Abstract
Immuunrespons veroorzaakt door een complexe interactie tussen het antigeen niet-specifieke aangeboren immuunsysteem en de antigeenspecifieke adaptieve immuunsysteem. Het immuunsysteem is een constant evenwicht handhaven van tolerantie tegen zelf-moleculen en snelle reactie op pathogenen. Dendritische cellen (DC) zijn krachtige professionele antigeen presenterende cellen die het aangeboren immuunsysteem koppelen aan het adaptieve immuunsysteem en de balans van de adaptieve respons tussen zelf en niet-zelf. Afhankelijk van de rijping signalen kunnen ongerijpte dendritische cellen selectief worden gestimuleerd om te differentiëren in immunogene of tolerogene DCs. Immunogene dendritische cellen proliferatie signalen antigeen-specifieke T cellen voor klonale expansie; terwijl tolerogene dendritische cellen reguleren tolerantie door antigenspecifieke T-cellen deletie of klonale vermeerdering van regulerende T-cellen. Als gevolg van dit unieke pand, worden dendritische cellen zeer gewild als therapeutische middelen voor kanker en auto-Diseases. Dendritische cellen kunnen worden geladen met specifieke antigenen in vitro en geïnjecteerd in het menselijk lichaam om een specifieke immuunrespons zowel immunogene en tolerogene monteren. Dit werk geeft een middel voor het genereren van in vitro uit monocyten, onrijpe monocyten afgeleide dendritische cellen (moDCs), tolerogene en volwassen moDCs die verschillen in oppervlakte marker expressie, functie en metabole fenotypes.
Introduction
DC werd voor het eerst beschreven door Paul Langerhans (Langerhans-cellen) in de late negentiende eeuw als verwezen door Jolles 1 en gekenmerkt door Ralph Steinman en Zanvil Cohn in 1973, die ze als professionele antigeen presenterende cellen 2 herkend. DCs worden gevonden in perifeer bloed en in de meeste weefsels van het lichaam, vooral overvloedig in weefsels die worden blootgesteld aan de externe omgeving zoals de huid (aanwezig als Langerhans cellen) en in de voeringen van de neus, longen, maag en darmen werkelijk kunnen ze extrinsieke antigenen tegenkomen. Onrijpe DC hebben endocytische mogelijkheid, maar relatief lage capaciteit om T-cellen 3 te stimuleren. Onrijpe DC te uiten verschillende patroonherkenning receptoren (PRRS) die capture-pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) of schade in verband moleculaire patronen (gedempt) 4. Het activeren van gevaar signalen rijden rijping richting immunogeen DCs terwijl self-moleculen leidt tot T-cel unresponsiveness en apoptose 5. Immunogene DCs worden gekenmerkt door de verhoogde expressie van MHC moleculen en co-stimulerende moleculen van het oppervlak en hun vermogen om naïeve T-cellen prime 6,7.
Onrijpe DC kan ook worden gerijpt in de richting van een Treg-inducerende of tolerogene staat in antwoord op vitamine D3 metaboliet 1a, 25 (O) 2 D 3 en bepaalde immunosuppressiva, zoals interleukine-10 (IL-10), dexamethason en rapamycine 8-9. Tolerogene DC's worden gekenmerkt door hun expressie van immunoreceptor tyrosine-gebaseerd remmend motief (ITIMs) bevattende oppervlak receptoren en liganden. Signaaltransductie van ITIMs met ILT familieleden, ILT3 en ILT4 in tolerogene DCs te remmen alloproliferation en rijden Foxp3 + Treg expansie 10,11. Deze unieke eigenschappen van tolerogene DC's tot hun diepe potentie in vivo, namelijk het kunnen duurzame induceren om getransplanteerde allogene transplantaten en suppress de ontwikkeling van auto-immuunziekten. Tolerogene DCs kunnen derhalve worden beschouwd als een subtype van rijpe DC-gepolariseerde maatregelen die op remming van immuunactivatie.
Momenteel zijn er twee algemene subsets van dendritische cellen in menselijk perifeer bloed plasmacytoïde DCs en myeloide DCs 12. Circulerende DCs zijn zeldzaam samenstellende minder dan 2% van de leukocyten in menselijk bloed en dit vormt een probleem voor de isolatie van een geschikt aantal DCs hun immuunregulerende functies te bestuderen. Om dit probleem te verhelpen, zijn monocyt gedifferentieerd DCs gebruikt als een in vitro model voor de studie van dendritische celfunctie. Deze in vitro DCs vergelijkbare receptoren en functies ten opzichte van in vivo DCs. Gedetailleerde vergelijking van DCs in vivo en in vitro gegenereerde monocyten afgeleide DCs (moDCs) onderzocht door andere laboratoria 13, 14, 15. Het is ook gemeld dat moDCs en CD1c + DCs waren gelijkwaardig aan antigeen presenterende en het induceren van T-cel-functie 15.
In dit artikel beschrijven we een werkwijze voor het genereren onrijpe moDCs uit perifere bloedmonocyten en differentiëren ze in immunogene en tolerogene DCs. Deze monocyten afgeleide dendritische cellen (moDCs) worden gekenmerkt door hun oppervlakte markers, cytokine profiel, immuunregulerende functies en metabolische toestanden. Immunogene en tolerogene dendritische cellen verschillende cytokinen die leiden tot groei van beide allogene T-cellen of regulerende T-cellen. In dit artikel wordt cytokine profiling uitgevoerd met systemen met behulp van multiplex-technologie. Groeimedium van cellen geïncubeerd met antilichaam geïmmobiliseerd gekleurde kralen en afgelezen in een compacte analyzer. Metabole staten van DCs worden geanalyseerd met behulp van extracellulaire flux analyzers dat zuurstof verbruik, een indicator van cellulaire ademhaling, en extracellulaire verzuring tarief dat glycolytische weerspiegelt metenflux in dendritische cellen. Meting van deze bioenergetica tarieven verschaft een middel om de veranderingen in de cellulaire stofwisseling die essentieel dendritische celontwikkeling en functie volgen.
Protocol
Dit onderzoek werd goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB NUS-10-250).
1. Isolatie van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs)
- Bereiding van reagens
- Bereid PBS / EDTA: met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en aangevuld met 2 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA). Steriliseer de oplossing door filtratie door een 0,2 pm filter. Opmerking voor PBS / EDTA bewaren bij 4 ° C en opwarmen tot kamertemperatuur vóór gebruik.
- Bereid kleuring buffer: met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) supplement met 2% foetaal runderserum (FBS), 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) en 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA). Steriliseer de oplossing door filtratie door een 0,2 pm filter.
- Verzamel Bloed van bloed Cone
Opmerking: Het bloed kegel bevat witte bloedcellen componenten verzameld nadat bordletpheresis uit het ziekenhuis. Als er bloed wordt verzameld in heparine of EDTA buizen, verdunnen het bloed met PBS in 1: 1 verhouding en ga verder met stap 1.3; als buffy coat wordt ontvangen, verdunnen buffy coat met PBS in 1: 2 ratio en ga verder met stap 1.3.- Snijd de twee uiteinden van de kegel om bloed te laten stromen in een 50 ml buis. Merk op dat de kegel bevat gewoonlijk 10 ml bloed.
- Gebruik een stomp uiteinde spuit met 30 ml PBS / EDTA de kegel wassen en te verzamelen in een 50 ml buis.
- Verdun bloed verder met PBS / EDTA tot een eindvolume van 80 ml.
- Isolatie van PBMC door dichtheidscentrifugatie 16
- Aliquot 15 ml Ficoll elk 4 verse 50 ml buizen.
- Gebruik een 25 ml serologische pipet tot 20 ml verdund bloed over de Ficoll laag toe te voegen. Let op de 50 ml buis te houden op een 45 hoek en de zorg om de interfase niet storen.
- Centrifugeer de buizen bij 805 xg ongeremd voor 30 min, 20 ° C.
