Abstract
Dit rapport bevat twee methoden voor de covalente immobilisatie van capture antilichamen op cellulose filterpapier graad No. 1 (gemiddeld-flow filter papier) discs en rang No. 113 (fast-flow filter papier) discs. Deze cellulose papierschijven werden geënt met functionele aminegroepen door een silaankoppelingsmiddel techniek voor de antilichamen geïmmobiliseerd daarop. Perjodaat oxidatie en glutaaraldehyde verknopende werkwijzen werden gebruikt om invangantilichamen enten op de cellulose papierschijven. Om de maximale bindingscapaciteit van de invangantilichamen hun doelen na immobilisatie te waarborgen, werden de effecten van verschillende concentraties van natriumperjodaat, glutaaraldehyde en invangantilichamen op het oppervlak van de papierschijven onderzocht. De antilichamen die aan de amine-gefunctionaliseerde cellulose papierschijven werden bekleed door een glutaaraldehyde verknopingsmiddel vertoonden verbeterde bindingsactiviteit naar het doel ten opzichte van het perjodaat oxidatiewerkwijze. IgG (in muizen referentieserum) werd gebruikt als een meetobject in deze studie de toepassing covalent geïmmobiliseerde antilichamen getest met glutaaraldehyde. Een nieuwe papieren, enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) werd met succes ontwikkeld en gevalideerd voor de bepaling van IgG. Deze methode vereist geen apparatuur vereist en kan 100 ng / ml IgG te detecteren. De fast-flow filter papier was gevoeliger dan het filterpapier medium-flow. De incubatietijd van deze assay was kort en vereist kleine monstervolumes. Dit blote oog, kan colorimetrische immunoassay worden uitgebreid naar andere doelen die worden geïdentificeerd met conventionele ELISA gedetecteerd.
Introduction
De point-of-care testen (POCT) diagnostisch onderzoek is belangrijk voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën voor therapeutische, gepersonaliseerde geneeskunde, en thuiszorg 1. Cellulose papier worden veel gebruikt als platforms immunoassays, omdat ze goedkoop toegankelijk, en waarvan de consument 2. Bovendien, de poreuze structuur van cellulose papier bezit het vermogen om vloeistofstroom rijden zonder extra energie impact. Registraties van papieren bioanalyse kan al in de 20 e eeuw, wanneer het papier chromatografie eerst werd uitgevonden in 1952. Het meest voorkomende voorbeeld is immunochromatographic testen 3, zoals zwangerschap en diabetes teststrips worden gevonden. Deze tests leveren relatief snelle analyse tijden en goedkoop analyse 4. Vanwege hun eenvoud, zijn deze conventionele papierstrook testen op grote schaal gebruikt in diagnostische POCT 5.
Detectiemethoden waaronder colorimetrische 6, electrochemische 7 en 8 elektrochemiluminescentie methoden zijn gemeld doelen in biologische monsters te meten. Naast deze kwantitatieve methoden, een betrouwbare werkwijze voor het immobiliseren van antilichamen op cellulose papier is ook belangrijk voor de ontwikkeling van diagnostica. Niet-specifieke adsorptie is de belangrijkste strategie voor het modificeren van antilichamen op het oppervlak van de papieren inrichtingen 9, 10 maximale bindingscapaciteit hun doelen na immobilisatie te garanderen. De eerdere studie toonden aan dat antilichamen die zijn geadsorbeerd cellulose papier kan desorberen uit de vezels 11 met 40%. Aldus kan directe adsorptie van antilichamen op cellulose geen reproduceerbare resultaten 12. Covalente immobilisatie van antilichamen die zijn geënt op het papieroppervlak is een alternatieve methode om een doeltreffend papieren bioassays 13. Diverse werkwijzen zijn beschreven voor de modificatie van cellulose 14, 15 12 handhaven. Carbonyldiimidazool gecombineerd met 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluorboraat 16; 1-fluor-2-nitro-4-azidobenzene door een UV gebaseerde activeringsstrategie 17, 18; een chemoenzymatic strategie gebaseerd op xyloglucan modificatie 19; een 1,4-phenylenediisothiocyanate koppelingsmiddel 20; heteropolysaccharide oxidatie 21 klik chemie 22; en kationische porfyrinen 23 zijn gebruikt voor het covalent immobiliseren biomoleculen cellulose papier. Chitosan gemodificeerd papier is gebruikt papier immunodevices 24-26 ontwikkelen omdat het overvloedig en biocompatibel 27. Chitosan kationische en hecht sterk aan anionische cellulose 27. De capture antilichamen worden geïmmobiliseerd op het papier door chitosan coating en glutaaraldehyde verknoping. Perjodaat oxidatie is een andere methode voor het enten van de kapiteinUre antilichamen op het cellulose papier 28. In deze werkwijze wordt natriumperjodaat gespot op het papier 1,2-dihydroxy (glycol) -groepen in cellulose direct omzetten aldehydegroepen. De aldehydegroepen worden dan gebruikt om covalente bindingen tussen polysacchariden en antilichamen 28 te vormen. Hoewel de fabricage eenvoudig is, is het moeilijk om volledig spoelen natriumperjodaat. Ongewassen natriumperjodaat kunnen verdere oxidatie van de antilichamen die zijn geïmmobiliseerd op het cellulose papier veroorzaken, waardoor de activiteit en stabiliteit van de antilichamen N -. (3-dimethylaminopropyl) - N-ethylcarbodiimide hydrochloride en N-hydroxysuccinimide verknopers worden ook gebruikt om covalent immobiliseren antilichamen op electrospun poly-L-melkzuur en celluloseacetaat nanovezels voor de ontwikkeling van nanovezel gebaseerde testen 29.
In deze studie werd een silaankoppelingsmiddel techniek om aminefunctionele groepen op cellulos entene paper discs. Deze techniek helpt om de oorspronkelijke poriegrootte wicking en filtratiesnelheid van cellulose filtreerpapier behouden, waardoor maximale verticale doorstroming in immunoassays. Het silaan koppelingsreagens techniek is op grote schaal gebruikt in biosensoren om substraatoppervlakken met secundaire aminegroepen functionaliseren, gevolgd door verdere modificatie gebruikt biomoleculen. Het enten van aminegroepen op het matrijsoppervlak omvat een condensatiereactie tussen -OH-groepen van het organofunctionele silaan agenten en matrixsubstraat 30. De cellulose papier schijven werden gefunctionaliseerd met amine groepen op silaankoppeling tot en met 3-aminopropyltrimethoxysilaan (APS) 31. Dit werd gevolgd door het covalent immobiliseren invangantilichamen op twee verschillende manieren. De eerste methode betrokken binding van perjodaat geoxideerd invangantilichamen het amine gefunctionaliseerde cellulose papierschijven. De tweede methode gebruikt glutaaraldehyde als een verknopingsmiddel om de vangst Antibodi hechtenes aan de amine-groep gefunctionaliseerd cellulose papier discs. De aanwezigheid van invangantilichamen werd bevestigd door konijn anti-humaan IgG-fluoresceïne isothiocyanaat (FITC), met fluorescentie- moleculaire imager. De bindingsactiviteit van konijn-anti-humaan IgG-FITC anti-konijnen IgG geit werd eveneens door peroxidase substraat. De effecten van verschillende concentraties natriumperjodaat, glutaaraldehyde en invangantilichamen onderzocht. De toepassing test van de geïmmobiliseerde capture antilichaam werd succesvol uitgevoerd door de bepaling van IgG serum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Enten Amine functionele groepen op Cellulose papier Discs
- Bereid een vierkant stuk papier met een afmeting van 1 cm x 1 cm en 100 papierschijven gemaakt van rang No. 1 cellulose papier met een diameter van 6,0 mm (filtreerpapier gemiddeld-stroom) met een perforator.
