Abstract
Bu rapor, selüloz filtre kağıdı notu 1 No'lu (orta akış filtre kağıdı) diskler ve sınıf sayılı 113 (hızlı akış filtre kağıdı) disklerine yakalama antikorların kovalent immobilizasyonu için iki yöntem sunar. antikorlar, bunların üzerinde hareketsiz önce bu selüloz kağıt diskler bir silan birleştirme tekniği ile amin fonksiyonel grubu ile aşılanmıştır. Periodat oksitleme ve glutaraldehid çapraz bağlama yöntemleri selüloz kağıt diskler üzerinde yakalama antikorları graft için kullanılmıştır. immobilizasyon sonra hedeflere antikorlarla maksimum bağlama kapasitesini sağlamak için, sodyum periodat, glutaraldehid ve kağıt diskler yüzeyi üzerinde antikorlarla çeşitli konsantrasyonlarda etkisi araştırılmıştır. periodat oksitleme yöntemine göre bir glutaraldehid çapraz bağlama maddesi yoluyla amin fonksiyonlu selüloz kağıt diskler üzerinde kaplanmıştır antikorlar hedef bağlanma aktivitesi geliştirilmiş gösterdi. (Fare referans serumda) IgG glutaraldehit yoluyla kovalent olarak hareketsizleştirilmiş antikor uygulamasını test etmek için bu çalışmada referans hedef olarak kullanıldı. Yeni bir kağıt bazlı, enzime bağlı immünosorbent deneyi (ELISA), başarılı bir şekilde geliştirilmiştir ve IgG saptanması için doğrulanmıştır. Bu yöntem, ekipman gerektirmez ve IgG 100 ng / ml algılayabilir. Hızlı akışlı filtre kağıdı orta akış filtre kağıdı daha duyarlıydı. Bu testin kuluçka süresi kısa ve küçük bir örnek hacimleri gerekli. Bu çıplak gözle, kolorimetrik immunoassay geleneksel ELISA ile tespit edilir diğer hedefleri tespit etmek için uzatılabilir.
Introduction
Nokta-bakım testi (POCT) tanı çalışma tedavi için yeni stratejilerin geliştirilmesi, kişiselleştirilmiş tıp ve ev bakımı 1 için çok önemlidir. Onlar, ucuz erişilebilir ve kullanıcılara 2 tanıdık gibi selüloz kağıtları yaygın bağışıklık platformlarda olarak kullanılır. Buna ek olarak, selüloz kağıt gözenekli yapısı ek enerji etkisi olmadan sıvı akışını sürücü güce sahip. Kağıt tabanlı biyo analizler kayıtları gibi erken en yaygın örneği hamilelik ve diyabet test şeritleri olarak immünokromatografik testleri 3, 1952 yılında kağıt kromatografisi ilk icat edildi 20. yüzyılın olarak bulunabilir. Bu testler nispeten hızlı tahlil süreleri ve ucuz analizi 4 sağlamaktadır. Nedeniyle bunların basitliği, bu geleneksel kağıt şerit testler yaygın POCT teşhis 5 kullanılmıştır.
Kolorimetrik 6, elektro dahil saptama yöntemleriKimyasal 7 ve elektrokemiluminesans 8 Yöntem biyolojik numunelerde hedeflerini ölçmek için rapor edilmiştir. Bu sayısal yöntemlere ek olarak, selüloz kağıt üzerindeki antikorların hareketsiz tutmak için güvenilir bir yöntem, aynı zamanda teşhis cihazları geliştirilmesi için önemlidir. Non-spesifik adsorpsiyon immobilizasyon sonra hedeflerine azami bağlama kapasitesini sağlamak için kağıt tabanlı cihazlar 9, 10 yüzeyindeki antikorların değiştirmek için ana stratejisidir. Ancak, bir önceki çalışma Selüloz kağıt üzerine adsorbe edilir antikorlar% 40 elyaf 11 desorbe göstermiştir. Böylece, selüloz üzerine antikorların direkt adsorpsiyonu tekrarlanabilir sonuçlar 12 sağlayamayabilir. Kağıt yüzeylere aşılanmış antikorların kovalent immobilizasyon etkili bir kağıt bazlı biyo-tahliller 13 gelişmekte olan alternatif bir yöntemdir. Çeşitli yöntemler selüloz 14, 15 modifikasyonu için bildirilmiştir 12 sonra kendi özgün işlevlerini korumak gerekir. Karbonildiimidazol 1-siyano-4-dimetilaminopiridinyum tetrafloroborat 16 ile birleştirilir; 18. UV-bazlı aktivasyon strateji 17, 1 ile-floro-2-nitro-4-azidobenzene; ksiloglukan değişiklik 19 dayanan bir chemoenzymatic strateji; bir 1,4-fenilendiizotiyosiyanat bağlayıcı madde 20; heteropolisakarit oksidasyon 21 tıklama kimyası 22; ve katyonik porfirinler 23 kovalent selüloz kağıt üzerinde biyomoleküllerin immobilize etmek için kullanılmıştır. Kitosan modifiye Kağıdı bol ve 27 biyouyumlu olduğu kağıt tabanlı immunodevices 24-26 geliştirmek için kullanılır olmuştur. Kitosan katyonik ve anyonik selüloz 27 kuvvetle yapışır. yakalama antikorları kitosan kaplama ve glutaraldehid çapraz bağlama yoluyla kağıt üzerinde immobilize edilir. Periodat oksitleme Yüzbaşı aşılama için başka bir yöntemdirselüloz kağıdından 28 ure antikorlar. Bu yöntemde, sodyum periodat aldehid gruplarına doğrudan selüloz 1,2-dihidroksi (glikol) gruplarına dönüştürmek için kağıt üzerinde fark edilir. Aldehit grupları daha sonra polisakkaritler ve antikorlar 28 arasında kovalent bağlar oluşturmak için kullanılırlar. imalat basit olmasına rağmen, tamamen, sodyum periodat yıkamak zordur. Yıkanmamış sodyum periodat antikorların etkinliğini ve stabilitesini etkileyen, selüloz kağıt üzerinde immobilize edilir antikorların daha oksidasyona neden olabilir N -. (3-dimetilaminopropil) - etilkarbodiimid hidroklorür ve N-hidroksisukinimid çapraz bağlayıcılar ayrıca kullanılan kovalent nano bazlı deneylerde 29 geliştirilmesi için electrospun poli-L-laktik asit ve selüloz asetat nanoliflerde antikor hareketsiz hale getirir.