- Verwijder deplasma laag en het verzamelen van de ring van PBMCs liggen net onder de plasma laag met een Pasteur pipet. Combineer vier buizen van PBMCs in twee 50 ml buisjes. Let op om te voorkomen dat het verzamelen van de transparante laag onder de PBMC.
- Voeg PBS / EDTA tot een eindvolume van 50 ml per buis van PBMCs en centrifugeer bij 548 xg met remmen voor 10 min, 20 ° C.
- Aspireren supernatant en resuspendeer pellet in elke buis met 25 ml kleurbuffer en te combineren in een 50 ml buis.
- Centrifugeer bij 367 xg met remmen voor 5 min, 4 ° C.
- Zuig supernatant en resuspendeer pellet met 10 ml vlekken buffer.
2. monocyten Verrijking door magnetische scheiding 17
- Bepaal aantal cellen
- Neem 20 pi PBMC celsuspensie en mengen met 20 pi trypan blauw naar het aantal levende cellen te tellen met behulp cytometer.
- Centrifuge cel suspensie bij 367 xg met remmengedurende 10 min, 4 ° C.
- Aspireren supernatant volledig en resuspendeer celpellet tot een concentratie van 10 7 cellen per 80 ul van vlekken buffer.
- magnetische Labeling
- Voeg 20 ul CD14 microkralen per 10 7 cellen, meng en incubeer gedurende 15 minuten bij 2-8 ° C.
- Was de cellen door toevoeging van 1 ml vlekken buffer per 10 7 cellen en centrifugeer bij 367 xg met remmen voor 10 min, 4 ° C.
- Aspireren supernatant volledig en resuspendeer celpellet in een concentratie van 10 7 cellen per 50 ul vlekken buffer.
- magnetische scheiding
- Gebruik middelgrote kolom voor maximaal 2 x 10 8 totaal cellen.
Opmerking: Kies een geschikte fase en separator volgens het totaal aantal cellen en het aantal CD14 + cellen aanbevolen in het gegevensblad. - Plaats de kolom in het magnetische veld ofa geschikte separator en voor te bereiden column door spoelen met 500 ul van vlekken buffer.
- Pipet celsuspensie op de kolom en laat ongelabelde cellen die door de kolom met een 15 ml buis passen.
- Plaats een nieuwe 15 ml buis in de kolom en waskolom 3 maal met 500 ui buffer kleuring. Zorg ervoor dat de kolom reservoir leeg is voordat het toevoegen van nieuwe vlekken buffer tussen de wasbeurten.
- Kolom verwijderen uit de afscheider en plaats deze op een verse 15 ml buis.
- Pipetteer 1 ml buffer kleuring op de kolom. Onmiddellijk spoelen van de magnetisch gemerkte cellen door stevig indrukken van de plunjer (in de kit) aan de kolom.
- Herhaal stappen 2.3.2 tot 2.3.6 met de geëlueerde fractie een nieuwe kolom aan de zuiverheid van CD14 + cellen te verhogen. Merk op dat de kralen zal worden uit de cellen automatisch in cultuur tijdens stap 3.2 vrijgegeven.
- Gebruik middelgrote kolom voor maximaal 2 x 10 8 totaal cellen.
3. Differentiatie van dendritische cellen Verschillende Activation SLIDSTATEN
- Bereiding van reagens (endotoxinegehalte moet minder dan 0,1 EU / ml in alle reagentia)
- Bereid celkweekmedium: RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA) en 0,05 mM 2-mercaptoethanol (2ME). Steriliseer de oplossing door filtratie door een 0,2 pm filter.
- Bereid cytokines: reconstitueren IL-4 en GM-CSF in celkweek kwaliteit water tot een concentratie van 0,25 mg / ml onder aseptische omstandigheden. Aliquot cytokines in 200 pl microcentrifugebuizen en bewaar bij -80 ° C.
- Bereid vitamine D3 voorraad: reconstrueren vitamine D3 in celcultuur kwaliteit water tot een concentratie van 100 mm onder aseptische omstandigheden. Aliquot vitamine D3 in 1,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C.
- Bereid dexamethason voorraad: reconstrueren dexamethason in celcultuur kwaliteit water tot een concentratie van 10 mm onder aseptische omstandigheden. aliquot dexamethasOne in 1,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C.
- Bereid LPS: reconstitueren Lipopolysacchariden (LPS) in celkweek kwaliteit water tot een concentratie van 1 mg / ml onder aseptische omstandigheden. Aliquot LPS in 1,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C.
- Het genereren van Verschillende moDCs
- Zaad 4 sets van CD14 + monocyten concentratie van 0,3-0,5 x 10 6 / ml celkweekmedium aangevuld met 200 ng / ml GM-CSF en 200 ng / ml IL-4 in 6 well platen. Merk op dat dit dag 0 en de hoeveelheid medium per put 6 2 ml.
- Incubeer cellen in weefselkweek incubator bij 37 ° C met 5% CO2.
- Verwijder 850 pl medium uit de kweek op dag 4 en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 min, 4 ° C. Aspireren supernatant en resuspendeer pellet in 1 ml celkweekmedium bevattende 2x van (200 ng / ml GM-CSF en 200 ng / ml IL-4). Voeg deze cel mengsel terugde cultuur. Merk op dat 2x concentratie toegevoegd GM-CSF en IL-4 zullen worden wanneer de 1x 1 ml medium terug in de kweek toegevoegd.
- Voeg 1 pl voorraad vitamine D3 en dexamethason 1 pl voorraad per ml medium met twee sets op dag 5 tot tolerogene moDCs genereren. Merk op dat de eindconcentratie van vitamine D3 100 nM dexamethason en 10 nM; toevoeging van GM-CSF en IL-4 is niet vereist op dag 5.
- Voeg 200 ng / ml GM-CSF en 200 ng / ml IL-4 om alle sets op dag 6.
- Voeg 1 ug / ml LPS aan een van de stellen behandeld met alleen GM-CSF en IL-4 op dag 6 tot rijpe moDCs genereren.
- Voeg 1 ug / ml LPS tot een set van de tolerogene moDCs op dag 6 tot LPS-tolerogene moDCs genereren.
- Oogst de verschillende moDCs op dag 7 door spoelen kweekschaal met PBS, EDTA flowcytometrie of andere studies. Merk op dat alleen niet-hechtende cellen worden geoogst. Let op dat percentage opbrengst van CD14 + monocYtes voor onvolwassen moDCs, volwassen moDCs, tolerogene moDCs en LPS-tolerogene DCs zijn ongeveer 90%, 50%, 60% respectievelijk 60% en varieert tussen bloeddonoren en FBS veel.
4. Flowcytometrie
- Celoppervlaktemerker karakterisering op moDCs
- Maak cellen van cultuur schotel door pipetteren. Was de cellen eenmaal met PBS / EDTA en resuspendeer cellen in een concentratie van 5 x 10 5 cellen per 50 ul kleuring buffer in 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Incubate 0,5 x 10 6 cell monsters met PerCP-geconjugeerde HLADR (1: 100), PE-geconjugeerde CD80 (01:50), PE-geconjugeerde CD83 (01:25), PE-geconjugeerde CD86 (01:50), APC geconjugeerde CD11c (01:50), PE-geconjugeerde CD14 (01:50) en PE-geconjugeerd BDCA3 (01:50) en APC-geconjugeerd ILT3 (01:25) in het donker gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Isotype gematched PerCP-geconjugeerd Mab (01:20), PE-geconjugeerd Mab (01:11), APC-geconjugeerd Mab (01:11) worden als negatieve controles dienen.
- Detecteren expressieniveaus van het oppervlak markers met een flow cytometer 18.
- Analyse van Mitochondriën Membraan potentieel van moDCs
- Bereid voorraadoplossing van 1 mM Red chloormethyl-X-rosamine (CMXRos) door toevoeging van 94,1 pl dimethylsulfoxide (DMSO) per 50 ug gelyofiliseerd Red CMXRos.
- Incubeer 2 x 10 5 moDCs met 100 nM Red CMXRos in 1 ml Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) gedurende 30 minuten bij 37 ° C in 15 ml buis.
