Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.
免疫反应的结果,从所述抗原的非特异性先天免疫系统和抗原特异性适应性免疫系统之间的复杂的相互作用。免疫系统是在维持耐受自身分子和迅速反应的病原体的恒定的平衡。树突细胞(DC)是先天免疫系统连结至适应性免疫系统和平衡自我和非自我之间的适应性反应有力专业的抗原呈递细胞。根据不同的成熟信号,未成熟树突状细胞可被选择性地刺激分化成免疫原性或耐受性的DC。免疫原性树突状细胞的抗原特异性T细胞克隆扩增提供扩散信号;同时致耐受性树突细胞调节由抗原特异性T细胞缺失或调节性T细胞的克隆扩增公差。由于这种独特的属性,树突细胞是高度为癌症和自身免疫DISE作为治疗剂追捧ASES。树突细胞可装载在体外特异性抗原和注入人体装入一个特定的免疫应答二者的免疫原性和耐受性。这项工作提出从在表面标志物表达,功能和代谢表型差异的单核细胞,单核细胞成熟树突状细胞(moDCs),耐受性和成熟moDCs 体外 ,产生一种手段。
DC最初是由保罗·朗格汉斯(朗格汉斯细胞)在十九世纪后期描述的Jolles 1作为引用,并在1973年谁承认他们是专职抗原提呈细胞2特点是拉尔夫斯坦曼和Zanvil科恩。的DC在外周血和在体内,在暴露于外部环境的组织尤其丰富的大多数组织如皮肤(本如朗格汉斯细胞)和在鼻,肺,胃的衬里和肠这使发现他们遇到的外来抗原。未成熟DC具有内吞能力,但相对较低的能力,以刺激T细胞3。未成熟DC表达各种模式识别受体(的PRRs),该捕获病原体相关分子模式(PAMP),或损害相关分子模式(D-AMPS)4。激活危险信号驱动向成熟树突状免疫原性,而自身分子导致T细胞unresponsiveneSS和凋亡5。免疫原性的DC是由MHC分子和共刺激表面分子和他们的总理幼稚T细胞的能力6,7 的上调为特征。
未成熟DC也可以朝向Treg细胞诱导或致耐受性状态中响应于维生素D3代谢物1α,25(O)2 D 3和某些免疫抑制剂象白细胞介素-10(IL-10),地塞米松和雷帕霉素8-9成熟。致耐受性树突由它们含有表面受体和配体免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIMs)的表达为特征。含ILT家族成员,ILT3和ILT4的耐受性树突状ITIMs的信号转导抑制alloproliferation和驱动器的Foxp3 + Treg细胞膨胀10,11。耐受性DC的这些独特的性质导致它们在体内的深刻效力,即诱导持久的耐受移植异体移植物和suppr的能力ESS自身免疫疾病的发展。致耐受性树突可以因此被看作其中在免疫激活的抑制功能成熟偏振光的DC的子类型。
目前,有树突状细胞在人外周血的两种通用子集:浆树突和骨髓DC 12。循环DC是罕见构成对人体血液中的白细胞的小于2%,这造成了困难的DC适当数量的分离研究其免疫调节功能。为了克服这个问题,单核细胞分化的DC用作树突细胞功能的研究的体外模型。相比在体内的DC 这些体外 DC具有相似的受体和功能。 体内的DC和体外产生的单核细胞衍生的DC(moDCs)详细的比较是由其他实验室13,14,15的影响。它也有报道说moDCs和CD1C +的DC分别相当于在抗原提呈和诱导T细胞的功能15。
在本文中,我们描述了产生自外周血单核细胞的未成熟moDCs,然后将它们分化成免疫原性和耐受性DC的方法。这些单核细胞来源的树突细胞(moDCs)由它们的表面标记,细胞因子分布,免疫调节功能和代谢状态,其特征。免疫原性和耐受性的树突细胞产生其导致要么同种异体T细胞或调节性T细胞的膨胀不同的细胞因子。在本文中,细胞因子分析与采用多重技术系统进行。细胞的生长培养基中培养用抗体固定化颜色编码珠和在一个紧凑的分析器读取。 DC的代谢状态使用测量氧气消耗速率,细胞呼吸的一个指标,和细胞外酸化率反映糖酵解外通量分析仪分析通量树突状细胞。这些生物能学率的测量提供跟踪细胞代谢这是在树突状细胞的发育和功能的重要变化的手段。
本文介绍了单核细胞不成熟moDCs,耐受性moDCs和成熟moDCs产生的方法。在这个协议中的重要步骤中详细在下面的段落中讨论。要注意的是人外周血用作这个协议和用于处理人血应实行普遍预防起始材料是重要的。虽然在技术上是可行的推导在人中24从骨髓的DC,从外周血中发现的细胞, 在体外 DC分化优选由于相比骨髓外周血的可用性。间在外周血中发现的细胞,造血CD34 +干细胞和单核细胞通常用于在体外生成DC的。造血CD34 +干细胞是与GM-CSF和TNF-α培养,以得到其然后进一步分化成朗格汉斯的CD1a +和CD14 +亚群样细胞和树突状细胞。相反地,单核细胞是在GM-CSF和IL-4中培养,以产生未成熟moDCs。几个协议用于从外周血单核细胞的富集;例如,通过加入塑料盘中,淘析和分离试剂盒25,26的粘附协议的优点是对细胞损害最小和相对成本效益但细胞纯度可能受到影响。和一个额外的步骤是必需的,以分离细胞用于进一步的实验。淘析是分隔根据它们的大小和密度的细胞的技术。淘洗的优点是细胞活力和单核细胞可容易地用于进一步的实验;然而这种技术是通过淘析器的可用性和无法分离具有相似沉淀参数细胞不同群体(T细胞和单核细胞)的限制。市售提取试剂盒采用磁珠来无论是正面还是选择单核细胞人口负选择。一些协议使用的是负向选择单核细胞隔离偏置为孤立的单核细胞保持“不变”(不标记或微珠的约束)。在这个协议中,CD14珠用于从PBMC中阳性选择人单核细胞。 CD14缺乏胞质域和CD14抗体的结合不会触发的信号转导。此外,该微珠将从培养后的单核细胞中分离,因此不会妨碍分化过程。此外,CD14的强烈大部分的单核细胞和弱对中性粒细胞和某些骨髓树突状细胞,因此这在更高的细胞纯度比其他方法17隔离结果的方法来表示。
