Abstract
תוצאות תגובה חיסוניות של יחסי גומלין מורכבים בין מערכת החיסון המולדת הלא-specific antigen והמערכת החיסונית אדפטיבית אנטיגן ספציפי. המערכת החיסונית היא איזון מתמיד בשמירה סבילה מולקולות עצמיות ותגובה במהירות לפתוגנים. תאי דנדריטים (DCS) הם תאי מציגי אנטיגן מקצועיים חזקים מקשרים מערכת החיסון המולדת למערכת חיסון אדפטיבית ולאזן את התגובה מסתגלת בין העצמי שאינו עצמי. בהתאם אותות התבגרות, תאים דנדריטים בשלים יכול להיות מגורה באופן סלקטיבי להתמיין DCs immunogenic או tolerogenic. תאי דנדריטים immunogenic לספק אותות התפשטות לתאי T אנטיגן ספציפי עבור שיבוטים; תוך התאים הדנדריטים tolerogenic להסדיר סובלנות על ידי אנטיגן ספציפי T-cell המחיקה או הרחבת המשובטים של תאי T רגולטוריים. בשל מאפיין ייחודי זה, תאים הדנדריטים הם בקשו במיוחד לאחר סוכנים טיפוליים כמו לסרטן dise אוטואימוניותases. תאים דנדריטים ניתן לטעון עם אנטיגנים ספציפיים במבחנה מוזרק לגוף האדם לעלות תגובה חיסונית ספציפית הן immunogenic ו tolerogenic. עבודה זו מציגה אמצעי ליצירת במבחנה מן מונוציטים, תאים דנדריטים בשלים נגזר מונוציטים (moDCs), tolerogenic ו moDCs בוגרת, הנבדלים זה מזה ביטוי סמן פני השטח, פונקציה פנוטיפים מטבוליים.
Introduction
DC תוארה לראשונה על ידי פול לנגרהנס (תאי לנגרהנס) במאה התשע עשרה אשר בסימוכין ידי Jolles 1 ומאופיינת ראלף שטיינמן זנוויל כהן בשנת 1973 שזיהו אותם מציגי אנטיגן מקצועיים תאים 2. DCs נמצא בדם היקפי וברוב הרקמות של הגוף, במיוחד בשפע ברקמות חשופות לסביבה החיצונית כמו העור (בהווה כתאים לנגרהנס) ובסופו של רפידות האף, הריאות, הקיבה והמעיים המאפשרות אותם נתקלים אנטיגנים חיצוניים. יש בשלה DCs יכולת endocytic אך יכולת נמוכה יחסית כדי לעורר תאי T 3. בשלה DCs לבטא קולטנים זיהוי דפוסים שונים (PRRs) כי דפוסים מולקולריים ללכוד קשור הפתוגן (PAMPs) או דפוסים מולקולריים הקשורים ניזק (damps) 4. אותות סכנה הפעילו לנהוג הבשלה לקראת DCs immunogenic בעוד מולקולות עצמיות לגרום unresponsivene תא Tss אפופטוזיס 5. DCs immunogenic מאופיין גברת הביטוי של מולקולות MHC ומולקולות משטח שיתוף גירוי ויכולתי תאי T נאיביים ממשלת 6,7.
בשלה DCs ניתן גם התבגר כלפי מדינה Treg וישכנע או tolerogenic בתגובה 1a המטבוליט ויטמין D3, 25 (O) 2 D 3 וסוכני אימונוסופרסיבי מסוימים כמו Interleukin-10 (IL-10), dexamethasone ו Rapamycin 8-9. DCs Tolerogenic מאופיין ביטוי immunoreceptor שלהם טירוזין מבוסס מוטיבים מעכבים (ITIMs) המכילים קולטנים ligands שטח. התמרה האות של ITIMs המכילים בני משפחה ILT, ILT3 ו ILT4 ב DCs tolerogenic לעכב alloproliferation ולנסוע Foxp3 + Treg הרחבת 10,11. תכונות ייחודיות אלה של DCs tolerogenic להוביל העצמה העמוקה שלהם in vivo, כלומר את יכולתו להשפיע על סובלנות עמידה שתלי אלוגנאית מושתלי supprESS להתפתחותן של מחלות אוטואימוניות. Tolerogenic DCs ניתן לראות אפוא כמו תת-סוג של DCs בוגרת מקוטב שבו לתפקד בלימת אקטיבציה החיסונית.
נכון לעכשיו, יש שני תת הכללי של תאים דנדריטים בדם ההיקפי האנושי: DCS plasmacytoid ו DCs מיאלואידית 12. DCs במחזור הם המהווים נדירים פחות מ -2% של לויקוציטים בדם אנושי וזה מהווה קושי לבידודה של מספר מתאים של DCs ללמוד פונקציות immunoregulatory שלהם. כדי להתגבר על בעיה זו, DCS בדיל מונוציטים משמש מודל במבחנה לחקר תפקוד תאים דנדריטים. יש DCs במבחנה אלה קולטנים פונקציות דומות לעומת in vivo DCs. השוואה מפורטת של in vivo DCS ו ב DCs נגזר מונוציטים שנוצר במבחנה (moDCs) נחקרות על ידי מעבדות אחרות 13, 14, 15. הוא דיווח גם כי moDCs ו- CD1c + DCs היו מקביל ב אנטיגן בהצגת גרימת תפקוד תא T 15.
במאמר זה, אנו מתארים שיטה להפקת moDCs בשלה מן מונוציטים בדם ההיקפי ולאחר מכן הבחנה אותם DCs immunogenic ו tolerogenic. מונוציטים נגזרים אלה תאים דנדריטים (moDCs) מאופיינים סמני פני השטח שלהם, פרופיל ציטוקינים, פונקציות immunoregulatory ומדינות מטבולית. תאים דנדריטים immunogenic ו tolerogenic לייצר ציטוקינים שונים אשר לגרום להתרחבות או של תאי T אלוגנאית או תאי T רגולטוריים. במאמר זה, פרופיל ציטוקינים מבוצע עם מערכות בטכנולוגיית זמנית. מדיום של תאי צמיחה מודגרת עם חרוזים בצבעים משותק נוגדן ולקרוא מנתח קומפקטי. מדינות מטבולית של DCs מנותחות באמצעות מנתחי שטף תאיים המודדים שיעור צריכת חמצן, אינדיקטור נשימה תאית, וקצב החמצה תאי משקף glycolyticשטף בתאים דנדריטיים. מדידת שיעורי bioenergetics אלה מספקת אמצעי כדי לעקוב אחר השינויים המטבוליזם תאי שחיוניים בפיתוח תאים דנדריטים ותפקוד.
Protocol
מחקר זה אושר על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי (NUS-IRB 10-250).
1. ניתוק של תאי הדם ההיקפי mononuclear (PBMCs)
- הכנת המגיב
- כן PBS / EDTA: תמיסת מלח שנאגר פוספט (PBS) וכן להשלים עם 2 מ"מ חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA). לעקר את הפתרון הזה על ידי סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. הערה לאחסן PBS / EDTA על 4 מעלות צלזיוס וחם לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
- הכן חיץ מכתים: תמיסת מלח שנאגרו-פוספט (PBS) תוספת עם 2% בסרום שור העובר (FBS), 10 מ"מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) ו -2 מ"מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA). לעקר את הפתרון הזה על ידי סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר.
- איסוף דם מדם קונוס
הערה: חרוט הדם מכיל רכיבים תאי הדם הלבנים שנאספו לאחר הצלחתletpheresis מבית החולים. אם הדם נאסף צינורות הפרין או EDTA, לדלל דם עם PBS ב 1: 1 יחס והמשך לשלב 1.3; אם המעיל באפי מתקבל, לדלל את המעיל באפי עם PBS ב 1: 2 יחס והמשך לשלב 1.3.- חותכים את שני הקצוות של חרוט כדי לאפשר לדם לזרום החוצה לתוך צינור 50 מ"ל. שים לב החרוט מכיל בדרך כלל 10 מיליליטר של דם.
- השתמש מזרק בקצה הקהה המכיל 30 מ"ל של EDTA PBS / לשטוף את חרוט ולאסוף בתוך שפופרת 50 מ"ל.
- לדלל דם נוספת עם PBS / EDTA לנפח סופי של 80 מ"ל.
- בידוד של PBMCs לפי צפיפות צנטריפוגה 16
- Aliquot 15 מ"ל Ficoll כל 4 צינורות טרי 50 מ"ל.
- השתמש pipet 25 מ"ל סרולוגיות להוסיף 20 מ"ל של דם מדולל מעל שכבת Ficoll. שימו לב להחזיק את שפופרת 50 מ"ל בזווית של 45 ולדאוג לא להפריע הביניים.