- Om -NH2 groepen af te leiden op het papier schijven, meng 1 ml APS en 10 ml aceton in een 50 ml glazen fles in de zuurkast. Voeg papierschijven aan de vers bereide APS mengsel van reagentia, en incubeer gedurende 5 uur met orbitaal roeren (200 opm) bij kamertemperatuur 32.
Let op: Behandel APS en aceton in de zuurkast. - Giet overtollige oplossing uit de 50 ml glazen fles in een container organisch afval.
- Voeg 10 ml aceton aan de glazen fles, meng en decanteer volledig om eventueel niet gereageerd APS en andere onzuiverheden te verwijderen. Herhaal deze stap tweemaal.
- Spreid de papieren schijven op het papier handdoek en plaats in een 110 ° C oven gedurende 3 uur. laat depapierschijven afkoelen. Bewaar de schijven in een 50 ml centrifugebuis bij kamertemperatuur.
- Gebruik Fourier transformatie infraroodspectroscopie (FTIR) voor het enten van aminegroepen controleren de cellulose vierkant papier, zoals hieronder beschreven (figuur 3A).
- Zet de computer en open de FTIR spectroscopie instrument.
- Open de software voor FTIR spectroscopie.
- Ga naar 'Measurement → Initialize'. De rechthoeken voor 'BS: KBr': zal 'Lamp Infrared' en 'Laser' groen wanneer de initialisatie is voltooid.
- Kies 'Data' onder de rechthoeken, en selecteer '% Overbrenging "," Happ-Genzel', '45', '4.0' en 'Min: 400, Max: 4000' voor 'Measurement Mode', 'apodisering', ' Nee. scans ',' Resolution 'en' Range (cm-1) '.
- Klik op 'Measure'.
- Selecteer 'Data file' voor de achtergrond van gegevens. Schrijvenbeneden de commentaren.
- Klik op 'BKG' om de basislijn voor de achtergrond te krijgen.
- Bevestig het vierkant papier op de film monsterhouder.
- Selecteer 'Data file' voor de steekproef gegevens. Noteer de opmerkingen.
- Klik op 'Voorbeeld' om de spectra van het monster te verkrijgen.
- Sluit de FTIR spectroscopie toepassing en schakel de computer uit.
- Herhaal de bovenstaande stappen (stappen 1,1-1,6) amine-gefunctionaliseerde rang No. 113 vierkante cellulose papier en schijven (fast-flow filtreerpapier) te bereiden, en het verkrijgen van de FTIR-spectra van de rang No. 113 vierkante papier (Figuur 3B).
2. Covalente immobilisatie van antilichamen op Amine-gefunctionaliseerde Cellulose Paper Discs
Figuur 1. Covalente immobilisatie van antilichamen op twee manieren.A. Antilichamen geïmmobiliseerd op met amine gefunctionaliseerde cellulose papierschijven met perjodaat oxidatie. Het koolhydraat residuen werden geoxideerd met natriumperjodaat tot aldehyde functionele groepen produceren. Vervolgens werden de geoxideerde antilichamen geladen amine-gefunctionaliseerde cellulose papierschijven. B. De antilichamen werden vervolgens geïmmobiliseerd op met amine gefunctionaliseerde cellulose papierschijven met glutaaraldehyde. Het amine gefunctionaliseerde cellulose papier schijven werden ondergedompeld in 0,05% glutaaraldehyde oplossing voor aldehydegroepen kennismaken met de papieren schijven. Na het wassen werden antilichamen op het aldehyde gefunctionaliseerde papier discs geladen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Immobiliseren antilichamen on-amine gefunctionaliseerde cellulose papier schijven door middel van perjodaat oxidatie (Figuur 1A).
- Meng 1 pl 2,5 mM natrium periodate met 2 pi 0,1 mg / ml konijn anti-humaan IgG-FITC en 7 ui 100 mM pH 5,5 acetaatbuffer in een 1,5 ml buis en incuberen van het mengsel in het donker gedurende 30 min.
LET OP: Volg deze volume verhouding meer geoxideerd antilichamen te bereiden indien nodig. Het volume verhouding van de concentratie van natriumperjodaat en konijn anti-humaan IgG-FITC optimaliseren. - Verdun de bovenstaande antilichaamoplossing met 30 ui 50 mM fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS, pH 7,4) tot een eindvolume van 40 pi.
- Bereid drie amine-gefunctionaliseerde medium-flow filter papier schijven en drie-amine gefunctionaliseerde fast-flow papieren schijven (zoals beschreven in paragraaf 1).
- Belasting 5 pi van de natriumperjodaat geoxideerd konijn anti-humaan IgG-FITC op elk medium stroomfilter papieren schijf en 8 pi op elke fast-flow filterpapier disk. Houd deze papieren schijven in het donker gedurende één uur bij kamertemperatuur.
- Was beide van de papieren schijf met 0,2 ml wassen buffer (50 mM Tris buffer met 0,15 M NaCl en 0,05% surfactant, pH 7,4). Herhaal het wassen drie keer.
- De fluorescentie beelden door een moleculaire fluorescentie imager om de aanwezigheid van antilichamen te identificeren op elke cellulosepapier schijf 32. Gebruik lege papierschijven (behandeld met dezelfde concentratie van antilichamen bij afwezigheid natriumperjodaat) als controle (Figuur S1 figuur S3).
OPMERKING: Bij experimentele optimalisering, de concentratie van één parameter die moet worden geoptimaliseerd en de concentraties van alle andere parameters vast. Een hoge fluorescentie-intensiteit verhoogt de hoeveelheid invangantilichamen die zijn geïmmobiliseerd op de cellulose papierschijven.
- Meng 1 pl 2,5 mM natrium periodate met 2 pi 0,1 mg / ml konijn anti-humaan IgG-FITC en 7 ui 100 mM pH 5,5 acetaatbuffer in een 1,5 ml buis en incuberen van het mengsel in het donker gedurende 30 min.
- Immobiliseren antilichamen op amine gefunctionaliseerd cellulose papier schijven door middel van glutaaraldehyde (Figuur 1B).
