Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

جيل غير ناضج، ناضج ومولد للتحمل الجذعية خلايا مع اختلاف الاستقلابية الظواهر

Published: June 22, 2016 doi: 10.3791/54128
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Translational Immunology, Institute of Molecular and Cell Biology, Agency for Science, Technology and Research, 2Singapore Immunology Network, 3Institute of Biomedical Studies, Baylor University

Abstract

النتائج الاستجابة المناعية من تفاعل معقد بين نظام المناعة الفطري مستضد غير محددة ومستضد محدد نظام المناعة التكيفية. جهاز المناعة هو التوازن المستمر في الحفاظ على التسامح إلى جزيئات الذات والرد بسرعة لمسببات الأمراض. الخلايا الجذعية (DCS) هي قوية المهنية مستضد الخلايا التي تربط بين نظام المناعة الفطري لجهاز المناعة على التكيف وتحقيق التوازن بين استجابة تكيفية بين الذاتية وغير الذاتية. اعتمادا على إشارات النضج، والخلايا الجذعية غير الناضجة يمكن حفز انتقائي على التمايز إلى البلدان النامية المناعية أو مولد للتحمل. توفر الخلايا الجذعية المناعية إشارات انتشار للخلايا T مستضد معين للتوسع نسيلي. في حين تنظم الخلايا الجذعية مولد للتحمل التسامح مستضد معين حذف خلايا T أو التوسع نسيلي من التنظيمية خلايا تي. ونظرا لهذه الخاصية الفريدة، وسعى للغاية الخلايا الجذعية بعد كعوامل علاجية لمرضى السرطان وفردوس المناعة الذاتيةASES. الخلايا الجذعية يمكن أن تكون محملة مستضدات معينة في المختبر، وحقنه في جسم الإنسان لجبل استجابة مناعية معينة سواء المناعية ومولد للتحمل. يعرض هذا العمل وسيلة لتوليد في المختبر من وحيدات، والخلايا الجذعية الوحيدات غير ناضجة مشتقة (moDCs)، مولد للتحمل وmoDCs ناضجة التي تختلف في التعبير علامة السطح، وظيفة والظواهر الأيضية.

Introduction

وقد وصفت العاصمة لأول مرة من قبل بول لانجرهانز (خلايا لانغرهانس) في أواخر القرن التاسع عشر، كما يشار اليه من قبل جولز (1) وتتميز رالف ستينمان وZanvil كوهن في عام 1973 الذي أقر بأنها المهنية مستضد الخلايا 2. تم العثور على البلدان النامية في الدم المحيطي وفي معظم أنسجة الجسم، وخصوصا وفرة في الأنسجة التي تتعرض للبيئة الخارجية مثل الجلد (بوصفها خلايا لانغرهانس) وفي بطانة الأنف والرئتين والمعدة والأمعاء والتي تتيح لهم لمواجهة مستضدات خارجي. غير ناضجة البلدان النامية لديها القدرة التقامي لكن قدرة متدنية نسبيا على تحفيز خلايا T 3. غير ناضجة البلدان النامية تعبير عن مختلف مستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs) أن القبض المرتبطة الممرض أنماط الجزيئية (PAMPs) أو أنماط الجزيئية المرتبطة الضرر (DAMPs) 4. تفعيل إشارات الخطر بالسيارة نضوج نحو البلدان النامية المناعية في حين تنتج جزيئات الذاتي في الخلايا التائية unresponsiveneSS وموت الخلايا المبرمج 5. وتتميز البلدان النامية المناعية التي upregulation من جزيئات MHC وجزيئات سطح شارك في تنشيطية وقدرتها على خلايا T ساذجة الرئيسية 6،7.

ويمكن أيضا أن نضجت غير ناضجة البلدان النامية نحو Treg الذي يحفز أو مولد للتحمل الدولة ردا على فيتامين D3 1A الأيض، 25 (O) 2 D 3 وبعض الأدوية المثبطة للمناعة مثل انترلوكين 10 (IL-10)، ديكساميثازون وrapamycin 8-9. وتتميز البلدان النامية مولد للتحمل من قبل التعبير عنها من الزخارف المثبطة أساس التيروزين immunoreceptor (ITIMs) التي تحتوي على مستقبلات سطح وبروابط. نقل الإشارة من ITIMs تحتوي على أفراد الأسرة ILT، ILT3 وILT4 في البلدان النامية مولد للتحمل تمنع alloproliferation ودفع Foxp3 + Treg التوسع 10،11. هذه الخصائص الفريدة للبلدان النامية مولد للتحمل تؤدي إلى قوة عميقة في الجسم الحي، وهي القدرة على إحداث التسامح دائم لترقيع خيفي زرع وsupprوفاق سطيف تطوير أمراض المناعة الذاتية. مولد للتحمل البلدان النامية قد ينظر بالتالي بانه نوع من البلدان النامية ناضجة الاستقطاب التي تعمل في تثبيط تنشيط جهاز المناعة.

حاليا، هناك نوعان من مجموعات فرعية العامة للخلايا الجذعية في الدم المحيطي البشري: البلدان النامية بلازماوية الشكل والبلدان النامية الدم النخاعي 12. البلدان النامية المتداولة هي المنشئة النادر أن أقل من 2٪ من الكريات البيض في دم الإنسان وهذا يشكل صعوبة في عزل عدد مناسب من البلدان النامية لدراسة وظائف immunoregulatory بهم. للتغلب على هذه المشكلة، وتستخدم الوحيدات متباينة البلدان النامية لتكون نموذجا في المختبر لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية. هذه البلدان النامية في المختبر لديها مستقبلات وظائف مماثلة مقارنة في الجسم الحي البلدان النامية. يتم التحقيق في مقارنة تفصيلية لفي الجسم الحي البلدان النامية في المختبر ولدت الوحيدات المستمدة البلدان النامية (moDCs) من قبل مختبرات أخرى 13 و 14 و 15. وذكر أيضا أن moDCs ومؤتمر نزع السلاحكانت 1C + البلدان النامية ما يعادلها في تقديم المستضد وتحملها T وظيفة الخلية 15.

في هذه الورقة، ونحن تصف طريقة لتوليد moDCs غير ناضجة من حيدات الدم الطرفية ومن ثم التفريق بينهما في البلدان النامية المناعية ومولد للتحمل. وتتميز هذه الوحيدات المستمدة الخلايا الجذعية (moDCs) من خلال علامات على السطح، ملف خلوى، وظائف immunoregulatory والدول التمثيل الغذائي. الخلايا الجذعية المناعية ومولد للتحمل تنتج السيتوكينات المختلفة التي تؤدي إلى توسيع إما خلايا T الصنعية أو الخلايا التائية التنظيمية. في هذه الورقة، يتم تنفيذ التنميط خلوى مع النظم التي تستخدم تكنولوجيا متعددة. يتم تحضين المتوسطة نمو الخلايا مع الأجسام المضادة يجمد ونا مميزا الخرز وقراءة في محلل المضغوط. ويتم تحليل الدول الأيضية من البلدان النامية باستخدام تحليل تدفق الخلية التي تقيس معدل الأكسجين الاستهلاك، وهو مؤشر على التنفس الخلوي، ومعدل تحمض خارج الخلية التي تعكس حال السكرتدفق في الخلايا الجذعية. قياس هذه المعدلات الطاقة الحيوية ويوفر وسيلة لتتبع التغيرات في عملية الأيض الخلوية التي تلعب دورا حيويا في تطوير الخلايا الجذعية وظيفة.

Protocol

وقد وافق هذا البحث من قبل مجلس المراجعة المؤسسية (IRB جامعة سنغافورة الوطنية-10-250).

1. عزل خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى (PBMCs)

  1. إعداد الكاشف
    1. إعداد برنامج تلفزيوني / EDTA: حل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وتكملة مع 2 مم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA). تعقيم هذا الحل عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.2 ميكرون. ملاحظة لتخزين PBS / EDTA في 4 درجات مئوية ودافئة لدرجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
    2. إعداد تلطيخ عازلة: الفوسفات مخزنة محلول ملحي (PBS) الملحق مع 2٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 10 ملي 4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) و 2 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA). تعقيم هذا الحل عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.2 ميكرون.
  2. جمع الدم من الدم المخروط
    ملاحظة: مخروط الدم يحتوي على مكونات خلايا الدم البيضاء التي جمعت بعد لوحةletpheresis من المستشفى. إذا تم جمعها الدم في الهيبارين أو EDTA الأنابيب، وتمييع الدم مع برنامج تلفزيوني في نسبة 1: 1 وانتقل إلى الخطوة 1.3. إذا تم تلقي معطف الشهباء، وتمييع معطف بافي مع برنامج تلفزيوني في 1: 2 نسبة وانتقل إلى الخطوة 1.3.
    1. قطع طرفي مخروط للسماح للدم بالتدفق خارج في أنبوب 50 مل. لاحظ أن مخروط عادة ما تحتوي على 10 مل من الدم.
    2. استخدام حقنة نهاية حادة تحتوي على 30 مل من برنامج تلفزيوني / EDTA لغسل مخروط وجمع في أنبوب 50 مل.
    3. تمييع الدم أخرى مع برنامج تلفزيوني / EDTA إلى الحجم النهائي من 80 مل.
  3. عزل PBMCs من الكثافة الطرد المركزي 16
    1. قسامة 15 مل Ficoll كل 4 جديدة 50 مل أنابيب.
    2. استخدام 25 مل الماصة المصلية لإضافة 20 مل من الدم المخفف فوق طبقة Ficoll. يحيط علما أن عقد أنبوب 50 مل في 45 زاوية والحرص على عدم تعكير صفو البيني.
    3. أنابيب الطرد المركزي في 805 x ج بدون فرامل لمدة 30 دقيقة، 20 ° C.
    4. مسح الطبقة البلازما وجمع عصابة من PBMCs الكذب أسفل طبقة البلازما مع الماصة باستور. الجمع بين أربعة أنابيب من PBMCs إلى قسمين 50 مل أنابيب. ملاحظة لتجنب جمع طبقة شفافة تحت PBMCs.
    5. إضافة PBS / EDTA إلى الحجم النهائي من 50 مل لكل أنبوب من PBMCs وأجهزة الطرد المركزي في 548 x ج مع الفرامل لمدة 10 دقيقة، 20 ° C.
    6. طاف نضح وبيليه resuspend في كل أنبوب مع 25 مل من العازلة تلطيخ والجمع في أنبوب واحد 50 مل.
    7. أجهزة الطرد المركزي في 367 x ج مع الفرامل لمدة 5 دقائق، 4 درجات مئوية.
    8. طاف نضح و resuspend بيليه مع 10 مل من العازلة تلطيخ.