- צנטריפוגה צינורות ב 805 XG ללא בלמים למשך 30 דקות, 20 ° C.
- הסר אתשכבת פלזמה לאסוף את הטבעת של PBMCs השוכנים ממש מתחת לשכבת פלזמה עם pipet פסטר. שלב ארבעה צינורות של PBMCs לשתי צינורות 50 מ"ל. הערה כדי למנוע איסוף השכבה השקופה מתחת PBMCs.
- להוסיף PBS / EDTA לנפח סופי של 50 מ"ל לכל צינור של PBMCs צנטריפוגות ב 548 XG עם הבלמים למשך 10 דקות, 20 ° C.
- לשאוב supernatant ו resuspend גלולה בצינור אחד עם 25 מ"ל של חיץ מכתים ולשלב לתוך צינור אחד 50 מ"ל.
- צנטריפוגה ב 367 XG עם הבלמים למשך 5 דקות, 4 ° C.
- לשאוב supernatant ו resuspend גלולה עם 10 מ"ל של חיץ מכתים.
2. עשרת מונוציטים ידי פרדה מגנטית 17
- לקבוע מספר סלולרי
- קח 20 μl של השעיה תא PBMC ומערבבים עם 20 μl של trypan כחול לספור את מספר תאים חיים באמצעות cytometer.
- השעית תא צנטריפוגה ב 367 XG עם בלמיםבמשך 10 דקות, 4 ° C.
- תא גלול לשאוב supernatant לחלוטין resuspend לריכוז של 10 7 תאים לכל 80 μl של חיץ מכתים.
- תיוג מגנטי
- הוסף 20 μl של microbeads CD14 לכל 10 7 תאים, מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות ב 2 - C ° 8.
- שטפו תאים על ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ מכתים לכל 10 7 תאים צנטריפוגות ב 367 XG עם הבלמים למשך 10 דק ', 4 ° C.
- תא גלול לשאוב supernatant לחלוטין resuspend בריכוז של 10 7 תאים לכל 50 μl של חיץ מכתים.
- פרדה מגנטית
- השתמש בעמודה בגודל בינוני לכל היותר 2 x 10 8 תאים בסך הכל.
הערה: בחר עמודה מפרידה המתאים על פי מספר התאים הכולל ומספר תאי CD14 + מומלצי הגיליון. - מקום עמודת O את השדה המגנטיfa מפריד מתאים ולהכין עמודה על ידי שטיפה עם 500 μl של חיץ מכתים.
- השעית תא פיפטה על עמודה ולאסוף תאים ללא תווית עובר בעמודה עם צינור 15 מיליליטר.
- החלף שפופרת 15 מ"ל חדש תחת העמודה ולשטוף טור 3 פעמים עם 500 μl של חיץ מכתים. ודא מאגר העמודה ריק לפני הוספת חיץ מכתים חדש בין השוטף.
- סור עמודה מן המפריד ומניח אותו על צינור 15 מיליליטר טרי.
- פיפטה 1 מ"ל של חיץ מכתים על הטור. מיד לשטוף את התאים שכותרתו מגנטית על ידי לחיצה על הבוכנה בתקיפות (המסופק בערכה) לתוך הטור.
- חזור על שלבים 2.3.2 עד 2.3.6 באמצעות חלק eluted על עמודה חדשה להגדיל את הטוהר של CD14 + תאים. ראוי לציין, כי החרוזים ישוחררו מהתאים אוטומטיים בתרבות במהלך שלב 3.2.
- השתמש בעמודה בגודל בינוני לכל היותר 2 x 10 8 תאים בסך הכל.
בידול 3. של תאים דנדריטים כדי הפעלה שונה Sטאטעס
- הכנת מגיב (אנדוטוקסינים רמה צריך להיות פחות מ 0.1 מ"ל / האיחוד האירופי בכל ריאגנטים)
- הכן בינוני תרבית תאים: RPMI 1640 בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS), 1% שאינם חיוניים חומצות אמינו (NEAA) ו 0.05 מ"מ 2-mercaptoethanol (2ME). לעקר את הפתרון הזה על ידי סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר.
- כן ציטוקינים: לשקם IL-4 ו- GM-CSF במי כיתת תא-תרבות לריכוז של 0.25 מ"ג / מיליליטר בהתאמה בתנאי aseptic. ציטוקינים Aliquot לתוך 200 צינורות microcentrifuge μl ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
- כן מלאה ויטמין D3: לשקם ויטמין D3 במי כיתת תא-תרבות לריכוז של 100 מ"מימ בתנאי aseptic. ויטמין D3 Aliquot לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C.
- כן מניות dexamethasone: לשקם dexamethasone במי כיתת תא-תרבות לריכוז של 10 מ"מימ בתנאי aseptic. aliquot dexamethasone לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C.
- הכן LPS: לשקם lipopolysaccharides (LPS) במים כיתה תא-תרבות לריכוז של 1 מ"ג / מ"ל בתנאים aseptic. LPS Aliquot לתוך צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge וחנות ב -20 ° C.
- יצירת moDCs השונה
- Seed 4 סטים של CD14 + מונוציטים בריכוז של 0.3 - 0.5 x 10 6 / מ"ל של מדיום תרבית תאים בתוספת 200 ng / ml של GM-CSF ו -200 ng / ml IL-4 ב 6 צלחות היטב. שים לב כי זוהי יום 0 ואת נפח בינוני בכל טוב 6 הוא 2 מ"ל.
- דגירה תאים בתרבית רקמה החממה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
- הסר 850 μl של המדיום מתרבות ב יום 4 ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות, 4 ° C. לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של מדיום תרבית תאים המכיל 2x של (200 ng / ml של GM-CSF ו -200 ng / ml IL-4). להוסיף תערובת התא הזה בחזרהלתרבות. שים לב ריכוז 2x מוסף GM-CSF ו- IL-4 יהפוך 1x כאשר 1 מ"ל של המדיום הוא הוסיף בחזרה לתוך התרבות.
- הוסף 1 μl של ויטמין D3 המניות 1μl של המניה dexamethasone לכל מ"ל של מדיום לשני סטים ביום 5 ליצור moDCs tolerogenic. ראוי לציין, כי הריכוז הסופי של ויטמין D3 הוא 100 ננומטר ו dexamethasone הוא 10 ננומטר; תוספת של GM-CSF ו- IL-4 אינו נדרש ביום 5.
- הוספת 200 ng / ml של GM-CSF ו -200 ng / ml IL-4 לכל הסטים ביום 6.
- הוסף 1 מיקרוגרם / מ"ל של LPS לאחד קבוצות שטופלו רק GM-CSF ו- IL-4 ב יום 6 כדי ליצור moDCs בוגרת.
- הוסף 1 מיקרוגרם / מ"ל של LPS למערכת אחת של moDCs tolerogenic ב יום 6 כדי ליצור moDCs LPS-tolerogenic.
- קציר את הסוגים השונים של moDCs ב יום 7 על ידי שטיפת צלחת תרבות עם PBS, EDTA עבור cytometry זרימה או מחקרים אחרים. שים לב שאינו חסידים תאים רק נקצרים. שים לב כי תשואת אחוז מן CD14 + monocytes עבור moDCs בשלה, moDCs הבוגרת, moDCs tolerogenic ו DCS-tolerogenic LPS הם כ -90%, 50%, 60% ו -60% בהתאמה ומשתנה בין תורמי דם הרבה FBS.
4. Cytometry זרימה
- אפיון מרקר פני התא על moDCs
- ניתוק התאים מצלחת התרבות ידי pipetting. שוטפים את התאים פעם עם PBS / EDTA ותאי resuspend בריכוז של 5 x 10 5 תאים לכל 50 μl של חיץ מכתים בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
- דגירה 0.5 x 10 6 aliquots תא עם HLADR PerCP מצומדות (1: 100), CD80 מצומדות PE (1:50), CD83 PE מצומדות (01:25), PE מצומדות CD86 (1:50), APC- CD11c מצומדות (1:50), CD14 מצומדות PE (1:50) ו BDCA3 PE מצומדות (1:50) ו APC מצומדות ILT3 (1:25) בחושך במשך 30 דקות ב 4 °. אלוטיפ בהתאמה PerCP מצומדות MAb (1:20), PE מצומדות MAb (1:11), APC מצומדות MAb (1:11) ישמש שולטת שלילית.
- לזהות את רמות הביטוי של סמני המשטח באמצעות cytometer זרימה 18.