- Voeg de drie APS behandeld medium-flow filter papier schijven en de drie fast-flow filterpapier discs (described in paragraaf 1) tot 2 ml van 50 mM PBS (pH 7,4) die 0,05% glutaaraldehyde bevat gedurende 1 uur met orbitaal roeren bij kamertemperatuur.
Let op: Behandel glutaraldehyde in de zuurkast. - Plaats drie schijven elk in twee 1,5 ml centrifugebuizen. Voeg 1 ml gedeïoniseerd (DI) water aan elke buis en schud de buizen gedurende 10 sec. Verwijder het water door het opzuigen met een pipet. Herhaal dit nog twee keer om eventuele niet-gereageerd glutaaraldehyde te verwijderen.
- Belasting 5 pl 25 ug / ml konijn anti-humaan IgG-FITC (vangantilichaam) op beide aldehyde gefunctionaliseerde medium stroomfilter papieren schijf en voeg 8 pi op elk aldehyde gefunctionaliseerde fast-flow filterpapier disk. Incubeer in het donker gedurende ongeveer 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 10 ui 50 mM PBS (pH 7,4) aan elk papieren schijf zonder de antilichamen en incubeer gedurende 40 min voor het amine aldehyde reactie.
- Was de papierschijven met 0,2 ml wasbuffer op een papieren handdoek. HerhaalWas tweemaal.
- Fotografeer de fluorescentie-beelden door middel van een fluorescentie moleculaire imager om te controleren op de aanwezigheid van antilichamen op elke cellulose papieren schijf 33. Gebruik blanco papier schijven als een controle.
Opmerking: In figuur 4, "0" staat voor de blanco papieren schijf die met dezelfde concentratie van FITC-antilichaam in de afwezigheid van glutaaraldehyde werd behandeld; in figuur 5A, werden de lege papierschijven behandeld met glutaraldehyde, maar geen FITC-antilichamen werden op de papierschijven geplaatst.
- Voeg de drie APS behandeld medium-flow filter papier schijven en de drie fast-flow filterpapier discs (described in paragraaf 1) tot 2 ml van 50 mM PBS (pH 7,4) die 0,05% glutaaraldehyde bevat gedurende 1 uur met orbitaal roeren bij kamertemperatuur.
- Droog de papierschijven (van 2.1 en 2,2) bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
- Blokkeer de papierschijven met 15 pl blokkerende buffer (10% magere melkpoeder in 50 mM Tris buffer, pH 7,4, met 0,15 M NaCl) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Load 5 ul en 8 gl peroxidase geconjugeerd geit anti-konijn IgG in PBS (1: 10.000) op middelgrote stroming en fast-flow filter papierschijven respectievelijk. Incubeer30 min in het donker bij kamertemperatuur.
- Was de papierschijven met 0,2 ml wasbuffer op een papieren handdoek. Herhaal het wassen drie keer.
Opmerking: Het is niet nodig de wasbuffer verwijdert de resultaten niet worden beïnvloed door de buffer. - Laad een 10 pi mengsel van 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) en waterstofperoxide oplossing op elke schijf.
- Neem beelden van de papieren schijven met een digitale camera of smartphone na 5 min incubatie.
Opmerking: In figuur 5B, "0" staat voor de papierschijven die werden behandeld met glutaraldehyde, gevolgd door het laden antilichaam-HRP (mierikswortelperoxidase) conjugaat in afwezigheid van FITC-antilichaam.
3. Papier-gebaseerde ELISA voor IgG Detection
Figuur 2. Schematische weergave van de papieren ELISA for IgG detectie. invangantilichamen werden covalent geïmmobiliseerd op de aldehyde-gefunctionaliseerde cellulose papierschijven met glutaaraldehyde. De cellulose papierschijven werden geblokkeerd met blokkerende buffer. Doelwit IgG werd vervolgens toegevoegd aan de schijven, gevolgd door het laden van HRP-geconjugeerde antilichamen signaal. Tenslotte werd de TMB en waterstofperoxide mengsel oplossing op elk papieren schijf voor de kleur uitlezing geladen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Voeg 5 ml 0,05% glutaaraldehyde oplossing (bereid in 50 mM PBS, pH 7,4) in een 20 ml glazen fles. Dompel 15 amine-gefunctionaliseerde medium stroomfilter papierschijven in deze oplossing en bewaren 1 uur onder schudden bij kamertemperatuur.
- Tegelijkertijd Herhaal stap 3.1 tot en met nog eens 15 aldehyde gefunctionaliseerd fast-flow filter papier discs te bereiden.
Let op: Behandel glutaraldehyde in de rookkap.
- Tegelijkertijd Herhaal stap 3.1 tot en met nog eens 15 aldehyde gefunctionaliseerd fast-flow filter papier discs te bereiden.
- Om ongereageerde glutaaraldehyde uit de papierschijven verwijderen, plaatst het 15 medium stroomfilter papierschijven in een 15 ml centrifugebuis, en de 15 snelle stroomfilter papierschijven in een 15 ml centrifugebuis. Voeg 5 ml van DI water aan elke buis en schud de buizen gedurende 10 sec. Verwijder het water door het opzuigen met een pipet. Herhaal dit twee keer om eventueel niet gereageerd glutaaraldehyde te verwijderen.
- Droog de papieren schijven in een 37 ° C oven.
- Voeg 5 ul en 8 pi 0,025 mg / ml muizen-IgG-Fc-fragment antilichamen tegen elk van de medium-stroom en fast-flow filter papierschijven respectievelijk, en incubeer gedurende 20 minuten.
- Voeg 10 ul van 50 mM PBS (pH 7,4) aan elk papieren schijf zonder de antilichamen en incubeer gedurende 40 min voor het amine aldehyde reactie.
- Was de papierschijven met 0,2 ml wasbuffer op een papieren handdoek. Herhaal het wassen drie keer.
- Droog de papierschijven in een oven op 37 ° C.
- Blokkeer de papieren schijven wi 15 pl blokkerende buffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Was beide papieren schijf met 0,2 ml wasbuffer op een papieren handdoek. Herhaal het wassen drie keer.
- Run IgG-normen.
- Belasting 10 pl diverse IgG concentraties (bijvoorbeeld 0, 10, 125, 250 en 500 ng / ml in PBS) op elke schijf in drievoud. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Was de papierschijven met 0,2 ml wasbuffer op een papieren handdoek. Herhaal het wassen drie keer.
- Belasting 10 gl HRP geconjugeerd muis-IgG-Fc-fragment antilichamen (1: 10.000, 10 mM PBS, pH 7,4) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Was de papierschijven met 0,2 ml wasbuffer op een papieren handdoek. Herhaal het wassen drie keer.
Opmerking: Het is niet nodig de wasbuffer verwijdert de resultaten niet worden beïnvloed door de aanwezigheid van buffer. - Laad een 10 pi mengsel van TMB en waterstofperoxide op elke schijf.
- Take beelden van al het papier schijven met een digitale camera of smartphone na 5 min incubatie.