- Voeg 2 ml PBS / EDTA cellen en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 min, kamertemperatuur. Herhaal 2 keer. Aspireren supernatant en resuspendeer celpellet in 300 pl PBS, EDTA, 2% FCS flowcytometrie analyse. Let op PE kanaal te gebruiken om Red CMXRos signaal te analyseren.
- Marker karakterisatie van T-cellen
- Incubeer 50 ui 1,2 x 10 6 CFSE-gelabelde allo CD4 + T-cellen (gegenereerd uitstap 5,6) met PerCP geconjugeerd CD3 (1: 200), PE / Cy7-geconjugeerde CD4 (1: 400) en APC / Cy7-geconjugeerde CD25 (1: 100) in het donker gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Vlek T-cellen met behulp van een commerciële kit met Foxp3-Alexa Fluor 647 (01:50) in het donker gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
5. Alloreaction Studies
- Bereid 5 mM voorraadoplossing van carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) door toevoeging van 18 ul DMSO gelyofiliseerd CFSE, volgens het protocol van de fabrikant.
- Zuiver CD4 + T-cellen uit PBMC
- Bepaal het aantal cellen door middel van 20 pl PBMC celsuspensie en mengen met 20 pi trypan blauw naar het aantal levende cellen onder toepassing van een cytometer tellen.
- Centrifugeer celsuspensie bij 367 xg met remmen voor 10 min, 4 ° C.
- Aspireren supernatant volledig en resuspendeer celpellet in een concentratie van 5 x 10 7 cellen per 1 ml vlekken buffer in een 5 ml polystyrrene buis.
- Voeg menselijke CD4 + T-cel verrijkingscocktail van 50 ul / ml cellen. Meng goed en incubeer bij kamertemperatuur (15-25 ° C) gedurende 10 min.
- Vortex magnetische deeltjes voor 30 sec en voeg magnetische deeltjes in 100 ul / ml cellen. Goed mengen en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
- Voeg kleurbuffer aan de celsuspensie tot een totaal volume van 2,5 ml. Meng de cellen in de buis door zachtjes en neer te pipetteren 2-3 keer. Breng de buis in de magneet en incubeer gedurende 5 min.
- Omkeren magneet met buis en giet de suspensie (bevat T-cellen) in een nieuwe 5 ml polystyreen buis.
- Bepaal het aantal cellen en incubeer 1,2 x 10 6 CD4 + T-cellen met 5 uM CFSE in 1 ml PBS gedurende 20 minuten bij 37 ° C, beschermd tegen licht.
- Voeg vervolgens vijf keer het oorspronkelijke volume kleuring van celkweek medium (bereid volgens stap 3.1.1) aan de cellen en incubeer gedurende 5 min.
- CENTRIFUGE bij 300 g gedurende 5 min, 4 ° C en resuspendeer pellet in celkweekmedium bij een concentratie van 2 x 10 5 per 75 ul.
- Voeg 75 ul van 2 x 10 5 CFSE-gelabelde CD4 + T-cellen aan elke moDC kweek die 75 pi celkweekmedium met 0, 2,5 x 10 3, 5 x 10 3, 10 x 10 3, 20 x 10 3 en 40 x 10 3 moDCs in 96 well U-bodemplaten. Cultuur 6 dagen in weefselkweek incubator bij 37 ° C met 5% CO2.
- Oogst pipetteren CD4 + T-cellen in 15 ml buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 min, 4 ° C. Verzamel supernatant cytokine analyse en resuspendeer celpellet in 2 ml PBS / EDTA en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
6. Cytokine Analyse 19
- Verzamel supernatanten van alloreaction studies zoals beschreven in stap 5.5.
- Voorbereiding van de reagens voor menselijk cytokine / Chemokine Magnetic Panel Analyse
- Voor de bereiding van mengfles van antilichaam geïmmobiliseerde parels voor individuele flesjes kralen (in de kit), vortex gedurende 1 minuut. Voeg 60 pi van elk antilichaam kraal flacon om het mengen fles (inbegrepen in de kit) en breng aan een uiteindelijk volume van 3 ml met Bead Diluent (meegeleverd).
- Voor de bereiding van kwaliteitscontroles, reconstrueren Quality Control 1 en Quality Control 2 (inbegrepen in de kit) met 250 pl gedemineraliseerd water.
- Voor de bereiding van wasbuffer Verdun 30 ml 10X wasbuffer (bij de kit) met 270 ml gedeïoniseerd water.
- Voor bereiding van humane cytokine Standaard, reconstitueren menselijke cytokine standaard (in de kit) met 250 gl gedeïoniseerd water aan 10.000 pg / ml concentratie geven.
- Voeg 50 ul van 10.000 pg / ml humaan cytokine standaard 200 gl Assay buffer (verschaft in de kit) in een 1,5 ml microcentrifugebuis tot 2000 pg / ml werkstandaard maken. Breng 50 pl van 2000 pg / ml humaan cytokine standaard 200 gl Assay buffer (verschaft in de kit) in een 1,5 ml microcentrifugebuis tot 400 pg / ml werkstandaard maken.
- Breng 50 pl van 400 pg / ml humaan cytokine standaard 200 gl Assay buffer (verschaft in de kit) in een 1,5 ml microcentrifugebuis tot 80 pg / ml werkstandaard maken. Breng 50 pl 80 pg / ml humaan cytokine standaard 200 gl Assay buffer (verschaft in de kit) in een 1,5 ml microcentrifugebuis tot 16 pg / ml werkstandaard maken.
- Breng 50 pl 16 pg / ml humaan cytokine standaard 200 gl Assay buffer (verschaft in de kit) in een 1,5 ml microcentrifugebuis tot 3,2 pg / ml werkstandaard maken. 0 pg / ml werkstandaard slechts 200 gl Assay buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Pre natte filterplaat (in de kit) pipetteren 200 ul assaybuffer (ontvangen) in elk putje van het filterbord. Afdichting en plaats de filterplaat op een plaat schudder gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Aspireren Assay buffer en voeg 25 ul van elk standaard of Kwaliteitscontrole in de geschikte putjes.
- Voeg 25 ul celkweek medium (bereid volgens stap 3.1.1) om de achtergrond, standaarden en controles.
- Voeg 25 gl testbuffer aan de monsterputjes en voeg 25 ul van het monster in de juiste monsterputjes.
- Vortex de mengfles bevattende antilichaam geïmmobiliseerde korrels en voeg 25 ul van de gemengde korrels aan elk putje. Afdichtplaat en incubeer onder schudden op een plaat schudder overnacht bij 4 ° C.
- Zuig vloeistof en wassen plaat 2 maal door het toevoegen van 200 pl / putje wasbuffer en opzuigen van de vloeistof.
- Voeg 25 ul van detectie antilichamen (ontvangen) in elk putje. Afdichting en incubeer onder schudden op een plaat schudder gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Voeg 25 ul van streptavidine Phycoerythrine (provided) aan elk putje dat de 25 pl detectie antilichamen. Afdichting en incubeer onder schudden op een plaat schudder gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
- Zuig vloeistof en wassen plaat zoals beschreven in stap 6.8.
- Voeg 150 ul / putje van omhullingfluïdum aan alle putjes en resuspendeer kralen op een plaat schudder gedurende 5 min.
- Detecteren fluorescentie-intensiteit van kralen met een 3D-systeem 20. Analyseer de mediaan fluorescentie-intensiteit van gegevens met behulp van een vijf parameter log-logistische curve-fitting methode voor het berekenen van cytokine / chemokines concentraties in monsters 21.
7. Real-time zuurstof verbruik (OCR) en extracellulaire Verzuring Rate (ECAR) Afmetingen
- Bereiding van het reagens / Materials
- Bereid OCR medium: Assay-medium aangevuld met 25 mM glucose en 1 mM natriumpyruvaat (pH 7,35). Steriliseer de oplossing door filtratie door een 0,2 pm filter. Let op dat dit medium is prepared zonder FBS omdat componenten in FBS zijn complex en verschillen van veel te veel helmknop.
