti-mus-IgG-Fc-infångande antikropp på omodifierad cellulosapappersskivor utfördes för att detektera IgG-koncentrationer. Resultaten indikerade att, ytterligare fixering av infångningsantikroppar krävs för reproducerbarhet. Silan tekniken framgångsrikt använts för att införa aminfunktionella grupper på cellulosapappersskivorna 34. Koncentrationen av APS påverkar immobilisering av antikroppar. Därför är mängden av APS i aceton också optimeras. 1 ml av APS i 10 ml aceton var en optimal koncentration för ympning amingruppen för immobilisering av antikroppar genom ett glutaraldehyd tvärbindningsmedel. Antikroppar ympade på cellulosapappersskivor efter perjodatoxidation och glutaraldehyd tvärbindningsmetoder. Våra resultat visade att bindningskapaciteten av immobiliserade antikroppar genom glutaraldehyd tvärbindningsmetod var bättre än den perjodatoxidation metod för medium-flöde och snabba flödesfilterpappersskivor. Vidare infångande antikroppar, som är immobiliserade på cellulosapappersskivor genom ett glutaraldehyd tvärbindningsmetod, behöll sin funktion och stabilt immobiliserat trots att papperet utsattes för mekanisk belastning av 15 tvättningar genom att vortexa. Tio procent av skummjölkspulver blockerande buffert visade sig behålla sin blockering effektivitet efter 15 tvättar (Figur S5).
De kovalent immobiliserade antikroppar användes för att utföra en sandwich-ELISA med detekteringen av IgG. IgG vid en koncentration av 100 ng / ml detekterades med blotta ögat med hjälp av denna pappersskiva baserad analys. Koncentrationen av IgG-serum från 0 till 500 ng / ml visade ett linjärt samband med kolorimetrisk intensitet, när varje steg inkuberades under en timme. Immunoassay testning för denna pappersskiva baserad ELISA krävs mindre mängd prov reagens och verkade vara mer effektiv än konventionella immun 36 figur S7 och S8 figur, respektive. Såsom illustreras i dessa figurer, är fibrerna slumpmässigt tvärbundna för båda typerna av filterpappersskivorna 25. Skälet till denna höga känslighet kan vara tjockleken på pappersskiva. För snabb-flödes skivor filterpapper tjockleken var 420 um jämfört med 180 pm för medelflödesfilterpapper. Således, mer infångningsantikroppar sannolikt skulle immobiliseras på fasta flödes skivor filterpapper, vilket ytterligare skulle öka känsligheten för analysen. Samtidigt, porstorlek för snabbt flöde skivor filterpapper (30 pm) var större än den för medelflödesfilterpappersskivor de (11 & #181; m). Efter pappersyta blockering, porstorleken av den förra var fortfarande tillräckligt stor för att driva vätskeflödet utan ett extra kraftsystemet. Emellertid flödeshastigheten för bufferten i det senare var långsammare. , Var således snabb-flödesfilterpapper bättre än medelflödesfilterpapper i tillämpningen av immunanalyser.
Reproducerbarheten av antikropparna på de immobiliserade filterpappersskivorna utvärderades genom ytterligare inkubering av pappersskivor med peroxidas-konjugerat get-anti-kanin-IgG och detektion av den kolorimetriska resultatet efter laddning av TMB-substrat och väteperoxid blandningslösning. Standardavvikelsen var mindre än 10% för denna pappersbaserad enhet. Stabiliteten hos kanin-anti-human-IgG-FITC på -NH 2 modifierade cellulosapappersskivor testades under upp till två månader. Pappers skivor som vid 4 ° C lagrades behållit sin bindningsaktivitet till peroxidaskonjugerad get anti-kanin IgG med en liten minskning i deras biENDE aktivitet. När emellertid antikropp immobiliserad pappersskivorna lagrades vid rumstemperatur eller 60 ° C, förlorade de sin bindningsaktivitet på grund av torrhet och hög temperatur. De tagna antikroppar skulle ha destabiliserat och denaturerad under dessa förhållanden.