Opmerking: In figuur 6A, "0" staat voor papierschijven behandeld met invangantilichaam immobilisatie, en het antilichaam-HRP / TMB oplossing zonder serum IgG. - Analyseer de intensiteit van elke papieren schijf in het beeld van Image J.
- Omzetten van de foto's genomen in stap 3.15 tot 'tif' format.
- Open 'Afbeelding J' software.
- Ga naar 'Bestand → Open', kies dan de afbeelding om te analyseren.
- Klik op de knop vorm 'Oval'.
- Ga naar 'Beeld → Type → 32 bit'.
- Ga naar 'Edit → Omkeren'.
- Ga naar 'Analyze → Measure'.
- Kopieer en analyseren van de gegevens in een spreadsheet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 3. Fourier transformatie infrarood (FTIR) spectra van onbehandelde en behandelde APS-medium stroomfilter vierkant papier (A) en fast-flow filter vierkant papier (B). A. De spectra voor onbehandelde medium stroomfilter vierkant papier was vergelijkbaar met dat van APS behandelde medium stroomfilter vierkant papier. De toename van de intensiteiten op banden van 902-1,170 cm -1 en 1,210-1,500 cm -1 voor de APS-behandelde vierkant papier behoorde tot Si-O-cellulose en CH vervormingen van SIOC-H groepen, respectievelijk. De toename van de banden bij 1650 cm -1 en 2885 cm -1 behoort tot het buigen van -NH 2 en CH 2 trillingen van de saline propyl groep, resp. B. De karakteristieke pieken in de 972 tot 1180 cm -1 bereik werden toegeschreven aan de Si-O-Si en SO-cellulose obligaties. De piek bij 1003 cm -1 werd veroorzaakt door de overlap van de Si-O-Si binding en de CO strekken van cellulose. Alle resultaten laten zien dat APS met succes is geënt op de cellulose plein papieren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De aanwezigheid van amine- functionele groepen op de cellulose vierkante stukken werden bepaald door FTIR. Figuur 3 geeft de FTIR-spectra onbehandelde gemodificeerd, medium-stroom en fast-flow filter square papers. Er waren drie stappen van de chemische modificatie van aminoalkylgroepen, via APS op cellulose oppervlakken. Stap één betrof de hydrolyse van APS de silanol derivaat van APS verschaffen. Stap twee betrokken adsorptie van het gehydrolyseerde derivaat APS op de cellulosevezels tot waterstofbinding OH-groepen van de hydrolyzed APS derivaat en de cellulose vezels. Stap drie bij de condensatie van de geadsorbeerde APS-derivaat, waardoor het enten van de APS-derivaat op het oppervlak van de cellulosevezel door middel van Si-OC binding en de vorming van Si-O-Si bruggen 34 siloxaan. Zoals getoond in figuur 3A, de toename van de band bij 1650 cm -1 werd aan het buigen van NH2 groepen en een toename van de band bij 2885 cm -1 overeenkomt met de CH 2 trillingen van het silaan propyl groep. Voor het origineel middel stroomfilter vierkant papier, de banden bij 902-1,170 cm -1 en 1,210-1,500 cm -1 overeen met de trillingen van de COC banden van glycosidische bruggen en uitrekking CH trillingen. Na behandelen van het vierkant papier met APS, verhoging van de voorziene deze twee bandbreedtes aangeeft dat ze tot Si-O-CH cellulose en vervormingen van SIOC-H groepen, respectievelijk. Net als bij middelgrote flow filter vierkant papier, de spectra voor gewijzigde fast-flow filter vierkant papier ook toegenomen in intensiteit bij 1650 cm -1 voor -NH2, vanwege de chemische modificatie met APS (Figuur 3B). De sterke karakteristieke pieken in de 972 tot 1180 cm -1 bereik werden toegeschreven aan de Si-O-Si en SO-cellulose obligaties; de hoogste piek was bij 1003 cm -1 vanwege de overlap van de Si-O-Si binding en de CO strekken cellulose 34. De karakteristieke obligaties in het golflengtegebied tussen 1188 en 1510 cm -1 voor APS behandeld vierkant papier worden veroorzaakt door de trillingen van de COC banden van glycosidische bruggen en CH stretching vibraties. De CH 2 stretching trillingen obligaties werden getoond bij 2,800-2,980 cm -1 en de hoogste piek werd in 2932 cm -1 voor de APS behandelde vierkant papier. Concluderend kan APS covalent worden geënt op nummer 1 en nr 113 filter vierkante papieren.
Figuur 4. Fluorescentie respons op verschillende concentraties van glutaaraldehyde in de immobilisatie van IgG-FITC op het papier discs (methode B) instellingen voor fluorescentie moleculaire imager. Excitatie, 488 nm, emissie 530 nm, resolutie 100 micrometer A:. Fluorescentie respons op 0, 0,001%, 0,005%, 0,01% en 0,050% glutaaraldehyde B:. Fluorescentie reactie op 0, 0,050%, 0,100%, 0,250% en 0,500% glutaaraldehyde. De concentratie van IgG-FITC op elke schijf was 0,01 mg / ml. Een verhoging van de concentratie van glutaaraldehyde ten hoogste 0,05% resulteerde in een toegenomen belading hoeveelheid IgG-FITC. Concentraties van glutaaraldehyde boven 0,05% daalde het laden hoeveelheid IgG-FITC. Klik hier om een grotere versie van deze fotofiguur.
Figuur 5. Fluorescentie reactie (A) en colorimetrische resultaat (B) met verschillende concentraties van IgG-FITC op de IgG-FITC-geïmmobiliseerde middelgrote stroming en fast-flow filter papierschijven (methode B) instellingen voor fluorescentie moleculaire imager. Excitatie , 488 nm, emissie, 530 nm, resolutie, 100 micrometer. # 1 staat voor kwaliteit No. 1, middelgrote-flow filter papieren schijf, en # 113 vertegenwoordigt rang No. 113 fast-flow filter papier schijf. APS-gemodificeerde papierschijven werden behandeld met 0,05% glutaaraldehyde als eerste. Vervolgens verschillende concentraties van IgG-FITC werden op de glutaaraldehyde gemodificeerde papierschijven. Verhogen van de belasting concentratie van IgG-FITC verhoogde de hoeveelheid van het geïmmobiliseerde IgG-FITC op het papierschijven. Verhoogde concentraties van geïmmobiliseerde IgG-FITC niet de bindingscapaciteit aan het antigeen te verbeteren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De basis workflow voor de covalente immobilisatie van antilichamen op met amine gefunctionaliseerde cellulose papierschijven wordt weergegeven in figuur 1. Het konijn anti-humaan IgG-FITC werd covalent geïmmobiliseerd op de cellulose papierschijven. De fluorescentie van de papierschijven aangegeven de immobilisatie van antilichamen tegen de papierschijven en de intensiteit van de fluorescentie was direct proportioneel met de concentratie van geïmmobiliseerde antilichamen. Peroxidase geconjugeerd geit anti-konijn IgG werd daarna aangebracht op het bindingsvermogen van het geïmmobiliseerde antilichamen te bepalen. Secundaire aminegroepen en aldehydegroepen kunnen met elkaar reageren tot een Schiffse base, die is gebruikt in bioconjugatie 35 vormen. Zij werden ook hier gebruikt voor covalente immobilisatie van captureantilichamen. In werkwijze A (figuur 1A), -NH 2 werd aan de cellulose papierschijven en -CHO was afgeleid van het konijn anti-humaan IgG-FITC door oxidatie van het Fc-gebied van antilichamen met natriumperjodaat. Op dezelfde manier werden de effecten van verschillende concentraties van natriumperjodaat en IgG-FITC-antilichamen geanalyseerd. Zoals getoond in figuur S1 en Figuur S2, natriumperjodaat van concentraties van 0 tot 1 mM en het konijn anti-humaan IgG-FITC 0,016-0,16 mg / ml had weinig effect op de oxidatie van 0,08 mg / ml konijn anti-humaan IgG FITC. De hoeveelheid antilichamen die covalent zijn gebonden aan de papierschijven toe met een toenemende concentratie van invangantilichamen 0-0,075 mg / ml (Figuur S3A).