- Bereid ECAR medium: Base medium aangevuld met 2 mM L-glutamine (pH 7,35). Steriliseer de oplossing door filtratie door een 0,2 pm filter. Let op dat dit medium wordt bereid zonder bicarbonaat, glucose, pyruvaat en FBS. Merk op dat FBS heeft buffercapaciteit en zal interfereren met de ECAR lezen.
- Bereid je verbindingen voor OCR metingen: Resuspendeer oligomycin met 630 ul van OCR medium tot 100 uM voorraad oplossing te maken en verdun met OCR medium tot 16 uM werkende concentratie. Resuspendeer carbonyl cyanide 4- (trifluormethoxy) fenylhydrazon (FCCP) met 720 ul van OCR medium tot 100 uM voorraad oplossing te maken en verdun met OCR medium tot 4,5 uM werkende concentratie. Resuspendeer rotenon / antimycin A met 540 ul van OCR medium tot 50 uM voorraad oplossing te maken en verdun met OCR medium tot 10 urn werken concentratie.
- Klaarmakenverbindingen voor ECAR metingen: Resuspendeer Glucose met 3 ml ECAR medium tot 100 mM voorraad oplossing te maken en verdun tot 80 mm werken concentratie. Resuspendeer oligomycin met 720 pi ECAR medium tot 100 uM voorraad oplossing te maken en verdun tot 18 mm werken concentratie. Resuspendeer 2-deoxy-D-glucose met 1,5 ml ECAR medium tot 1000 mM voorraadoplossing te maken.
- Pipetteer 200 ul van kalibrant in elk putje van de cassette en opslag bij 37 ° C zonder CO2 één dag voor metingen.
- Real-time OCR Metingen
- Oogst moDCs en resuspendeer elk type moDCs OCR medium bij een concentratie van 60 x 10 3 per 150 pl medium OCR.
- Zaad 60 x 10 3 cellen / putje in een poly-D-lysine-gecoate 96-well plaat met vlakke bodem en incubeer in een niet-CO 2 incubator gedurende 1 uur bij 37 ° C. Let op 50 pl 50 ng / ml poly-D-lysine het bekleden van de plaat te gebruiken voor 1 uur en was metsteriel water. Blijf plaat drogen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur vóór gebruik.
- Pipet 25 ul OCR medium in injectie poort A voor alle putten; 25 pl OCR medium dat 16 uM oligomycin in injectiehaven B voor alle putjes; 25 pl OCR medium dat 4,5 uM (FCCP) in injectiehaven C voor alle wells en 25 pi OCR medium dat 10 mM rotenon / antimycin A injectiepoort D voor alle putjes. Merk op dat de uiteindelijke concentratie goed oligomycin is 2 uM, 0,5 uM FCCP is en rotenon / antimycin A 1 uM.
- Plaats de plaat in de extracellulaire flux analyzer en een complete OCR studie met alle moDCs draaien gelijktijdig in vier opeenvolgende fasen: basale ademhaling (na het midden injectie van de haven van A), mitochondriale complex V remming (na het injecteren van drugs van de haven B), maximale ademhaling inductie (na drug injectie van de haven C) en elektronen transportketen inhibitie (na het geneesmiddel uit de haven D) 22. Let op dat er 3 cycles tussen injecties en 6 min interval tussen de metingen.
- Real-time ECAR Metingen
- Oogst moDCs en resuspendeer elk type moDCs in ECAR medium bij een concentratie van 60 x 10 3 per 150 pl ECAR medium.
- Zaad 6 x 10 4 cellen / putje in een poly-D-lysine-gecoate 96-well plaat met vlakke bodem en incubeer in een niet-CO 2 incubator gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Pipet 25 ul ECAR medium in injectie poort A voor alle putten; 25 pl ECAR medium dat 10 mM glucose in injectiehaven B voor alle putjes; 25 pl ECAR medium dat 18 uM oligomycin in injectiehaven C voor alle wells en 25 pi OCR medium dat 1000 mM 2-deoxy-D-glucose in injectiepoort D voor alle putjes. Merk op dat de uiteindelijke goed concentratie glucose 10 uM, oligomycin is 2 uM en 2-deoxy-D-glucose 100 mM.
- Plaats de plaat in de extracellulaire flux analyzer en uitvoeren van eencompleet ECAR studie met alle moDCs gelijktijdig in vier opeenvolgende fasen: basale ademhaling (na het midden injectie van de haven van A), glycolyse inductie (na het injecteren van drugs van de haven B), maximale glycolyse inductie (na het injecteren van drugs van de haven C) en glycolyse inhibitie (na drug van de haven D) 22.
- Analyseren statistische verschillen met behulp van one-way ANOVA met Tukey meervoudige vergelijking post-test.
Representative Results
Monocyten Zuivering en dendritische cel differentiatie
Monocyten werden gezuiverd uit PBMC door dichtheidscentrifugatie van perifeer bloed (figuur 1A), gevolgd door CD14 + positieve selectie magnetische scheiding (Figuur 1B) en gekweekt in compleet medium in aanwezigheid van GM-CSF en IL-4 tot onrijpe dendritische cellen te verkrijgen ( figuur 2A). Toevoeging van vitamine D3 en dexamethason na GM-CSF en IL-4 resulteerde in de differentiatie van onrijpe moDCs in tolerogene moDCs (figuur 2B). LPS werd toegevoegd aan de rijping van onrijpe moDCs bewegen om moDCs (figuur 2C) en tolerogene moDCs volwassen werden gestimuleerd met LPS om resistentie tegen rijping (figuur 2D) te controleren. De bloedmonsters die in dit werk werden verkregen van gezonde donoren met eerdere kennistoestemming.
moDC karakterisering
Surface Marker karakterisering door flowcytometrie
Analyse van DC oppervlaktemerkers gebleken dat volwassen moDCs expressie de hoogste niveaus van rijping markers HLA-DR, CD83 en CD86 in vergelijking met LPS behandelde tolerogene moDCs, tolerogene moDCs en onvolwassen moDCs (figuur 3). Deze resultaten toonden dat tolerogene moDCs waren resistent tegen rijping vergelijking met onrijpe moDCs na LPS stimulatie. Bovendien, LPS-behandelde tolerogene moDCs en tolerogene moDCs weergegeven verhoogde expressie van CD14, BDCA3 (CD141) en immunoglobuline-achtige transcript (ILT) 3 ten opzichte van onvolwassen en volwassen moDCs. De tolerogene moDCs dat we hier gegenereerd is met eerdere verslagen 23.
Functionele karakterisering van moDCs
moDCs geïnduceerde rijping worden immunogeen en laat cytokinen die de proliferatie van CD4 + T-cellen te bevorderen. Onderzochten wij de immunogeniciteit van de verschillende subtypes moDC door het meten van de proliferatie van co-gekweekte T-cellen. Tolerogene moDCs waren slecht immunogeen in vergelijking met volwassen moDCs, zoals blijkt uit lage alloproliferation van CD4 + T-cellen (Figuur 4A). Tolerogene moDCs worden gekenmerkt door hun lage IFN-Γ lage IL-12p40 en IL-10 high cytokineproductie in alloreaction co-kweken met CD4 + T-cellen (Figuur 4B). Door de toename van het aantal tolerogene moDCs in co-culturen van volwassen moDCs allospecifieke geïnduceerde CD4 + T-cellen verhoogde frequentie van CD25 high Foxp3 + regulerende T-cellen (Figuur 4C).