Det finns vissa kritiska steg i immobilisering av infångande antikroppar på cellulosapappersskivor med användning av glutaraldehyd som tvärbindningsmedel. Steg 1,2 att ympa amingrupper på pappersskivorna är ett kritiskt steg i den framgångsrika kovalent immobilisering av infångande antikroppar. Om detta steg misslyckas, kommer hela immobilisering processen misslyckas. FTIR användes för att bestämma huruvida amingrupper styrde immobiliserad på pappersskivorna (steg 1,6). För det andra är ympning av aldehydgrupper på cellulosa pappersskivor annan viktig steg (steg 2.2.1 och steg 3,1). Antikropparna immobiliseras kovalent på de cellulosapappersskivor genom bildning av en Schiff-bas. Till sist, Är steget att immobilisera infångningsantikroppar på filterpappersskivor viktigt (steg 2.2.3, steg 3,4, och steg 3,5). Amingrupperna från infångningsantikroppar reagerade med aldehydgrupperna från cellulosapappersskivor för att fastställa antikropparna på pappersskivorna. Om det här steget misslyckades, skulle fånga antikroppar inte immobilisera på pappersskivor och alla ELISA applikationstester skulle vara negativt. Vi kan använda en fluorescensmolekyl avbildare för att bestämma närvaron av infångningsantikroppar. Peroxidas-konjugerad get-anti-kanin-IgG och peroxidas-baserade kolorimetriska reaktioner kan användas för att bekräfta bindningskapaciteten hos de immobiliserade antikropparna.
Detta protokoll kan stöta på vissa problem, såsom en hög bakgrund till signalen, ingen signal eller en svag signal, och en ojämn färg avläsning. De möjliga orsakerna till dessa problem och felsökningsmetoder för att övervinna dessa problem diskuteras nedan. Höga bakgrundssignaler uppträder vanligtvis due till en kort blockeringstiden. Detta kan lösas genom att öka blockerings inkubationstiden, tvättning av pappersskivor grundligt, och undvikande av tillsats av överskott av detektionsantikropp konjugat enzym för att avlägsna höga bakgrundssignaler. Möjliga orsaker är en frånvaro av målantigen över blockering, otillräcklig inkubationstid, och en icke-fungerande detektionsantikropp enzymkonjugat. För att övervinna dessa problem, måste de målantigener sättas och inkuberas under en lämplig tidsperiod genom att använda en ny antikroppskonjugat och lagra det som föreslagits av tillverkaren. Det är lämpligt att inkludera en positiv kontroll för att upptäcka. Ojämna färg avläsning beror på stapling av pappersskivor under ympning processen. För att undvika detta problem måste pappersskivor separeras under ympning processen APS, och antigen och påvisande av antikroppar konjugat enzym måste spridas jämnt på pappersskivan vid varje steg.
Även om det pappersbaserade analysen är ett enkeltoch kostnadseffektiv metod, det finns begränsningar. Orienteringen av antikroppar på substratytan är kritisk för utförandet av immunanalysen, eftersom den glutaraldehyd tvärbindningsmedel reagerar med amingrupperna från Fab-region och Fc-regionen av de infångningsantikroppar. Således behöver de immobiliserade antikropparna inte inträffar i en mycket orienterad sätt. Eftersom det finns mer amingrupper från Fab-region än från Fc-regionen av IgG-antikroppar, är den bindande aktiviteten av de immobiliserade antikropparna fortfarande tillräckligt hög för deras tillämpning.
Olika ytfunktionalisering metoder för cellulosapapper sammanfattades i en färsk rapport 37. Reagens såsom divinylsulfon; 1,4-phenylenediisothiocyanate; 4-azido-benzenediazonium; epiklorhydrin; 4-azido-a-fluor-2-nitrocyclohexane; och 4-merkapto-benzenediazonium, skulle kunna användas för att kovalent immobilisera biomolekyler på cellulosapapper. Adsorption och infångning användes ocksåatt belägga cellulosapapper med biomolekyler. Jämfört med de andra metoderna, är kombinationen av silantekniken och glutaraldehyd tvärbindningsmedel för kovalent immobilisering av antikroppar på cellulosapapper en enkel metod. Dessutom kan denna kombination har liten effekt på den termiska och mekaniska egenskaperna hos cellulosapapper, vilket gör att den maximala vertikala genomströmnings i immunanalyser. Denna strategi skulle kunna utvidgas för att immobilisera andra biomolekyler på cellulosapapper.