Een zwakke kleurverandering werd waargenomen wanneer het bindingsvermogen werd bepaald door de peroxidase bepaling. Dit kan door het gebruik vanovermaat natriumperjodaat, dat reageert met de invangantilichamen en veroorzaakt een verlies van bindingsactiviteit. Het is waarschijnlijk dat de natriumperjodaat niet volledig worden verwijderd van de papierschijven gewassen. Dit werd bevestigd door de simpele principe dat natriumperjodaat oplossing heeft een gele kleur bij menging met PURPALD oplossing. Daarom werden perjodaat geoxideerd antilichamen geladen op de papierschijven en geïncubeerd gedurende 1 uur. De papierschijven werden driemaal gewassen met PBS (met 0,05% Tween-20) en vervolgens werd PURPALD oplossing toegevoegd aan deze schijven. Het papier schijven toonde een paarse kleur onmiddellijk, met vermelding van de aanwezigheid van aldehyde groepen uit-perjodaat geoxideerde antilichamen. Deze paarse kleur veranderde in geel binnen 10 minuten, waarbij de aanwezigheid van natriumperjodaat op papierschijven bevestigd.
Als alternatief kan een glutaraldehyde crosslinking methode (methode B, figuur 1B) werd gebruikt om het amine te koppelen groups van de APS-behandelde papierschijven en antilichamen. De concentraties van glutaaraldehyde (figuur 4) en konijn anti-humaan IgG-FITC (figuur 5A) die op de cellulose papierschijven geladen, zijn geoptimaliseerd. Zoals getoond in figuur 4, de fluorescentie-intensiteit bereikt een maximum van 0,05% glutaaraldehyde, waardoor het laden van konijn anti-humaan IgG-FITC verzadigd raakte de cellulose papieren schijf bij deze concentratie; een verhoging van de concentratie van glutaaraldehyde 2,5% had een verhoging van het aantal konijnen anti-humaan IgG-FITC op het cellulose papierschijven (figuur S4) vertonen. De fluorescentie-intensiteit ook toe met toenemende concentraties van konijnen anti-humaan IgG-FITC dat op de papierschijven (Figuur 5A) werden geladen. Een blauwe kleur ontwikkelde direct na de toevoeging van TMB substraat en waterstofperoxide gemengde oplossing op het papier's bekijken die peroxidas bevattee geconjugeerde detectie-antilichamen (Figuur 5B). Bovendien blokkerende buffer die bevatte 10% magere melkpoeder werd aangetoond dat het blokkeren van efficiëntie na 15 wasbeurten (figuur S5) behouden. Werkwijze B werd gekozen voor de toepassing van het geïmmobiliseerde antilichamen te testen, zoals gedemonstreerd verbeterde bindingsactiviteit aan zijn doel. Vandaar dat een 0,025 mg / ml concentratie invangantilichamen werd voor IgG detectie.
Figuur 6. IJkkrommen voor de bepaling van IgG door ELISA papieren. # 1 staat voor rang No. 1, middelgrote stroomfilter papieren schijf en # 113 vertegenwoordigt rang No. 113 fast-flow filterpapier disk. Het bovenste paneel A toont de kleur uitlezing voor middelgrote stroming (# 1) en fast-flow (# 113) cellulosepapier schijven met verschillende concentraties van IgG. Het onderste paneelB toont de ELISA resultaten voor verschillende concentraties van IgG. Drievoud werden gebruikt om de standaarddeviatie (SD) te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Geit anti-muis IgG-Fc-fragment vangend antilichaam, IgG serum en geit anti-muis IgG-Fc-fragment antilichaam geconjugeerd HRP werden gebruikt voor de sandwich test. Zoals getoond in figuur 6 en figuur S6, de concentratie van IgG serum van 0 tot 500 ng / ml had een lineair verband met colorimetrische intensiteit bij elke stap werd gedurende 1 uur. In figuur S6, de kleurvariatie met verschillende concentraties IgG was het voor 1 uur incubatie. Maar de resultaten van de 10 minuten incubatie was geen duidelijke verandering in de kleurintensiteit met verschillende concentraties IgG tonen. Dus de sensItivity van deze paper-gebaseerde ELISA geschikt was voor het ontwikkelen van praktische point-of-care testen.