2. الوحيدات التخصيب بواسطة مغناطيس 17

  1. تحديد عدد الخلايا
    1. يستغرق 20 ميكرولتر من تعليق خلية PBMC وتخلط مع 20 ميكرولتر من التريبان الأزرق لحساب عدد الخلايا الحية باستخدام عداد الكريات.
    2. تعليق خلية الطرد المركزي في 367 x ج مع الفرامللمدة 10 دقيقة، 4 درجات مئوية.
    3. نضح طاف تماما و resuspend الخلية بيليه إلى تركيز من 10 7 خلايا في 80 ميكرولتر من العازلة تلطيخ.
  2. وصفها المغناطيسي
    1. إضافة 20 ميكرولتر من ميكروبيدات CD14 في 10 7 خلايا، وتخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في 2-8 درجة مئوية.
    2. غسل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من العازلة تلطيخ في 10 7 خلايا وأجهزة الطرد المركزي في 367 x ج مع الفرامل لمدة 10 دقيقة، 4 درجات مئوية.
    3. نضح بيليه طاف تماما و resuspend خلية في تركيز 10 7 خلايا في 50 ميكرولتر من العازلة تلطيخ.
  3. الفصل المغناطيسي
    1. استخدام عمود متوسطة الحجم لمدة أقصاها 2 × 10 8 مجموع الخلايا.
      ملاحظة: اختر العمود وفاصل المناسب وفقا لعدد من مجموع الخلايا، وعدد الخلايا CD14 + الموصى بها في ورقة البيانات.
    2. وضع عمود في مجال س المغناطيسياتحاد كرة القدم فاصل مناسبة وإعداد العمود قبل الشطف مع 500 ميكرولتر من العازلة تلطيخ.
    3. تعليق خلية ماصة على عمود وجمع الخلايا غير المسماة التي تمر عبر العمود مع أنبوب 15 مل.
    4. استبدال أنبوب 15 مل جديد تحت عمود وغسل العمود 3 مرات مع 500 ميكرولتر من العازلة تلطيخ. تأكد من الخزان عمود فارغ قبل إضافة عازلة تلطيخ جديد بين يغسل.
    5. إزالة عمود من الفاصل ووضعه على أنبوب 15 مل الطازجة.
    6. ماصة 1 مل من العازلة تلطيخ على العمود. تدفق على الفور من الخلايا المسمى مغناطيسيا عن طريق دفع بقوة المكبس (المنصوص عليها في عدة) في العمود.
    7. كرر الخطوات من 2.3.2 إلى 2.3.6 باستخدام جزء مزال على عمود جديد لزيادة نقاء CD14 + الخلايا. لاحظ أنه سيتم الإفراج عن حبات من الخلايا تلقائيا في الثقافة خلال خطوة 3.2.

3. تمايز الخلايا الجذعية لتفعيل مختلف Sتتس

  1. إعداد الكاشف (الذيفان الداخلي المستوى يجب أن يكون أقل من 0.1 في الاتحاد الأوروبي / مل في كل الكواشف)
    1. إعداد خلية ثقافة المتوسط: RPMI 1640 تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 1٪ غير الضرورية الأحماض الأمينية (NEAA) و 0.05 مم 2-المركابتويثانول (2ME). تعقيم هذا الحل عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.2 ميكرون.
    2. إعداد السيتوكينات: إعادة IL-4 و GM-CSF في المياه الصف خلية الثقافة إلى تركيز 0.25 ملغ / مل على التوالي تحت ظروف معقمة. السيتوكينات قسامة إلى 200 أنابيب microcentrifuge ميكرولتر ومخزن في -80 درجة مئوية.
    3. إعداد فيتامين D3 الأوراق المالية: إعادة تشكيل فيتامين D3 في المياه الصف خلية الثقافة إلى تركيز 100 مم تحت ظروف معقمة. قسامة فيتامين D3 إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge ومخزن في -20 درجة مئوية.
    4. إعداد الأوراق المالية ديكساميثازون: إعادة ديكساميثازون في المياه الصف خلية الثقافة إلى تركيز من 10 ملم تحت ظروف معقمة. قسامة dexamethasone إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge ومخزن في -20 درجة مئوية.
    5. إعداد LPS: إعادة عديدات سكر شحمية (LPS) في المياه الصف خلية الثقافة إلى تركيز 1 ملغ / مل تحت ظروف معقمة. LPS قسامة إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge ومخزن في -20 درجة مئوية.
  2. توليد moDCs مختلفة
    1. البذور 4 مجموعات من CD14 + حيدات في تركيز 0،3-0،5 × 10 6 / مل من خلية ثقافة المتوسط ​​تستكمل مع 200 نانوغرام / مل من GM-CSF و 200 نانوغرام / مل من IL-4 في 6 لوحات جيدا. لاحظ أن هذا هو يوم 0 وحجم المتوسطة في كل بئر 6 هو 2 مل.
    2. احتضان الخلايا في الأنسجة حاضنة الثقافة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
    3. إزالة 850 ميكرولتر من المتوسط ​​من الثقافة في يوم 4 و الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق، 4 درجات مئوية. طاف نضح وبيليه resuspend في 1 مل من مستنبت الخلية التي تحتوي 2X (200 نانوغرام / مل من GM-CSF و 200 نانوغرام / مل من IL-4). إضافة هذا الخليط خلية الظهرللثقافة. لاحظ أن تركيز 2X مضافة للGM-CSF و IL-4 سيصبح 1X عند إضافة مل 1 من متوسطة الى الوراء في الثقافة.
    4. إضافة 1 ميكرولتر من فيتامين D3 الأسهم و1μl من الأسهم ديكساميثازون لكل مل من المتوسط ​​إلى اثنين من مجموعات في يوم 5 لتوليد moDCs مولد للتحمل. لاحظ أن تركيز النهائي من فيتامين D3 هو 100 نانومتر وديكساميثازون 10 نانومتر. ليس مطلوبا إضافة GM-CSF و IL-4 يوم 5.
    5. إضافة 200 نانوغرام / مل من GM-CSF و 200 نانوغرام / مل من IL-4 إلى جميع مجموعات في يوم 6.
    6. إضافة 1 ميكروغرام / مل من LPS إلى واحدة من مجموعات تعامل مع فقط GM-CSF و IL-4 في يوم 6 لتوليد moDCs ناضجة.
    7. إضافة 1 ميكروغرام / مل من LPS لمجموعة واحدة من moDCs مولد للتحمل في يوم 6 لتوليد LPS-مولد للتحمل moDCs.
    8. حصاد أنواع مختلفة من moDCs في يوم 7 عن طريق تنظيف صحن ثقافة مع برنامج تلفزيوني، EDTA لالتدفق الخلوي أو غيرها من الدراسات. لاحظ أن يتم حصاد الخلايا غير ملتصقة فقط. تأخذ علما بأن نسبة العائد من CD14 + monocytes لmoDCs غير ناضجة، moDCs ناضجة، moDCs مولد للتحمل والبلدان النامية LPS-مولد للتحمل حوالي 90٪، 50٪، 60٪ و 60٪ على التوالي، وتتفاوت بين المتبرعين بالدم وFBS الكثير.