- ניתוח של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריה של moDCs
- הכן פתרון המניות של 1 מ"מ האדום Chloromethyl-X-rosamine (CMXRos) על ידי הוספת 94.1 μl של sulfoxide דימתיל (DMSO) לכל 50 מיקרוגרם של CMXRos האדום lyophilized.
- דגירה 2 x 10 5 moDCs עם 100 ננומטר האדום CMXRos ב 1 מ"ל של תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS) למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס 15 מ"ל צינור.
- הוסף 2 מ"ל של PBS / EDTA לתאים צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות, בטמפרטורת החדר. חזור על 2 פעמים. לשאוב supernatant ו resuspend תא גלולה ב 300 μl של PBS, EDTA, 2% FCS עבור ניתוח תזרים cytometry. שימו לב לשימוש בערוץ PE לנתח האות האדום CMXRos.
- אפיון מרקר של תאי- T
- דגירה 50 μl של 1.2 x 10 6 CFSE שכותרתו allo-תאי T מסוג CD4 + (המופקצעד 5.6) עם CD3 PerCP מצומדות (1: 200), CD4 PE / Cy7 מצומדות (1: 400) ו CD25 APC / Cy7 מצומדות (1: 100) בחושך במשך 30 דקות ב 4 °. כתם מתאי T באמצעות ערכה מסחרית עם Foxp3-Alexa פלואוריד 647 (1:50) בחושך במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
5. מחקרים Alloreaction
- כן פתרון מניות 5 מ"מ של אסתר carboxyfluorescein succinimidyl (CFSE) על ידי הוספת 18 μl של DMSO כדי lyophilized CFSE, על פי הפרוטוקול של היצרן.
- לטהר CD4 + T-תאי PBMCs
- לקבוע מספר הסלולרי על ידי לקיחת 20 μl של ההשעיה תא PBMC ומערבבים עם 20 μl של trypan כחול לספור את מספר תאים חיים באמצעות cytometer.
- תא צנטריפוגה השעיה על 367 XG עם בלמים למשך 10 דק ', 4 ° C.
- תא גלולה לשאוב supernatant לחלוטין resuspend בריכוז של 5 x 10 7 תאים לכל 1 מ"ל של חיץ מכתים בתוך 5 מ"ל ופוליסטצינור רן.
- להוסיף האדם CD4 + T Cell עשר קוקטייל ב 50 תאי μl / מיליליטר. מערבבים היטב דגירה בטמפרטורת החדר (15 - 25 מעלות צלזיוס) במשך 10 דקות.
- חלקיקים מגנטיים וורטקס למשך 30 שניות ומוסיפים חלקיקים מגנטיים ב 100 μl / תאים מ"ל. מערבבים היטב דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
- הוסף חוצץ מכתים את ההשעיה התא בהיקף כולל של 2.5 מ"ל. מערבבים את התאים בצינור על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה 2 - 3 פעמים. מניחים את הצינור לתוך המגנט דגירה במשך 5 דקות.
- הפוך מגנט עם צינור למזוג ההשעיה (מכיל תאי T) לתוך צינור פוליסטירן חדש 5 מ"ל.
- לקבוע מספר תא דגירה 1.2 x 10 6 CD4 + T-תאים עם 5 CFSE מיקרומטר 1 מ"ל של PBS במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור.
- להוסיף חמש פעמים את נפח מכתים המקורי של תרבית תאים בינוניים (הערוכים על פי צעד 3.1.1) אל התאים דגירה של 5 דקות.
- CentrifUge ב XG 300 במשך 5 דקות, 4 ° C ו resuspend גלולה במדיום תרבית תאים בריכוז של 2 x 10 5 לכל 75 μl.
- הוסף 75 μl של 2 x 10 5 CFSE שכותרתו CD4 + T-תאים לכל תרבות moDC המכיל 75 μl של המדיום תרבית תאים עם 0, 2.5 x 10 3, 5 x 10 3, 10 x 10 3, 20 x 10 3 ו 40 x 10 3 moDCs ב 96 צלחות גם U-תחתונות. תרבות עבור 6 ימים בתרבית רקמה החממה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
- קציר ידי pipetting CD4 + T-תאים לתוך 15 מ"ל צינור ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות, 4 ° C. איסוף supernatant לניתוח ציטוקינים ו resuspend תא גלולה ב 2 מ"ל של PBS / EDTA ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C..
6. 19 ניתוח ציטוקין
- אסוף supernatants ממחקרים alloreaction כמתואר בשלב 5.5.
- הכנת מגיב עבור האדם ציטוקין / Chemokinדואר ניתוח לוח מגנטי
- להכנת ערבוב בקבוק החרוזים משותק נוגדן בקבוקונים בודדים של חרוזים (כלול בערכה), מערבולת דקות 1. הוסף 60 μl מכל בקבוקון חרוז נוגדני בקבוק הערבוב (כלול בערכה) ומביא נפח סופי של 3 מיליליטר עם חרוז ממס (בתנאי).
- להכנת בקרות איכות, לשקם בקרת איכות 1 ובקרת איכות 2 (כלול בערכה) עם 250 μl מים deionized.
- להכנת חיץ לשטוף, לדלל 30 מ"ל של חיץ 10x Wash (כלול בערכה) עם 270 מ"ל מים ללא יונים.
- להכנת תקן ציטוקינים אדם, לשקם את רמת ציטוקינים אדם (כלולה בערכה) עם 250 μl מי deionized לתת ריכוז 10,000 pg / ml.
- הוסף 50 μl של 10,000 pg / ml תקן ציטוקינים אדם ב- 200 μl של חיץ assay (המסופק בערכה) בצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge לעשות 2,000 pg / ml תקן עובד. העברת 50 μl של 2,000 pg / ml תקן ציטוקינים אדם ב- 200 μl של חיץ assay (המסופק בערכה) בצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge לעשות 400 pg / ml תקן עובד.
- העברת 50 μl של 400 pg / ml תקן ציטוקינים אדם ב- 200 μl של חיץ assay (המסופק בערכה) בצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge לעשות 80 pg / ml תקן עובד. העברת 50 μl של 80 pg / ml תקן ציטוקינים אדם ב- 200 μl של חיץ assay (המסופק בערכה) בצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge לעשות 16 pg / ml תקן עובד.
- העברת 50 μl של 16 pg / תקן ציטוקינים האדם מ"ל ל 200 μl של חיץ assay (המסופק בערכה) בצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge לעשות 3.2 pg / ml תקן עובד. 0 pg / ml תקן עובד יש רק 200 μl של חיץ Assay צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
- צלחת מסנן רטוב קדם (כלול בערכה) על ידי pipetting 200 μl של חיץ assay (מסופק) לבאר כל מסנןצַלַחַת. חותם ומניחים בצלחת מסנן על שייקר צלחת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשאוב Assay החיץ להוסיף 25 μl של כל פקד רגיל או איכות לתוך הבארות המתאימות.
- הוסף 25 μl של מדיום תרבית תאים (הערוכים על פי צעד 3.1.1) על בארות רקע, התקנים ובקרה.
- הוסף 25 μl של חיץ Assay על הבארות המדגמות ולהוסיף 25 μl של המדגם לתוך בארות המדגם המתאימות.
- וורטקס בקבוק הערבוב המכיל חרוזים-משותק נוגדן ולהוסיף 25 μl של החרוזים המעורבים היטב כל אחד. חותם צלחת דגירה עם תסיסה על שייקר צלחת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- צלחת נוזל שטיפה לשאוב 2 פעמים על ידי הוספת 200 μl / היטב לשטוף חיץ aspirating הנוזל.
- הוסף 25 μl של נוגדני זיהוי (בתנאי) לתוך כל טוב. חותם דגירה עם תסיסה על שייקר צלחת במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
- הוסף 25 μl של Streptavidin- Phycoerythrin (משליided) זה טוב המכיל את 25 μl של נוגדני זיהוי. חותם דגירה עם תסיסה על שייקר צלחת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- צלחת נוזל שטיפה לשאוב כמתואר בשלב 6.8.
- להוסיף 150 μl / היטב נדן נוזלים לכל הבארות וחרוזי resuspend על שייקר צלחת במשך 5 דקות.
- זיהוי עוצמת הקרינה של חרוזים באמצעות מערכת 3D 20. לנתח את הנתונים עוצמי פלורסנט החציוני בשיטה הולם עקומה חמישה פרמטר לוגיסטי-log לחישוב ריכוזים ציטוקינים / כמוקינים בדגימות 21.