Figuur S1. Fluorescentie respons op verschillende concentraties van natriumperjodaat (methode A). Variërende concentraties natriumperjodaat werden in een concentratie van 0,016 mg / ml en gebruikt voor het bestuderen van antilichaam oxidatieactiviteit gemengd met konijn anti-humaan IgG-FITC. Door verhogen van de concentratie van natriumperjodaat, het laden hoeveelheid IgG-FITC toe en bereikte een maximum bij 0,25 mM. Waargenomen werd dat de concentraties van natriumperjodaat die hoger waren dan dit de hoeveelheid geïmmobiliseerde IgG-FITC niet verhoogd. Drievoud werden gebruikt om de standaarddeviatie (SD) te bepalen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur S2. fluorescentieresponsen verschillende concentraties van konijnen anti-humaan IgG-FITC (methode A). De concentratie van natriumperjodaat was 0,25 mM in de oplossing van het antilichaam oxidatieactiviteit onderzoek en de eindconcentratie van konijn-anti-humaan IgG-FITC op elke schijf was 0,016 mg / ml. Wanneer de concentratie van natriumperjodaat werd vastgesteld, de concentratie van IgG-FITC had weinig effect op de oxidatie van IgG-FITC. Drievoud werden gebruikt om de standaarddeviatie (SD) te bepalen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur S3. Fluorescentierespons en colorimetrische resultaat van het laden van verschillende concentraties geoxideerde konijnen anti-humaan IgG-FITC op het papierschijven (methode A). Voor natriumperjodaat oxidatie, 0,08 mg / ml IgG-FITC en 0,25 mM natriumperjodaat gebruikt. De verdunning van peroxidase-geconjugeerd anti-konijn IgG1: 50.000. Het verhogen van de belasting concentratie van IgG-FITC op het cellulose papier schijven verhoogde het bedrag van geïmmobiliseerde IgG-FITC, maar had geen effect op doel binding hebben. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur S4. Fluorescentie vanwege de hoge concentratie van glutaaraldehyde in de immobilisatie van IgG-FITC op het cellulose papierschijven (methode B). De concentratie van IgG-FITC op elke schijf was 0,01 mg / ml. Concentraties van glutaaraldehyde die hoger zijn dan 0,25% heeft de hoeveelheid geïmmobiliseerde IgG-FITC op het cellulose papier discs niet toenemen waren. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur S5. Effect van aantal wastijd. A: was. hing drie keer B: wassen 15 keer. Capture antilichamen geïmmobiliseerd op de cellulose vierkant papier nog steeds een goede binding capaciteit om hun doelstellingen, hoewel het plein papier werd 15 keer gewerveld. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur S6. Papieren ELISA resultaten voor IgG. Voor de concentraties van IgG van 0 tot 500 ng / ml De resultaten van één uur incubatie zijn beter dan de resultaten van 10 minuten incubatie. Voor hoge concentraties van IgG, 10 minuten is genoeg tijd voor incubatie. Drievoud werden gebruikt om de standaarddeviatie (SD) te bepalen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur S7. Scanning elektronenmicroscopie (SEM) beelden van medium-flow filter papier op verschillende vergrotingen. A: 85X en B: 20.000 x. Veldemissie scanning elektronenmicroscoop (FE-SEM) werkend bij 5 kV werd gebruikt om de deeltjesmorfologie bepalen. De cellulose vezels zijn willekeurig verknoopt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur S8. SEM beelden van fast-flow filter papier op verschillende vergrotingen. A: 100X en B: 20.000 x. Veldemissie scanning elektronenmicroscoop (FE-SEM) werkend bij 5 kV werd gebruikt om de deeltjesmorfologie bepalen. De cellulose vezels zijn willekeurig verknoopt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Directe coating van affiniteit gezuiverd geit-anti-muis IgG-Fc capture antilichaam op niet-gemodificeerde cellulose papierschijven werd uitgevoerd IgG concentraties te detecteren. De resultaten gaven aan dat verdere fixatie van de invangantilichamen vereist voor reproduceerbaarheid. Het silaan techniek werd met succes gebruikt voor aminefunctionele groepen te introduceren aan de cellulose papierschijven 34. De concentratie van APS beïnvloedt de immobilisatie van antilichamen. Derhalve werd de hoeveelheid APS in aceton geoptimaliseerd. 1 ml van APS in 10 ml aceton werd een optimale concentratie voor het enten van de aminegroep voor het immobiliseren van antilichamen door een glutaaraldehyde verknopingsmiddel. Antilichamen werden geënt op de cellulose papierschijven door perjodaat oxidatie en glutaaraldehyde verknopingswerkwijzen. Onze resultaten lieten zien dat de bindingscapaciteit van geïmmobiliseerde antilichamen via glutaraldehyde crosslinking methode was beter dan de perjodaatoxidatie werkwijze voor medium-flow en een snelle doorstroming-filterpapier discs. Verder invangantilichamen, die cellulose papierschijven werden geïmmobiliseerd via een glutaraldehyde crosslinking werkwijze behielden hun functie en werden stabiel zelfs geïmmobiliseerd al het papier aan de mechanische spanning van 15 wassingen werd onderworpen aan vortexen. Tien procent van de mageremelkpoeder blokkerende buffer bleek te zijn het blokkeren van efficiëntie na 15 wasbeurten (figuur S5) te behouden.
Het covalent geïmmobiliseerde antilichamen werden toegepast om een sandwich ELISA uitgevoerd met de detectie van IgG. IgG bij een concentratie van 100 ng / ml werd gedetecteerd met het blote oog met deze papieren schijf gebaseerde test. De concentratie van IgG serum van 0 tot 500 ng / ml vertoonde een lineaire relatie met colorimetrische intensiteit, bij elke stap werd gedurende één uur. De immunoassay testen voor deze papieren schijf gebaseerde ELISA vereist minder reagens en monster bleek efficiënter dan conventionele immunoassays 36 zijn Figuur S7 en S8 Figuur respectievelijk. Zoals getoond in deze figuren zijn de vezels willekeurig verknoopt voor beide soorten schijven filterpapier 25. De reden voor deze hoge gevoeligheid kan de dikte van het papier schijf. Voor fast-flow filter papier schijven was de dikte van 420 urn ten opzichte van 180 micrometer voor middelgrote-flow filter papier. Dus meer invangantilichamen waren waarschijnlijk geïmmobiliseerd op fast-flow filter papierschijven, die verder de gevoeligheid van de test zou toenemen. Tegelijkertijd, de poriegrootte van de fast-flow filter papierschijven (30 pm) was groter dan die van het medium stroomfilter papierschijven (11 & #181; m). Na papieroppervlak blokkering, de poriegrootte van de eerste was nog steeds groot genoeg om vloeistofstroming rijden zonder extra stroomsysteem. De stroomsnelheid van de buffer in de laatste langzamer. Daarom fast-flow filtreerpapier was beter dan middelgrote stroming filtreerpapier bij de toepassing van immunoassays.
De reproduceerbaarheid van de antilichamen geïmmobiliseerd op de filter papierschijven werd geëvalueerd door verdere incubatie van de papierschijven met peroxidase-geconjugeerd geiten anti-konijn IgG en detectie van de colorimetrische resultaat na het laden van het TMB-substraat en waterstofperoxide gemengde oplossing. De standaardafwijking was minder dan 10% voor deze papieren apparaat. De stabiliteit van konijn-anti-humaan IgG-FITC op het NH2 gemodificeerde cellulose papierschijven werd getest tot twee maanden. De papierschijven dat bij 4 ° C werden bewaard handhaafden hun bindingsactiviteit aan peroxidase geconjugeerd geit anti-konijn IgG met een lichte daling van de binding activiteit. Wanneer de antilichaam geïmmobiliseerd papierschijven werden opgeslagen bij kamertemperatuur of 60 ° C, verloren hun bindingsactiviteit door de droogte en hoge temperaturen. De gemaakte antilichamen kunnen gedestabiliseerd en gedenatureerd onder deze omstandigheden.