Bu çalışmada, bir silan birleştirme tekniği SELÜLOZDEN ilgili amin fonksiyonel grupları graft için kullanılane kağıt diskler. Bu teknik, maksimum dikey akış yoluyla immün sağlayan orijinal gözenek boyutu, esneklik ve selüloz filtre kağıdı filtrasyon hızını korumak için yardımcı olur. silan birleştirme tekniği çok fazla modifikasyonu kullanılarak biyomoleküllerin ardından ikincil amin grubu ile alt-tabaka yüzeyleri işlevselleştirilmesi biyosensör kullanılmıştır. Matris yüzeyinin üzerine amin gruplarının eklenme -OH organofonksiyonel silan maddelerin grupları ve matriks substrat 30 ile bir yoğunlaştırma reaksiyonu ihtiva eder. Selüloz kağıt diskler 3-aminopropihrimetoksisilanı (APS) ile 31 silan bağlama ile amin gruplarıyla beraber çalışan bulundu. Bu iki farklı yöntem kullanarak kovalent hareketsizleştirici antikorlarla izledi. İlk yöntem, bir amin işlevselleştirilmiş selüloz kağıt diskler periodat oksidize antikorlarla bağlanması içeriyordu. İkinci yöntem yakalama antibodi takmak için bir çapraz bağlama maddesi olarak glutaraldehid kullanılanamin grubu işlevselleştirilmiş selüloz kağıt diskler es. Yakalama antikorlarının varlığı bir floresan molekül bir görüntü cihazını kullanarak, tavşan anti-insan IgG-floresin izotiyosiyanat (FITC) ile teyit edilmiştir. anti-tavşan IgG keçi, tavşan anti-insan IgG-FITC bağlanma aktivitesi, peroksidaz substrat ile değerlendirildi. sodyum periodat, glutaraldehid ve yakalama çeşitli antikor konsantrasyonları etkileri incelenmiştir. immobilize yakalama antikor uygulama testi başarıyla IgG serum tespiti yoluyla gerçekleştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Selüloz Kağıt Diskleri 1. Aşılama Amin Fonksiyonel Gruplar
- bir delik ile 6,0 mm (orta akış filtre kağıdı) bir çapı olan Cinsi No. 1, selüloz kağıdından yapılmış 1 cm x 1 cm ve 100 kağıdı diskler bir boyuta sahip kare bir parça kağıt hazırlayın.
- Kağıt diskler üzerinde -NH2 gruplarını elde davlumbaz 50 ml'lik bir cam şişeye 1 mi APS ve 10 mi aseton karıştırın. Taze hazırlanmış APS reajanı kanşımına kağıdı diskler ekleyin ve oda sıcaklığında 32 orbital karıştırılarak (200 rpm) ile 5 saat boyunca inkübe edilir.
Dikkat: davlumbaz APS ve aseton tutun. - organik atık kabı içine 50 ml cam şişe aşırı çözüm süzün.
- Cam şişeye 10 ml aseton ekleyin karıştırın ve reaksiyona girmemiş APS ve diğer yabancı maddeleri çıkarmak için tam süzün. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
- 3 saat için 110 ° C fırında kağıt havlu ve yerde kağıt diskleri yayıldı. izin vermekKağıt diskleri soğutmak için. Oda sıcaklığında, 50 ml santrifüj tüpüne diskleri saklayın.
- Aşağıdaki (Şekil 3A) tarif edildiği gibi selüloz kare kağıt üzerindeki amin gruplarından aşılama kontrol etmek için kızılötesi spektroskopisi (FTIR) kullanın.
- Bilgisayarı açın ve FTIR spektroskopisi aleti açın.
- FTIR spektroskopisi için yazılımı açın.
- 'Ölçüm → başlat' gidin. 'BS: KBr' için dikdörtgenler,: başlatma bittiğinde 'Lamba Kızılötesi' ve 'Lazer' yeşile döner.
- dikdörtgenler altında 'Veri' seçin ve '% Geçirgenlik', 'Happ-Genzel', '45', '4.0' ve 'Min: 400, Maks: 4000' seçeneğini 'Ölçüm Mode' için, 'apodizasyonlu', ' Yok hayır. Taramalar ',' Karar 've' Range (cm-1) 'evi.
- 'Tedbir' tıklayın.
- Arka plan verileri için 'Veri dosyası' seçeneğini seçin. YazmakYorumlar aşağı.
- arka plan için temel almak için 'BKG tıklayın.
- Film numune tutucu kare kağıt sabitleyin.
- örnek veriler için 'Veri dosyası' seçeneğini seçin. Yorum yazın.
- numune için spektrumları elde etmek için 'örnek' tıklayın.
- FTIR spektroskopi uygulamasını kapatın ve bilgisayarı kapatın.
- Yukarıdaki adımları (1.6 1.1 adımlar) amin işlevselleştirilmiş dereceli No 113 selüloz kare kağıt ve diskleri (hızlı akış filtre kağıdı) hazırlamak için tekrarlayın ve sınıf sayılı 113 metrekare kağıt (Şekil 3B) için FTIR spektrumları elde.
Amin fonksiyonlu Selüloz Kağıt Disklerinde Antikorların 2. Kovalent İmmobilizasyonu
İki farklı yöntemle antikorların 1. Kovalent immobilizasyon Şekil.Bir. Periyodat oksidasyon yoluyla amin fonksiyonlu selüloz kağıt diskler üzerinde hareketsiz Antikorlar. karbohidrat kalıntıları aldehid fonksiyonel grupları üretmek üzere sodyum periodat ile yükseltgenmiştir. Daha sonra, okside antikorlar amin işlevselleştirilmiş selüloz kağıt diskler üzerine yüklendi. B. antikorlar, daha sonra, glutaraldehid ile amin işlevselleştirilmiş selüloz kağıt diskler üzerinde hareketsizleştirildi. Amin işlevselleştirilmiş selüloz kağıt diskler kağıt diskler aldehid gruplarını eklemek için,% 0.05 glutaraldehid çözeltisi içine daldırılmıştır. Yıkandıktan sonra, antikorlar aldehit fonksiyonlaşmış kağıt diskler üzerine yüklendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Periodat oksidasyon (Şekil 1A) ile amin işlevselleştirilmiş selüloz kağıt diskler üzerinde antikorların hareketsiz.
- 2.5 mM sodyum Süresiâ 1 ul karıştırın0.1 mg'lık 2 ul TE / ml tavşan IgG-FITC, anti-insan bir 1.5 ml'lik bir tüp içinde 100 mM pH 5.5 asetat tamponu 7 ul, ve 30 dakika boyunca karanlıkta karışımı inkübe edin.
NOT: Gerekirse daha yükseltgenmiş antikorlar hazırlamak için bu hacim oranı izleyin. sodyum periodat ve tavşan anti-insan IgG-FITC konsantrasyonunun optimize etmek için hacim oranı olarak değiştirin. - (PH 7.4 PBS) 40 ul'lik nihai bir hacme kadar 50 mM fosfat tamponu tuz 30 ul yukarıdaki antikor çözeltisi ile seyreltilir.
- Üç-amin işlevselleştirilmiş orta akış filtre kağıdı diskleri (Bölüm 1 'de tarif edildiği gibi), üç amin işlevselleştirilmiş hızlı akış kağıdı diskler hazırlayın.
- Yük her ortam akış filtre kağıdı diski üzerine sodyum periodat oksidize tavşan anti-insan IgG-FITC 5 ul ve her bir hızlı akış filtre kağıdı diski üzerine 8 ul. Oda sıcaklığında bir saat boyunca karanlıkta bu kağıt diskler tutun.
- Yıkama devetüyü 0.2 ml kağıt diskin her yıkamaER (50 mM Tris, 0.15 M NaCl ve% 0.05 yüzey aktif madde, pH 7.4 ile tampon A). yıkandıkları üç kez tekrarlayın.
- Her selüloz kağıt disk 32 antikorların varlığını belirlemek için bir floresan moleküler kamera ile floresan görüntüleri fotoğraflamak. (S3 Şekil Şekil S1) bir kontrol olarak (sodyum periodat yokluğunda antikorların aynı konsantrasyonda muamele edilmiş) boş kağıt diskler kullanın.
NOT: Deneysel optimizasyonu için, optimize edilmiş ve tüm diğer parametreler konsantrasyonlarını düzeltmek gerekiyor bir parametrenin konsantrasyonunu değiştirir. Yüksek floresan yoğunluğu selüloz kağıt diskler üzerinde immobilize edilir antikorlarla miktarını artırır.