7. דרג צריכת החמצן בזמן אמת (OCR) ושיעור החמצה תאיים (ECAR) מדידות
- הכנת המגיב / חומרים
- הכן בינוני OCR: בינוני Assay בתוספת 25 גלוקוז מ"מ ו 1 פירובט נתרן מ"מ (pH 7.35). לעקר את הפתרון הזה על ידי סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. שימו לב כי המדיום הזה הוא יחסי ציבורepared ללא FBS כי הרכיבים FBS מורכבים ומשתנים ממגרש אחד מאבק הרבה.
- כן בינוני ECAR: בסיס בתוספת בינונית עם 2 מ"מ L- גלוטמין (pH 7.35). לעקר את הפתרון הזה על ידי סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. שימו לב כי המדיום הזה שהוכן ללא ביקרבונט, גלוקוז, פירובט ו FBS. שים לב יש FBS קיבולת החציצה יפריע קריאת ECAR.
- הכן תרכובות למדידות OCR: Resuspend oligomycin עם 630 μl של המדיום OCR לעשות 100 מיקרומטר פתרון המניות לדלל עם המדיום OCR ל -16 מיקרומטר עובד ריכוז. ציאניד 4- קרבוניל גלולה (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) עם 720 μl של המדיום OCR לעשות 100 מיקרומטר פתרון המניות לדלל עם המדיום OCR ל -4.5 מיקרומטר עובד ריכוז. rotenone Resuspend / A antimycin עם 540 μl של המדיום OCR לעשות 50 מיקרומטר פתרון המניות לדלל עם המדיום OCR על 10 מיקרומטר עובד ריכוז.
- להכיןתרכובות למדידות ECAR: גלוקוז Resuspend עם 3 מ"ל של מדיום ECAR לעשות 100 פתרון מ"מ המניות לדלל עד 80 מ"מ עובד ריכוז. Resuspend oligomycin עם 720 μl של המדיום ECAR לעשות 100 מיקרומטר פתרון המניות לדלל עד 18 מ"מ עובד ריכוז. Resuspend 2-deoxy-D- גלוקוז עם 1.5 מ"ל של מדיום ECAR לעשות 1,000 מניות פתרון מ"מ.
- Pipet 200 μl של calibrant לבאר כל מחסנית ולאחסן ב 37 ° C ללא CO 2 יום אחד לפני המדידות.
- מדידות בזמן אמת OCR
- MoDCs קציר ו resuspend כל סוג של moDCs במדיום OCR בריכוז של 60 x 10 3 לכל 150 μl של המדיום OCR.
- Seed 60 x 10 3 תאים / היטב פולי- D- ליזין מצופה 96-גם שטוח התחתונה צלחת דגירה חממה בלתי-CO 2 עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס. שימו לב לשימוש 50 μl של 50 ng / ml של פולי- D- ליזין לצפות את צלחת 1 hr ולשטוף עםמים סטריליים. שמור צלחת יבש עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
- בינוני OCR פיפטה 25 μl ליציאת הזרקה עבור כל הבארות; בינוני 25 μl OCR המכיל 16 מיקרומטר של oligomycin בסי נמל הזרקה עבור כל הבארות; בינוני 25 μl OCR המכיל 4.5 מיקרומטר של (FCCP) ב- C נמל הזרקת עבור כל בארות ו -25 בינוני μl OCR המכיל 10 מ"מ rotenone / A antimycin ברה נמל הזרקת עבור כל בארות. ראוי לציין, כי ריכוז היטב הסופי עבור oligomycin הוא 2 מיקרומטר, FCCP הוא 0.5 מיקרומטר ו rotenone / A antimycin הוא 1 מיקרומטר.
- מניח צלחת לתוך מנתח שטף תאי ולהפעיל מחקר OCR להשלים עם כל moDCs זמנית בארבעה שלבים עוקבים: נשימה הבזליים (לאחר הזרקה בינונית מנמל), עיכוב V מורכב המיטוכונדריה (לאחר מתן תרופת מ- B נמל), אינדוקצית נשימה מקסימלי (לאחר הזרקת סמים מ C נמל) ועיכוב שרשרת העברת אלקטרונים (אחרי תרופת D נמל) 22. שימו לב כי ישנם 3 גycles בין זריקות מרווח 6 דקות בין המדידות.
- מדידות ECAR בזמן אמת
- MoDCs קציר ו resuspend כל סוג של moDCs במדיום ECAR בריכוז של 60 x 10 3 לכל 150 μl של המדיום ECAR.
- זרע 6 x 10 4 תאים / היטב פולי- D- ליזין מצופה 96-גם שטוח תחתון צלחת דגירת חממה בלתי-CO 2 עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
- בינוני ECAR פיפטה 25 μl ליציאת הזרקה עבור כל הבארות; 25 μl בינוני ECAR המכיל 10 מ"מ של גלוקוז B נמל הזרקת עבור כל בארות; בינוני 25 μl ECAR המכיל 18 מיקרומטר של oligomycin ב- C נמל הזרקה לכל הבארות 25 בינוני μL OCR המכיל 1,000 מ"מ 2-deoxy-D- גלוקוז ברה נמל הזרקה עבור כל הבארות. ראוי לציין, כי ריכוז היטב הסופי עבור גלוקוז הוא 10 מיקרומטר, oligomycin הוא 2 מיקרומטר ו 2-deoxy-D- גלוקוז הוא 100 מ"מ.
- מניח צלחת לתוך מנתח שטף תאי ולהפעילמחקר ECAR להשלים עם כל moDCs זמנית בארבעה שלבים עוקבים: נשימה הבזליים (לאחר ההזרקה בינוני מנמל), אינדוקציה הגליקוליזה (לאחר מתן התרופה מ- B הנמל), אינדוקציה הגליקוליזה מקסימלי (לאחר מתן התרופה מ C הנמל) ועיכוב הגליקוליזה (לאחר תרופת D נמל) 22.
- לנתח הבדלים סטטיסטיים באמצעות ANOVA חד כיווני עם שלאחר בדיקת Tukey מרובה השוואה.
Representative Results
טיהור מונוציטים ו התמיינות תאים דנדריטים
מונוציטים היו מטוהרים מן PBMCs ידי צנטריפוגה צפיפות של דם ההיקפי (איור 1 א), ואחריו CD14 + הפרדה מגנט סלקציה חיובית (איור 1B) ו בתרבית בינונית מלא בנוכחות GM-CSF ו- IL-4 להשיג תאי דנדריטים בשלים ( איור 2 א). תוספת של ויטמין D3 ו dexamethasone פוסט GM-CSF ו- IL-4 הביא את הבידול של moDCs בשלה לתוך moDCs tolerogenic (איור 2 ב). LPS התווסף לגרום להבשלת moDCs בשלה להבשיל moDCs (איור 2 ג) ו moDCs tolerogenic היו מגורה עם LPS לאמת עמידות התבגרות (איור 2 ד). דגימות הדם המשמשות בעבודה זו התקבלו מתורמים בריאים עם קודם הודיעו הַסכָּמָה.
אפיון moDC
Surface מרקר אפיון על ידי cytometry זרימה
ניתוח של סמני משטח DC הראה כי moDCs הבוגרת הביעה את הרמות הגבוהות ביותר של סמני התבגרות HLA-DR, CD83 ו CD86 לעומת moDCs tolerogenic שטופל LPS, moDCs tolerogenic ו moDCs המפותח (איור 3). תוצאות אלו הראו כי moDCs tolerogenic היו עמידים התבגרות לעומת moDCs בשלה בעקבות גירוי LPS. בנוסף, LPS שטופלו moDCs tolerogenic ו moDCs tolerogenic מוצג ביטוי מוגבר של CD14, BDCA3 (CD141) ותעתיקים אימונוגלובולין דמוי (ILT) 3 לעומת moDCs בשלה ובוגרת. MoDCs tolerogenic זה שעוררו כאן עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים 23.
יפ-together.within-page = "1"> אפיון פונקציונלי של moDCs
moDCs המושרה על התבגרות להיות immunogenic ולשחרר ציטוקינים המקדמים התפשטות של CD4 + T-תאי. החוקרים העריכו את immunogenicity של תת moDC השונה על ידי מדידת ההתפשטות של תאי T שיתוף תרבותי. MoDCs Tolerogenic היו גרוע immunogenic לעומת moDCs הבוגרת, כפי שמוצג על ידי alloproliferation הנמוך של CD4 + T-תאי (איור 4 א). MoDCs Tolerogenic מאופיין IFN-Γ, נמוך IL-12p40, וגבוה IL-10 ציטוקין ייצור הנמוך שלהם alloreaction שיתוף תרבויות עם CD4 + T לתאים (איור 4B). יתר על כן, הגדלת מספר moDCs tolerogenic ב שיתוף תרבויות של moDCs בוגרת המושרה allospecific CD4 + T-תאים הגדילו את תדירות Foxp3 גבוהה CD25 + תאי T רגולטוריים (איור 4C).