Den metod som visat här skulle kunna utsträckas till upptäckt av analyt, så länge som direkta antikroppar mot det finns. Denna metod kan också användas för att utveckla multiplex detektion. Till exempel på ett kvadratiskt papper kan olika områden särskiljas för olika mål. De infångande antikroppar för målen kan immobiliseras genom ett glutaraldehyd tvärbindningsmedel på deras specifika område. Detta kan följas av de ELISEtt förfarande för att detektera olika mål. Således gör den föreslagna metoden det pappersbaserade ELISA ett mångsidigt verktyg för påvisande av andra mål med hjälp av blotta ögat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellulose filter paper, Grade 1 (medium flow filter paper) | GE Healthcare Pte Ltd Singapore | 1001 110 | |
| Cellulose filter paper, Grade 113 (Fast flow filter paper) | Sigma-Aldrich, Singapore | 1113-320 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Singapore | G6257 | Grade II, 25% in H2O |
| Surfactant | Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore | P2287 | |
| Bovine serum album | Sigma-Aldrich, Singapore | A2153 | |
| Skimmed milk powder | Louis François | Packed by Kitchen Capers, Singapore | |
| Tris base | Promega | H5135 | |
| Sodium periodate | Merck | 106597 | |
| Na2HPO4 | Merck | 106585 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| NaCl | CALBIOCHEM | 567441 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| HCl | Merck | 100317 | |
| phosphate buffer saline (PBS) | N/A | N/A | PBS, containing 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol/L Na2HPO4 and 1.5 mmol/L KH2PO4, is prepared with water and adjusted to pH 7.4 with 0.1 mol/L NaOH or 0.1 mol/L HCl |
| Acetone | Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore | 9005-68 | |
| Mixture of TMB and hydrogen peroxide solution | 1-Step ultra TMB-ELISA solution , Thermo Scientific Pierce | 34029 | 1 L |
| Rabbit anti-human IgG-FITC | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2278 | |
| Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2030 | |
| Affinity purified goat anti-Mouse IgG-Fc coating antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131A | |
| Mouse reference serum | Bethyl Laboratories, Inc | RS10-101-5 | 9.5 mg/ml |
| HRP conjugated goat anti-mouse IgG-Fc detection antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131P | |
| Equipment | |||
| Fourier transform infrared spectrophotometer | Shimadzu IR Prestige-21 | N/A | |
| Fluorescence molecular imager | Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore | N/A | |
| Oven | NUVE FN500 | N/A | |
| Turbo mixer VM-2000 | MYC LTD | N/A | |
| ImageJ | RGB, free download | N/A |
References
- Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). J. Virol. Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M. Simple telemedicine for developing regions: camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis. Anal. Chem. 80 (10), 3699-3707 (2008).
- Lode, P. V. Point-of-care immunotesting: approaching the analytical performance of central laboratory methods. Clin. Biochem. 38 (7), 591-606 (2005).
- Posthuma-Trumpie, G. A., Amerongen, A. V., Korf, J., Berkel, W. J. V. Perspectives for on-site monitoring of progesterone. Trends Biotechnol. 27 (11), 652-660 (2009).
- Lim, D. V., Simpson, J. M., Kearns, E. A., Kramer, M. F. Current and developing technologies for monitoring agents of bioterrorism and biowarfare. Clin. Microbiol. Rev. 18 (4), 583-607 (2005).
- Li, X., Tian, J., Shen, W. Progress in patterned paper sizing for fabrication of paperbased microfluidic sensors. Cellulose. 17 (3), 649-659 (2010).
- Nie, Z., et al. Electrochemical sensing in paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 10, 477-483 (2010).
- Delaney, J. L., Hogan, C. F., Tian, J., Shen, W. Electrogenerated chemiluminescence detection in paper-based microfluidic sensors. Anal. Chem. 83 (4), 1300-1306 (2011).
- Oh, Y. K., Joung, H. A., Kim, S., Kim, M. G. Vertical flow immunoassay (VFA) biosensor for a rapid one-step immunoassay. Lab Chip. 13 (5), 768-772 (2013).
- Cheng, C. M., et al.
- Jarujamrus, P., Tian, J., Li, X., Siripinyanond, A., Shiowatana, J., Shen, W. Mechanisms of red blood cells agglutination in antibody-treated paper. Analyst. 137 (9), 2205-2210 (2012).
- Credou, J., Volland, H., Dano, J., Berthelot, T. A one-step and biocompatible cellulose functionalization for covalent antibody immobilization on immunoassay membranes. J. Mat. Chem. B. 1, 3277-3286 (2013).
- Kong, F., Hu, Y. F. Biomolecule immobilization techniques for bioactive paper fabrication. Anal. Bioanal. Chem. 403, 7-13 (2012).
- Orelma, H., Teerinen, T., Johansson, L. S., Holappa, S., Laine, J. CMC-modified cellulose biointerface for antibody conjugation. Biomacromolecules. 13, 1051-1058 (2013).
- Yu, A., et al. Biofunctional paper via covalent modification of cellulose. Langmuir. 28 (30), 11265-11273 (2012).