血单核细胞可以分化成树突状或巨噬细胞和单核细胞的命运在很大程度上取决于细胞因子环境。在本文中,通过加入粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM生成moDCs-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)的人外周血单核细胞。 GM-CSF是必需的单核细胞的生存和IL-4上施加巨噬细胞分化的抑制活性;和组合加成的GM-SCSF和IL-4的单核细胞产生相比,个别的细胞因子27未成熟moDCs的比例更高。有迹象表明,通过添加肿瘤坏死因子α(TNF-α),干扰素α(IFN-α)和白细胞介素13(IL-13)到外周血单核细胞28,29,30生成moDCs其他协议。 GM-CSF和IL-4的组合在20世纪90年代进行了优化,现在公认的协议产生分化成免疫原性或耐受性moDCs和极化为Th1,Th2细胞或Th17细胞促进moDCs塑料未成熟DC。
未成熟moDCs通过加入的维生素D3和地塞米松分化为致耐受性moDCs。有几个协议产生耐受性例如树突状,通过核因子-κB(NF-KB)抑制,β连环蛋白活化,维生素D3,地塞米松和雷帕霉素31,32,33,34,35,9,36,37。虽然两者单独维生素D3和地塞米松已经报道以诱导对DC,维生素D3和地塞米松结果在alloproliferation更大抑制当使用各药物比组合的耐受性的效果。因此,用于产生致耐受性DC的现有协议被修改,以维生素D3和地塞米松的组合。这种方法目前正在接受为有治疗效用的人树突状耐受性的典范。同样重要的是要注意,重构维生素D3和地塞米松具有短的保质期。
在这个协议中,脂多糖(LPS)的溶液中加入作为DC成熟诱导剂。未成熟moDCs也可以使用诱导促炎症鸡尾酒成熟:(TNF-α),白细胞介素1β(IL-1β),白细胞介素-6(IL-6)和前列腺素E2)或促炎细胞因子(TNF-α和干扰素γ(IFN-Γ))。促炎性鸡尾酒产生具有高共刺激和迁移功能成熟moDCs但它们产生IL-12的38的相对较低的水平。 TNF-α或IFN-Γ单独是不能诱导稳定树突表型39。 LPS刺激Toll样受体4(TLR4),介导的NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(的MAPKs)的活化来诱导DC成熟。 LPS诱导的DC成熟示出的DC成熟标志物(CD83,CD86,HLA-DR)的上调和还导致生产的IL-12p70的。此外,该步骤可以被进一步修饰以配对TLR3激动剂LPS以产生用于临床癌症疫苗的成熟DCs。在本文中,耐受性的DC被证明是对LPS处理成熟性。这些半成熟树突状都没有免疫原性和不releaSE促炎细胞因子40。
此协议的局限性在于分化过程。这个过程需要从第0天8天的时间这对被改编成高通量分析困难7天。在协议的修改需要缩短分化过程然而,在不同的状态产生高数可行的DC。其次,通过增加细胞因子在这个协议产生的DC和这些细胞因子不支持DC人口的时间长。此外,细胞因子的浓度使用比体内要高得多,并可能会导致不属于生理相同体内的DC通路偏置发展。例如在直流前体的体外培养物已被证明对GM-CSF的,这是不用于体内 41正常DC分化的重要的细胞因子反应。然而,细胞因子刺激可以是基因的有效方法在体外进行实验率高的数字直流。以经受从这个协议来的其他分析,如免疫荧光染色产生的这些细胞,流式细胞仪的能力,异体反应的研究和代谢研究增加了这种方法的有效性。 这些体外的DC作为一个很好的模式,以提高直流发育,成熟和抗原呈递的知识,这是以前难以在体内 DC的罕见数字做。
DC的调节免疫的免疫耐受性与能力,使得他们在对抗癌症和自身免疫性疾病的42,43,44,45疗法有吸引力的候选人。在这个协议中产生免疫原性的DCs可以用来改进对感染性疾病和肿瘤疫苗功效;同时致耐受性树突可用于控制不需要的T细胞应答和防止移植后排斥反应。错综复杂免疫力和耐受性之间的平衡非常依赖于DC的分化状态。 DC分化是受多种信号途径和代谢命运管辖协调蜂窝方案。 DC的不同分化状态的生物能量和生物合成需求不同;例如,相比于在静止状态的DC活化DC需要更有活力的代谢适应生存和迁移是非常重要。要注意的是维生素D3,地塞米松和雷帕霉素为它们诱导耐受性树突能力已知它是重要的,已经描述了以影响直流代谢。在本文中,从不同的分化状态moDCs的能量代谢使用外流量分析仪进行了表征和耐受性moDCs表现出最高的代谢可塑性和LPS诱导的成熟降低这种可塑性。同化代谢支持DCs成熟,而分解代谢的影响耐受性DC功能46。区议会从这个协议产生可用于评估是否改变DC的代谢状态按住键修改在治疗免疫力和宽容。总之,我们提出了一个协议,为研究DC的免疫功能至关重要的代不成熟,耐受性和成熟moDCs的。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由局科技与Reasearch核心资金(JEC到)的支持。
Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | PBMC isolation |
Syringe | Becton, Dickinson | 302832 | PBMC isolation |
1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | PBMC isolation |
15 mL falcon tube | Falcon | 352096 | PBMC isolation |
50 mL falcon tube | Falcon | 352070 | PBMC isolation |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | PBMC isolation |
0.2 µm filter | Sartorius stedim biotech | 17597 | PBMC isolation |
MACs kit | Miltenyi biotec | 130-042-201 | Monocyte enrichment |
MiniMACS Separator | Miltenyi biotec | 130-042-102 | Monocyte enrichment |
Cell culture grade water | Invitrogen, Life Technologies | Cell culture | |
RPMI | Gibco, Life Technologies | 11875-093 | Cell culture |
FBS | Hyclone | SH30070103 | Cell culture |
Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140 | Cell culture |
Phosphate Buffered Saline |
Gibco, Life Technologies | 10010-031 | Cell culture |
NEAA | Gibco, Life Technologies | 11140-040 | Cell culture |
EDTA | Gibco, Life Technologies | 15575 | Cell culture |
HEPES | Gibco, Life Technologies | 15630-080 | Cell culture |
Sodium Pyruvate | Gibco, Life Technologies | 11360-070 | Cell culture |
GM-CSF | Miltenyi biotec | 130-093-868 | Cell culture |
IL-4 | Miltenyi biotec | 130-093-924 | Cell culture |
Vitamin D3 | Sigma | D1530 | Cell culture |
Dexamethasone | Sigma | D2915 | Cell culture |
LPS | Sigma | l2755 | Cell culture |
trypan blue | Gibco, Life Technologies | 15250-061 | Cell culture |
PerCP-conjugated HLADR | BioLegend | 307628 | Cytometry |
PE-conjugated CD80 | BD Biosciences | 557227 | Cytometry |
PE-conjugated CD83 | BD Biosciences | 556855 | Cytometry |
PE-conjugated CD86 | BD Biosciences | 555665 | Cytometry |
APC-conjugated CD11c | BD Biosciences | 340544 | Cytometry |
PE-conjugated CD14 | Miltenyi biotec | 130-091-242 | Cytometry |