האדום CMXRos משמש כדי לשקף את פעילות המיטוכונדריה לנתח את רמות פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה ב moDCs. MoDCs Tolerogenic נצפה להיות פעילות המיטוכונדריה גבוהה בהשוואה תת הבדיל moDC האחר (איור 5 א). לאחר מכן, שיעור צריכת חמצן המיטוכונדריה (OCR) נבחן עבור תת-הסוגים השונים moDC באמצעות bioanalyzer. מדידות OCR לאפשר תובנה ברזולוציה גבוהות על הפרופיל המטבולי, מתן מידע כולל אך לא מוגבל נשימה בסיסית, קיבולת נשימת חילוף, דליפת פרוטון ונשימה הלא המיטוכונדריה. מדידת OCR מספק אמצעי כדי להעריך את היכולת של התאים להגיב ללחץ. התאים מוטרדים מבחינת מטבולית על ידי התוספת של שלוש תרכובות שונות ברציפות. הזריקה הראשונה היא Oligomycin (מצמד ATP) אשר מעכב V המורכבת של שרשרת העברת אלקטרונים (ETC), מעכב סינתזת ATP. צעד זה שמייחד את אחוז החמצן הנצרך לסינתזת ATP ואחוז החמצן נצרך להתגבר דליפת פרוטון על פני קרום המיטוכונדריה הפנימי. הזריקה השנייה היא FCCP (ETC מאיץ) משבש סינתזת ATP על ידי העברת יוני מימן על פני הקרום המיטוכונדריה במקום דרך ערוץ הפרוטון של V. קומפלקס קריסת פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה מובילה לצריכה מהירה של אנרגיה וחמצן, ללא דור של ATP. טיפול FCCP ניתן להשתמש כדי לחשב את קיבולת הנשימה חילוף של תאים. תחזוקה של קיבולת הנשימה חילוף בתנאי קיצון היא קריטית להישרדות התא. יכולת זו נקבעת על ידי מספר גורמים, לרבות הזמין של מצע היכולת התפקודית של האנזימים מעורבים וכו הזריקה השלישית היא שילוב של Rotenone, Complלשעבר הייתי מעכב, ו Antimycin A, מעכב III מורכב. שילוב זה נכבה נשימת המיטוכונדריאלי ו- OCR הוא ציין להקטין כתוצאה במיטוכונדריה לקויה (איור 5 ג). MoDCs Tolerogenic גילה רמות OCR בסיס גבוהות moDCs הבוגרת (5D איור). בנוסף, tolerogenic, LPS-tolerogenic, ו moDCs בשלה והראו גדילת קיבולת נשימת חילוף לעומת moDCs הבוגרת (איור 5E).
אפיון מטבולית של moDCs
בגלל חומצה לקטית ופרוטונים משתחררים מתאי במהלך הגליקוליזה, ניתחנו את הפעילות glycolytic של moDCs על ידי ביצוע ניתוח בזמן אמת של שיעור החמצה תאיים (ECAR) (איור 6). בנוכחות גלוקוז, שיעור glycolytic של כל moDCs גדל לעומת השלב הבסיסי, עםmoDCs הבוגרת מפגין שיעור glycolytic גבוה moDCs המפותח (6D איור). Tolerogenic ו moDCs בשלה הציגו הגליקוליזה מקסימלי גבוהה (הנגרמת על ידי oligomycin בנוכחות גלוקוז) לעומת moDCs שטופל LPS (איור 6). קיבולת glycolytic של moDCs tolerogenic ובלתי הבשל הייתה גבוהה יותר מאשר moDCs הבוגרת (איור 6E). בניגוד שיעור glycolytic הגבוהה שלהם, מילואים glycolytic היה הנמוך ביותר מזה moDCs בוגרת (איור 6F).
איור 1:. טיהור מונוציטים מן הדם היקפי (א) 25 מיליליטר של דם מצוי בשכבה בזהירות על 15 מיליליטר של Ficoll לכל 50 מ"ל צינור לפני צנטריפוגה. PBMCs מרוכזים בשכבה מתחת פלזמה לאחר צנטריפוגה צפיפות. (ב) PBMCs מודגרת עם microbeads כי הם conj ugated כדי monoclonal antibodies CD14 האדם (אלוטיפ: עכבר IgG2a). ולאחר מכן הועמסו על עמודה אשר ממוקם בשדה המגנטי של מפריד לבודד CD14 + מונוציטים אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: אפיון מורפולוגי של moDCs. (א) 200 ng / ml של GM-CSF ו- IL-4 מתווסף מונוציטים CD14 + מטוהרים ביום 0, 4 ו -6 כדי ליצור moDCs בשלה; ו- (ב) צעד נוסף של גירוי עם 100 ננומטר ויטמין D3 ו -10 ננומטר dexamethasone ביום 5 מייצר moDCs tolerogenic. MoDCs בשלה moDCs tolerogenic מגורה עם 1 מיקרוגרם / מ"ל LPS ביום 6 שיש להפיק (C) להבשיל moDCs ו (ד) moDCs LPS-tolerogenic.ttps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. אפיון מרקר Surface ידי cytometry זרימה רמות הביטוי של סמנים משטח HLA-DR, CD80, CD83, CD86, CD11, CD14, BDCA3 ו LT3 ב tolerogenic (ירוק), LPS-tolerogenic (שחור), לא בוגר (אדום), בוגרת (כחול) moDCs. שולטת אלוטיפ מוצגים באפור. היסטוגרמה אישי לכל סוג תא זמם עם ספירת תאי ציר Y נגד יומן ציר ה- X של עוצמת fluorophore ומצופית. כל היסטוגרמות מייצגים ארבעה ניסויים בלתי תלויים. נתון זה יש הבדל בין J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10.4049 / jimmunol.1303316 (1 ביוני 2015). לשכפל ו מחדש עם בעלי הזכויות. כל הזכויות שמורות 2015. האגודה האמריקאית שלאימונולוגים, Inc. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: אפיון פונקציונלי של moDCs. (א) כימות תדירות alloproliferation של CD4 + T-תאי המושרה על ידי שיתוף תרבות עם מספר גדל והולך של tolerogenic (TOL; ירוק), LPS-tolerogenic (L-TOL; שחור), לא בוגר (IMM; אדום) ובוגרת (MAT ; כחול) moDCs. הנתונים אספו מארבעה ניסויים בלתי תלויים; כלומר הבדלים סטטיסטיים SEM + בין כל moDCs לעומת moDCs בוגרת נותחו על ידי ANOVA דו סטרי עם ניתוח ציטוקין שלאחר מבחן השוואה מרובות Dunnett. (B) של IFN-Γ (פאנל משמאל), IL-12p40 (פאנל באמצע) ו אִי- 10 (בחלונית הימניתיא) supernatants מן alloreactions בין CD4 + T-תאי שיתוף תרבותי עם מספר גדל והולך של מי tolerogenic (ירוק), לא בוגר (אדום) או (כחול) moDCs בוגרת. נתונים היו נקווים משישה ניסויים בלתי תלויים; ממוצע ± SEM (ג) CD4 + T-cell alloproliferation והרחבת תאי T רגולטוריים המושרה על ידי שיתוף התרבות עם moDCs בוגרת בנוכחות של מספר גדל והולך של moDCs tolerogenic. ציר Y שמאלי, תדירות הפצת CD4 + T-cell. ציר Y ימני, תדירות Foxp3 גבוהה CD25 + התאים מגודרים על שגשוג CD4 + T-תאי. הנתונים היו נקווה משלושה ניסויים עצמאיים; ממוצע ± SEM הבדלים סטטיסטיים בין נוכחות מול העדר נוכחות של moDCs tolerogenic נותחו על ידי ANOVA חד כיווני עם שיתוף שלאחר מבחן השוואה מרובות Dunnett. (ד) CD4 + T-cell alloproliferation (שמאל) ותדירות CD25highFoxP3 + תאים (מימין) הנגרמת על ידי תרבות עם moDCs tolerogenicבנוכחות של מספר גדל והולך של moDCs הבוגרת. הנתונים היו נקווים משניים לשלושה ניסויים בלתי תלויים; ± SEM מתכוון הבדלים סטטיסטיים בין הנוכחות מול עדר נוכחות של moDCs הבוגרת נותחו על ידי דו כיוונית ANOVA עם השוואה מרובה Dunnett שלאחר בדיקה. נתון זה יש הבדל בין J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10.4049 / jimmunol.1303316 (1 ביוני 2015). לשכפל ו מחדש עם בעלי הזכויות. כל הזכויות שמורות 2015. האגודה האמריקאית של אימונולוגים, Inc. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: ניתוח של מיטוכונדריאלי פעילות של moDCs. (א) רמות של פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה (CMXRos האדום) ב moDCs התקבלו על ידי fניתוח cytometric נמוך. הנתונים של ארבעה ניסויים בלתי תלויים היו נקווה. ממוצע ± SEM (ב) ייצוג סכמטי של נשימה המיטוכונדריאלי בזמן אמת. OCR ניתוח החל נשימת בסיס, לאחר התוספת של oligomycin (עיכוב V מורכב), FCCP (אינדוקצית נשימה מקסימלי), ו rotenone / antimycin תערובת (שרשרת העברת אלקטרונים [ETC] עיכוב). המיטוכונדריה SRC (basal המקסימלי מופחתות נשימה מקסימלי) נגזרת מעקום OCR. (C) מחקר הקינטית נציג של המיטוכונדריה OCR (pmol / min) ב tolerogenic (TOL, ירוק), LPS-tolerogenic (L-TOL, שחור) , לא בוגר (IMM, אדום) ובוגרת (MAT, כחול) moDCs ידי שימוש בחיבור רציף של oligomycin (OLIG), FCCP, ו rotenone / antimycin A (רוט-AA). (ד) כימות OCR הנשימה הבסיס של moDCs ו ( E) לחסוך קיבולת הנשימה של moDCs. הנתונים היו נקוו מחמישה ניסויים בלתי תלויים. ממוצע ± SEמ נתון זה יש הבדל בין J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10.4049 / jimmunol.1303316 (1 ביוני 2015). לשכפל ו מחדש עם בעלי הזכויות. כל הזכויות שמורות 2015. האגודה האמריקאית של אימונולוגים, Inc. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: אפיון מטבולית של moDCs. (א) ייצוג סכמטי של הגליקוליזה בזמן אמת. ניתוח ECAR מתחיל מ ECAR הבסיס, שבה התאים הודגרו בתקשורת גלוקוז ללא ואחריו תוספת של גלוקוז (אינדוקציה הגליקוליזה), oligomycin (אשר גורם הגליקוליזה תא מקסימלי ועיכוב V מורכבות), ולבסוף 2-deoxy-D- גלוקוז(עיכוב הגליקוליזה). שיעור glycolytic (האינדוקציה הגליקוליזה המופחתת עבור ECAR הבזליים), קיבולת glycolytic (הגליקוליזה מקסימלי המופחתת עבור ECAR הבזליים), ובמילואי glycolytic (מופחתי הגליקוליזה מקסימלי לזירוז הגליקוליזה) נגזרים מעקום ECAR. (ב) מחקר הקינטית נציג של הגליקוליזה תלויה ECAR (mPH / min) ב tolerogenic (TOL, ירוק), LPS-tolerogenic (L-TOL, שחור), לא בוגר (IMM, אדום), ובוגרת (MAT, כחול) moDCs ידי שימוש בחיבור רציף של גלוקוז (Gluc), oligomycin (OLIG), ו -2 DG. (C) ברים מראים רמות ECAR הבזליים (ד) שיעור glycolytic (E) קיבולת glycolytic, ו- (F) שמורת glycolytic של moDCs. הנתונים היו נקווה משלושה ניסויים עצמאיים; כלומר 6 SEM. הבדלים סטטיסטיים נותחו על ידי ANOVA חד כיווני עם פוסט-מבחן השוואה מרובה Tukey. נתון זה יש הבדל בין J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10.4049 / jimmunol.1303316 (1 ביוני 2015). לשכפל ו מחדש עם בעלי הזכויות. כל הזכויות שמורות 2015. האגודה האמריקאית של אימונולוגים, Inc. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
מאמר זה מתאר שיטה להפקה מ moDCs מונוציטים בשלה, moDCs tolerogenic ו moDCs הבוגרת. הצעדים החשובים בפרוטוקול זה נדונים בהרחבה בפסקאות הבאות. חשוב לציין כי דם היקפי אדם משמש כחומר החל בפרוטוקול זה ואמצעי זהירות אוניברסלית לטיפול דם אדם צריך להיות מתורגל. למרות זאת קיים היתכנות טכנית לגזור DCs ממח עצם בבני האדם 24, הבידול במבחנת DC מתאי נמצא בדם היקפי עדיף בשל הזמינות של דם היקפי לעומת מח עצם. בין התאים הנמצאים בדם היקפי, תאי CD34 + גזע hematopoietic ומונוציטים משמשים עבור הדור במבחנה של DCs. CD34 Hematopoietic + תאי גזע בתרבית עם GM-CSF ו- TNF-α לגזור CD1a + ו- CD14 + תת אשר לאחר מכן הם מובחנים יותר לתוך לנגרהנסכמו תאים ותאים דנדריטיים. לעומת זאת, מונוציטים הם בתרבית GM-CSF ו- IL-4 כדי ליצור moDCs בשלה. פרוטוקולים כמה משמשים להעשרת מונוציטים מדם היקפי; למשל, על ידי דבקות צלחות פלסטיק, elutriation וערכות בידוד 25, 26 היתרונות של הפרוטוקול הדבק הם ניזק מינימאלי תאים יחסית חסכוניים תא אולם הטוהר עלול להיות בסיכון.; אשר היוו צעד נוסף נדרש כדי לנתק את התאים עבור ניסויים נוספים. Elutriation היא טכניקה שמפרידה תאים בהתבסס על הגודל והצפיפות שלהם. היתרונות של elutriation הם כדאי תא מונוציטים יכול לשמש בקלות עבור ניסויים נוספים; טכניקת אולם זה מוגבל על ידי הזמינות של elutriator וחוסר היכולת להפריד אוכלוסיות שונות של תאים (T תאים מונוציטים) עם פרמטרי שקיעה דומים. מסחרי ערכות בידוד זמינות לנצל microbeads מגנטי או חיובי לבחור אולבחור את אוכלוסיית monocytic שלילית. כמה פרוטוקולים מוטים כלפי בידוד מונוציטים באמצעות הסלקציה השלילית כמו מונוציטים המבודדים להישאר "נגעו" (לא כבול על ידי סמנים או microbeads). בפרוטוקול זה, חרוזי CD14 שמשו מונוציטים אדם בחרו חיוביים PBMCs. CD14 חסר תחום ציטופלסמית ומחייבת של נוגדנים CD14 אינה מפעילה הולכת אותות. יתר על כן, microbeads יהיה להתנתק מונוציטים אחרי תרבות ומכאן לא לעכב את תהליך הבידול. בנוסף, CD14 מתבטא בחריפות על רוב מונוציטים ו חלוש על נויטרופילים וכמה תאי דנדריטים מיאלואידית, ומכאן שיטה זו של תוצאות בידוד בטהרת תא גבוהה יותר מאשר השיטות האחרות 17.
מונוציטים בדם יכול להיות מובחן לתוך DCs או מקרופאגים ועל גורל מונוציטים תלוי במידה רבה על הסביבה ציטוקינים. במאמר זה, moDCs מופקים על ידי הוספת גורם מגרה המושבה מקרופאג-גרנולוציט (GM-CSF) ו- interleukin 4 (IL-4) כדי מונוציטים בדם היקפיים אנושיים. GM-CSF נדרש להישרדות מונוציטים ו- IL-4 מפעילה פעילות מעכבת על בידול מקרופאג; והתוספת קומבינטורית של GM-SCSF ו- IL-4 מונוציטים להניב אחוז גבוה יותר של moDCs בשלה לעומת ציטוקינים הפרט 27. ישנם פרוטוקולים אחרים שיוצרים moDCs ידי הוספת אלפא tumor necrosis factor (TNF-α), אינטרפרון אלפא (IFN-α) ו -13 Interleukin (IL-13) כדי מונוציטים בדם ההיקפי 28, 29, 30. השילוב של GM-CSF ו- IL-4 היה מותאם בשנת 1990 ועכשיו פרוטוקול מקובל שיוצר DCs בשלה פלסטיק מובחן לתוך moDCs immunogenic או tolerogenic ומקוטבת לתוך Th1, moDCs קידום Th2 או TH17.
moDCs בשלה הם מובחנים לתוך moDCs tolerogenic על ידי תוספת של ויטמין D3 ו dexamethasone. ישנם מספר פרוטוקולים ליצור DCs tolerogenic למשל, באמצעותגורם-kappa B גרעיני (NF-kB) עיכוב, הפעלה β-קטנין, ויטמין D3, Dexamethasone ו -31 Rapamycin, 32, 33, 34, 35, 9, 36, 37. למרות ששני הוויטמין D3 ו dexamethasone לבד דווחו לגרום שפעת tolerogenic על DCS, השילוב של ויטמין D3 ו תוצאת dexamethasone בתוך דיכוי גדול יותר של alloproliferation מאשר כאשר תרופות פרט משמשות. לכן, בפרוטוקול הקיים עבור הדור של tolerogenic DCs שונה כדי שילוב של ויטמין D3 ו dexamethasone. שיטה זו מתבצעת מקובל כיום כמודל DCs tolerogenic אדם עם תועלת טיפולית. כמו כן, חשוב לציין כי ויטמין D3 מחדש ו dexamethasone יש חיי מדף קצרים.