4. التدفق الخلوي

  1. خلية السطح ماركر توصيف على moDCs
    1. فصل الخلايا من صحن الثقافة من قبل pipetting. غسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني / EDTA والخلايا resuspend في تركيز 5 × 10 5 خلايا في 50 ميكرولتر من العازلة تلطيخ في 1.5 مل أنبوب microcentrifuge.
    2. احتضان 0.5 × 10 6 قسامات الخلية مع PerCP مترافق HLADR (1: 100)،-PE مترافق CD80 (01:50)، والمؤسسة العامة مترافق CD83 (01:25)، والمؤسسة العامة مترافق CD86 (01:50)، APC- CD11c ومترافق (01:50)،-PE مترافق CD14 (01:50) وBDCA3-PE مترافق (01:50) وAPC-مترافق ILT3 (01:25) في الظلام لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. PerCP مترافق ماب (01:20)، والمؤسسة العامة مترافق ماب (01:11)، APC مترافق ماب (01:11) سيخدم الضوابط سلبية المطابقة نمط إسوي.
    3. كشف عن مستويات التعبير عن علامات السطح باستخدام قياس التدفق الخلوي 18.
  2. تحليل الميتوكوندريا غشاء إمكانيات moDCs
    1. إعداد محلول المخزون من 1 ملم الأحمر كلوروميثيل-X-rosamine (CMXRos) وذلك بإضافة 94.1 ميكرولتر من سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]) في 50 ميكروغرام من مجفف بالتجميد CMXRos الأحمر.
    2. احتضان 2 × 10 5 moDCs مع 100 نيوتن متر الأحمر CMXRos في 1 مل من محلول ملح هانك المتوازن (HBSS) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 15 مل أنبوب.
    3. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني / EDTA إلى خلايا وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق، درجة حرارة الغرفة. كرر 2 مرات. طاف نضح وبيليه الخلية resuspend في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، EDTA، 2٪ FCS لتحليل التدفق الخلوي. يحيط علما لاستخدام قناة PE لتحليل إشارة الأحمر CMXRos.
  3. علامة توصيف الخلايا التائية
    1. احتضان 50 ميكرولتر من 1.2 × 10 6 CFSE المسمى ألو CD4 + T-الخلايا (ولدت منالخطوة 5.6) مع PerCP مترافق CD3 (1: 200)، والمؤسسة العامة / Cy7 مترافق CD4 (1: 400) وCD25 APC / Cy7 مترافق (1: 100) في الظلام لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. وصمة عار خلايا تي باستخدام طقم التجارية مع Foxp3-فلور اليكسا 647 (01:50) في الظلام لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.

5. دراسات Alloreaction

  1. إعداد 5 ملي حل سهم carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) وذلك بإضافة 18 ميكرولتر من DMSO إلى مجفف بالتجميد CFSE، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  2. تنقية CD4 + T خلايا من PBMCs
    1. تحديد عدد الخلايا بأخذ 20 ميكرولتر من تعليق خلية PBMC وتخلط مع 20 ميكرولتر من التريبان الأزرق لحساب عدد من الخلايا الحية باستخدام عداد الكريات.
    2. تعليق خلية الطرد المركزي في 367 x ج مع الفرامل لمدة 10 دقيقة، 4 درجات مئوية.
    3. نضح بيليه طاف تماما و resuspend خلية في تركيز 5 × 10 7 خلايا لكل 1 مل من العازلة تلطيخ في 5 مل polystyأنبوب رينيه.
    4. إضافة CD4 + T الإنسان إثراء خلية كوكتيل في 50 ميكرولتر / خلايا مل. تخلط جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية) لمدة 10 دقيقة.
    5. دوامة الجزيئات المغناطيسية لمدة 30 ثانية، وإضافة الجزيئات المغناطيسية في 100 ميكرولتر / خلايا مل. تخلط جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    6. إضافة العازلة تلطيخ إلى تعليق خلية إلى إجمالي حجم 2.5 مل. مزيج من الخلايا في الأنبوب قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا 2-3 مرات. وضع أنبوب في جذب واحتضان لمدة 5 دقائق.
    7. عكس المغناطيس مع أنبوب وصب تعليق (يحتوي على خلايا T) في جديد 5 مل أنبوب البوليسترين.
  3. تحديد عدد الخلايا واحتضان 1.2 × 10 6 CD4 + T-الخلايا مع CFSE 5 ميكرومتر في 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية، محمية من الضوء.
  4. إضافة خمسة أضعاف حجم تلطيخ الأصلي من مستنبت الخلية (التي أعدت وفقا لخطوة 3.1.1) إلى الخلايا واحتضان لمدة 5 دقائق.
  5. Centrifأويغه في 300 x ج لمدة 5 دقائق، 4 درجات مئوية وبيليه resuspend في خلية ثقافة المتوسط ​​بتركيز 2 × 10 5 في 75 ميكرولتر.
  6. إضافة 75 ميكرولتر من 2 × 10 5 CD4 + T-الخلايا المسمى CFSE إلى كل ثقافة moDC تحتوي على 75 ميكرولتر من مستنبت الخلية 0، 2.5 × 10 3، 5 × 10 3، 10 × 10 3، 20 × 10 و 3 40 × 10 3 moDCs في 96 لوحات جيدا U-القاع. الثقافة لمدة 6 أيام في الأنسجة حاضنة الثقافة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  7. الحصاد قبل pipetting CD4 + T-خلايا في أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق، 4 درجات مئوية. جمع طاف للتحليل خلوى وبيليه الخلية resuspend في 2 مل من برنامج تلفزيوني / EDTA وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.

6. خلوى تحليل 19

  1. جمع supernatants من الدراسات alloreaction كما هو موضح في الخطوة 5.5.
  2. إعداد الكاشف لخلوى الإنسان / Chemokinالبريد تحليل لوحة المغناطيسي
    1. لإعداد خلط زجاجة من الخرز يجمد الأجسام المضادة للقارورة الفردية من الخرز (المدرجة في المجموعة)، دوامة لمدة 1 دقيقة. إضافة 60 ميكرولتر من كل قارورة الأجسام المضادة حبة لزجاجة الاختلاط (في الطقم) وتقديمهم إلى الحجم النهائي من 3 مل مع الخرزة مخفف (المقدمة).
    2. لإعداد ضوابط الجودة، إعادة ضبط الجودة (1) ومراقبة الجودة 2 (المدرجة في المجموعة) مع 250 ميكرولتر الماء منزوع الأيونات.
    3. لإعداد عازلة غسل، وتمييع 30 مل من العازلة 10X غسل (المدرجة في المجموعة) مع 270 مل من الماء منزوع الأيونات.
    4. لإعداد خلوى البشري الموحدة، إعادة مستوى خلوى البشري (المدرجة في المجموعة) مع 250 ميكرولتر الماء منزوع الأيونات لإعطاء 10000 خريج تركيز / مل.
      1. إضافة 50 ميكرولتر من 10000 جزء من الغرام / مل معيار خلوى الإنسان في 200 ميكرولتر من العازلة الفحص (المنصوص عليها في عدة) في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل لجعل 2000 جزء من الغرام / مل معيار العمل. نقل 50 ميكرولتر من 2000 جزء من الغرام / مل معيار خلوى الإنسان في 200 ميكرولتر من العازلة الفحص (المنصوص عليها في عدة) في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل لجعل 400 جزء من الغرام / مل معيار العمل.
      2. نقل 50 ميكرولتر من 400 جزء من الغرام / مل معيار خلوى الإنسان في 200 ميكرولتر من العازلة الفحص (المنصوص عليها في عدة) في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل لجعل 80 جزء من الغرام / مل معيار العمل. نقل 50 ميكرولتر من 80 جزء من الغرام / مل معيار خلوى الإنسان في 200 ميكرولتر من العازلة الفحص (المنصوص عليها في عدة) في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل لجعل 16 جزء من الغرام / مل معيار العمل.
      3. نقل 50 ميكرولتر من 16 جزء من الغرام / مل معيار خلوى الإنسان في 200 ميكرولتر من العازلة الفحص (المنصوص عليها في عدة) في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل لجعل 3.2 غ / مل معيار العمل. 0 جزء من الغرام / مل معيار العمل ليس لديها سوى 200 ميكرولتر من العازلة الفحص في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
  3. قبل لوحة فلتر الرطب (المدرجة في المجموعة) من قبل pipetting 200 ميكرولتر من العازلة الفحص (المقدمة) في كل بئر من التصفيةطبق. ختم ووضع لوحة تصفية على شاكر لوحة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. نضح الفحص العازلة وإضافة 25 ميكرولتر من كل ستاندرد أو مراقبة الجودة في آبار المناسبة.
  5. إضافة 25 ميكرولتر من مستنبت الخلية (التي أعدت وفقا لخطوة 3.1.1) على خلفية والمعايير وآبار المراقبة.
  6. إضافة 25 ميكرولتر من العازلة الفحص لعينة الآبار وإضافة 25 ميكرولتر من عينة في آبار العينة المناسبة.
  7. دوامة الزجاجة خلط تحتوي على الخرز يجمد الأجسام المضادة وإضافة 25 ميكرولتر من الخرز مختلطة إلى كل بئر. ختم لوحة واحتضان مع الانفعالات على شاكر لوحة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  8. نضح السوائل وغسل لوحة 2 مرات عن طريق إضافة 200 ميكرولتر / بئر غسل العازلة والشفط السائل.
  9. إضافة 25 ميكرولتر من الأجسام المضادة كشف (المقدمة) في كل بئر. ختم واحتضان مع الانفعالات على شاكر لوحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  10. إضافة 25 ميكرولتر من Streptavidin- فيكوإيريترين (سفر الأمثالعيديد) لكل تحتوي أيضا على 25 ميكرولتر من الأجسام المضادة الكشف. ختم واحتضان مع الانفعالات على شاكر لوحة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  11. نضح لوحة السوائل وغسل كما هو موضح في الخطوة 6.8.
  12. إضافة 150 ميكرولتر / بئر غمد السائل لجميع الآبار وResuspend الخرز على شاكر لوحة لمدة 5 دقائق.
  13. كشف كثافة مضان من الخرز باستخدام نظام 3D 20. تحليل البيانات كثافة الفلورسنت متوسط ​​باستخدام خمسة المعلمة طريقة تركيب منحنى سجل اللوجستي لحساب تركيزات خلوى / كيموكينات في عينات 21.