- 2.5 mM sodyum Süresiâ 1 ul karıştırın0.1 mg'lık 2 ul TE / ml tavşan IgG-FITC, anti-insan bir 1.5 ml'lik bir tüp içinde 100 mM pH 5.5 asetat tamponu 7 ul, ve 30 dakika boyunca karanlıkta karışımı inkübe edin.
- Glutaraldehid (Şekil 1B) yoluyla amin işlevselleştirilmiş selüloz kağıt diskler üzerinde antikorların hareketsiz.
- Üç APS tedavi orta akış filtre kağıdı diskleri ve üç hızlı akış filtresi kağıdı diskleri ekleyin (desoda sıcaklığında orbital bir karıştırma ile 1 saat süreyle% 0.05 glutaraldehit içeren 50 mM PBS (pH 7.4), 2 ml Kısım 1) 'de açıklanan şekilde.
Dikkat: davlumbaz glutaraldehit işleyin. - iki adet 1,5 ml santrifüj tüplerine üç diskleri her koyun. Her tüpe deiyonize (Di) su, 1 ml ilave edilir ve 10 saniye boyunca tüpleri çalkalanır. bir pipet ile aspire su çıkarmak. herhangi bir reaksiyona girmemiş glutaraldehit kaldırmak için iki kez daha tekrarlayın.
- Yük 5, her aldehit işlevselleştirilmiş orta akış filtre kağıdı diski üzerine 25 ug / ml tavşan anti-insan IgG-FITC (yakalama antikoru) ul ve her aldehit fonksiyonalize hızlı akış filtre kağıdı diski üzerine 8 ul ilave edin. oda sıcaklığında yaklaşık 20 dakika süreyle karanlıkta inkübe edilir. Daha sonra, antikorlar çıkarmadan, her bir kağıt disk 50 mM, PBS (pH 7.4) 10 ul ve amin aldehid reaksiyon için 40 dakika boyunca inkübe edin.
- bir kağıt havlu üzerine yıkama tamponu 0.2 ml kağıdı diskler yıkayın. Tekrarlaiki kez yıkayın.
- Her selüloz kağıt disk 33 antikorların varlığı kontrol etmek için bir floresan moleküler kamera ile floresan görüntüleri fotoğraflamak. Bir kontrol olarak boş kağıt diskler kullanın.
Not: Şekil 4'te, '0' glutaraldehit yokluğunda FITC antikoru aynı konsantrasyonda ile muamele edildi boş kağıt diski temsil eder; Şekil 5A'da, boş kağıt diskler glutaraldehid ile muamele edildi, ancak FITC antikorlar kağıdı diskler üzerine yüklendi.
- Üç APS tedavi orta akış filtre kağıdı diskleri ve üç hızlı akış filtresi kağıdı diskleri ekleyin (desoda sıcaklığında orbital bir karıştırma ile 1 saat süreyle% 0.05 glutaraldehit içeren 50 mM PBS (pH 7.4), 2 ml Kısım 1) 'de açıklanan şekilde.
- 10 dakika için 37 ° C 'de (Bölüm 2.1 ve 2.2 arasında) kağıt diskler kurutun.
- blokaj tamponu 15 ul kağıdı diskler bloke oda sıcaklığında 10 dakika süre ile (% 10, 0.15 M NaCI ile, 50 mM Tris tamponu, pH 7.4 içinde yağsız süt tozu).
- Yük 5 ul PBS içinde peroksidaz konjuge keçi anti-tavşan IgG 8 ul (1: 10,000), sırasıyla, orta akış ve hızlı akış filtre kağıdı diskler üzerine. inkübeOda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika.
- bir kağıt havlu üzerine yıkama tamponu 0.2 ml kağıdı diskler yıkayın. yıkandıkları üç kez tekrarlayın.
NOT: Bu sonuçlar tampon etkilenmez olarak yıkama tampon kaldırmak için gerekli değildir. - Her bir disk üzerine 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) ve hidrojen peroksit çözeltisinin bir 10 ul karıştırılmalıdır.
- inkübasyon 5 dakika sonra bir dijital kamera ya da akıllı telefon ile kağıt diskler görüntüleri çekin.
Not: Şekil 5B'de ise, '0' antikor-HRP (yaban turpu peroksidazı) FITC antikoru yokluğunda konjügatı yükleme ardından glutaraldehid ile muamele edildi kağıdı diskler, anlamına gelir.
3. IgG Algılama için ELISA Paper-based
Kağıt tabanlı ELISA fo Şekil 2. şematikR IgG tespiti. antikorlarla kovalent glutaraldehid ile aldehit işlevselleştirilmiş selüloz kağıt diskler üzerinde hareketsizleştirildi. selüloz kağıt diskler bloklama tamponu ile bloke edildi. Hedef IgG daha sonra HRP ile konjüge edilmiş sinyal antikor yükleme, ardından diskler için ilave edildi. Son olarak, TMB ve hidrojen peroksit karışımı çözüm renk okuma için her kağıt diske yüklendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- 20 ml'lik bir cam şişeye (50 mM PBS, pH 7.4 içinde hazırlanmıştır)% 0.05 glutaraldehid çözeltisi 5 ml. Bu çözeltiye 15 amin işlevselleştirilmiş orta akış filtre kağıdı diskler daldırın ve oda sıcaklığında çalkalanarak 1 saat boyunca devam edin.
- Aynı zamanda, tekrar Adım 3.1 başka bir 15 aldehit fonksiyonlaşmış hızlı akış filtre kağıdı diskleri hazırlamak.
Dikkat: duman içinde glutaraldehit Koludavlumbaz.
- Aynı zamanda, tekrar Adım 3.1 başka bir 15 aldehit fonksiyonlaşmış hızlı akış filtre kağıdı diskleri hazırlamak.
- kağıdı diskler, reaksiyona girmemiş glutaraldehid kaldırmak için başka bir 15 ml santrifüj tüpü içinde 15 ml santrifüj tüpü içinde 15 orta akış filtre kağıdı diskler, 15, hızlı akışlı filtre kağıdı diskleri yerleştirin. Her tüpe DI suyun 5 ml ilave edilir ve 10 saniye boyunca tüpleri çalkalanır. bir pipet ile aspire su çıkarmak. reaksiyona girmemiş glutaraldehid çıkarmak için iki kez tekrarlanır.
- 37 ° C fırın içinde kağıdı diskler kurutun.
- 5 ul sırasıyla orta akış ve hızlı akışlı filtre kağıdı diskler, her bir 0.025 mg / ml fare IgG-Fc fragmanı antikorların 8 ul ekleyin ve 20 dakika boyunca inkübe edin.
- antikorlar çıkarmadan, her bir kağıt disk 50 mM, PBS (pH 7.4) 10 ul ekle ve amin aldehid reaksiyon için 40 dakika boyunca inkübe edin.
- bir kağıt havlu üzerine yıkama tamponu 0.2 ml kağıdı diskler yıkayın. yıkandıkları üç kez tekrarlayın.
- 37 ° C'de bir fırın içinde kağıdı diskler kurutun.
- w kağıt diskleri engelleOda sıcaklığında 10 dakika süre ile blokaj tamponu içinde i 15 ul.
- bir kağıt havlu üzerine yıkama tamponu 0.2 ml, her bir kağıt diski yıkayın. yıkandıkları üç kez tekrarlayın.
- IgG standartlarını çalıştırın.