Er zijn een aantal belangrijke stappen in de immobilisatie van invangantilichamen op cellulose papierschijven behulp glutaaraldehyde als verknopingsmiddel. Stap 1,2 tot aminegroepen enten op het papier schijven is een cruciale stap in de succesvolle covalente immobilisatie van capture antilichamen. Als deze stap mislukt, wordt het volledige immobilisatie proces mislukken. FTIR werd bepaald of aminegroepen succes werden geïmmobiliseerd op de papierschijven (stap 1,6). Ten tweede, het enten van aldehydegroepen op de cellulose papierschijven is een cruciale stap (stap 2.2.1 en stap 3,1). De antilichamen werden covalent geïmmobiliseerd op de cellulose papierschijven door de vorming van een Schiffse base. Eindelijk, De stap naar capture antilichamen te immobiliseren op het filter papier discs is belangrijk (Stap 2.2.3, Stap 3.4 en Stap 3.5). De aminegroepen van de invangantilichamen reageren met de aldehyde groepen van de cellulose papierschijven aan de antilichamen op het papierschijven lossen. Als deze stap mislukt, zou invangantilichamen niet immobiliseren op het papier schijven en alle ELISA-applicatietesten zou negatief zijn. We kunnen een moleculaire fluorescentie imager om de aanwezigheid van invangantilichamen bepalen. Peroxidase-geconjugeerd geit anti-konijn IgG en peroxidase gebaseerde colorimetrische reacties kunnen worden toegepast om de bindingscapaciteit van de geïmmobiliseerde antilichamen te bevestigen.
Dit protocol kan een aantal problemen, zoals een hoge achtergrond van het signaal, geen signaal of een zwak signaal, en een ongelijkmatige kleur uitlezing tegenkomen. De mogelijke oorzaken van deze problemen en methoden voor probleemoplossing voor het overwinnen van deze problemen worden hieronder besproken. High achtergrond signalen treden meestal due om een korte tijd blokkeren. Dit kan worden opgelost door het verhogen van de blokkerende incubatietijd, wassen papierschijven grondig en het vermijden van de toevoeging van overmaat detecterende antilichaam geconjugeerd enzym hoge achtergrondsignalen te verwijderen. De mogelijke oorzaken zijn het ontbreken van doelantigeen, dan blokkeren, voldoende incubatietijd, en een niet-functionele detectie antilichaam-enzym conjugaat. Om deze problemen te overwinnen, moet de doelantigenen worden toegevoegd en geïncubeerd gedurende een geschikte tijdsperiode met een nieuw antilichaam conjugaat en slaan zoals gesuggereerd door de fabrikant. Het is raadzaam om een positieve controle voor detectie omvatten. Ongelijke kleur uitlezingen zijn door het stapelen van papierschijven gedurende het entproces. Om dit probleem te voorkomen, moet de papieren schijven worden gescheiden tijdens de APS enting proces, en het antigen en detectie antilichaam conjugaat enzym moet gelijkmatig worden verspreid over de papieren schijf bij elke stap.
Hoewel de papieren test is een eenvoudigeen kosteneffectieve methode zijn er beperkingen. De oriëntatie van antilichamen op het substraatoppervlak is kritisch voor de prestatie van de immunoassay, zoals glutaaraldehyd verknopingsmiddel reageert met de aminegroepen van het Fab gebied en het Fc-gebied van de invangantilichamen. Zo hoeft de geïmmobiliseerde antilichamen niet voor in hooggeoriënteerde wijze. Aangezien er meer aminegroepen uit de regio Fab dan van het Fc-gebied van de IgG antilichamen, de bindingsactiviteit van de geïmmobiliseerde antilichamen nog steeds hoog genoeg is voor de toepassing ervan.
Verschillende oppervlakte functionalisering methoden voor het cellulose papier werden samengevat in een recent rapport 37. Reagentia zoals divinylsulfon; 1,4-phenylenediisothiocyanate; 4-azido-benzenediazonium; epichloorhydrine; 4-azido-a-fluor-2-nitrocyclohexane; en 4-mercapto-benzenediazonium, kan worden gebruikt voor het covalent immobiliseren biomoleculen cellulose papier. Adsorptie en invangen werden ook gebruikthet bekleden van de cellulose papier met biomoleculen. Vergeleken met de andere methoden, de combinatie van de techniek silaan en glutaaraldehyd verknopingsmiddel voor covalente immobilisatie van antilichamen op cellulose papier is een eenvoudige methode. Bovendien kan deze combinatie weinig effect hebben op de thermische en mechanische eigenschappen van het cellulose papier, waardoor de maximale verticale doorstroming in immunoassays. Deze strategie kan worden uitgebreid tot andere biomoleculen te immobiliseren op het cellulose papier.
De methodologie hier getoond zou kunnen worden uitgebreid tot de ontdekking van een analyt, zolang rechtstreekse antilichamen daartegen zijn. Deze werkwijze kan ook worden gebruikt voor multiplex detectie ontwikkelen. Bijvoorbeeld, op een vierkant papier, verschillende gebieden onderscheiden van verschillende doelwitten. De invangantilichamen voor de doelstellingen kunnen worden geïmmobiliseerd door een glutaaraldehyde verknopingsmiddel van hun specifieke gebied. Dit kan worden gevolgd door de ELISEen procedure om verschillende doelen te detecteren. Zo is de voorgestelde werkwijze maakt de papieren ELISA een veelzijdig instrument voor de detectie van andere doelen via het blote oog.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellulose filter paper, Grade 1 (medium flow filter paper) | GE Healthcare Pte Ltd Singapore | 1001 110 | |
| Cellulose filter paper, Grade 113 (Fast flow filter paper) | Sigma-Aldrich, Singapore | 1113-320 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Singapore | G6257 | Grade II, 25% in H2O |
| Surfactant | Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore | P2287 | |
| Bovine serum album | Sigma-Aldrich, Singapore | A2153 | |
| Skimmed milk powder | Louis François | Packed by Kitchen Capers, Singapore | |
| Tris base | Promega | H5135 | |
| Sodium periodate | Merck | 106597 | |
| Na2HPO4 | Merck | 106585 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| NaCl | CALBIOCHEM | 567441 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| HCl | Merck | 100317 | |
| phosphate buffer saline (PBS) | N/A | N/A | PBS, containing 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol/L Na2HPO4 and 1.5 mmol/L KH2PO4, is prepared with water and adjusted to pH 7.4 with 0.1 mol/L NaOH or 0.1 mol/L HCl |
| Acetone | Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore | 9005-68 | |
| Mixture of TMB and hydrogen peroxide solution | 1-Step ultra TMB-ELISA solution , Thermo Scientific Pierce | 34029 | 1 L |
| Rabbit anti-human IgG-FITC | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2278 | |
| Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2030 | |
| Affinity purified goat anti-Mouse IgG-Fc coating antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131A | |
| Mouse reference serum | Bethyl Laboratories, Inc | RS10-101-5 | 9.5 mg/ml |
| HRP conjugated goat anti-mouse IgG-Fc detection antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131P | |
| Equipment | |||
| Fourier transform infrared spectrophotometer | Shimadzu IR Prestige-21 | N/A | |
| Fluorescence molecular imager | Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore | N/A | |
| Oven | NUVE FN500 | N/A | |
| Turbo mixer VM-2000 | MYC LTD | N/A | |
| ImageJ | RGB, free download | N/A |
References
- Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). J. Virol. Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M. Simple telemedicine for developing regions: camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis. Anal. Chem. 80 (10), 3699-3707 (2008).