7. في الوقت الحقيقي معدل الأكسجين استهلاك (OCR) وخارج الخلية تحمض معدل (ECAR) القياسات

  1. إعداد الكاشف / المواد
    1. إعداد التعرف الضوئي على الحروف المتوسطة: متوسط ​​فحص تستكمل مع 25 ملي الجلوكوز و1 ملم البيروفات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.35). تعقيم هذا الحل عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.2 ميكرون. يحيط علما أن هذه الوسيلة هي العلاقات العامةepared دون FBS لأن المكونات في FBS معقدة وتختلف من قطعة واحدة إلى العضو الذكري الكثير.
    2. إعداد المتوسطة ECAR: قاعدة تستكمل المتوسطة مع 2 مم L-الجلوتامين (درجة الحموضة 7.35). تعقيم هذا الحل عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.2 ميكرون. تحيط علما بأن يتم إعداد هذه الوسيلة دون بيكربونات، الجلوكوز، بيروفات وFBS. لاحظ أن FBS ديه قدرة التخزين المؤقت وسوف تتداخل مع القراءة ECAR.
    3. إعداد المركبات لقياس OCR: و resuspend أوليغوميسين مع 630 ميكرولتر من التعرف الضوئي على الحروف المتوسطة لجعل 100 ميكرومتر حل الأسهم وتمييع مع OCR المتوسطة إلى 16 ميكرومتر تركيز العمل. و resuspend الكربونيل السيانيد 4- (trifluoromethoxy) فينيل هيدرازون (FCCP) مع 720 ميكرولتر من التعرف الضوئي على الحروف المتوسطة لجعل 100 ميكرومتر حل الأسهم وتمييع مع OCR المتوسط ​​إلى 4.5 ميكرومتر تركيز العمل. و resuspend روتينون / أنتيمايسين إيه مع 540 ميكرولتر من التعرف الضوئي على الحروف المتوسطة لجعل 50 ميكرومتر حل الأسهم وتمييع مع OCR المتوسط ​​إلى 10 ميكرومتر تركيز العمل.
    4. إعدادمركبات لقياس ECAR: و resuspend الجلوكوز مع 3 مل من المتوسط ​​ECAR لجعل 100 المحلول ملي وتضعف إلى 80 ملي تركيز العمل. و resuspend أوليغوميسين مع 720 ميكرولتر من المتوسطة ECAR لجعل 100 ميكرومتر حل الأسهم وتمييع إلى 18 ملي تركيز العمل. و resuspend 2-ديوكسي-D-الجلوكوز مع 1.5 مل من المتوسط ​​ECAR لجعل 1000 ملي حل الأوراق المالية.
    5. الماصة 200 ميكرولتر من calibrant في كل بئر من خرطوشة وتخزينها في 37 درجة مئوية مع عدم وجود CO 2 يوم واحد قبل القياسات.
  2. في الوقت الحقيقي القياسات التعرف الضوئي على الحروف
    1. حصاد moDCs وresuspend كل نوع من moDCs في التعرف الضوئي على الحروف المتوسطة بتركيز 60 × 10 3 في 150 ميكرولتر من التعرف الضوئي على الحروف المتوسطة.
    2. البذور 60 × 10 3 خلايا / جيد في أسفل لوحة 96-جيدا مسطحة المغلفة بولي-D-ليسين واحتضان في حاضنة غير CO-2 لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. يحيط علما استخدام 50 ميكرولتر من 50 نانوغرام / مل من بولي-D-ليسين لمعطف لوحة لمدة 1 ساعة ويغسلالماء المعقم. حافظ على لوحة جافة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
    3. ماصة 25 ميكرولتر التعرف الضوئي على الحروف المتوسطة إلى ميناء حقن ألف لجميع الآبار. 25 ميكرولتر OCR المتوسط ​​تحتوي على 16 ميكرومتر من أوليغوميسين في ميناء حقن B لجميع الآبار. 25 ميكرولتر OCR المتوسط ​​تحتوي على 4.5 ميكرومتر (FCCP) في حقن ميناء مئوية لجميع الآبار و 25 ميكرولتر المتوسطة OCR تحتوي على 10 ملي روتينون / أنتيمايسين إيه في ميناء حقن D لجميع الآبار. لاحظ أن التركيز جيدا النهائي لأوليغوميسين هو 2 ميكرومتر، FCCP 0.5 ميكرومتر وروتينون / أنتيمايسين إيه هو 1 ميكرومتر.
    4. وضع لوحة في محلل تدفق خارج الخلية وتشغيل الدراسة التعرف الضوئي على الحروف كاملة مع جميع moDCs في وقت واحد في أربع مراحل متتالية: التنفس القاعدية (بعد حقن المتوسط ​​من ميناء أ)، الميتوكوندريا تثبيط الخامس معقدة (بعد حقن المخدرات من ميناء B)، أقصى التنفس الاستقراء (بعد حقن المخدرات من ميناء C) والإلكترون تثبيط سلسلة النقل (بعد المخدرات من ميناء D) 22. الإحاطة علما بأن هناك 3 جycles بين الحقن و6 الفاصلة دقيقة بين القياسات.
  3. القياسات ECAR في الوقت الحقيقي
    1. حصاد moDCs وresuspend كل نوع من moDCs في المتوسط ​​ECAR بتركيز 60 × 10 3 في 150 ميكرولتر من المتوسطة ECAR.
    2. البذور 6 × 10 4 خلايا / جيد في أسفل لوحة 96-جيدا مسطحة المغلفة بولي-D-ليسين واحتضان في حاضنة غير CO-2 لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    3. ماصة 25 ميكرولتر المتوسطة ECAR بمنفذ حقن ألف لجميع الآبار. 25 ميكرولتر ECAR المتوسطة التي تحتوي على 10 ملي الجلوكوز في ميناء حقن B لجميع الآبار. 25 ميكرولتر ECAR المتوسط ​​تحتوي على 18 ميكرومتر من أوليغوميسين في ميناء حقن مئوية لجميع الآبار و 25 ميكرولتر OCR المتوسط ​​تحتوي على 1000 ملي 2-ديوكسي-D-الجلوكوز في ميناء حقن D لجميع الآبار. لاحظ أن التركيز جيدا النهائي للجلوكوز هو 10 ميكرومتر، أوليغوميسين هو 2 ميكرومتر و2-ديوكسي-D-الجلوكوز هو 100 ملم.
    4. وضع لوحة في محلل تدفق خارج الخلية وتشغيلدراسة كاملة ECAR مع كل moDCs في وقت واحد في أربع مراحل متتالية: التنفس القاعدية (بعد حقن المتوسط ​​من ميناء أ)، تحلل الاستقراء (بعد حقن المخدرات من ميناء B)، إلى أقصى حد تحريض تحلل (بعد حقن المخدرات من ميناء C) وتثبيط تحلل (بعد المخدرات من ميناء D) 22.
    5. تحليل الاختلافات الإحصائية باستخدام في اتجاه واحد أنوفا مع توكي مقارنة متعددة في مرحلة ما بعد الاختبار.

Representative Results

تنقية الوحيدات وتمايز الخلايا الجذعية

وتنقيته حيدات من PBMCs بواسطة الطرد المركزي كثافة الدم المحيطي (الشكل 1A)، تليها CD14 + الفصل انتقاء إيجابي المغناطيسي (الشكل 1B) والمثقف في المتوسط ​​كاملة في حضور GM-CSF و IL-4 للحصول على الخلايا الجذعية غير الناضجة ( الشكل 2A). أدت إضافة فيتامين D3 وآخر ديكساميثازون GM-CSF و IL-4 في التفريق بين moDCs غير ناضجة إلى moDCs مولد للتحمل (الشكل 2B). وأضاف LPS للحث على نضوج moDCs غير ناضجة لتنضج moDCs (الشكل 2C) وmoDCs مولد للتحمل وحفز مع LPS للتحقق من المقاومة إلى النضج (الشكل 2D). تم الحصول على عينات الدم المستخدمة في هذا العمل من المتبرعين الأصحاء مع سابقة علم موافقة.

moDC توصيف

السطح ماركر توصيف بواسطة التدفق الخلوي

وأظهر تحليل علامات سطح العاصمة التي moDCs ناضجة أعرب عن أعلى مستويات من علامات النضج HLA-DR، CD83 CD86 ومقارنة moDCs مولد للتحمل تعامل LPS، moDCs مولد للتحمل وmoDCs غير ناضجة (الشكل 3). وأظهرت هذه النتائج أن moDCs مولد للتحمل هم مقاومة للنضوج بالمقارنة مع moDCs غير ناضجة بعد التحفيز LPS. وبالإضافة إلى ذلك، LPS المعالجة moDCs مولد للتحمل وmoDCs مولد للتحمل عرض التعبير زيادة CD14، BDCA3 (CD141) والمناعي مثل نص (ILT) 3 مقارنة moDCs غير ناضجة وناضجة. وmoDCs مولد للتحمل التي ولدت لنا هنا يتسق مع التقارير السابقة 23.