- Yük, çeşitli IgG konsantrasyonları 10 ul (örneğin, 0, 10, 125, 250 ve 500 ng / ml'lik son yoğunluğa seyreltildi) üç kopya halinde her bir diske. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- bir kağıt havlu üzerine yıkama tamponu 0.2 ml kağıdı diskler yıkayın. yıkandıkları üç kez tekrarlayın.
- Yük 10 HRP ile konjüge edilmiş bir fare IgG-Fc fragmanı antikorları (1: 10,000, 10 mM PBS, pH 7.4) ul, ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir.
- bir kağıt havlu üzerine yıkama tamponu 0.2 ml kağıdı diskler yıkayın. yıkandıkları üç kez tekrarlayın.
NOT: Bu sonuçlar tampon maddesi etkilenmez çamaşır tampon kaldırmak için gerekli değildir. - Her diske bir TMB 10 ul karışımı ve hidrojen peroksit yükleyin.
- Tinkübasyon 5 dakika sonra bir dijital fotoğraf makinesi veya akıllı telefon ile tüm kağıt disklerin AKE görüntüler.
Not: Şekil 6A'da, '0' yakalama antikoru immobilizasyon ile muamele kağıdı diskler anlamına gelir ve IgG serum olmadan, antikor-HRP / TMB çözeltisi. - Görüntü J. görüntüdeki her kağıt diskin yoğunluğunu analiz
- 'Tif' formatına adım 3.15 alınan görüntüleri dönüştürün.
- Aç 'Görüntü J' yazılım.
- 'Dosya → Aç' git analiz resim seçin.
- şekil düğmesini 'Oval' seçin.
- 'Görüntü → Tipi → 32 bit' gidin.
- 'Düzen → Invert' gidin.
- '→ ölçün Analiz' gidin.
- Kopyala ve bir e-tablodaki verileri analiz eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 3. Fourier işlenmemiş ve APS-tedavi orta akış filtresi kare kağıt (A) ve hızlı akış filtresi kare kağıt (B). A kızılötesi (FTIR) spektrumları dönüşümü. muamele edilmemiş orta akış filtresi kare kağıt spektrumu APS muamele edilmiş orta akış filtresi kare kağıt edilene benzerdi. 902-1,170 cm-1 ve 1,210-1,500 cm-1 APS-muamele kare kağıt için bantlarında yoğunluğunda yaşanan artış sırasıyla SiOC-H gruplarının Si-O-selüloz ve CH deformasyonlar aitti. 1650 cm -1 ve 2885 cm -1 bantların artış sırasıyla tuzlu propil kısmından -NH2 ve CH 2 titreşimlerin eğilme aittir. B. 972 1180 cm karakteristik zirveleri -1 aralık Si-O-Si ve SO-ce atfedilmiştirllulose bağlar. 1003 cm tepe -1 Si-O-Si bağı ve selüloz germe CO üst üste neden oldu. Sonuçların tüm APS başarıyla selüloz kare kağıtları üzerine aşılı olduğunu göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Selüloz kare kağıtlara amin fonksiyonel grupların varlığı FTIR ile saptanmıştır. 3, işlenmemiş, tadil edilmiş, orta akış ve hızlı akışlı filtre kare kağıt FTIR spektrumları göstermektedir. Selüloz yüzeylerinde APS kullanılarak aminoalkil grupları kimyasal modifikasyona neden olan üç adım vardı. Adım bir APS silanol türevi sağlamak için APS hidrolizini çıkıyor. Aşama İki saat arasında OH gruplarının hidrojen bağları yoluyla, selüloz lifleri üzerine hidrolize APS türevinin adsorpsiyonu dahilydrolyzed APS türevi ve selüloz lifleri. Adım üç Si-OC bağı yoluyla selüloz fiberin yüzeyine APS türevi aşılama ve Si-O-Si siloksan köprülerin 34 oluşumuna yol açan adsorbe APS türevi yoğunlaşmasını, içeriyordu. Şekil 3A'da, 1.650 cm bandın artış gösterildiği gibi -1 2.885 cm -1 CH silan propil grubunun 2 titreşimleri karşılık gelen en NH2 gruplarının bükülme ve bant bir artış ile ilişkilendirilmiştir. Orijinal orta akış filtresi kare kağıtlar için, 902-1,170 cm -1 ve 1,210-1,500 cm bantları -1 glikozidik köprü ve CH germe titreşimlerin KOK tahvil titreşimlere karşılık geldi. APS kare kağıt işleme tabi tuttuktan sonra bu iki bant genişliklerinde yoğunluğundaki artış sırasıyla, SiOC-H gruplarının Si-O-selüloz ve CH deformasyonlara yer aldığını gösterir. Orta-fl benzerow kare kağıt, aynı zamanda nedeniyle APS (Şekil 3B) ile kimyasal modifikasyona, NH 2 için 1650 cm -1 de şiddeti artmış modifiye hızlı akış filtresi kare kağıt için spektrumları filtre. 972 1180 cm güçlü karakteristik zirveleri -1 aralık Si-O-Si atfedilen edildi ve SO-selüloz bağlar; en yüksek zirvesi 1.003 cm -1 nedeniyle Si-O-Si bağı ve selüloz 34 gerilmesi CO örtüşme için oldu. Kare kağıt tedavi cm 1188 ila 1510 -1 APS için dalga boyu aralığında karakteristik bağlar glikozidik köprü ve CH germe titreşimlerin KOK bağlarının titreşimlerin neden olur. CH 2 germe titreşim bağlar APS kare kağıt işlendi 2.932 cm -1 için 2,800-2,980 cm -1 ve en yüksek zirvesinde gösterildi. Sonuç olarak, APS kovalent No. 1 ve 113 filtre kare kağıtları aşılı edilebilir.
Kağıt diskler (Yöntem B) IgG FITC İmmobilizasyonda glutaraldehit farklı konsantrasyonlarda Şekil 4. Floresan cevapları floresan moleküler kamera ayarları:. Uyarma, 488 nm, emisyon, 530 nm, çözünürlük, 100 mikrometre A:. Floresan . 0 Floresan yanıt 0.050,% 0.100,% 0.250 ve% 0.500,% gluteraldehit: 0,% 0.001,% 0.005,% 0.01 ve 0.050,% glutaraldehit B'ye cevabı. Her bir diskte IgG FITC konsantrasyonu ml / 0.01 mg'dir. % 0.05'lik bir maksimum glutaraldehit konsantrasyonundaki bir artış, IgG-FITC artan bir yükleme miktarı ile sonuçlandı. % 0.05 yukarıda glutaraldehit konsantrasyonları IgG FITC yükleme miktarı azalmıştır. Bu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınızrakam.