Rode CMXRos wordt gebruikt om de mitochondriale activiteit weerspiegelen de mitochondriale membraanpotentiaal niveaus moDCs analyseren. Tolerogene moDCs waargenomen hogere mitochondriale activiteit in vergelijking met de andere moDC onderscheiden subtypen (Figuur 5A). Vervolgens wordt de mate van mitochondriale zuurstofverbruik (OCR) beoordeeld om de verschillende subtypen moDC met een bioanalyzer. OCR metingen laten hoge resolutie inzichten in het metabolische profiel, informatie waaronder maar niet beperkt tot basale ademhaling, extra ademhalingscapaciteit, proton lek en non-mitochondriale ademhaling. De meting van OCR verschaft een middel om het vermogen van cellen om te reageren op stress beoordelen. De cellen metabolisch verstoord door de toevoeging van drie verschillende verbindingen na elkaar. De eerste injectie is Oligomycin (ATP Koppeling), die complex V van het elektron transport keten (ETC) remt, remmen ATP-synthese. Deze stap onderscheidt het percentage zuurstof verbruikt voor ATP synthese en het percentage zuurstof verbruikt om proton lek in het binnenste mitochondriale membraan overwonnen. De tweede injectie is FCCP (ETC versneller) die ATP-synthese verstoort door het vervoer van waterstofionen over de mitochondriale membraan in plaats van door het proton kanaal van Complex V. De ineenstorting van de mitochondriale membraanpotentiaal leidt tot een snelle verbruik van energie en zuurstof, zonder dat de vorming van ATP. FCCP behandeling kan worden gebruikt om het reservewiel ademhalingscapaciteit cellen te berekenen. Onderhoud van reserveonderdelen ademhalingscapaciteit onder stressomstandigheden is essentieel voor celoverleving. Dit vermogen wordt bepaald door verschillende factoren, zoals de beschikbaarheid van substraat en de functionele capaciteit van de bij de ETC enzymen De derde injectie is een combinatie van Rotenon een Complex I-remmer, en Antimycin A, een complex III-remmer. Deze combinatie wordt afgesloten mitochondriale respiratie en OCR waargenomen afnemen als gevolg van verminderde mitochondriale functie (figuur 5C). Tolerogene moDCs weergegeven hogere basale OCR niveaus dan volwassen moDCs (figuur 5D). Daarnaast tolerogene, LPS-tolerogene, en onvolwassen moDCs toonde verhoogde reservecapaciteit respiratoire capaciteit in vergelijking met volwassen moDCs (Figuur 5E).
Metabole karakterisering van moDCs
Omdat melkzuur en protonen zijn vrijgemaakt uit cellen gedurende glycolyse, de glycolytische activiteit van moDCs analyseerden we door het uitvoeren van een real-time analyse van het percentage van extracellulaire aanzuring (ECAR) (Figuur 6B). In aanwezigheid van glucose, de glycolytische snelheid van moDCs toegenomen in vergelijking met de basale stadium, metvolwassen moDCs vertonen hoger glycolytische tarief dan onvolwassen moDCs (figuur 6D). Tolerogene en onvolwassen moDCs hadden hogere maximale glycolyse (geïnduceerd door oligomycin in aanwezigheid van glucose) in vergelijking met LPS behandelde moDCs (figuur 6B). De glycolytische capaciteit van tolerogene en onvolwassen moDCs was hoger dan volwassen moDCs (figuur 6E). In tegenstelling tot hun hoge glycolytische tarief, glycolytische reserve was de laagste in de volgroeide moDCs (figuur 6F).
Figuur 1:. Zuivering monocyten uit perifeer bloed (A) 25 ml bloed wordt zorgvuldig laag aangebracht op 15 ml Ficoll per 50 ml tube vóór centrifugatie. PBMC's worden geconcentreerd in een laag onder het plasma na dichtheidscentrifugatie. (B) PBMC geïncubeerd met microkralen die conj ugated menselijke CD14-antilichamen (isotype: muis IgG2a) monoklonale. en vervolgens geladen op een kolom die is geplaatst in het magnetische veld van een Separator om CD14 + monocyten te isoleren Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: morfologische analyse van moDCs. (A) 200 ng / ml GM-CSF en IL-4 wordt toegevoegd aan gezuiverde CD14 + monocyten op dag 0, 4 en 6 onvolgroeide moDCs genereren; en (B) een bijkomende stap van stimulering met 100 nM vitamine D3 en 10 nM dexamethason op dag 5 genereert tolerogene moDCs. Onrijpe moDCs en tolerogene moDCs zijn gestimuleerd met 1 ug / ml LPS op dag 6 genereren (C) mature moDCs en (D) LPS-tolerogene moDCs.TTP's: //www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Surface Marker Karakterisering door Flowcytometrie Expressie niveaus van oppervlaktemerkers HLA-DR, CD80, CD83, CD86, CD11, CD14, BDCA3 en LT3 in tolerogene (groen), LPS-tolerogene (zwart), onrijpe (rood), mature (blauw) moDCs. Isotype controles worden grijs weergegeven. Individuele histogram voor elk type cel is uitgezet met Y-as celgetal tegen X-as log van fluorofoor intensiteit en bedekt. Alle histogrammen zijn representatief voor vier onafhankelijke experimenten. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 juni 2015). Gereproduceerd en gepubliceerd met auteursrechtelijke toestemming. Copyright 2015. De Amerikaanse Vereniging vanImmunologen, Inc. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Functionele karakterisering van moDCs. (A) Kwantificering van alloproliferation frequentie van CD4 + T-cellen geïnduceerd door co-kweek met steeds tolerogene (TOL en groen), LPS-tolerogene (L-TOL, zwart), onrijpe (IMM, rood) en volwassen (MAT ; blauw) moDCs. De gegevens werden verzameld uit vier onafhankelijke experimenten; bedoel + SEM Statistische verschillen tussen alle moDCs versus volwassen moDCs werden geanalyseerd door twee-weg ANOVA met Dunnett meervoudige vergelijking post-test. (B) Cytokine analyse van IFN-Γ (linker paneel), IL-12p40 (middelste paneel) en Il- 10 (rechtervensterl) in supernatanten van alloreactions tussen CD4 + T-cellen co-gekweekt met toenemende aantallen of tolerogene (groen), onrijpe (rood) of volwassen (blauw) moDCs. Gegevens werden verzameld van zes onafhankelijke experimenten; gemiddelde ± SEM (C) CD4 + T-cellen alloproliferation en regulerende T-cellen geïnduceerd door uitbreiding co-cultuur met volwassen moDCs bij aanwezigheid van steeds tolerogene moDCs. Linker Y-as frequentie van CD4 + T-celproliferatie. Rechter Y-as frequentie van CD25 high Foxp3 + cellen gated op proliferatieve CD4 + T-cellen. De gegevens werden verzameld uit drie onafhankelijke experimenten; gemiddelde ± SEM Statistische verschillen tussen aanwezigheid versus afwezigheid van tolerogene moDCs werden geanalyseerd door one-way ANOVA met Dunnett meervoudige vergelijkingstest nameting. (D) CD4 + T-cellen alloproliferation (links) en frequentie van CD25highFoxP3 + cellen (rechts) geïnduceerd door co- cultuur met tolerogene moDCsin de aanwezigheid van toenemende aantallen rijpe moDCs. De gegevens werden verzameld van twee naar drie onafhankelijke experimenten; gemiddelde ± SEM Statistische verschillen tussen de aanwezigheid versus afwezigheid van volwassen moDCs door twee-weg ANOVA werden geanalyseerd met Dunnett meervoudige vergelijking post-test. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 juni 2015). Gereproduceerd en gepubliceerd met auteursrechtelijke toestemming. Copyright 2015. De Amerikaanse Vereniging van immunologen, Inc. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Analyse van mitochondriale activiteit van moDCs. (A) Niveaus van mitochondriale membraanpotentiaal (Red CMXRos) in moDCs werden verkregen door flage cytometrische analyse. De gegevens van vier onafhankelijke experimenten werden samengevoegd. De gemiddelde ± SEM (B) Schematische weergave van een real-time mitochondriale ademhaling. OCR ze vanuit basale ademhaling en na toevoeging van oligomycin (complex V remming), FCCP (maximale ademhaling inductie) en rotenon / antimycin Een mengsel (elektronentransportketen [ETC] inhibitie). De mitochondriale SRC (maximale basale afgetrokken maximale ademhaling) is afgeleid van de OCR kromme. (C) Representatieve kinetisch onderzoek van mitochondria OCR (pmol / min) in tolerogene (TOL, groen), LPS-tolerogene (L-TOL, zwart) , onvolwassen (IMM, rood) en volwassen (MAT, blauw) moDCs door achtereenvolgende toevoeging van oligomycin (Olig), FCCP en rotenon / antimycin A (Rot-AA). (D) OCR kwantificering van basale ademhaling van moDCs en ( E) te sparen respiratoire capaciteit van moDCs. De gegevens werden verzameld van vijf onafhankelijke experimenten. Gemiddelde ± SEM. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 juni 2015). Gereproduceerd en gepubliceerd met auteursrechtelijke toestemming. Copyright 2015. De Amerikaanse Vereniging van immunologen, Inc. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Metabolic Karakterisering van moDCs. (A) Schematische weergave van real-time glycolyse. ECAR obv basale ECAR, waarbij de cellen in glucose-vrij medium, gevolgd door de toevoeging van glucose (glycolyse inductie) geïncubeerd, oligomycin (welke maximale cell glycolyse en complexe V remming induceert) en tenslotte 2-deoxy-D- glucose(Glycolyse remming). Glycolytische rate (glycolyse inductie afgetrokken voor basale ECAR), glycolytische capaciteit (maximale glycolyse afgetrokken voor basale ECAR) en glycolytische reserve (maximale glycolyse afgetrokken voor glycolyse inductie) zijn afgeleid van de ECAR curve. (B) Vertegenwoordiger kinetische studie van de glycolyse-afhankelijke ECAR (mijl / min) in tolerogene (TOL, groen), LPS-tolerogene (L-TOL, zwart), onvolwassen (IMM, rood), en volwassen (MAT, blauw) moDCs door achtereenvolgende toevoeging van glucose (Gluc), oligomycin (Olig), en 2-DG. (C) Bars tonen basale ECAR niveaus (D) glycolytische rate (E) glycolytische capaciteit en glycolytische reserve van moDCs (F). De gegevens werden verzameld uit drie onafhankelijke experimenten; bedoel 6 SEM. Statistische verschillen werden geanalyseerd door one-way ANOVA met Tukey meervoudige vergelijking na de test. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 juni 2015). Gereproduceerd en gepubliceerd met auteursrechtelijke toestemming. Copyright 2015. De Amerikaanse Vereniging van immunologen, Inc. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Dit document beschrijft een methode om te genereren uit monocyten onvolwassen moDCs, tolerogene moDCs en volwassen moDCs. De belangrijke stappen in dit protocol worden in detail besproken in de volgende paragrafen. Het is belangrijk op te merken dat humaan perifeer bloed wordt gebruikt als uitgangsmateriaal in dit protocol en universele voorzorgen in acht menselijk bloed worden toegepast. Hoewel het technisch mogelijk DC uit beenmerg afleiden bij de mens 24, wordt de in vitro DC differentiatie van cellen in perifeer bloed voorkeur vanwege de beschikbaarheid van perifere bloed in vergelijking met beenmerg. Onder de cellen in perifeer bloed, worden hematopoietische CD34 + stamcellen en monocyten gewoonlijk gebruikt voor de in vitro generatie van DCs. CD34 + hematopoietische stamcellen gekweekt met GM-CSF en TNF-α te CD1a + en CD14 + subsets die dan verder worden onderverdeeld in Langerhans leidenachtige cellen en dendritische cellen. Omgekeerd, monocyten gekweekt in GM-CSF en IL-4 tot onrijpe moDCs genereren. Verschillende protocollen gebruikt voor de verrijking van monocyten uit perifeer bloed; bijvoorbeeld door hechting aan plastic schaaltjes, elutriatie en isolatie kits 25, 26 De voordelen van de hechting protocol zijn minimale schade aan cellen en relatief kosteneffectief echter cel zuiverheid kan worden ondermijnd.; en een extra stap nodig is om de cellen los voor verdere experimenten. Elutriatie is een techniek die cellen op basis van hun grootte en dichtheid scheidt. De voordelen van elutriatie zijn levensvatbaarheid van de cellen en monocyten kunnen gemakkelijk worden gebruikt voor verdere experimenten; Maar deze techniek wordt beperkt door de beschikbaarheid van een afslibinrichting en het onvermogen om verschillende populaties van cellen (T-cellen en monocyten) met gelijke sedimentatie parameters scheiden. In de handel verkrijgbare isolatie kits gebruik maken van magnetische microbolletjes om ofwel kiezen positief ofnegatief selecteert u de monocytische bevolking. Sommige protocollen zijn vooral gericht op monocyten isolatie met behulp van de negatieve selectie zoals het geïsoleerde monocyten "onaangeroerd" (niet gebonden door markers of microbolletjes) blijven. In dit protocol werden CD14 beads gebruikt om positieve selecteren humane monocyten uit PBMC. CD14 ontbreekt een cytoplasmatisch domein en de binding van antilichaam aan CD14 leidt niet tot signaaltransductie. Bovendien zal de microkralen losmaken van monocyten na kweken en dus niet het differentiatieproces belemmeren. Bovendien is CD14 sterk tot expressie gebracht op de meeste monocyten en zwak op neutrofielen en sommige myeloïde dendritische cellen, vandaar deze isolatiemethode tot hogere cel zuiverheid dan de andere methoden 17.
Bloedmonocyten kunnen worden onderscheiden in DCs of macrofagen en het lot van monocyten sterk afhankelijk van de cytokine milieu. In dit artikel worden moDCs gegenereerd door toevoeging van granulocyt-macrofaag-koloniestimulerende factor (GM-CSF) En interleukine 4 (IL-4) menselijke perifere bloedmonocyten. GM-CSF is vereist voor monocyten overleving en IL-4 oefent een remmende werking op macrofaag differentiatie; en combinatoriële toevoeging van GM-SCSF en IL-4 op monocyten leveren een hoger percentage onrijpe moDCs vergelijking met individuele cytokine 27. Er zijn andere protocols die moDCs genereren door het toevoegen van tumornecrosefactor alfa (TNF-α), interferon alfa (IFN-α) en interleukine 13 (IL-13) perifere bloedmonocyten 28, 29, 30. De combinatie van GM-CSF en IL-4 werd geoptimaliseerd in de jaren 1990 en nu een geaccepteerd protocol dat plastic onrijpe DCs gedifferentieerd in immunogene of tolerogene moDCs en gepolariseerd in Th1, Th2 of Th17 bevorderen moDCs genereert.
Onrijpe moDCs worden onderverdeeld in tolerogene moDCs door toevoeging van vitamine D3 en dexamethason. Er zijn verschillende protocollen tolerogene DCs bijvoorbeeld genereren, vianuclear factor-kappa B (NF-kB) remming, β-catenine activering, vitamine D3, Dexamethason en Rapamycine 31, 32, 33, 34, 35, 9, 36, 37. Hoewel zowel vitamine D3 en dexamethason alleen gemeld een tolerogene effect op DCs, de combinatie van vitamine D3 en dexamethason leiden tot een mate onderdrukt alloproliferation dan wanneer afzonderlijke geneesmiddelen worden gebruikt induceren. Hiervoor wordt het bestaande protocol voor het genereren van tolerogene DC's werd gemodificeerd om een combinatie van vitamine D3 en dexamethason. Deze werkwijze wordt momenteel als een model voor humane tolerogene DCs met een therapeutisch nut geaccepteerd. Het is ook belangrijk op te merken dat de gereconstitueerde vitamine D3 en dexamethason hebben een korte houdbaarheid.