الآثار البيئية-together.within الصفحات = "1"> توصيف الوظيفي للmoDCs

moDCs الناجم عن النضج تصبح مناعة وإطلاق السيتوكينات التي تشجع على انتشار CD4 + T الخلايا. قمنا بتقييم المناعية من الأنواع الفرعية moDC مختلفة عن طريق قياس انتشار الخلايا T-شارك مثقف. كانت moDCs مولد للتحمل سيئة للمناعة مقارنة مع moDCs ناضجة، كما يتضح من alloproliferation منخفضة من CD4 + T-الخلايا (الشكل 4A). تتميز moDCs مولد للتحمل التي كتبها المتدني الإنترفيرون Γ، وانخفاض IL-12p40، وارتفاع IL-10 إنتاج السيتوكينات في alloreaction المشترك الثقافات مع CD4 + T-الخلايا (الشكل 4B). وعلاوة على ذلك، زادت allospecific زيادة عدد moDCs مولد للتحمل في المشترك الثقافات من moDCs ناضجة يسببها CD4 + T الخلايا وتيرة CD25 عالية Foxp3 + التنظيمية خلايا تي (الشكل 4C).

تحليل آخر الميتوكوندريا

يستخدم الأحمر CMXRos لتعكس النشاط الميتوكوندريا لتحليل مستويات المحتملة غشاء الميتوكوندريا في moDCs. وقد لوحظت moDCs مولد للتحمل أن يكون النشاط الميتوكوندريا أعلى مقارنة مع الأنواع الفرعية moDC متباينة الأخرى (الشكل 5A). بعد ذلك، يتم تقييم معدل استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا (OCR) لفرعية moDC مختلفة باستخدام bioanalyzer. قياسات OCR تسمح رؤى عالية الدقة لمحة التمثيل الغذائي، وتوفير المعلومات بما في ذلك ولكن لا تقتصر على التنفس القاعدية، قدرة الجهاز التنفسي الغيار، تسرب بروتون والتنفس غير الميتوكوندريا. قياس OCR يوفر وسيلة لتقييم قدرة الخلايا على الاستجابة للإجهاد. ومضطرب الخلايا التمثيل الغذائي من خلال إضافة ثلاث مركبات مختلفة في الخلافة. الحقنة الأولى هو رأigomycin (ATP المقرنة) الذي يمنع الخامس معقدة من سلسلة نقل الإلكترون (ETC)، مما يعوق تركيب ATP. هذه الخطوة يميز نسبة الأوكسجين المستهلكة لتخليق ATP ونسبة الأوكسجين المستهلكة للتغلب على تسرب بروتون عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلية. الحقنة الثانية هو FCCP (ETC مسرع) الذي يعطل تركيب ATP عن طريق نقل أيونات الهيدروجين عبر الغشاء الميتوكوندريا بدلا من خلال قناة بروتون خامسا مجمع انهيار محتمل غشاء الميتوكوندريا يؤدي إلى استهلاك السريع من الطاقة والأوكسجين، دون جيل للاعبي التنس المحترفين. العلاج FCCP يمكن استخدامها لحساب قدرة الجهاز التنفسي الغيار من الخلايا. الحفاظ على قدرة الجهاز التنفسي الغيار تحت ظروف الإجهاد أمر بالغ الأهمية لبقاء الخلية. يتم تحديد هذه القدرات من خلال عدة عوامل، بما في ذلك توفر الركيزة والقدرات الوظيفية من الأنزيمات المشاركة في الخ. حقن الثالث هو مزيج من روتنون، وكومبلبحكم أنني المانع، وأنتيمايسين إيه، والثالث المانع مجمع. هذا المزيج إيقاف التنفس الميتوكوندريا ويلاحظ التعرف الضوئي على الحروف في الانخفاض نتيجة لضعف وظيفة الميتوكوندريا (الشكل 5C). عرض moDCs مولد للتحمل مستويات OCR القاعدية أعلى من moDCs ناضجة (الشكل 5D). وبالإضافة إلى ذلك، مولد للتحمل، LPS-مولد للتحمل، وmoDCs غير ناضجة أظهرت زيادة قدرة الجهاز التنفسي الغيار مقارنة مع moDCs ناضجة (الشكل 5E).

توصيف الأيضي moDCs

لأنه يتم الافراج حمض اللبنيك والبروتونات من الخلايا خلال تحلل، قمنا بتحليل النشاط حال السكر من moDCs عن طريق إجراء تحليل في الوقت الحقيقي من معدل تحمض خارج الخلية (ECAR) (الشكل 6B). في وجود الجلوكوز، معدل حال السكر من جميع moDCs زيادة مقارنة مع المرحلة القاعدية، معmoDCs ناضجة واظهار معدل حال السكر أعلى من moDCs غير ناضجة (الشكل 6D). مولد للتحمل وmoDCs غير ناضجة عرضت تحلل القصوى العالي (الناجم عن أوليغوميسين في وجود الجلوكوز) مقارنة مع moDCs تعامل LPS (الشكل 6B). وكانت القدرة حال السكر من moDCs مولد للتحمل وغير ناضجة أعلى من moDCs ناضجة (الشكل 6E). وعلى النقيض من معدل حال السكر عالية، وكان احتياطي حال السكر أدنى مستوى في moDCs ناضجة (الشكل 6F).

شكل 1
الشكل 1: تنقية الوحيدات من الدم المحيطي (A) والطبقات 25 مل من الدم بعناية على 15 مل من Ficoll لكل 50 مل أنبوب الطرد المركزي قبل. وتتركز PBMCs في طبقة أقل من البلازما بعد الطرد المركزي كثافة. يتم تحضين (ب) PBMCs مع ميكروبيدات التي هي حرف عطف ugated إلى وحيدة النسيلة الأجسام المضادة CD14 الإنسان (نمط إسوي: الماوس IgG2a). ومن ثم تحميلها على العمود الذي يوضع في المجال المغناطيسي للفاصل لعزل CD14 + حيدات الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: الخصائص المورفولوجية من moDCs. (A) يضاف 200 نانوغرام / مل من GM-CSF و IL-4 لتنقية CD14 + حيدات في اليوم 0 و 4 و 6 لتوليد moDCs غير ناضجة. و (ب) خطوة إضافية من التحفيز مع 100 نيوتن متر فيتامين D3 و 10 نانومتر ديكساميثازون في يوم 5 يولد moDCs مولد للتحمل. يتم تحفيز moDCs غير ناضجة وmoDCs مولد للتحمل مع 1 ميكروغرام LPS / مل في يوم 6 لتوليد (C) تنضج moDCs وmoDCs (D) LPS-مولد للتحمل.ttps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: السطح ماركر توصيف بواسطة التدفق الخلوي مستويات التعبير من علامات سطح HLA-DR، CD80، CD83، CD86، CD11، CD14، BDCA3 وLT3 في مولد للتحمل (الأخضر)، LPS-مولد للتحمل (أسود)، غير ناضج (أحمر)، ناضجة (الأزرق) moDCs. ويبين الضوابط نمط إسوي في الرمادي. يتم رسم بياني الفردية لكل نوع من الخلايا مع العمودي عدد خلايا ضد السجل المحور السيني من شدة fluorophore ومضافين. كل رسوم بيانية هي تمثيلية من أربع تجارب مستقلة. تم تعديل هذا الرقم من J IMMUNOL 194 (11)، 5174-5186، دوى: 10.4049 / jimmunol.1303316 (1 يونيو 2015). مستنسخة ونشرها بإذن حقوق التأليف والنشر. حقوق الطبع والنشر عام 2015. والجمعية الأمريكية لالمناعة، وشركة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: توصيف الوظيفي للmoDCs. (A) الكمي لتردد alloproliferation من CD4 + T الخلايا الناجم عن ثقافة مشتركة مع الأعداد المتزايدة من مولد للتحمل (تول، الأخضر)، LPS-مولد للتحمل (L-TOL، أسود)، غير ناضجة (IMM، أحمر) وناضجة (MAT ، الأزرق) moDCs. تم تجميع البيانات من أربع تجارب مستقلة؛ يعني فروق ذات دلالة إحصائية + ووزارة شؤون المرأة بين جميع moDCs مقابل تم تحليلها من قبل اتجاهين أنوفا مع Dunnett مقارنة متعددة في مرحلة ما بعد اختبار moDCs ناضجة. (ب) تحليل خلوى من الإنترفيرون Γ (اللوحة اليسرى)، IL-12p40 (وسط لوحة) وايل 10 (الجزء الأيمنل) في supernatants من alloreactions بين CD4 + T الخلايا شارك في تربيتها مع تزايد أعداد إما مولد للتحمل (الأخضر)، وغير ناضج (أحمر) أو الأزرق ناضجة) moDCs (. وكان يتم تجميع البيانات من ست تجارب مستقلة. يعني ± SEM alloproliferation (C) CD4 + T الخلية والتنظيمي توسيع الخلايا التائية الناجمة عن ثقافة مشتركة مع moDCs ناضجة في وجود أعداد من moDCs مولد للتحمل زيادة. اليسار العمودي، وتواتر تي خلية CD4 + انتشار الأسلحة النووية. الصحيح العمودي، وتواتر CD25 Foxp3 عالية + الخلايا المغلقة على التكاثري CD4 + T الخلايا. وكان يتم تجميع البيانات من ثلاث تجارب مستقلة؛ يعني ± SEM فروق ذات دلالة إحصائية بين وجود مقابل غياب تم تحليلها من قبل في اتجاه واحد أنوفا مع Dunnett مقارنة متعددة في مرحلة ما بعد اختبار moDCs مولد للتحمل. (D) CD4 + T-خلية alloproliferation (يسار) وتواتر CD25highFoxP3 + الخلايا (يمين) الناجم عن المشارك الثقافة مع moDCs مولد للتحملفي وجود أعداد من moDCs ناضجة زيادة. وكان يتم تجميع البيانات من سنتين إلى ثلاث تجارب مستقلة. يعني ± SEM فروق ذات دلالة إحصائية بين وجود مقابل حللت غياب moDCs ناضجة من اتجاهين أنوفا مع Dunnett مقارنة متعددة في مرحلة ما بعد الاختبار. تم تعديل هذا الرقم من J IMMUNOL 194 (11)، 5174-5186، دوى: 10.4049 / jimmunol.1303316 (1 يونيو 2015). مستنسخة ونشرها مع المؤلف إذن. حقوق الطبع والنشر عام 2015. والجمعية الأمريكية للمناعة، وشركة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: تحليل الميتوكوندريا آخر من moDCs. (أ) تم الحصول على مستويات محتمل غشاء الميتوكوندريا (الأحمر CMXRos) في moDCs التي كتبها fتحليل cytometric منخفضة. وكان يتم تجميع البيانات من أربع تجارب مستقلة. يعني ± SEM (ب) تمثيل تخطيطي في الوقت الحقيقي التنفس الميتوكوندريا. تحليل التعرف الضوئي على الحروف بدءا من التنفس القاعدية وبعد إضافة أوليغوميسين (معقد الخامس تثبيط)، FCCP (أقصى التنفس الاستقراء)، وروتينون / أنتيمايسين إيه خليط (الإلكترون سلسلة النقل [ETC] تثبيط). يشتق SRC (القاعدية القصوى تطرح من التنفس الأقصى) الميتوكوندريا من منحنى التعرف الضوئي على الحروف. (C) دراسة الحركية التمثيلية للالميتوكوندريا التعرف الضوئي على الحروف (بمول / دقيقة) في مولد للتحمل (TOL والأخضر)، LPS-مولد للتحمل (L-TOL، أسود) ، غير ناضجة (IMM والأحمر) وناضجة (MAT، الأزرق) moDCs باستخدام بالإضافة متتابعة من أوليغوميسين (Olig)، FCCP، وروتينون / أنتيمايسين إيه (روت-AA). (D) OCR الكمي التنفس القاعدية من moDCs و( E) تجنيب قدرة الجهاز التنفسي من moDCs. وكان يتم تجميع البيانات من خمس تجارب مستقلة. يعني ± SEتم تعديل هذا الرقم م من J IMMUNOL 194 (11)، 5174-5186، دوى: 10.4049 / jimmunol.1303316 (1 يونيو 2015). مستنسخة ونشرها مع المؤلف إذن. حقوق الطبع والنشر عام 2015. والجمعية الأمريكية للمناعة، وشركة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6: توصيف التمثيل الغذائي من moDCs. (أ) تمثيل تخطيطي في الوقت الحقيقي تحلل. يبدأ تحليل ECAR من ECAR القاعدية، التي حضنت الخلايا في وسائل الإعلام الحرة الجلوكوز تليها إضافة الجلوكوز (تحلل الاستقراء)، أوليغوميسين (الذي يدفع تحلل الخلية القصوى وتثبيط الخامس معقدة)، وأخيرا 2-ديوكسي-د جلوكوز(تثبيط تحلل). وتستمد معدل حال السكر (الحث تحلل تطرح للECAR القاعدية)، والقدرة على حال السكر (تحلل القصوى تطرح للECAR القاعدية)، واحتياطي حال السكر (تحلل القصوى طرح لتحريض تحلل) من منحنى ECAR. (ب) دراسة الحركية التمثيلية لليعتمد تحلل، ECAR (ميلا في الساعة / دقيقة) في مولد للتحمل (TOL والأخضر)، LPS-مولد للتحمل (L-TOL، أسود)، غير ناضجة (IMM والأحمر)، وتنضج (MAT، الأزرق) moDCs باستخدام بالإضافة متتابعة من الجلوكوز (Gluc)، أوليغوميسين (Olig)، و2-DG. البارات (C) تظهر مستويات ECAR القاعدية (D) معدل حال السكر (E) القدرة حال السكر، و (F) احتياطي حال السكر من moDCs. وكان يتم تجميع البيانات من ثلاث تجارب مستقلة؛ يعني 6 SEM. وقد تم تحليل فروق ذات دلالة إحصائية من قبل في اتجاه واحد أنوفا مع توكي مقارنة متعددة في مرحلة ما بعد الاختبار. تم تعديل هذا الرقم من J IMMUNOL 194 (11)، 5174-5186، دوى: 10.4049 / jimmunol.1303316 (1 يونيو 2015). مستنسخة ونشرها مع المؤلف إذن. حقوق الطبع والنشر عام 2015. والجمعية الأمريكية للمناعة، وشركة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