. IgG, FITC-hareketsizleştirilmiş orta akış ve hızlı akışlı filtre kağıdı diskleri (Metot B) floresans molekül kamera ayarlarına IgG-FITC farklı konsantrasyonları Şekil 5. floresan tepkisi (A) ve kolorimetrik sonucu (B): Uyarma , 488 nm, emisyon, 530 nm, çözünürlük, 100 mikrometre. 1. sınıf No. 1, orta akış filtre kağıdı diski temsil eder ve 113. dereceli No. 113 hızlı akış filtre kağıdı diski temsil eder. APS-modifiye edilmiş kağıt diskler, ilk önce,% 0.05 glutaraldehid ile tedavi edildi. Daha sonra, IgG-FITC farklı konsantrasyonlarda glutaraldehit modifiye kağıdı diskler üzerine yüklendi. IgG FITC yükleme konsantrasyonunu arttırmak kağıt diskler üzerinde hareketsiz IgG FITC miktarı arttı. Bununla birlikte, hareketsiz IgG FITC artan konsantrasyonları antijene bağlanma kapasitesini geliştirmek vermedi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Amin fonksiyonlu selüloz kağıt diskler üzerinde antikorların kovalent hareketsizleştirme için temel iş akışı, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Tavşan anti-insan IgG-FITC kovalent selüloz kağıt diskler üzerinde immobilize edildi. kağıdı diskler floresans kağıdı diskler antikorlarının immobilizasyon belirtilmiştir, ve floresan yoğunluğu hareketsizleştirilmiş antikor konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. Peroksidaz bağlı keçi anti-tavşan IgG daha sonra immobilize edilmiş antikor bağlama kapasitesini belirlemek için uygulanan. İkincil amin grupları ve aldehid grupları bioconjugation 35 kullanılmaktadır, bir Schiff bazı oluşturmak üzere birbiriyle reaksiyona girebilir. Ayrıca, yakalama kovalent hareketsizleştirme için kullanıldıantikorlardır. Yöntem A (Şekil 1A), -NH2 selüloz kağıt diskler ilave edildi ve -CHO, sodyum periyodat ile, antikorların Fc bölgesine oksidasyonu ile tavşan anti-insan IgG-FITC elde edildi. Aynı şekilde, sodyum periodat ve IgG, FITC antikorlarının çeşitli konsantrasyonlarının etkisi de incelenmiştir. Şekil S1 ve S2 Şekil, 0.16 mg / ml, 1 mM ve 0.016 arasında tavşan anti-insan IgG-FITC 0 konsantrasyonlarda sodyum periodat gösterildiği gibi 0.08 mg / ml tavşan anti-insan IgG oksidasyonu üzerinde çok az etki vardı -FITC. Kovalent kağıdı diskler bağlanmaydı antikorlarının miktarı 0 0.075 mg / ml (Şekil S3 A) yakalama antikor artan bir konsantrasyonu ile artmıştır.
bağlanma yeteneği peroksidaz deneyi ile belirlendiği hafif bir renk değişimi gözlenmiştir. Bu kullanımı nedeniyle olabiliryakalama antikorları ile reaksiyona girer ve bağlayıcı bir aktivite kaybına yol açar fazla sodyum periodat. Sodyum periodat tamamen uzak kağıt diskler yıkanamaz muhtemeldir. Bu sodyum periodat çözeltisi purpald çözeltisi ile karıştırılır sarı bir renk sağlayan basit bir prensip ile teyit edilmiştir. Bu nedenle, periodat oksidize antikorlar kağıdı diskler üzerine yüklendi ve 1 saat süreyle inkübe edildi. kağıdı diskleri PBS (% 0.05 Tween-20 ihtiva eden) ile üç kez yıkandı ve daha sonra purpald çözelti, bu diskler ilave edildi. kağıdı diskleri periodat oksitlenmiş antikorlardan aldehid gruplarının varlığını gösteren, hemen mor bir renk göstermiştir. Kağıt diskler üzerinde sodyum periodat varlığını doğruladı 10 dakika içinde sarıya Bu mor renk.
Seçenek olarak ise, bir glutaraldehid çapraz bağlama yöntemi (yöntem B, Şekil 1B) amin grou bağlamak için kullanılanAPS-işlenmiş kağıt diskler ve antikorlardan ps. Selüloz kağıt diskler üzerine yüklendi glutaraldehid konsantrasyonları (Şekil 4) ve tavşan anti-insan IgG-FITC (Şekil 5A) optimize edilmiştir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, floresans yoğunluğu, tavşan anti-insan IgG-FITC yükleme bu konsantrasyonda selüloz kağıt disk üzerinde doymuş olduğu anlamına gelir glutaraldehit% 0.05, en fazla ulaştı % 2.5 glutaraldehit konsantrasyonundaki bir artış selüloz kağıt diskler (Şekil S4) tavşan anti-insan IgG-FITC miktarında bir artış göstermemiştir. Floresan yoğunluğu, aynı zamanda, kağıt diskler (Şekil 5A) üzerine yüklendi tavşan anti-insan IgG-FITC artan konsantrasyonları artmıştır. peroxidas ihtiva kağıt diskler TMB alt tabakasını ve hidrojen peroksit karışımı, çözeltisi ilave edilmesi üzerine hemen geliştirilmiş bir mavi renke konjüge saptama antikorları (Şekil 5B). Buna ek olarak, bloke edici tampon,% 10 süt tozu 15 kez (Şekil S5) sonra engelleme etkinliği korumak için gösterilmiştir yağsız içerdiği. onun hedef bağlanma aktivitesi geliştirilmiş gösterildiği gibi Metod B, immobilize antikor uygulamasını test etmek için seçilmiştir. Bu nedenle, yakalama antikor 0.025 mg / ml konsantrasyonu IgG tespiti için kullanılmıştır.
Kağıt tabanlı ELISA. # 1 tarafından IgG tayini için Şekil 6. Kalibrasyon eğrileri sınıf No. 1, orta akış filtre kağıdı diski temsil eder ve 113. dereceli No. 113 hızlı akış filtre kağıdı diski temsil eder. Üst panelde, A, orta akış IgG farklı konsantrasyonda (# 1) ve hızlı akış (# 113) selüloz kağıt diskler için renk okuma sunulur. alt panelB IgG farklı konsantrasyonu için ELISA sonucu sunar. Kopyaların standart sapması (SD) belirlemek için kullanılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
HRP bağlı keçi anti-fare IgG-Fc fragmanı yakalama antikoru, IgG serum ve keçi anti-fare IgG-Fc fragmanı antikor sandviç deneyi için kullanıldı. Şekil 6 ve Şekil S6, 0 ila 500 ng / ml arasında serum IgG konsantrasyonu de gösterildiği gibi her bir aşama, 1 saat süre ile inkübe edildiğinde kolorimetrik yoğunluğu ile doğrusal bir ilişki vardı. Şekil S6 olarak, IgG farklı konsantrasyonları ile renk değişimi inkübasyondan 1 saat boyunca açıktı. Bununla birlikte, 10 dakika süreyle inkübe sonuçları IgG farklı konsantrasyonları ile renk yoğunluğunda belirgin bir değişiklik göstermemiştir. Bu nedenle, sensBu kağıt tabanlı ELISA iTivity pratik nokta-bakım test geliştirmek için uygundur.