- Stollner, D., Scheller, F. W., Warsinke, A. Activation of cellulose membranes with 1,1′-carbonyldiimidazole or 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate as a basis for the development of immunosensors. Anal Biochem. 304 (2), 157-165 (2002).
- Bora, U., Sharma, P., Kannan, K., Nahar, P. Photoreactive cellulose membrane - a novel matrix for covalent immobilization of biomolecules. J. Biotechnol. 126 (2), 220-229 (2006).
- Sharma, P., Basir, S. F., Nahar, P. Photoimmobilization of unmodified carbohydrates on activated surface. J Colloid Interface Sci. 342 (1), 202-204 (2010).
- Brumer, H., Zhou, Q., Baumann, M. J., Carlsson, K., Teeri, T. T. Activation of crystalline cellulose surfaces through the chemoenzymatic modification of xyloglucan. J. Am. Chem. Soc. 126 (18), 5715-5721 (2004).
- Araujo, A. C., Song, Y., Lundeberg, J., Stahl, P. L., Brumer, H. Activated paper surfaces for the rapid hybridization of DNA through capillary transport. Anal Chem. 84 (7), 3311-3317 (2012).
- Xu, C., Spadiut, O., Araujo, A. C., Nakhai, A., Brumer, H. Chemo-enzymatic Assembly of Clickable Cellulose Surfaces via Multivalent Polysaccharides. ChemSusChem. 5 (4), 661-665 (2012).
- Filpponen, I., et al. Generic method for modular surface modification of cellulosic materials in aqueous medium by sequential "click" reaction and adsorption. Biomacromolecules. 13 (3), 736-742 (2012).
- Feese, E., Sadeghifar, H., Gracz, H. S., Argyropoulos, D. S., Ghiladi, R. A. Photobactericidal porphyrin-cellulose nanocrystals: synthesis, characterization, and antimicrobial properties. Biomacromolecules. 12 (10), 3528-3539 (2011).
- Zang, D., Ge, L., Yan, M., Song, X., Yu, J. Electrochemical immunoassay on a 3D microfluidic paper-based device. Chem. Commun. 48 (39), 4683-4685 (2012).
- Ge, L., Yan, J. X., Song, X. R., Yan, M., Ge, S. J., Yu, J. H. Three-dimensional paper-based electrochemiluminescence immunodevice for multiplexed measurement of biomarkers and point-of-care testing. Biomaterials. 33 (4), 1024-1031 (2012).
- Wang, S., et al. Paper-based chemiluminescence ELISA: lab-on-paper based on chitosan modified paper device and wax-screen-printing. Biosens. Bioelectron. 31 (1), 212-218 (2012).
- Koev, S. T., et al. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
- Wang, S. M., et al. Simple and covalent fabrication of a paper device and its application in sensitive chemiluminescence immunoassay. Analyst. 137 (16), 3821-3827 (2012).
- Sadira, S., Prabhakaranc, M. P., Wicaksonob, D. H. B., Ramakrishna, S. Fiber based enzyme-linked immunosorbent assay for C-reactive protein. Sensor Actuat B-Chem. 205, 50-60 (2014).
- Koga, H., Kitaoka, T., Isogai, A. In situ modification of cellulose paper with amino groups for catalytic applications. J. Mater. Chem. 21, 9356-9361 (2011).
- Klemm, D., Heublein, B., Fink, H. P., Bohn, A. Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material. Angew. Chem., Int. Ed. 44 (22), 3358-3393 (2005).
- Fernandes, S. C. M., et al. Bioinspired antimicrobial and biocompatible bacterial cellulose membranes obtained by surface functionalization with aminoalkyl groups. ACS Appl. Mater. Interfaces. 5 (8), 3290-3297 (2013).
- Pharos FX plus molecular imager instructions, Catalog Number 170-9460. , (2005).
- Tee, Y. B., Talib, R. A., Abdan, K., Chin, N. L., Basha, R. K., Yunos, K. F. M.
- Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nat Protoc. 2, 1152-1165 (2007).
- Guidi, A., Laricchia-Robbio, L., Gianfaldoni, D., Revoltella, R., Del Bono, G. Comparison of a conventional immunoassay (ELISA) with a surface plasmon resonance-based biosensor for IGF-1 detection in cows' milk. Biosens Bioelectron. 16, 971-977 (2001).
- Ahmed, S., Bui, M. N., Abbas, A. Paper-based chemical and biological sensors: Engineering aspects. Biosens Bioelectron. 77, 249-263 (2016).