In dit protocol Lipopolysacchariden (LPS) werd toegevoegd als een DC rijping inductor. Onrijpe moDCs kan ook veroorzaakt worden om rijping met behulp van pro-inflammatoire cocktail:(TNF-α), interleukine 1 bèta (IL-1β), interleukine 6 (IL-6) en prostaglandine E2) of pro-inflammatoire cytokinen (TNF-α en interferon gamma (IFN-Γ)). Pro-inflammatoire cocktail genereert volwassen moDCs met een hoge co-stimulerende en trekkende functies, maar ze produceren relatief lage niveaus van IL-12 38. TNF-α of IFN-Γ alleen niet in staat om een stabiele dendritische fenotype 39 induceren. LPS stimuleert Toll-like receptor 4 (TLR4), medieert de activering van NF-kB en mitogeen geactiveerde eiwitkinasen (MAPK's) naar DC rijping te induceren. DC rijping geïnduceerd door LPS toont een opregulatie van DC rijping merkers (CD83, CD86, HLA-DR) en leidde tot de productie van IL-12p70. Bovendien kan deze verder worden gemodificeerd LPS met TLR3 agonisten paren met rijpe DC voor klinische kanker vaccins. In dit artikel worden tolerogene DCs getoond resistent tegen rijping na LPS behandeling. Deze semi-rijpe achtige DCs zijn niet immunogeen is en niet release pro-inflammatoire cytokines 40.
De beperkingen van dit protocol liggen in het differentiatieproces. Het proces duurt 8 dagen vanaf dag 0 tot dag 7 die een probleem worden aangepast in high throughput analyse vormt. Wijziging van het protocol is vereist om de differentiatie te verkorten nog op grote aantallen levensvatbare DCs in de verschillende staten. Ten tweede worden de DCs gegenereerd door toevoeging van cytokinen in dit protocol en deze cytokinen niet DC populatie in stand gedurende langere tijd. Bovendien zijn cytokinen in concentraties veel hoger dan in vivo en kan leiden tot vertekende ontwikkeling van paden die niet fysiologisch identiek in vivo DCs. Bijvoorbeeld in vitro kweken van DC precursoren is aangetoond reactie op GM-CSF, die niet essentieel voor normale cytokine DC differentiatie in vivo 41. Niettemin kan cytokinestimulatie een bruikbare methode genwaardeert grote aantallen DC in vitro experimenten. Het vermogen om deze cellen gegenereerd uit dit protocol andere analyses zoals immunofluorescentie kleuring onderworpen, flowcytometrie, allo reactiestudies en metabole studies verhoogt de bruikbaarheid van deze methode. Deze in vitro DCs dienen als een goed model om de kennis van DC ontwikkeling, rijping en antigeenpresentatie die voorheen moeilijk te maken met de zeldzame aantallen DCs in vivo te verbeteren.
DCs vermogen van immunologische tolerantie tegen immuniteit reguleren daardoor aantrekkelijk kandidaten therapieën tegen kanker en auto-immuunziekten 42, 43, 44, 45. Immunogene DC gegenereerd in dit protocol kan worden gebruikt voor vaccinatie werkzaamheid tegen infectieziekten en tumoren te verbeteren; terwijl tolerogene DCs kan worden gebruikt om ongewenste T-cel responsen te controleren en afstoting na transplantatie te voorkomen. de ingewikkeldebalans tussen immuniteit en tolerantie is afhankelijk enorm op DC differentiatie status. DC differentiatie is een gecoördineerd cellulaire programma dat wordt beheerst door meerdere signaalwegen en metabolisme. Verschillende differentiatie staten van DC verschillen in bio-energetische en biosynthese behoeften; bijvoorbeeld geactiveerde DCs vereisen meer energie metabole aanpassingen belangrijk voor de overleving en migratie in vergelijking met DC's in rusttoestand. Het is belangrijk op te merken dat vitamine D3, dexamethason en rapamycine zijn bekend om hun vermogen om tolerogene DCs induceren, zijn beschreven DC metabolisme beïnvloeden. In deze paper, de energieke metabolisme van moDCs uit verschillende differentiatie staten werden gekarakteriseerd met behulp van extracellulaire flux analyzers en tolerogene moDCs tentoongesteld de hoogste metabole plasticiteit en LPS-geïnduceerde rijping daalde deze plasticiteit. Anabole stofwisseling ondersteunt DC rijping terwijl katabole metabolisme invloeden tolerogene DC functioneert 46. de DCSgegenereerd uit dit protocol kan worden beoordeeld of het veranderen van de metabole toestand van DCs de sleutel tot het wijzigen immuniteit en tolerantie in therapeutica. Tot slot, presenteerden we een protocol voor het genereren van onvolwassen, tolerogene en volwassen moDCs van cruciaal belang voor het bestuderen van immuunregulatorische functies DC's '.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Agentschap voor Wetenschap, Technologie en Reasearch basisfinanciering (tot JEC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | PBMC isolation |
| Syringe | Becton, Dickinson | 302832 | PBMC isolation |
| 1.5 ml centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | PBMC isolation |
| 15 ml falcon tube | Falcon | 352096 | PBMC isolation |
| 50 ml falcon tube | Falcon | 352070 | PBMC isolation |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | PBMC isolation |
| 0.2 µm filter | Sartorius stedim biotech | 17597 | PBMC isolation |
| MACs kit | Miltenyi biotec | 130-042-201 | Monocyte enrichment |
| MiniMACS Separator | Miltenyi biotec | 130-042-102 | Monocyte enrichment |
| Cell culture grade water | Invitrogen, Life Technologies | Cell culture | |
| RPMI | Gibco, Life Technologies | 11875-093 | Cell culture |
| FBS | Hyclone | SH30070103 | Cell culture |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140 | Cell culture |
| Phosphate Buffered Saline |
Gibco, Life Technologies | 10010-031 | Cell culture |
| NEAA | Gibco, Life Technologies | 11140-040 | Cell culture |
| EDTA | Gibco, Life Technologies | 15575 | Cell culture |
| HEPES | Gibco, Life Technologies | 15630-080 | Cell culture |
| Sodium Pyruvate | Gibco, Life Technologies | 11360-070 | Cell culture |
| GM-CSF | Miltenyi biotec | 130-093-868 | Cell culture |
| IL-4 | Miltenyi biotec | 130-093-924 | Cell culture |
| Vitamin D3 | Sigma | D1530 | Cell culture |
| Dexamethasone | Sigma | D2915 | Cell culture |
| LPS | Sigma | l2755 | Cell culture |
| trypan blue | Gibco, Life Technologies | 15250-061 | Cell culture |
| PerCP-conjugated HLADR | BioLegend | 307628 | Cytometry |
| PE-conjugated CD80 | BD Biosciences | 557227 | Cytometry |
| PE-conjugated CD83 | BD Biosciences | 556855 | Cytometry |
| PE-conjugated CD86 | BD Biosciences | 555665 | Cytometry |
| APC-conjugated CD11c | BD Biosciences | 340544 | Cytometry |
| PE-conjugated CD14 | Miltenyi biotec | 130-091-242 | Cytometry |
| PE-conjugated BDCA3 | Miltenyi biotec | 130-090-514 | Cytometry |
| APC-conjugated ILT3 | eBioscience | 12-5139-73 | Cytometry |
| Isotype matched PerCP- conjugated Mab |
BioLegend | 400250 | Cytometry |
| Isotype matched PE- conjugated Mab |
Miltenyi biotec | 130-091-835 | Cytometry |
| Isotype matched APC- conjugated Mab |
Miltenyi biotec | 130-091-836 | Cytometry |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Pharmingen | BD LSR II | Cytometry |
| cytofix/cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Cytometry |
| APC/CY7-conjugated CD25 | BD pharmingen | 557753 | Cytometry |
| PE/CY7-conjugated CD4 | Biolegend | 300512 | Cytometry |
| PerCP-conjugated CD3 | Biolegend | 300428 | Cytometry |
| EasySep Human CD4+ T cell enrichment kit | STEMCELL Technologies | 19052 | Alloreaction study |
| EasySep magnet | STEMCELL Technologies | 18000 | Alloreaction study |
| Cell Trace CFSE cell proliferation kit | Molecular probes | C34554 | Alloreaction study |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14025092 | Alloreaction study |
| Alexa Fluor 647-conjugated FoxP3 | BD Biosciences | 560889 | |
| Milliplex MAP Human Cytokine/Chemokine magnetic bead panel |
Millipore | HCYTOMAG-60K | Cytokine analysis |
| 5 ml Polystyrene tube | Falcon | 352058 | Cytokine analysis |
| Luminex Sheath Fluid | Millipore | SHEATHFLUID | Cytokine analysis |
| FLEXMAP 3D system with xPONENT software | Luminex Corporation | FLEXMAP 3D | Cytokine analysis |
| MitoTracker Red CMXRos | Cell Signalling | 9082 | Mitochondrial activity |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | Mitochondrial activity |
| XF Assay Medium (OCR) | Seahorse Bioscience | 102352-000 | Metabolic adaptation |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | Metabolic adaptation |
| XF Base Medium (ECAR) | Seahorse Bioscience | 102353-100 | Metabolic adaptation |
| L-glutamine | Gibco, Life Technologies | 25030-081 | Metabolic adaptation |
| Calibrant | Seahorse Bioscience | 100840-000 | Metabolic adaptation |
| XF Cell Mito Stress kit | Seahorse Bioscience | 103015-100 | Metabolic adaptation |
| XF Glycolysis Stress kit | Seahorse Bioscience | 103020-100 | Metabolic adaptation |
| Seahorse | Seahorse Bioscience | XFe96 | Metabolic adaptation |
References
- Jolles, S. Paul Langerhans. J Clin Pathol. 55 (4), 243-24 (2002).