Şekil S1. Sodyum periodat (Metot A), farklı konsantrasyonlarda Floresan tepkileri. Sodyum periodat değişen konsantrasyonlarda 0.016 mg / ml antikor, oksidasyon aktivitesi çalışma için kullanılan bir konsantrasyonda tavşan anti-insan IgG-FITC ile karıştırılmıştır. sodyum periodat konsantrasyonunu arttırarak, IgG-FITC yükleme miktarı arttıkça ve 0.25 mm bir maksimuma ulaşmıştır. Bu daha yüksek olduğu sodyum periodat konsantrasyonları immobilize IgG FITC miktarını artırmadığını gözlenmiştir. Kopyaların standart sapması (SD) belirlemek için kullanılmıştır. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Şekil S2. Floresan yanıtıtavşan anti-insan IgG-FITC (Metot A), farklı konsantrasyonlarda s. sodyum periodat konsantrasyonu, Antikor oksitleme aktivitesi çalışma için çözelti içinde 0.25 mM, ve her bir diskteki tavşan anti-insan IgG-FITC nihai konsantrasyonu mi, 0.016 mg / oldu. sodyum periodat konsantrasyonu sabit zaman, IgG-FITC konsantrasyonu, IgG-FITC oksidasyonu üzerinde çok az etkiye sahipti. Kopyaların standart sapması (SD) belirlemek için kullanılmıştır. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Şekil S3. Floresans yanıt ve kağıdı diskler (Metot A) üzerine okside tavşan anti-insan IgG-FITC farklı konsantrasyonlarda yüklenmesini kolorimetrik sonucu., Sodyum periodat oksidasyon, 0.08 mg / lgG-FITC ve 0.25 mM sodyum periyodat ml kullanılmıştır. peroksidaz bağlı anti-tavşan IgG dilüsyon olarak1: 50,000. Selüloz kağıt diskler üzerinde IgG-FITC yükleme konsantrasyonunu arttırmak hareketsiz IgG FITC miktarı arttı, ancak. Bağlayıcı hedefin üzerinde bir etkisi yoktu bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Şekil S4. Selüloz kağıt diskler (Yöntem B) IgG-FITC hareketsizleştirilmesi glutaraldehit yüksek konsantrasyonda floresan tepkisi. Her bir diskte IgG FITC konsantrasyonu 0.01 mg / ml olmuştur. Selüloz kağıt diskler üzerinde hareketsiz IgG FITC miktarı artmadı daha yüksek% 0.25 idi glutaraldehit Konsantrasyonları. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Şekil S5. Yıkama sayısını etkisi. A: oldu. Hing üç kez B: yıkama 15 kez. Selüloz kare kağıt üzerinde hareketsiz yakalama antikorları hala kare kağıt 15 kez karıştırılmıştır olsa bile, kendi hedeflerine iyi bağlama kapasitesi vardı. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Şekil S6. Kağıt göre IgG ELISA sonuçları. 0 500 ng / ml arasında IgG konsantrasyonları için, inkübasyon bir saat sonuçları inkübasyon 10 dakika daha iyi sonuçlar bulunmaktadır. IgG yüksek konsantrasyonlarda için 10 dakika inkübasyon için yeterli zamanı. Kopyaların standart sapması (SD) belirlemek için kullanılmıştır. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Şekil S7. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) farklı büyütme düzeylerinde orta akış filtre kağıdı görüntüler. A: 85X ve B: 20,000X. 5 kV çalışan Saha emisyon taramalı elektron mikroskobu (FE-SEM) parçacık morfolojisini belirlemek için kullanılmıştır. Selüloz lifleri rastgele çapraz bağlanmış bulunmaktadır. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Şekil S8. Farklı büyütme hızlı akış filtre kağıdı SEM görüntüleri. A: 100X ve B: 20,000X. 5 kV çalışan Saha emisyon taramalı elektron mikroskobu (FE-SEM) parçacık morfolojisini belirlemek için kullanılmıştır. Selüloz lifleri rastgele çapraz bağlanmış bulunmaktadır. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
modifiye edilmemiş selüloz kağıt diskler üzerinde afinite saflaştırması yapılmış keçi anti-fare IgG-Fc yakalama antikoru doğrudan kaplama IgG konsantrasyonları tespit etmek için yapılmıştır. Sonuçlar antikorlarla daha sabitleme tekrarlanabilirliği için gerekli olan, ortaya koymuştur. Silan tekniğin başarılı selüloz kağıt diskler 34 amin fonksiyonel gruplarının eklenmesi için kullanıldı. APS konsantrasyonu antikor hareketsiz hale etkiler. Bu nedenle, aseton içinde APS miktarı da optimize edilmiştir. 10 ml aseton içinde APS 1 ml glutaraldehid çapraz bağlama maddesi yoluyla antikorların hareketsizleştirilmesi için amin grubu aşılanması için en uygun konsantrasyon. Antikorlar periodat oksidasyon ve glutaraldehid çapraz bağlama yöntemleri ile selüloz kağıt diskler üzerinde aşılanmıştır. Sonuçlarımız glutaraldehid çapraz bağlama yöntemi kullanılarak immobilize antikor bağlama kapasitesi med periodat oksitleme yöntemi daha iyi olduğunu ortaya çıkardıyum-akış ve hızlı akış filtre kağıdı diskleri. Bundan başka, bir glutaraldehid çapraz bağlama yöntemiyle selüloz kağıt diskler üzerinde immobilize yakalama antikorları, işlevini muhafaza ve kağıt vorteks yoluyla 15 yıkama mekanik strese tabi tutuldu da kararlı bir şekilde daha hareketsizleştirildi. Yağı alınmış süt tozu, bloke edici tampon yüzde on 15 kez (Şekil S5) sonra engelleme etkinliğini koruduğu tespit edildi.
kovalent hareketsizleştirilmiş antikorlar, IgG algılama ile bir sandviç ELISA'yı gerçekleştirmek için kullanıldı. 100 ng / ml arasında bir konsantrasyonda, IgG, bu kağıt diski göre deney kullanılarak çıplak gözle tespit edilmiştir. 0 ila 500 ng / ml IgG serum konsantrasyonu, her bir aşama, bir saat inkübe edildi kolorimetrik yoğunluğu ile doğrusal bir ilişki göstermiştir. ELISA tabanlı bu kağıt disk için immunoassay test daha az numune reaktifi gerekli ve geleneksel immunoassay 36 daha verimli olduğu ortaya çıktı Şekil S7 ve S8 Şekil gösterilmiştir. Bu şekillerde gösterildiği gibi, fiberler rasgele çapraz bağlanmış filtre kağıdı diskleri 25 her iki tür içindir. Bu yüksek hassasiyet nedeni kağıt diskin kalınlığı olabilir. hızlı akış filtre kağıdı diskler için kalınlığı orta akış filtresi kağıdı 180 mikron ile karşılaştırıldığında 420 mikron idi. Bu nedenle, daha fazla yakalama antikorlar ayrıca tahlilin hassasiyetini arttıracaktır hızlı akış filtre kağıdı diskler, üzerinde immobilize edilmesi olasıdır. Aynı zamanda, hızlı akışlı filtre kağıdı diskler (30 um) için gözenek boyutu (11 ve # orta akış filtre kağıdı diskler daha büyüktü181 m). kağıt yüzey engelleme sonra birincinin gözenek boyutu yine ekstra bir güç sistemi olmadan sıvı akışını götürmek için yeterli büyüktü. Ancak, ikincisi tampon için akış hızı daha yavaş oldu. Bu nedenle, hızlı akışlı filtre kağıdı bağışıklık uygulamasında orta akış filtre kağıdı daha iyiydi.
hareketsiz filtre kağıdı diskler üzerindeki antikorların tekrarlanabilirliği TMB alt tabakasını ve hidrojen peroksit karışımı, solüsyon yükledikten sonra kolorimetrik sonucun peroksidaz-konjuge keçi anti-tavşan IgG ve algılama kağıdı diskler daha inkübe edilerek değerlendirildi. standart sapma, bu kağıt tabanlı cihaz için% 10'dan daha az oldu. -NH2 Modifiye edilmiş selüloz kağıt diskler üzerinde tavşan anti-insan IgG-FITC stabilitesi iki aya kadar test edilmiştir. 4 ° C'de saklandı kağıdı diskleri da bi hafif bir azalma ile keçi anti-tavşan IgG-konjuge peroksidaz bağlanma aktivitesi muhafazaaktiviteyi nding. Bununla birlikte, antikorun immobilize kağıdı diskleri oda sıcaklığında muhafaza ya da 60 ° C olduğu zaman, bunlar nedeniyle kuruyana ve yüksek sıcaklığa bağlanma aktivitesi kaybetti. Yakalanan antikor destabilize edildiği ve bu koşullar altında denatüre olabilir.