- Lode, P. V. Point-of-care immunotesting: approaching the analytical performance of central laboratory methods. Clin. Biochem. 38 (7), 591-606 (2005).
- Posthuma-Trumpie, G. A., Amerongen, A. V., Korf, J., Berkel, W. J. V. Perspectives for on-site monitoring of progesterone. Trends Biotechnol. 27 (11), 652-660 (2009).
- Lim, D. V., Simpson, J. M., Kearns, E. A., Kramer, M. F. Current and developing technologies for monitoring agents of bioterrorism and biowarfare. Clin. Microbiol. Rev. 18 (4), 583-607 (2005).
- Li, X., Tian, J., Shen, W. Progress in patterned paper sizing for fabrication of paperbased microfluidic sensors. Cellulose. 17 (3), 649-659 (2010).
- Nie, Z., et al. Electrochemical sensing in paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 10, 477-483 (2010).
- Delaney, J. L., Hogan, C. F., Tian, J., Shen, W. Electrogenerated chemiluminescence detection in paper-based microfluidic sensors. Anal. Chem. 83 (4), 1300-1306 (2011).
- Oh, Y. K., Joung, H. A., Kim, S., Kim, M. G. Vertical flow immunoassay (VFA) biosensor for a rapid one-step immunoassay. Lab Chip. 13 (5), 768-772 (2013).
- Cheng, C. M., et al.
- Jarujamrus, P., Tian, J., Li, X., Siripinyanond, A., Shiowatana, J., Shen, W. Mechanisms of red blood cells agglutination in antibody-treated paper. Analyst. 137 (9), 2205-2210 (2012).
- Credou, J., Volland, H., Dano, J., Berthelot, T. A one-step and biocompatible cellulose functionalization for covalent antibody immobilization on immunoassay membranes. J. Mat. Chem. B. 1, 3277-3286 (2013).
- Kong, F., Hu, Y. F. Biomolecule immobilization techniques for bioactive paper fabrication. Anal. Bioanal. Chem. 403, 7-13 (2012).
- Orelma, H., Teerinen, T., Johansson, L. S., Holappa, S., Laine, J. CMC-modified cellulose biointerface for antibody conjugation. Biomacromolecules. 13, 1051-1058 (2013).
- Yu, A., et al. Biofunctional paper via covalent modification of cellulose. Langmuir. 28 (30), 11265-11273 (2012).
- Stollner, D., Scheller, F. W., Warsinke, A. Activation of cellulose membranes with 1,1′-carbonyldiimidazole or 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate as a basis for the development of immunosensors. Anal Biochem. 304 (2), 157-165 (2002).
- Bora, U., Sharma, P., Kannan, K., Nahar, P. Photoreactive cellulose membrane - a novel matrix for covalent immobilization of biomolecules. J. Biotechnol. 126 (2), 220-229 (2006).
- Sharma, P., Basir, S. F., Nahar, P. Photoimmobilization of unmodified carbohydrates on activated surface. J Colloid Interface Sci. 342 (1), 202-204 (2010).
- Brumer, H., Zhou, Q., Baumann, M. J., Carlsson, K., Teeri, T. T. Activation of crystalline cellulose surfaces through the chemoenzymatic modification of xyloglucan. J. Am. Chem. Soc. 126 (18), 5715-5721 (2004).
- Araujo, A. C., Song, Y., Lundeberg, J., Stahl, P. L., Brumer, H. Activated paper surfaces for the rapid hybridization of DNA through capillary transport. Anal Chem. 84 (7), 3311-3317 (2012).
- Xu, C., Spadiut, O., Araujo, A. C., Nakhai, A., Brumer, H. Chemo-enzymatic Assembly of Clickable Cellulose Surfaces via Multivalent Polysaccharides. ChemSusChem. 5 (4), 661-665 (2012).
- Filpponen, I., et al. Generic method for modular surface modification of cellulosic materials in aqueous medium by sequential "click" reaction and adsorption. Biomacromolecules. 13 (3), 736-742 (2012).
- Feese, E., Sadeghifar, H., Gracz, H. S., Argyropoulos, D. S., Ghiladi, R. A. Photobactericidal porphyrin-cellulose nanocrystals: synthesis, characterization, and antimicrobial properties. Biomacromolecules. 12 (10), 3528-3539 (2011).
- Zang, D., Ge, L., Yan, M., Song, X., Yu, J. Electrochemical immunoassay on a 3D microfluidic paper-based device. Chem. Commun. 48 (39), 4683-4685 (2012).
- Ge, L., Yan, J. X., Song, X. R., Yan, M., Ge, S. J., Yu, J. H. Three-dimensional paper-based electrochemiluminescence immunodevice for multiplexed measurement of biomarkers and point-of-care testing. Biomaterials. 33 (4), 1024-1031 (2012).
- Wang, S., et al. Paper-based chemiluminescence ELISA: lab-on-paper based on chitosan modified paper device and wax-screen-printing. Biosens. Bioelectron. 31 (1), 212-218 (2012).
- Koev, S. T., et al. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
- Wang, S. M., et al. Simple and covalent fabrication of a paper device and its application in sensitive chemiluminescence immunoassay. Analyst. 137 (16), 3821-3827 (2012).
- Sadira, S., Prabhakaranc, M. P., Wicaksonob, D. H. B., Ramakrishna, S. Fiber based enzyme-linked immunosorbent assay for C-reactive protein. Sensor Actuat B-Chem. 205, 50-60 (2014).
- Koga, H., Kitaoka, T., Isogai, A. In situ modification of cellulose paper with amino groups for catalytic applications. J. Mater. Chem. 21, 9356-9361 (2011).
- Klemm, D., Heublein, B., Fink, H. P., Bohn, A. Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material. Angew. Chem., Int. Ed. 44 (22), 3358-3393 (2005).
- Fernandes, S. C. M., et al. Bioinspired antimicrobial and biocompatible bacterial cellulose membranes obtained by surface functionalization with aminoalkyl groups. ACS Appl. Mater. Interfaces. 5 (8), 3290-3297 (2013).
- Pharos FX plus molecular imager instructions, Catalog Number 170-9460. , (2005).
- Tee, Y. B., Talib, R. A., Abdan, K., Chin, N. L., Basha, R. K., Yunos, K. F. M.
- Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nat Protoc. 2, 1152-1165 (2007).
- Guidi, A., Laricchia-Robbio, L., Gianfaldoni, D., Revoltella, R., Del Bono, G. Comparison of a conventional immunoassay (ELISA) with a surface plasmon resonance-based biosensor for IGF-1 detection in cows' milk. Biosens Bioelectron. 16, 971-977 (2001).
- Ahmed, S., Bui, M. N., Abbas, A. Paper-based chemical and biological sensors: Engineering aspects. Biosens Bioelectron. 77, 249-263 (2016).