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
- Steinman, R. M., Swanson, J. The endocytic activity of dendritic cells. J Exp Med. 182 (2), 283-288 (1995).
- Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
- Mueller, D. L. Mechanisms maintaining peripheral tolerance. Nat Immunol. 11 (1), 21-27 (2010).
- Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
- Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
- Paavonen, J., Lehtinen, M. Interactions between human papillomavirus and other sexually transmitted agents in the etiology of cervical cancer. Curr Opin Infect Dis. 12 (1), 67-71 (1999).
- Ohtani, M., et al. Mammalian target of rapamycin and glycogen synthase kinase 3 differentially regulate lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production in dendritic cells. Blood. 112 (3), 635-643 (2008).
- Wilde, B., et al. Dendritic cells in renal biopsies of patients with ANCA-associated vasculitis. Nephrol Dial Transplant. 24 (7), 2151-2156 (2009).
- Al-Hello, H., et al. An enterovirus strain isolated from diabetic child belongs to a genetic subcluster of echovirus 11, but is also neutralised with monotypic antisera to coxsackievirus A9. J Gen Virol. 89, 1949-1959 (2008).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), 74-80 (2010).
- Osugi, Y., Vuckovic, S., Hart, D. N. Myeloid blood CD11c(+) dendritic cells and monocyte-derived dendritic cells differ in their ability to stimulate T lymphocytes. Blood. 100 (8), 2858-2866 (2002).
- Reynolds, G., Haniffa, M. Human and Mouse Mononuclear Phagocyte Networks: A Tale of Two Species. Front Immunol. 6, (2015).
- Jefford, M., et al. Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli. Blood. 102 (5), 1753-1763 (2003).
- Menck, K., et al. Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags. J Vis Exp. (91), (2014).
- Zhou, L., et al. Impact of human granulocyte and monocyte isolation procedures on functional studies. Clin Vaccine Immunol. 19 (7), 1065-1074 (2012).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Faresjo, M. A useful guide for analysis of immune markers by fluorochrome (Luminex) technique. Methods Mol Biol. 1172, 87-96 (2014).
- Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. J Vis Exp. (65), (2012).
- Defawe, O. D., et al. Optimization and qualification of a multiplex bead array to assess cytokine and chemokine production by vaccine-specific cells. J Immunol Methods. 382 (1-2), 117-128 (2012).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. (46), (2010).
- Chunharas, A., Pabunruang, W., Hongeng, S. Congenital self-healing Langerhans cell histiocytosis with pulmonary involvement: spontaneous regression. J Med Assoc Thai. 85, 1309-1313 (2002).
- Bai, L., Feuerer, M., Beckhove, P., Umansky, V., Schirrmacher, V. Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells. Int J Oncol. 20 (2), 247-253 (2002).
- Felzmann, T., et al. Monocyte enrichment from leukapharesis products for the generation of DCs by plastic adherence, or by positive or negative selection. Cytotherapy. 5 (5), 391-398 (2003).
- Berger, T. G., et al. Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra) for clinical-scale generation of dendritic cells. J Immunol Methods. 298 (1-2), 1-2 (2005).
- Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
- Pace, S. T., Gelman, B. B., Wong, B. R. Primary Langerhans cell histiocytosis of the lacrimal gland in an adult. Can J Ophthalmol. 50 (3), 40-43 (2015).
- Ravanfar, P., Wallace, J. S., Pace, N. C. Diaper dermatitis: a review and update. Curr Opin Pediatr. 24 (4), 472-479 (2012).
- Gebhardt, C., et al. A case of cutaneous Rosai-Dorfman disease refractory to imatinib therapy. Arch Dermatol. 145 (5), 571-574 (2009).
- Vazquez, P., Robles, A. M., de Pablo, F., Hernandez-Sanchez, C. Non-neural tyrosine hydroxylase, via modulation of endocrine pancreatic precursors, is required for normal development of beta cells in the mouse pancreas. Diabetologia. 57 (11), 2339-2347 (2014).
- Pellacani, G., et al. Distinct melanoma types based on reflectance confocal microscopy. Exp Dermatol. 23 (6), 414-418 (2014).
- Shi, Y., et al. Hepatic involvement of Langerhans cell histiocytosis in children--imaging findings of computed tomography, magnetic resonance imaging and magnetic resonance cholangiopancreatography. Pediatr Radiol. 44 (6), 713-718 (2014).
- Haustein, M., Terai, N., Pablik, J., Pillunat, L. E., Sommer, F. Therapy-resistant swelling of the upper eyelid in childhood. Ophthalmologe. 111 (1), 53-57 (2014).
- Haidinger, M., et al. A versatile role of mammalian target of rapamycin in human dendritic cell function and differentiation. J Immunol. 185 (7), 3919-3931 (2010).
- Macedo, C., Turquist, H., Metes, D., Thomson, A. W. Immunoregulatory properties of rapamycin-conditioned monocyte-derived dendritic cells and their role in transplantation. Transplant Res. 1 (1), 16 (2012).
- Fischer, R., Turnquist, H. R., Taner, T., Thomson, A. W. Use of rapamycin in the induction of tolerogenic dendritic cells. Handb Exp Pharmacol. 188 (188), 215-232 (2009).
- Nicolette, C. A., et al. Dendritic cells for active immunotherapy: optimizing design and manufacture in order to develop commercially and clinically viable products. Vaccine. 25, 47-60 (2007).
- Han, T. H., et al. Evaluation of 3 clinical dendritic cell maturation protocols containing lipopolysaccharide and interferon-gamma. J Immunother. 32 (4), 399-407 (2009).
- Paananen, A., et al. Molecular and biological analysis of echovirus 9 strain isolated from a diabetic child. J Med Virol. 69 (4), 529-537 (2003).
- HC, O. N., Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
- Mest, H. J., et al. Glucose-induced insulin secretion is potentiated by a new imidazoline compound. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 364 (1), 47-52 (2001).
- Puc, J., et al. Mitochondrial activity after cold preservation of pancreatic islet cells treated with pefloxacin (PFX). Ann Transplant. 3 (1), 38-41 (1998).
- Alarcon, C., Serna, J., Perez-Villamil, B., de Pablo, F. Synthesis and differentially regulated processing of proinsulin in developing chick pancreas, liver and neuroretina. FEBS Letters. 436 (3), 361-366 (1998).
- Jekunen, A. P., Kairemo, K. J., Paavonen, T. Imaging of Hand-Schuller-Christian syndrome by a monoclonal antibody. Clin Nucl Med. 22 (11), 771-774 (1997).
- Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nat Rev Immunol. 15 (1), 18-29 (2015).