בפרוטוקול זה, lipopolysaccharides (LPS) נוסף כמו inducer התבגרות DC. moDCs בשלה יכולה להיגרם גם בשלה באמצעות קוקטייל פרו-דלקתי:(TNF-α), בטא Interleukin 1 (IL-1β), Interleukin 6 (IL-6) ו- E2 פרוסטגלנדין) או ציטוקינים פרו-דלקתיים (TNF-α ו גמא אינטרפרון (IFN-Γ)). קוקטייל פרו-דלקתיים מייצר moDCs בוגרת עם גבוה שיתוף גירוי ופונקציות נודדות אבל הם מייצרים רמות נמוכות יחסית של IL-12 38. TNF-α או IFN-Γ לבדו אינו מסוגל לעורר פנוטיפ הדנדריטים יציב 39. LPS מגרה כמו-אגרה קולטן 4 (TLR4), מתווכת את ההפעלה של NF-kB ו קינאזות חלבון מופעל mitogen (MAPKs) כדי לגרום התבגרות DC. התבגרות DC המושרה על ידי LPS מראה בתקנה עד סמני התבגרות DC (CD83, CD86, HLA-DR) וגם הובילה את הייצור של IL-12p70. בנוסף, שלב זה יכול להיות שונה יותר לשייך LPS עם אגוניסטים TLR3 לייצר DCs בוגרת חיסונים לסרטן קליניים. במאמר זה, DCS tolerogenic מוצג להיות עמיד בפני התבגרות על טיפול LPS. אלה למחצה להתבגר כמו DCs אינם immunogenic ולעשות לא release הפרו דלקתי ציטוקינים 40.
המגבלות של פרוטוקול זה לשכב את תהליך הבידול. התהליך לוקח 8 ימים מהיום 0 עד יום 7 שמהווה קושי להיות מותאם לתוך תפוקה גבוהה מנתח. שינוי בפרוטוקול נדרש לקצר את תהליך הבידול עדיין להניב מספר רב של DCs קיימא במדינות השונות. שנית, הקל DCS מופק על ידי תוספת של ציטוקינים בפרוטוקול זה וציטוקינים אלה לא לקיים אוכלוסיית DC עבור תקופה ארוכה של זמן. יתר על כן, ציטוקינים משמשים בריכוזים גבוהים בהרבה in vivo ועלולה לגרום להתפתחות מוטה של המסלולים שאינם זהים מבחינה פיזיולוגית in vivo DCs. לדוגמא בתרבויות במבחנה של מבשרי DC הוכח להגיב GM-CSF, שאינו ציטוקינים חיוני לבידול נורמלי DC in vivo 41. אף על פי כן, גירוי ציטוקינים יכול להיות שיטה שימושית גןלדרג מספרים גבוהים של DC במבחנה לניסויים. היכולת להכפיף תאים אלה המופקים בפרוטוקול זה כדי ניתוחים אחרים כגון מכתים immunofluorescence, cytometry זרימה, allo מחקרי תגובה ואת חילוף חומרי מחקרים מגדילים את התועלת של שיטה זו. DCs במבחנה אלה לשמש מודל טוב כדי לשפר את הידע של פיתוח DC, התבגרות והצגת אנטיגן וזה קשה לעשות בעבר עם המספרים הנדירים של in vivo DCs.
יכולתם של DCs להסדיר חסינות אימונולוגיים לעומת סובלנות גורם להם מועמדים אטרקטיביים הרפוי נגד סרטן ומחלות אוטואימוניות 42, 43, 44, 45. DCs immunogenic שנוצר בפרוטוקול זה יכול לשמש כדי לשפר את יעילות החיסון נגד מחלות זיהומיות וגידולים; בעוד שניתן להשתמש DCs tolerogenic לשלוט בתגובות תא T הרצוי ולמנוע דחיות לאחר השתלה. המורכבאיזון בין חסינות וסובלנות תלוי מאוד על מצב בידול DC. בידול DC הוא תכנית הסלולר ומתואמת נשלטת על ידי מסלולי איתות מרובים גורל מטבולים. מדינות בידול שונים של DC שונה בצרכים bioenergetic וביוסינטזה; למשל, DCS מופעל דורש עיבודים מטבולית אנרגטיים יותר חשובים להישרדות והגירה לעומת DCs ב נח מדינה. חשוב לציין כי ויטמין D3, dexamethasone ו rapamycin ידועים ביכולתם לגרום DCs tolerogenic, תוארו להשפיע מטבוליזם DC. במאמר זה, את חילוף החומרים האנרגטיים של moDCs ממדינות בידול שונות אופיינו באמצעות מנתחי שטף תאיים ו moDCs tolerogenic הציג פלסטיות המטבולית הגבוהה ביותר LPS-induced התבגרות ירד פלסטיות זו. מטבוליזם אנאבוליים תומך התבגרות DCs תוך השפעות חילוף החומרים קטבולי tolerogenic DC מתפקד 46. קל DCSהמופק פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להעריך האם לשנות את המצב מהטבולים של DCs טומן בחובם את מפתח השינוי חסינות וסובלנות רפויה. לסיכום, הצגנו פרוטוקול הדור של בוסר, tolerogenic ובוגרת moDCs חיוני ללימוד פונקציות immunoregulatory 'DCs.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנות למדע, טכנולוגיה Reasearch מימון Core (כדי JEC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | PBMC isolation |
| Syringe | Becton, Dickinson | 302832 | PBMC isolation |
| 1.5 ml centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | PBMC isolation |
| 15 ml falcon tube | Falcon | 352096 | PBMC isolation |
| 50 ml falcon tube | Falcon | 352070 | PBMC isolation |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | PBMC isolation |
| 0.2 µm filter | Sartorius stedim biotech | 17597 | PBMC isolation |
| MACs kit | Miltenyi biotec | 130-042-201 | Monocyte enrichment |
| MiniMACS Separator | Miltenyi biotec | 130-042-102 | Monocyte enrichment |
| Cell culture grade water | Invitrogen, Life Technologies | Cell culture | |
| RPMI | Gibco, Life Technologies | 11875-093 | Cell culture |
| FBS | Hyclone | SH30070103 | Cell culture |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140 | Cell culture |
| Phosphate Buffered Saline |
Gibco, Life Technologies | 10010-031 | Cell culture |
| NEAA | Gibco, Life Technologies | 11140-040 | Cell culture |
| EDTA | Gibco, Life Technologies | 15575 | Cell culture |
| HEPES | Gibco, Life Technologies | 15630-080 | Cell culture |
| Sodium Pyruvate | Gibco, Life Technologies | 11360-070 | Cell culture |
| GM-CSF | Miltenyi biotec | 130-093-868 | Cell culture |
| IL-4 | Miltenyi biotec | 130-093-924 | Cell culture |
| Vitamin D3 | Sigma | D1530 | Cell culture |
| Dexamethasone | Sigma | D2915 | Cell culture |
| LPS | Sigma | l2755 | Cell culture |
| trypan blue | Gibco, Life Technologies | 15250-061 | Cell culture |
| PerCP-conjugated HLADR | BioLegend | 307628 | Cytometry |
| PE-conjugated CD80 | BD Biosciences | 557227 | Cytometry |
| PE-conjugated CD83 | BD Biosciences | 556855 | Cytometry |
| PE-conjugated CD86 | BD Biosciences | 555665 | Cytometry |
| APC-conjugated CD11c | BD Biosciences | 340544 | Cytometry |
| PE-conjugated CD14 | Miltenyi biotec | 130-091-242 | Cytometry |
| PE-conjugated BDCA3 | Miltenyi biotec | 130-090-514 | Cytometry |
| APC-conjugated ILT3 | eBioscience | 12-5139-73 | Cytometry |
| Isotype matched PerCP- conjugated Mab |
BioLegend | 400250 | Cytometry |
| Isotype matched PE- conjugated Mab |
Miltenyi biotec | 130-091-835 | Cytometry |
| Isotype matched APC- conjugated Mab |
Miltenyi biotec | 130-091-836 | Cytometry |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Pharmingen | BD LSR II | Cytometry |
| cytofix/cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Cytometry |
| APC/CY7-conjugated CD25 | BD pharmingen | 557753 | Cytometry |
| PE/CY7-conjugated CD4 | Biolegend | 300512 | Cytometry |
| PerCP-conjugated CD3 | Biolegend | 300428 | Cytometry |
| EasySep Human CD4+ T cell enrichment kit | STEMCELL Technologies | 19052 | Alloreaction study |
| EasySep magnet | STEMCELL Technologies | 18000 | Alloreaction study |
| Cell Trace CFSE cell proliferation kit | Molecular probes | C34554 | Alloreaction study |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14025092 | Alloreaction study |
| Alexa Fluor 647-conjugated FoxP3 | BD Biosciences | 560889 | |
| Milliplex MAP Human Cytokine/Chemokine magnetic bead panel |
Millipore | HCYTOMAG-60K | Cytokine analysis |
| 5 ml Polystyrene tube | Falcon | 352058 | Cytokine analysis |
| Luminex Sheath Fluid | Millipore | SHEATHFLUID | Cytokine analysis |
| FLEXMAP 3D system with xPONENT software | Luminex Corporation | FLEXMAP 3D | Cytokine analysis |
| MitoTracker Red CMXRos | Cell Signalling | 9082 | Mitochondrial activity |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | Mitochondrial activity |
| XF Assay Medium (OCR) | Seahorse Bioscience | 102352-000 | Metabolic adaptation |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | Metabolic adaptation |
| XF Base Medium (ECAR) | Seahorse Bioscience | 102353-100 | Metabolic adaptation |
| L-glutamine | Gibco, Life Technologies | 25030-081 | Metabolic adaptation |
| Calibrant | Seahorse Bioscience | 100840-000 | Metabolic adaptation |
| XF Cell Mito Stress kit | Seahorse Bioscience | 103015-100 | Metabolic adaptation |
| XF Glycolysis Stress kit | Seahorse Bioscience | 103020-100 | Metabolic adaptation |
| Seahorse | Seahorse Bioscience | XFe96 | Metabolic adaptation |
References
- Jolles, S. Paul Langerhans. J Clin Pathol. 55 (4), 243-24 (2002).