PE-conjugated BDCA3 | Miltenyi biotec | 130-090-514 | Cytometry |
APC-conjugated ILT3 | eBioscience | 12-5139-73 | Cytometry |
Isotype matched PerCP- conjugated Mab |
BioLegend | 400250 | Cytometry |
Isotype matched PE- conjugated Mab |
Miltenyi biotec | 130-091-835 | Cytometry |
Isotype matched APC- conjugated Mab |
Miltenyi biotec | 130-091-836 | Cytometry |
BD LSR II Flow Cytometer | BD Pharmingen | BD LSR II | Cytometry |
cytofix/cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Cytometry |
APC/CY7-conjugated CD25 | BD pharmingen | 557753 | Cytometry |
PE/CY7-conjugated CD4 | Biolegend | 300512 | Cytometry |
PerCP-conjugated CD3 | Biolegend | 300428 | Cytometry |
EasySep Human CD4+ T cell enrichment kit | STEMCELL Technologies | 19052 | Alloreaction study |
EasySep magnet | STEMCELL Technologies | 18000 | Alloreaction study |
Cell Trace CFSE cell proliferation kit | Molecular probes | C34554 | Alloreaction study |
HBSS | Gibco, Life Technologies | 14025092 | Alloreaction study |
Alexa Fluor 647-conjugated FoxP3 | BD Biosciences | 560889 | |
Milliplex MAP Human Cytokine/Chemokine magnetic bead panel |
Millipore | HCYTOMAG-60K | Cytokine analysis |
5 mL Polystyrene tube | Falcon | 352058 | Cytokine analysis |
Luminex Sheath Fluid | Millipore | SHEATHFLUID | Cytokine analysis |
FLEXMAP 3D system with xPONENT software | Luminex Corporation | FLEXMAP 3D | Cytokine analysis |
MitoTracker Red CMXRos | Cell Signalling | 9082 | Mitochondrial activity |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | Mitochondrial activity |
XF Assay Medium (OCR) | Seahorse Bioscience | 102352-000 | Metabolic adaptation |
Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | Metabolic adaptation |
XF Base Medium (ECAR) | Seahorse Bioscience | 102353-100 | Metabolic adaptation |
L-glutamine | Gibco, Life Technologies | 25030-081 | Metabolic adaptation |
Calibrant | Seahorse Bioscience | 100840-000 | Metabolic adaptation |
XF Cell Mito Stress kit | Seahorse Bioscience | 103015-100 | Metabolic adaptation |
XF Glycolysis Stress kit | Seahorse Bioscience | 103020-100 | Metabolic adaptation |
Seahorse | Seahorse Bioscience | XFe96 | Metabolic adaptation |