وتصف هذه الورقة طريقة لتوليد من وحيدات moDCs غير ناضجة، moDCs مولد للتحمل وmoDCs ناضجة. وتناقش الخطوات الهامة في هذا البروتوكول بالتفصيل في الفقرات التالية. من المهم أن نلاحظ أن يستخدم الدم المحيطي البشري كمادة أولية في هذا البروتوكول والاحتياطات العالمية للتعامل مع الدم البشري يجب أن تمارس. على الرغم من أنه من الممكن تقنيا لاشتقاق البلدان النامية من نخاع العظام في البشر 24، ويفضل في المختبر العاصمة التمايز من الخلايا الموجودة في الدم المحيطي نظرا لتوافر الدم المحيطي مقارنة نخاع العظام. بين الخلايا الموجودة في الدم المحيطي، المكونة للدم CD34 + الخلايا الجذعية وحيدات وتستخدم عادة للجيل في المختبر من البلدان النامية. CD34 + المكونة للدم والخلايا الجذعية هي تربيتها مع GM-CSF وTNF-α لاستخلاص CD1a + وCD14 + مجموعات فرعية يتم بعد ذلك فرقت أيضا إلى انجرهانزمثل الخلايا والخلايا الجذعية. على العكس من ذلك، وحيدات يتم تربيتها في GM-CSF و IL-4 لتوليد moDCs غير ناضجة. وتستخدم عدة بروتوكولات لإثراء حيدات من الدم المحيطي. على سبيل المثال، من خلال التمسك أطباق بلاستيكية، تصويل ومستلزمات عزل 25، 26 مزايا بروتوكول الانضمام هي الحد الأدنى تلف الخلايا وفعالة من حيث التكلفة ولكن الخلية نقاء يمكن المساس نسبيا؛ ومطلوب خطوة إضافية لفصل الخلايا لمزيد من التجارب. تصويل هو الاسلوب الذي يفصل الخلايا استنادا إلى حجم وكثافة. مزايا تصويل هي بقاء الخلية وحيدات يمكن استخدامها بسهولة لمزيد من التجارب. لكن هذه التقنية محدودة بسبب توافر elutriator وعدم القدرة على الفصل بين مجموعات مختلفة من الخلايا (خلايا تي وحيدات) مع المعلمات الترسيب مماثلة. تجاريا مجموعات العزلة المتاحة الاستفادة ميكروبيدات المغناطيسية لتحديد إما إيجابا أوسلبا تحديد السكان الوحيدات. متحيزة بعض البروتوكولات نحو العزلة الوحيدات باستخدام اختيار سلبية تبقى حيدات معزولة "تمس" (غير ملزمة علامات أو ميكروبيدات). في هذا البروتوكول، واستخدمت حبات CD14 على حيدات الإنسان مختارة إيجابية من PBMCs. CD14 يفتقر مجال حشوية وملزمة من الأجسام المضادة لCD14 لا يؤدي نقل الإشارة. وعلاوة على ذلك، فإن ميكروبيدات فصل من وحيدات بعد ثقافة، وبالتالي لا يعوق عملية التمايز. وبالإضافة إلى ذلك، يتم التعبير عن CD14 بقوة على معظم حيدات وضعيفة على العدلات وبعض الخلايا الجذعية الدم النخاعي، وبالتالي هذه الطريقة نتائج العزلة في أعلى نقاء خلية من أساليب أخرى 17.

يمكن التفريق بين حيدات الدم في البلدان النامية أو الضامة ومصير حيدات يعتمد إلى حد كبير على البيئة خلوى. في هذه الورقة، يتم إنشاؤها moDCs بإضافة عامل تحفيز مستعمرة الكريات البيضاء بلعم (GM-CSF) وانترلوكين 4 (IL-4) إلى حيدات الدم المحيطي الإنسان. مطلوب GM-CSF من أجل البقاء الوحيدات وIL-4 تمارس نشاط كابح بشكل خاص على التمايز بلعم. وبالإضافة إلى ذلك اندماجي من GM-SCSF وIL-4 إلى حيدات تسفر عن ارتفاع نسبة moDCs غير ناضج مقارنة خلوى فردي (27). وهناك غيرها من البروتوكولات التي تولد moDCs بإضافة عامل نخر الورم ألفا (TNF-α)، انترفيرون ألفا (IFN-α) وانترلوكين 13 (IL-13) إلى حيدات الدموية المحيطية 28، 29، 30. تم تحسين مزيج من GM-CSF و IL-4 في 1990s، والآن بروتوكول قبلت أن يولد البلدان النامية غير ناضجة بلاستيكية متباينة في moDCs مناعة أو مولد للتحمل والاستقطاب في TH1، TH2 أو Th17 moDCs تعزيز.