Bir çapraz bağlama maddesi olarak glutaraldehid ile selüloz kağıt diskler üzerinde antikorlarla hareketsizleştirilmesi bazı kritik adım vardır. Kağıt diskler üzerinde amin grupları greft 1.2 Adım yakalama antikorların başarılı kovalent immobilizasyonu kritik bir adımdır. Bu adım başarısız olursa, tüm immobilizasyon işlemi başarısız olur. FTIR amin grupları başarılı kağıdı diskler (adım 1.6) üzerinde hareketsiz olup olmadığını belirlemek için kullanılmıştır. İkincisi, selüloz kağıt diskler üzerinde aldehit gruplarının aşılanması başka kritik basamakta (2.2.1 ve Adım 3.1) 'dir. antikorlar, kovalent bir Schiff bazı oluşması ile selüloz kağıt diskler üzerinde hareketsizleştirildi. En sonundaFiltre kağıdı diskleri üzerindeki yakalama antikorları hareketsiz adım önemli (Adım 2.2.3, 3.4 Adım ve 3.5 Adım) 'dir. yakalama antikorlardan amin grupları kağıt diskler üzerinde antikorların düzeltmek için selüloz kağıt diskler aldehit grupları ile tepki gösterdi. Bu adım başarısız olduysa, yakalama antikorları kağıt diskler üzerinde hareketsiz olmaz ve ELISA uygulama testleri tüm negatif olacaktır. Biz yakalama antikorlarının varlığını belirlemek için bir floresan moleküler görüntüleyici kullanabilirsiniz. Peroksidaz ile konjüge edilmiş keçi anti-tavşan IgG ve peroksidaz bazlı kolorimetrik reaksiyonlar hareketsiz kılınmış antikor bağlama kapasitesi teyit etmek için kullanılabilir.
Bu protokol, sinyal yüksek bir arka plan, hiçbir sinyal ya da zayıf bir sinyal ve dengesiz bir renk okuma gibi bazı sorunları ile karşılaşabilirsiniz. Bu sorunların üstesinden gelmek için bu sorunların ve sorun giderme yöntemlerinin olası nedenleri aşağıda ele alınmıştır. Yüksek arka plan sinyalleri genellikle du meydanaKısa bir engelleme süre e. Bu engelleme, inkübasyon süresi arttıkça iyice kağıdı diskler yıkama ve yüksek plan sinyallerini çıkarmak için aşırı algılama antikor konjügatı, enzim ilave kaçınarak çözülebilir. olası nedenler Blokaj fazla hedef antijenin yokluğunda, yetersiz inkübasyon süresi ve fonksiyonel olmayan bir algılama antikor enzim konjugatı içermektedir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, hedef antijenler ilave edildi ve yeni bir antikor konjügatı kullanılarak ve üretici tarafından önerilen depolayarak, uygun bir süre boyunca inkübe olması gerekir. Saptama için pozitif kontrol edilmesi tavsiye edilir. Dengesiz renk readouts aşılama işlemi sırasında kağıt disklerin istifleme kaynaklanmaktadır. Bu sorunu önlemek için, kağıt diskler APS aşılama işlemi sırasında ayrılmalıdır ve antijen ve antikor saptama eşlenik enzim her adımda kağıt disk üzerinde üniform yayılmalıdır.
kağıt tabanlı deney basit olmasına rağmenve uygun maliyetli bir yöntem olup, sınırlamalar vardır. glutaraldehid çapraz bağlama maddesi Fab ve çekim, antikorların Fc bölgesine amin grupları ile reaksiyona girmektedir substrat yüzeyi üzerinde antikor yönlendirme, immüno performansı için çok önemlidir. Bu durumda, hareketsiz hale antikorlar yüksek ölçüde yönlendirilmiş bir biçimde oluşmaz. daha fazla amin grubu IgG Fc bölgesinden daha Fab bölgesinden olduğu için, immobilize edilmiş antikor bağlama aktivitesi hala uygulama için yeteri kadar yüksektir.
Selüloz kağıt için farklı yüzey fonksiyonlandırmalar yöntemleri son raporunda 37 özetlenmiştir. divinil sülfon reajanlar; 1,4-fenilendiizotiyosiyanat; 4-azido-benzendiazonyum; epiklorohidrin; 4-azido-a-floro-2-nitrocyclohexane; ve 4-merkapto-benzendiazonyum kovalent selüloz kağıt üzerinde biyomoleküllerin immobilize etmek için kullanılabilir. Adsorpsiyon ve tuzak da yararlanılmıştırbiyomoleküllerin ile kaplamak için selüloz kağıt. diğer yöntemlere göre, silan tekniği ve selüloz kağıt üzerindeki antikorların kovalent hareketsizleştirme için glutaraldehid çapraz bağlama maddesi kombinasyonu, basit bir yöntemdir. Buna ek olarak, bu kombinasyon, bağışıklık maksimum dikey akış through sağlayan, selüloz kağıt, termal ve mekanik performansı üzerinde çok az etkisi olabilir. Bu strateji selüloz kağıt üzerinde diğer biyomoleküllerin hareketsiz için uzun olabilir.
Burada gösterilen metodoloji potansiyel sürece buna karşı doğrudan antikorlar mevcut olduğu gibi, herhangi bir analitin tespiti için uzun olabilir. Bu yöntem, aynı zamanda, çoklu tespit geliştirmek için de kullanılabilir. Örneğin, bir kare kağıt üzerinde, farklı alanlarda çeşitli hedefler için ayırt edilebilir. hedefler için yakalama antikorlar belirli bir alan üzerinde bir glutaraldehid çapraz bağlama maddesi ile hareketsiz hale getirilebilir. Bu Elis ile takip edilebilirBir prosedür, çeşitli hedefleri tespit etmek için. Bu durumda, Önerilen yöntem, çıplak gözle diğer hedeflerin saptanması için kağıt tabanlı ELISA çok yönlü bir araç yapar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellulose filter paper, Grade 1 (medium flow filter paper) | GE Healthcare Pte Ltd Singapore | 1001 110 | |
| Cellulose filter paper, Grade 113 (Fast flow filter paper) | Sigma-Aldrich, Singapore | 1113-320 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Singapore | G6257 | Grade II, 25% in H2O |
| Surfactant | Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore | P2287 | |
| Bovine serum album | Sigma-Aldrich, Singapore | A2153 | |
| Skimmed milk powder | Louis François | Packed by Kitchen Capers, Singapore | |
| Tris base | Promega | H5135 | |
| Sodium periodate | Merck | 106597 | |
| Na2HPO4 | Merck | 106585 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| NaCl | CALBIOCHEM | 567441 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| HCl | Merck | 100317 | |
| phosphate buffer saline (PBS) | N/A | N/A | PBS, containing 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol/L Na2HPO4 and 1.5 mmol/L KH2PO4, is prepared with water and adjusted to pH 7.4 with 0.1 mol/L NaOH or 0.1 mol/L HCl |
| Acetone | Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore | 9005-68 | |
| Mixture of TMB and hydrogen peroxide solution | 1-Step ultra TMB-ELISA solution , Thermo Scientific Pierce | 34029 | 1 L |
| Rabbit anti-human IgG-FITC | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2278 | |
| Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2030 | |
| Affinity purified goat anti-Mouse IgG-Fc coating antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131A | |
| Mouse reference serum | Bethyl Laboratories, Inc | RS10-101-5 | 9.5 mg/ml |
| HRP conjugated goat anti-mouse IgG-Fc detection antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131P | |
| Equipment | |||
| Fourier transform infrared spectrophotometer | Shimadzu IR Prestige-21 | N/A | |
| Fluorescence molecular imager | Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore | N/A | |
| Oven | NUVE FN500 | N/A | |
| Turbo mixer VM-2000 | MYC LTD | N/A | |
| ImageJ | RGB, free download | N/A |
References
- Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). J. Virol. Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M. Simple telemedicine for developing regions: camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis. Anal. Chem. 80 (10), 3699-3707 (2008).
- Lode, P. V. Point-of-care immunotesting: approaching the analytical performance of central laboratory methods. Clin. Biochem. 38 (7), 591-606 (2005).
- Posthuma-Trumpie, G. A., Amerongen, A. V., Korf, J., Berkel, W. J. V. Perspectives for on-site monitoring of progesterone. Trends Biotechnol. 27 (11), 652-660 (2009).
- Lim, D. V., Simpson, J. M., Kearns, E. A., Kramer, M. F. Current and developing technologies for monitoring agents of bioterrorism and biowarfare. Clin. Microbiol. Rev. 18 (4), 583-607 (2005).
- Li, X., Tian, J., Shen, W. Progress in patterned paper sizing for fabrication of paperbased microfluidic sensors. Cellulose. 17 (3), 649-659 (2010).
- Nie, Z., et al. Electrochemical sensing in paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 10, 477-483 (2010).
- Delaney, J. L., Hogan, C. F., Tian, J., Shen, W. Electrogenerated chemiluminescence detection in paper-based microfluidic sensors. Anal. Chem. 83 (4), 1300-1306 (2011).
- Oh, Y. K., Joung, H. A., Kim, S., Kim, M. G. Vertical flow immunoassay (VFA) biosensor for a rapid one-step immunoassay. Lab Chip. 13 (5), 768-772 (2013).
- Cheng, C. M., et al.
- Jarujamrus, P., Tian, J., Li, X., Siripinyanond, A., Shiowatana, J., Shen, W. Mechanisms of red blood cells agglutination in antibody-treated paper. Analyst. 137 (9), 2205-2210 (2012).
- Credou, J., Volland, H., Dano, J., Berthelot, T. A one-step and biocompatible cellulose functionalization for covalent antibody immobilization on immunoassay membranes. J. Mat. Chem. B. 1, 3277-3286 (2013).
- Kong, F., Hu, Y. F. Biomolecule immobilization techniques for bioactive paper fabrication. Anal. Bioanal. Chem. 403, 7-13 (2012).
- Orelma, H., Teerinen, T., Johansson, L. S., Holappa, S., Laine, J. CMC-modified cellulose biointerface for antibody conjugation. Biomacromolecules. 13, 1051-1058 (2013).
- Yu, A., et al. Biofunctional paper via covalent modification of cellulose. Langmuir. 28 (30), 11265-11273 (2012).
- Stollner, D., Scheller, F. W., Warsinke, A. Activation of cellulose membranes with 1,1′-carbonyldiimidazole or 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate as a basis for the development of immunosensors. Anal Biochem. 304 (2), 157-165 (2002).
- Bora, U., Sharma, P., Kannan, K., Nahar, P. Photoreactive cellulose membrane - a novel matrix for covalent immobilization of biomolecules. J. Biotechnol. 126 (2), 220-229 (2006).
- Sharma, P., Basir, S. F., Nahar, P. Photoimmobilization of unmodified carbohydrates on activated surface. J Colloid Interface Sci. 342 (1), 202-204 (2010).
- Brumer, H., Zhou, Q., Baumann, M. J., Carlsson, K., Teeri, T. T. Activation of crystalline cellulose surfaces through the chemoenzymatic modification of xyloglucan. J. Am. Chem. Soc. 126 (18), 5715-5721 (2004).
- Araujo, A. C., Song, Y., Lundeberg, J., Stahl, P. L., Brumer, H. Activated paper surfaces for the rapid hybridization of DNA through capillary transport. Anal Chem. 84 (7), 3311-3317 (2012).
- Xu, C., Spadiut, O., Araujo, A. C., Nakhai, A., Brumer, H. Chemo-enzymatic Assembly of Clickable Cellulose Surfaces via Multivalent Polysaccharides. ChemSusChem. 5 (4), 661-665 (2012).
- Filpponen, I., et al. Generic method for modular surface modification of cellulosic materials in aqueous medium by sequential "click" reaction and adsorption. Biomacromolecules. 13 (3), 736-742 (2012).
- Feese, E., Sadeghifar, H., Gracz, H. S., Argyropoulos, D. S., Ghiladi, R. A. Photobactericidal porphyrin-cellulose nanocrystals: synthesis, characterization, and antimicrobial properties. Biomacromolecules. 12 (10), 3528-3539 (2011).
- Zang, D., Ge, L., Yan, M., Song, X., Yu, J. Electrochemical immunoassay on a 3D microfluidic paper-based device. Chem. Commun. 48 (39), 4683-4685 (2012).
- Ge, L., Yan, J. X., Song, X. R., Yan, M., Ge, S. J., Yu, J. H. Three-dimensional paper-based electrochemiluminescence immunodevice for multiplexed measurement of biomarkers and point-of-care testing. Biomaterials. 33 (4), 1024-1031 (2012).
- Wang, S., et al. Paper-based chemiluminescence ELISA: lab-on-paper based on chitosan modified paper device and wax-screen-printing. Biosens. Bioelectron. 31 (1), 212-218 (2012).
- Koev, S. T., et al. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
- Wang, S. M., et al. Simple and covalent fabrication of a paper device and its application in sensitive chemiluminescence immunoassay. Analyst. 137 (16), 3821-3827 (2012).
- Sadira, S., Prabhakaranc, M. P., Wicaksonob, D. H. B., Ramakrishna, S. Fiber based enzyme-linked immunosorbent assay for C-reactive protein. Sensor Actuat B-Chem. 205, 50-60 (2014).
- Koga, H., Kitaoka, T., Isogai, A. In situ modification of cellulose paper with amino groups for catalytic applications. J. Mater. Chem. 21, 9356-9361 (2011).
- Klemm, D., Heublein, B., Fink, H. P., Bohn, A. Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material. Angew. Chem., Int. Ed. 44 (22), 3358-3393 (2005).
- Fernandes, S. C. M., et al. Bioinspired antimicrobial and biocompatible bacterial cellulose membranes obtained by surface functionalization with aminoalkyl groups. ACS Appl. Mater. Interfaces. 5 (8), 3290-3297 (2013).
- Pharos FX plus molecular imager instructions, Catalog Number 170-9460. , (2005).
- Tee, Y. B., Talib, R. A., Abdan, K., Chin, N. L., Basha, R. K., Yunos, K. F. M.
- Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nat Protoc. 2, 1152-1165 (2007).
- Guidi, A., Laricchia-Robbio, L., Gianfaldoni, D., Revoltella, R., Del Bono, G. Comparison of a conventional immunoassay (ELISA) with a surface plasmon resonance-based biosensor for IGF-1 detection in cows' milk. Biosens Bioelectron. 16, 971-977 (2001).
- Ahmed, S., Bui, M. N., Abbas, A. Paper-based chemical and biological sensors: Engineering aspects. Biosens Bioelectron. 77, 249-263 (2016).