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
- Steinman, R. M., Swanson, J. The endocytic activity of dendritic cells. J Exp Med. 182 (2), 283-288 (1995).
- Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
- Mueller, D. L. Mechanisms maintaining peripheral tolerance. Nat Immunol. 11 (1), 21-27 (2010).
- Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
- Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
- Paavonen, J., Lehtinen, M. Interactions between human papillomavirus and other sexually transmitted agents in the etiology of cervical cancer. Curr Opin Infect Dis. 12 (1), 67-71 (1999).
- Ohtani, M., et al. Mammalian target of rapamycin and glycogen synthase kinase 3 differentially regulate lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production in dendritic cells. Blood. 112 (3), 635-643 (2008).
- Wilde, B., et al. Dendritic cells in renal biopsies of patients with ANCA-associated vasculitis. Nephrol Dial Transplant. 24 (7), 2151-2156 (2009).
- Al-Hello, H., et al. An enterovirus strain isolated from diabetic child belongs to a genetic subcluster of echovirus 11, but is also neutralised with monotypic antisera to coxsackievirus A9. J Gen Virol. 89, 1949-1959 (2008).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), 74-80 (2010).
- Osugi, Y., Vuckovic, S., Hart, D. N. Myeloid blood CD11c(+) dendritic cells and monocyte-derived dendritic cells differ in their ability to stimulate T lymphocytes. Blood. 100 (8), 2858-2866 (2002).
- Reynolds, G., Haniffa, M. Human and Mouse Mononuclear Phagocyte Networks: A Tale of Two Species. Front Immunol. 6, (2015).
- Jefford, M., et al. Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli. Blood. 102 (5), 1753-1763 (2003).
- Menck, K., et al. Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags. J Vis Exp. (91), (2014).
- Zhou, L., et al. Impact of human granulocyte and monocyte isolation procedures on functional studies. Clin Vaccine Immunol. 19 (7), 1065-1074 (2012).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Faresjo, M. A useful guide for analysis of immune markers by fluorochrome (Luminex) technique. Methods Mol Biol. 1172, 87-96 (2014).
- Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. J Vis Exp. (65), (2012).
- Defawe, O. D., et al. Optimization and qualification of a multiplex bead array to assess cytokine and chemokine production by vaccine-specific cells. J Immunol Methods. 382 (1-2), 117-128 (2012).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. (46), (2010).
- Chunharas, A., Pabunruang, W., Hongeng, S. Congenital self-healing Langerhans cell histiocytosis with pulmonary involvement: spontaneous regression. J Med Assoc Thai. 85, 1309-1313 (2002).
- Bai, L., Feuerer, M., Beckhove, P., Umansky, V., Schirrmacher, V. Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells. Int J Oncol. 20 (2), 247-253 (2002).
- Felzmann, T., et al. Monocyte enrichment from leukapharesis products for the generation of DCs by plastic adherence, or by positive or negative selection. Cytotherapy. 5 (5), 391-398 (2003).
- Berger, T. G., et al. Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra) for clinical-scale generation of dendritic cells. J Immunol Methods. 298 (1-2), 1-2 (2005).
- Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
- Pace, S. T., Gelman, B. B., Wong, B. R. Primary Langerhans cell histiocytosis of the lacrimal gland in an adult. Can J Ophthalmol. 50 (3), 40-43 (2015).
- Ravanfar, P., Wallace, J. S., Pace, N. C. Diaper dermatitis: a review and update. Curr Opin Pediatr. 24 (4), 472-479 (2012).
- Gebhardt, C., et al. A case of cutaneous Rosai-Dorfman disease refractory to imatinib therapy. Arch Dermatol. 145 (5), 571-574 (2009).
- Vazquez, P., Robles, A. M., de Pablo, F., Hernandez-Sanchez, C. Non-neural tyrosine hydroxylase, via modulation of endocrine pancreatic precursors, is required for normal development of beta cells in the mouse pancreas. Diabetologia. 57 (11), 2339-2347 (2014).
- Pellacani, G., et al. Distinct melanoma types based on reflectance confocal microscopy. Exp Dermatol. 23 (6), 414-418 (2014).
- Shi, Y., et al. Hepatic involvement of Langerhans cell histiocytosis in children--imaging findings of computed tomography, magnetic resonance imaging and magnetic resonance cholangiopancreatography. Pediatr Radiol. 44 (6), 713-718 (2014).
- Haustein, M., Terai, N., Pablik, J., Pillunat, L. E., Sommer, F. Therapy-resistant swelling of the upper eyelid in childhood. Ophthalmologe. 111 (1), 53-57 (2014).
- Haidinger, M., et al. A versatile role of mammalian target of rapamycin in human dendritic cell function and differentiation. J Immunol. 185 (7), 3919-3931 (2010).
- Macedo, C., Turquist, H., Metes, D., Thomson, A. W. Immunoregulatory properties of rapamycin-conditioned monocyte-derived dendritic cells and their role in transplantation. Transplant Res. 1 (1), 16 (2012).
- Fischer, R., Turnquist, H. R., Taner, T., Thomson, A. W. Use of rapamycin in the induction of tolerogenic dendritic cells. Handb Exp Pharmacol. 188 (188), 215-232 (2009).
- Nicolette, C. A., et al. Dendritic cells for active immunotherapy: optimizing design and manufacture in order to develop commercially and clinically viable products. Vaccine. 25, 47-60 (2007).
- Han, T. H., et al. Evaluation of 3 clinical dendritic cell maturation protocols containing lipopolysaccharide and interferon-gamma. J Immunother. 32 (4), 399-407 (2009).
- Paananen, A., et al. Molecular and biological analysis of echovirus 9 strain isolated from a diabetic child. J Med Virol. 69 (4), 529-537 (2003).
- HC, O. N., Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
- Mest, H. J., et al. Glucose-induced insulin secretion is potentiated by a new imidazoline compound. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 364 (1), 47-52 (2001).
- Puc, J., et al. Mitochondrial activity after cold preservation of pancreatic islet cells treated with pefloxacin (PFX). Ann Transplant. 3 (1), 38-41 (1998).
- Alarcon, C., Serna, J., Perez-Villamil, B., de Pablo, F. Synthesis and differentially regulated processing of proinsulin in developing chick pancreas, liver and neuroretina. FEBS Letters. 436 (3), 361-366 (1998).
- Jekunen, A. P., Kairemo, K. J., Paavonen, T. Imaging of Hand-Schuller-Christian syndrome by a monoclonal antibody. Clin Nucl Med. 22 (11), 771-774 (1997).
- Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nat Rev Immunol. 15 (1), 18-29 (2015).