وتختلف moDCs غير ناضجة إلى moDCs مولد للتحمل بإضافة فيتامين D3 وديكساميثازون. هناك عدة بروتوكولات لتوليد البلدان النامية مولد للتحمل على سبيل المثال، عن طريقعامل كابا النووي B (NF-كيلوبايت) تثبيط، وتفعيل بيتا كاتينين، فيتامين D3، ديكساميثازون وRapamycin 31، 32، 33، 34، 35، 9، 36، 37. على الرغم من أن تم الإبلاغ عن كل من فيتامين D3 وديكساميثازون وحده لإحداث تأثير مولد للتحمل في البلدان النامية، ومزيج من فيتامين D3 ونتيجة ديكساميثازون في قمع أكبر من alloproliferation مما كانت عليه عندما تستخدم المخدرات الفردية. لذلك، تم تعديل بروتوكول القائمة لتوليد مولد للتحمل البلدان النامية لمزيج من فيتامين D3 وديكساميثازون. ويجري حاليا قبول هذا الأسلوب نموذجا للبلدان النامية مولد للتحمل الإنسان مع فائدة علاجية. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن فيتامين D3 وديكساميثازون تشكيلها لديها الصلاحية القصيرة.

في هذا البروتوكول، وأضيف عديدات سكر شحمية (LPS) بوصفها النضج محفز العاصمة. ويمكن أيضا أن يتسبب moDCs غير ناضجة لإنضاج باستخدام كوكتيل الموالية للالتهابات:(TNF-α)، انترلوكين 1 بيتا (IL-1β)، انترلوكين 6 (IL-6) وE2 البروستاجلاندين) أو السيتوكينات الموالية للالتهابات (TNF-α والانترفيرون غاما (IFN-Γ)). كوكتيل الموالية للالتهابات يولد moDCs ناضجة مع وظائف عالية شارك في تنشيطية والمهاجرة كنها تنتج مستويات منخفضة نسبيا من IL-12 38. TNF-α أو الإنترفيرون Γ وحدها ليست قادرة على حمل النمط الظاهري شجيري مستقر 39. LPS يحفز تول مثل مستقبلات 4 (TLR4)، يتوسط تفعيل NF-كيلوبايت و mitogen تفعيلها تحركات البروتينات (MAPKs) للحث على العاصمة النضج. DC نضوج الناجمة عن LPS ويظهر في التنظيم يصل من العاصمة علامات النضج (CD83، CD86، HLA-DR) وأدى أيضا إلى إنتاج IL-12p70. وبالإضافة إلى ذلك، هذه الخطوة يمكن زيادة تعديل لإقران LPS مع منبهات TLR3 لإنتاج البلدان النامية ناضجة لقاحات السرطان السريرية. في هذه الورقة، وتظهر البلدان النامية مولد للتحمل لتكون مقاومة للنضوج على العلاج LPS. هذه شبه ناضجة مثل البلدان النامية ليست المناعية ولا releaحد ذاته السيتوكينات الموالية للالتهابات 40.

القيود المفروضة على هذا البروتوكول تكمن في عملية التمايز. وتستغرق العملية 8 أيام من يوم 0 إلى يوم 7 الأمر الذي يشكل صعوبة لتكييفها إلى تحليل إنتاجية عالية. مطلوب تعديل في بروتوكول لتقصير عملية التمايز بعد تسفر عن أعداد كبيرة من البلدان النامية قابلة للحياة في ولايات مختلفة. ثانيا، يتم إنشاء البلدان النامية عن طريق إضافة السيتوكينات في هذا البروتوكول وهذه السيتوكينات لا حفاظ على تعداد سكان العاصمة لفترة طويلة من الزمن. وعلاوة على ذلك، يتم استخدام السيتوكينات في تركيزات أعلى بكثير مما كانت عليه في الجسم الحي، ويمكن أن تؤدي إلى تطوير متحيزة من الممرات التي ليست متطابقة من الناحية الفسيولوجية للفي الجسم الحي البلدان النامية. على سبيل المثال في الثقافات المختبر السلائف العاصمة وقد ثبت للرد على GM-CSF، وهي ليست خلوى أساسيا للتمايز العاصمة الطبيعي في الجسم الحي 41. ومع ذلك، يمكن تحفيز خلوى أن يكون وسيلة مفيدة لجينمعدل أعداد كبيرة من العاصمة في المختبر لإجراء التجارب. القدرة على إخضاع هذه الخلايا المتولدة من هذا البروتوكول إلى تحليلات أخرى مثل تلطيخ المناعي، التدفق الخلوي، ألو دراسات التفاعل ودراسات التمثيل الغذائي يزيد من فائدة هذا الأسلوب. هذه البلدان النامية في المختبر بمثابة نموذج جيد لتحسين المعرفة للتنمية العاصمة، والنضج وتقديم المستضد والتي من الصعب سابقا للقيام مع أرقام نادرة في الجسم الحي البلدان النامية.

قدرة البلدان النامية "لتنظيم الحصانة المناعية مقابل التسامح يجعلهم المرشحين جاذبية في علاجات ضد السرطان وأمراض المناعة الذاتية 42، 43، 44، 45. البلدان النامية مناعة ولدت في هذا البروتوكول يمكن استخدامها لتحسين فعالية التطعيم ضد الأمراض المعدية والأورام. بينما البلدان النامية مولد للتحمل يمكن أن تستخدم للسيطرة على استجابات الخلايا غير المرغوب فيها T ومنع الرفض بعد الزرع. ومعقدالتوازن بين الحصانة والتسامح يعتمد بشكل كبير على الوضع التمايز العاصمة. العاصمة التمايز هو برنامج الخلوي المنسق الذي تحكمه مسارات الإشارات المتعددة ومصير الأيض. الدول التمايز مختلفة من العاصمة تختلف في احتياجات الطاقة البيولوجية والحيوي. على سبيل المثال، البلدان النامية تنشيط تتطلب التعديلات التمثيل الغذائي أكثر حيوية مهمة من أجل البقاء والهجرة بالمقارنة مع البلدان النامية في يستريح الدولة. ومن المهم أن نلاحظ معروفة أن فيتامين D3، ديكساميثازون وrapamycin لقدرتها على حث البلدان النامية مولد للتحمل، وقد وصفت للتأثير على التمثيل الغذائي العاصمة. في هذه الورقة، وتميزت عملية الأيض نشطة من moDCs من الدول التمايز مختلفة باستخدام تحليل تدفق الخلية وعرضت moDCs مولد للتحمل أعلى نضوج التمثيل الغذائي اللدونة وLPS يسببها نقص هذا اللدونة. الأيض الابتنائية يدعم البلدان النامية النضج بينما التأثيرات الأيض تقويضي مولد للتحمل DC يعمل 46. في البلدان الناميةولدت من هذا البروتوكول يمكن استخدامها لتقييم ما إذا كان تغيير الدولة الأيضية من البلدان النامية الاستمرار على مفتاح لتعديل الحصانة والتسامح في العلاجات. في الختام، قدمنا ​​بروتوكول للجيل غير ناضجة، مولد للتحمل وmoDCs ناضجة حاسمة لدراسة وظائف immunoregulatory البلدان النامية ".

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل وكالة للعلوم والتكنولوجيا ورسرش الأساسية التمويل (لJEC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll GE Healthcare 17-1440-03 PBMC isolation
Syringe Becton, Dickinson 302832 PBMC isolation
1.5 ml centrifuge tube Axygen MCT-150-C PBMC isolation
15 ml falcon tube Falcon 352096 PBMC isolation
50 ml falcon tube Falcon 352070 PBMC isolation
Centrifuge Eppendorf 5810R PBMC isolation
0.2 µm filter Sartorius stedim biotech 17597 PBMC isolation
MACs kit Miltenyi biotec 130-042-201 Monocyte enrichment
MiniMACS Separator Miltenyi biotec 130-042-102 Monocyte enrichment
Cell culture grade water Invitrogen, Life Technologies Cell culture
RPMI Gibco, Life Technologies 11875-093 Cell culture
FBS Hyclone SH30070103 Cell culture
Penicillin-streptomycin Gibco, Life Technologies 15140 Cell culture
Phosphate
Buffered Saline		 Gibco, Life Technologies 10010-031 Cell culture
NEAA Gibco, Life Technologies 11140-040 Cell culture
EDTA Gibco, Life Technologies 15575 Cell culture
HEPES Gibco, Life Technologies 15630-080 Cell culture
Sodium Pyruvate Gibco, Life Technologies 11360-070 Cell culture
GM-CSF Miltenyi biotec 130-093-868 Cell culture
IL-4 Miltenyi biotec 130-093-924 Cell culture
Vitamin D3 Sigma D1530 Cell culture
Dexamethasone Sigma D2915 Cell culture
LPS Sigma l2755 Cell culture
trypan blue Gibco, Life Technologies 15250-061 Cell culture
PerCP-conjugated HLADR  BioLegend 307628 Cytometry
PE-conjugated CD80 BD Biosciences 557227 Cytometry
PE-conjugated CD83  BD Biosciences 556855 Cytometry
PE-conjugated CD86  BD Biosciences 555665 Cytometry
APC-conjugated CD11c BD Biosciences 340544 Cytometry
PE-conjugated CD14  Miltenyi biotec 130-091-242 Cytometry
PE-conjugated BDCA3  Miltenyi biotec 130-090-514 Cytometry
APC-conjugated ILT3  eBioscience 12-5139-73 Cytometry
Isotype matched
PerCP- conjugated Mab		 BioLegend 400250 Cytometry
Isotype matched
PE- conjugated Mab		 Miltenyi biotec 130-091-835 Cytometry
Isotype matched
APC- conjugated Mab		 Miltenyi biotec 130-091-836 Cytometry
BD LSR II Flow Cytometer BD Pharmingen BD LSR II  Cytometry
cytofix/cytoperm BD Biosciences 554714 Cytometry
APC/CY7-conjugated CD25 BD pharmingen 557753 Cytometry
PE/CY7-conjugated CD4 Biolegend 300512 Cytometry
PerCP-conjugated CD3 Biolegend 300428 Cytometry
EasySep Human CD4+ T cell enrichment kit STEMCELL Technologies 19052 Alloreaction study
EasySep magnet  STEMCELL Technologies 18000 Alloreaction study
Cell Trace CFSE cell proliferation kit Molecular probes C34554 Alloreaction study
HBSS Gibco, Life Technologies 14025092 Alloreaction study
Alexa Fluor 647-conjugated FoxP3 BD Biosciences 560889
Milliplex MAP Human
Cytokine/Chemokine
magnetic bead panel		 Millipore HCYTOMAG-60K Cytokine analysis
5 ml Polystyrene tube Falcon 352058 Cytokine analysis
Luminex Sheath Fluid  Millipore SHEATHFLUID Cytokine analysis
FLEXMAP 3D system with xPONENT software Luminex Corporation FLEXMAP 3D Cytokine analysis
MitoTracker Red CMXRos Cell Signalling 9082 Mitochondrial activity
DMSO Sigma Aldrich D2650 Mitochondrial activity
XF Assay Medium (OCR) Seahorse Bioscience 102352-000 Metabolic adaptation
Glucose  Sigma Aldrich G8769 Metabolic adaptation
XF Base Medium (ECAR) Seahorse Bioscience 102353-100 Metabolic adaptation
L-glutamine Gibco, Life Technologies 25030-081 Metabolic adaptation
Calibrant Seahorse Bioscience 100840-000  Metabolic adaptation
XF Cell Mito Stress kit Seahorse Bioscience 103015-100 Metabolic adaptation
XF Glycolysis Stress kit Seahorse Bioscience 103020-100 Metabolic adaptation
Seahorse  Seahorse Bioscience XFe96 Metabolic adaptation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jolles, S. Paul Langerhans. J Clin Pathol. 55 (4), 243-24 (2002).
  2. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  3. Steinman, R. M., Swanson, J. The endocytic activity of dendritic cells. J Exp Med. 182 (2), 283-288 (1995).
  4. Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
  5. Mueller, D. L. Mechanisms maintaining peripheral tolerance. Nat Immunol. 11 (1), 21-27 (2010).
  6. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  7. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
  8. Paavonen, J., Lehtinen, M. Interactions between human papillomavirus and other sexually transmitted agents in the etiology of cervical cancer. Curr Opin Infect Dis. 12 (1), 67-71 (1999).
  9. Ohtani, M., et al. Mammalian target of rapamycin and glycogen synthase kinase 3 differentially regulate lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production in dendritic cells. Blood. 112 (3), 635-643 (2008).
  10. Wilde, B., et al. Dendritic cells in renal biopsies of patients with ANCA-associated vasculitis. Nephrol Dial Transplant. 24 (7), 2151-2156 (2009).
  11. Al-Hello, H., et al. An enterovirus strain isolated from diabetic child belongs to a genetic subcluster of echovirus 11, but is also neutralised with monotypic antisera to coxsackievirus A9. J Gen Virol. 89, 1949-1959 (2008).
  12. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), 74-80 (2010).
  13. Osugi, Y., Vuckovic, S., Hart, D. N. Myeloid blood CD11c(+) dendritic cells and monocyte-derived dendritic cells differ in their ability to stimulate T lymphocytes. Blood. 100 (8), 2858-2866 (2002).
  14. Reynolds, G., Haniffa, M. Human and Mouse Mononuclear Phagocyte Networks: A Tale of Two Species. Front Immunol. 6, (2015).
  15. Jefford, M., et al. Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli. Blood. 102 (5), 1753-1763 (2003).
  16. Menck, K., et al. Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags. J Vis Exp. (91), (2014).
  17. Zhou, L., et al. Impact of human granulocyte and monocyte isolation procedures on functional studies. Clin Vaccine Immunol. 19 (7), 1065-1074 (2012).
  18. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  19. Faresjo, M. A useful guide for analysis of immune markers by fluorochrome (Luminex) technique. Methods Mol Biol. 1172, 87-96 (2014).
  20. Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. J Vis Exp. (65), (2012).
  21. Defawe, O. D., et al. Optimization and qualification of a multiplex bead array to assess cytokine and chemokine production by vaccine-specific cells. J Immunol Methods. 382 (1-2), 117-128 (2012).
  22. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. (46), (2010).
  23. Chunharas, A., Pabunruang, W., Hongeng, S. Congenital self-healing Langerhans cell histiocytosis with pulmonary involvement: spontaneous regression. J Med Assoc Thai. 85, 1309-1313 (2002).
  24. Bai, L., Feuerer, M., Beckhove, P., Umansky, V., Schirrmacher, V. Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells. Int J Oncol. 20 (2), 247-253 (2002).
  25. Felzmann, T., et al. Monocyte enrichment from leukapharesis products for the generation of DCs by plastic adherence, or by positive or negative selection. Cytotherapy. 5 (5), 391-398 (2003).
  26. Berger, T. G., et al. Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra) for clinical-scale generation of dendritic cells. J Immunol Methods. 298 (1-2), 1-2 (2005).
  27. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  28. Pace, S. T., Gelman, B. B., Wong, B. R. Primary Langerhans cell histiocytosis of the lacrimal gland in an adult. Can J Ophthalmol. 50 (3), 40-43 (2015).
  29. Ravanfar, P., Wallace, J. S., Pace, N. C. Diaper dermatitis: a review and update. Curr Opin Pediatr. 24 (4), 472-479 (2012).
  30. Gebhardt, C., et al. A case of cutaneous Rosai-Dorfman disease refractory to imatinib therapy. Arch Dermatol. 145 (5), 571-574 (2009).
  31. Vazquez, P., Robles, A. M., de Pablo, F., Hernandez-Sanchez, C. Non-neural tyrosine hydroxylase, via modulation of endocrine pancreatic precursors, is required for normal development of beta cells in the mouse pancreas. Diabetologia. 57 (11), 2339-2347 (2014).
  32. Pellacani, G., et al. Distinct melanoma types based on reflectance confocal microscopy. Exp Dermatol. 23 (6), 414-418 (2014).
  33. Shi, Y., et al. Hepatic involvement of Langerhans cell histiocytosis in children--imaging findings of computed tomography, magnetic resonance imaging and magnetic resonance cholangiopancreatography. Pediatr Radiol. 44 (6), 713-718 (2014).
  34. Haustein, M., Terai, N., Pablik, J., Pillunat, L. E., Sommer, F. Therapy-resistant swelling of the upper eyelid in childhood. Ophthalmologe. 111 (1), 53-57 (2014).
  35. Haidinger, M., et al. A versatile role of mammalian target of rapamycin in human dendritic cell function and differentiation. J Immunol. 185 (7), 3919-3931 (2010).
  36. Macedo, C., Turquist, H., Metes, D., Thomson, A. W. Immunoregulatory properties of rapamycin-conditioned monocyte-derived dendritic cells and their role in transplantation. Transplant Res. 1 (1), 16 (2012).
  37. Fischer, R., Turnquist, H. R., Taner, T., Thomson, A. W. Use of rapamycin in the induction of tolerogenic dendritic cells. Handb Exp Pharmacol. 188 (188), 215-232 (2009).
  38. Nicolette, C. A., et al. Dendritic cells for active immunotherapy: optimizing design and manufacture in order to develop commercially and clinically viable products. Vaccine. 25, 47-60 (2007).
  39. Han, T. H., et al. Evaluation of 3 clinical dendritic cell maturation protocols containing lipopolysaccharide and interferon-gamma. J Immunother. 32 (4), 399-407 (2009).
  40. Paananen, A., et al. Molecular and biological analysis of echovirus 9 strain isolated from a diabetic child. J Med Virol. 69 (4), 529-537 (2003).
  41. HC, O. N., Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
  42. Mest, H. J., et al. Glucose-induced insulin secretion is potentiated by a new imidazoline compound. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 364 (1), 47-52 (2001).
  43. Puc, J., et al. Mitochondrial activity after cold preservation of pancreatic islet cells treated with pefloxacin (PFX). Ann Transplant. 3 (1), 38-41 (1998).
  44. Alarcon, C., Serna, J., Perez-Villamil, B., de Pablo, F. Synthesis and differentially regulated processing of proinsulin in developing chick pancreas, liver and neuroretina. FEBS Letters. 436 (3), 361-366 (1998).
  45. Jekunen, A. P., Kairemo, K. J., Paavonen, T. Imaging of Hand-Schuller-Christian syndrome by a monoclonal antibody. Clin Nucl Med. 22 (11), 771-774 (1997).
  46. Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nat Rev Immunol. 15 (1), 18-29 (2015).

Tags

علم المناعة، العدد 112، مولد للتحمل moDCs، ناضج moDCs، غير ناضج moDCs، الحصانة، والتسامح، والأيض
جيل غير ناضج، ناضج ومولد للتحمل الجذعية خلايا مع اختلاف الاستقلابية الظواهر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sim, W. J., Malinarich, F.,… More

Sim, W. J., Malinarich, F., Fairhurst, A. M., Connolly, J. E. Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes. J. Vis. Exp. (112), e54128, doi:10.3791/54128 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter