Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.
Immunrespons resultater fra et komplekst samspill mellom antigen ikke-spesifikk medfødte immunsystemet og antigenet spesifikt adaptive immunsystemet. Immunsystemet er en konstant balanse opprettholde toleranse til selv-molekyler og reagere raskt til patogener. Dendrittiske celler (DCS) er kraftige profesjonelle antigenpresenterende celler som lenker det medfødte immunsystemet til det adaptive immunsystemet og balansere adaptive respons mellom selv og ikke-selv. Avhengig av modnings signaler, kan umodne dendrittiske celler selektivt bli stimulert til å differensiere til immunogene eller tolerogene DC. Immunogene dendrittceller tilveiebringe spredningssignaler til antigen-spesifikke T-celler for klonal ekspansjon; mens tolerogene dendrittceller regulere toleranse av antigen-spesifikke T-celle-delesjon eller klonal ekspansjon av regulatoriske T-celler. På grunn av denne unike eiendommen, er dendrittiske celler svært ettertraktet som terapeutiske midler for kreft og autoimmune diseAses. Dendrittiske celler kan lastes med spesifikke antigener in vitro og injisert inn i menneskekroppen for å montere en spesifikk immunrespons både immunogen og tolerogene. Dette arbeidet presenterer et middel til å generere in vitro fra monocytter, umoden monocytter avledet dendrittiske celler (moDCs), tolerogene og modne moDCs som skiller i overflate markør uttrykk, funksjon og metabolske fenotyper.
DC ble først beskrevet av Paul Langerhans (Langerhans-celler) i slutten av forrige århundre som refereres av Jolles en og preget av Ralph Steinman og Zanvil Cohn i 1973 som kjente dem som profesjonelle antigenpresenterende celler 2. DC finnes i perifert blod og i de fleste vev i kroppen, spesielt rik på vev som er utsatt for det ytre miljø, slik som huden (tilstede som Langerhans-celler) og i beleggene i nese, lunger, mage og tarmer som muliggjør dem til å møte ytre antigener. Umodne DC har endocytic evne, men relativt lav kapasitet til å stimulere T-celler 3. Umodne DCs uttrykke ulike mønstergjenkjenning reseptorer (PRRS) som fengsler patogen-forbundet molekylære mønstre (PAMPs) eller skade-forbundet molekylære mønstre (demper) 4. Aktivering faresignalene kjøre modning mot immunogene DCs mens selv molekyler resultere i T-celle unresponsiveness og apoptose 5. Immunogene DC er preget av oppregulering av MHC molekyler og co-stimulerende overflatemolekyler og deres evne til å prime naive T-celler 6,7.
Umodne DC også kan modnes til en treg-induserende eller tolerogene tilstand som reaksjon på vitamin D3 metabolitt 1a, 25 (O) 2-D3 og visse immunosuppressive midler som interleukin-10 (IL-10), deksametason og rapamycin 8-9. Tolerogene DC er preget av deres uttrykk for immunoreceptor tyrosin-baserte hemmende motiver (ITIMs) som inneholder overflatereseptorer og ligander. Signaltransduksjon av ITIMs inneholder ILT familiemedlemmer, ILT3 og ILT4 i tolerogene DC hemme alloproliferation og kjøre foxp3 + treg utvidelse 10,11. Disse unike egenskaper av tolerogene DC føre til at de dype potens in vivo, nemlig evnen til å indusere toleranse til holdbar transplanterte allogene transplantater og supprESS utviklingen av autoimmune sykdommer. Tolerogene DC kan betraktes derfor som en subtype av modne polarisert DC som virker ved inhibering av aktivering av immunsystemet.
For tiden er det to generelle undergrupper av dendrittiske celler i humant perifert blod: plasmacytoid DC og myeloide DC 12. Sirkulerende DC er sjeldne, som utgjør mindre enn 2% av leukocytter i menneskeblod, og dette utgjør en vanskelighet til isolering av et passende antall DC for å studere deres immunregulerende funksjoner. For å overvinne dette problemet, er monocytt differensiert DC brukt som en in vitro modell for studiet av dendrittiske cellefunksjon. Disse in vitro DC har lignende reseptorer og funksjoner i forhold til in vivo DC. Detaljert sammenligning av in vivo DC og in vitro generert stammer fra monocytter DC (moDCs) er undersøkt ved andre laboratorier 13, 14, 15. Det er også rapportert at moDCs og CD1c + DC var tilsvarende på antigenpresenterende og indusere T-celle funksjon 15.
I denne artikkelen beskriver vi en metode for generering av umodne moDCs fra perifert blod monocytter og deretter skille dem inn immunogene og tolerogene DC. Disse stammer fra monocytter dendrittiske celler (moDCs) kjennetegnes ved sine overflatemarkører, cytokin profilen, immunfunksjoner og metabolske tilstander. Immunogene og tolerogene dendrittiske celler produserer forskjellige cytokiner som resulterer i ekspansjon av enten allogene T-celler eller regulatoriske T-celler. I denne utredningen, er cytokin profilering utføres med systemer som bruker multiplex-teknologi. Vekstmedium av celler ble inkubert med antistoff immobilisert fargekodet perler og lest i en kompakt analysator. Metabolske tilstander av DC er analysert ved hjelp av ekstracellulære flux analysatorer som måler oksygenforbruk rente, en indikator på mobilnettet åndedrett, og ekstracellulære forsuring hastighet som gjenspeiler glycolyticflux i dendrittiske celler. Måling av disse bioenergi prisene gir et middel for å spore endringer i cellenes stoffskifte som er avgjørende i dendrittiske cellen utvikling og funksjon.
Dette notatet beskriver en metode for å generere fra monocytter umodne moDCs, tolerogene moDCs og modne moDCs. De viktigste trinnene i denne protokollen er diskutert i detalj i de følgende avsnittene. Det er viktig å merke seg at humant perifert blod blir brukt som et utgangsmateriale i denne protokollen, og universelle retningslinjer for behandling av humant blod skal praktiseres. Selv om det er teknisk mulig å utlede DC fra benmarg hos mennesker 24, er in vitro DC differensiering av celler som finnes i perifert blod foretrukket på grunn av tilgjengeligheten av perifert blod sammenlignet med benmargen. Blant de celler som finnes i perifert blod, er hematopoetiske CD34 + stamceller og monocytter som vanligvis brukes for in vitro produksjon av DC. Hematopoetisk CD34 + stamceller blir dyrket sammen med GM-CSF og TNF-α for å utlede CD1a + og CD14 + undergrupper som deretter videre differensiert til Langerhansliknende celler og dendrittiske celler. Omvendt, monocytter dyrket i GM-CSF og IL-4 for å generere umodne moDCs. Flere protokoller brukes for anriking av monocytter fra perifert blod; for eksempel ved tilslutning til plastskåler, oppslemming og isoleringssett 25, 26 Fordelene ved den tilslutning protokollen er minimal skade på celler og forholdsvis kostnadseffektiv imidlertid celle renhet kan være kompromittert.; og et ekstra trinn er nødvendig for å løsne cellene for ytterligere eksperimenter. Oppslemming er en teknikk som skiller celler basert på deres størrelse og tetthet. Fordelene med oppslemming er celleviabilitet og monocytter, kan lett anvendes for videre eksperimenter; men denne teknikken er begrenset av tilgjengeligheten av en elutriator og manglende evne til å skille mellom forskjellige populasjoner av celler (T-celler og monocytter) med tilsvarende sedimenteringsparametere. Kommersielt tilgjengelige isolasjon kits bruke magnetiske mikro å enten velge positivt ellernegativt velge monocytic befolkningen. Noen protokoller er forutinntatt mot monocytter isolert med negativ seleksjon som de isolerte monocytter forbli "urørt" (ikke bundet av markører eller mikroperler). I denne protokollen, ble CD14 perler brukes til positive velger humane monocytter fra PBMC. CD14 mangler et cytoplasmatisk domene og binding av antistoffet til CD14 ikke utløser signaloverføring. Videre vil mikroperlene løsne fra monocytter etter kultur og således ikke hindrer differensieringsprosessen. I tillegg er CD14 sterkt uttrykt på de fleste monocytter og svakt på nøytrofile celler og noen myeloid dendrittiske celler, derav denne metoden for isolasjon resulterer i høyere cellerenhet enn de andre metodene 17.
Blodmonocytter kan differensieres til DCS eller makrofager og skjebnen til monocytter i stor grad avhenger av cytokin miljø. I denne utredningen, er moDCs genereres ved å legge granulocytt-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) Og interleukin 4 (IL-4) til humane perifere blodmonocytter. GM-CSF er nødvendig for monocytt overlevelse og IL-4 utøver en inhibitorisk aktivitet på makrofag differensiering; og kombinatoriske tillegg av GM-SCSF og IL-4 til monocytter gi en høyere prosentandel av umodne moDCs forhold til individuell cytokin 27. Det finnes andre protokoller som genererer moDCs ved tilsetning av tumornekrosefaktor alfa (TNF-α), interferon-alfa (IFN-α) og interleukin 13 (IL-13) for å perifere blodmonocytter 28, 29, 30. Kombinasjonen av GM-CSF og IL-4 ble optimalisert på 1990-tallet og nå en akseptert protokoll som genererer plast umodne DC differensierte inn immunogene eller tolerogene moDCs og polariserte i Th1, Th2 eller Th17 fremme moDCs.
Umodne moDCs blir differensiert i tolerogene moDCs ved tilsetning av vitamin D3 og dexametason. Det finnes flere protokoller for å generere tolerogene DC for eksempel vianukleær faktor kappa B-(NF-kB) inhibering, β-catenin aktivering, vitamin D3, deksametason og Rapamycin 31, 32, 33, 34, 35, 9, 36, 37. Selv om både vitamin D3 og dexametason alene har blitt rapportert å indusere en tolerogene effekt på DC, kombinasjonen av vitamin D3 og dexametason resultat i en større undertrykkelse av alloproliferation enn når de enkelte stoffer er anvendt. Derfor ble den eksisterende protokoll for generering av tolerogene DC modifisert til en kombinasjon av vitamin D3 og dexametason. Denne metoden er i ferd med å bli akseptert som en modell for menneske tolerogene DCs med et terapeutisk verktøy. Det er også viktig å merke seg at det rekonstituerte vitamin D3 og dexametason har kort holdbarhet.
I denne protokollen, ble lipopolysakkarider (LPS) lagt til som en DC modning induser. Umodne moDCs kan også bli overtalt til modning ved hjelp av pro-inflammatoriske cocktail:(TNF-α), Interleukin 1 beta (IL-1β), Interleukin 6 (IL-6) og prostaglandin E2) eller pro-inflammatoriske cytokiner (TNF-a og interferon gamma (IFN-Γ)). Pro-inflammatorisk cocktail genererer modne moDCs med høy ko-stimulerende og trekkende funksjoner, men de frembringer forholdsvis lave nivåer av IL-12 38. TNF-α eller IFN-Γ alene er ikke i stand til å indusere en stabil dendrittisk fenotype 39. LPS stimulerer Toll-like receptor 4 (TLR4), medierer aktivering av NF-kB og mitogen aktivert protein kinaser (MAPK) for å indusere DC modning. DC modning indusert av LPS viser en oppregulering av DC modnings markører (CD83, CD86, HLA-DR) og også førte til produksjon av IL-12p70. I tillegg kan dette trinnet endres ytterligere å pare LPS med TLR3-agonister å produsere modne DC for kliniske kreftvaksiner. I denne utredningen, er tolerogene DCs vist seg å være resistente mot modning på LPS behandling. Disse halv modne som DC er ikke immunogene og ikke releaSE proinflammatoriske cytokiner 40.
Begrensningene i denne protokollen ligge i differensiering prosessen. Prosessen tar 8 dager fra dag 0 til dag 7 som utgjør en vanskelighet for å tilpasses til høy gjennomstrømning analyser. En modifikasjon av protokollen som kreves for å forkorte den differensieringsprosessen likevel gi et høyt antall levedyktige DC i ulike tilstander. For det andre, blir DCS generert ved tilsetning av cytokiner i denne protokollen, og disse cytokinene ikke opprettholde DC befolkning over lengre tid. Videre er cytokiner som brukes i konsentrasjoner mye høyere enn in vivo og kan resultere i forspent utvikling av banene som ikke er fysiologisk identiske med in vivo DC. For eksempel in vitro kulturer av DC-forløpere har vist seg å svare på GM-CSF, som ikke er en viktig cytokin for normal DC differensiering in vivo 41. Likevel kan cytokin stimulering være en nyttig metode for å genrangere høyt antall DC in vitro for eksperimentering. Evnen til å underkaste disse cellene som genereres fra denne protokollen til andre analyser som immunofluorescens flekker, strømningscytometri, allo reaksjonsstudier og metaboliske studier øker nytten av denne fremgangsmåte. Disse in vitro DC tjene som en god modell for å forbedre kunnskapen til DC-utvikling, modning og antigen presentasjon som er tidligere vanskelig å gjøre med de sjeldne antall in vivo DC.
DCs 'evne til å regulere immunologisk immunitet mot toleranse gjør dem attraktive kandidater i terapi mot kreft og autoimmune sykdommer 42, 43, 44, 45. Immunogene DC generert på denne protokollen kan brukes til å forbedre vaksinasjon effekt mot infeksjonssykdommer og tumorer; mens tolerogene DC kan brukes til å kontrollere uønskede T-celle responser og forhindre avvisning etter transplantasjon. intrikatebalanse mellom immunitet og toleranse avhenger umåtelig på DC differensiering status. DC differensiering er en koordinert cellular program som er styrt av flere signalveier og metabolske skjebne. Ulike differensierings statene DC varierer i bioenergetisk og biosyntese behov; for eksempel aktiverte DC krever mer energiske metabolske tilpasninger viktige for overlevelse og migrasjon i forhold til DC på hviletilstand. Det er viktig å merke seg at vitamin D3, deksametason og rapamycin er kjent for sin evne til å indusere tolerogene DC, har blitt beskrevet å påvirke DC metabolisme. I denne utredningen, ble den energiske metabolismen av moDCs fra ulike differensierings tilstander preget hjelp ekstracellulære fluks analysatorer og tolerogene moDCs utstilt høyeste metabolske plastisitet og LPS-indusert modning redusert dette plastisitet. Anabole metabolisme støtter DCs modning mens katabole metabolisme påvirkninger tolerogene DC fungerer 46. DCSgenerert fra denne protokollen kan brukes til å vurdere om å endre den metabolske tilstand av DC holder nøkkelen til å endre immunitet og toleranse i terapi. I konklusjonen, presenterte vi en protokoll for generering av umodne, tolerogene og modne moDCs avgjørende for å studere DCs 'immunfunksjoner.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Direktoratet for Science, Technology and Reasearch kjernefinansiering (til JEC).
Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | PBMC isolation |
Syringe | Becton, Dickinson | 302832 | PBMC isolation |
1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | PBMC isolation |
15 mL falcon tube | Falcon | 352096 | PBMC isolation |
50 mL falcon tube | Falcon | 352070 | PBMC isolation |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | PBMC isolation |
0.2 µm filter | Sartorius stedim biotech | 17597 | PBMC isolation |
MACs kit | Miltenyi biotec | 130-042-201 | Monocyte enrichment |
MiniMACS Separator | Miltenyi biotec | 130-042-102 | Monocyte enrichment |
Cell culture grade water | Invitrogen, Life Technologies | Cell culture | |
RPMI | Gibco, Life Technologies | 11875-093 | Cell culture |
FBS | Hyclone | SH30070103 | Cell culture |
Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140 | Cell culture |
Phosphate Buffered Saline |
Gibco, Life Technologies | 10010-031 | Cell culture |
NEAA | Gibco, Life Technologies | 11140-040 | Cell culture |
EDTA | Gibco, Life Technologies | 15575 | Cell culture |
HEPES | Gibco, Life Technologies | 15630-080 | Cell culture |
Sodium Pyruvate | Gibco, Life Technologies | 11360-070 | Cell culture |
GM-CSF | Miltenyi biotec | 130-093-868 | Cell culture |
IL-4 | Miltenyi biotec | 130-093-924 | Cell culture |
Vitamin D3 | Sigma | D1530 | Cell culture |
Dexamethasone | Sigma | D2915 | Cell culture |
LPS | Sigma | l2755 | Cell culture |
trypan blue | Gibco, Life Technologies | 15250-061 | Cell culture |
PerCP-conjugated HLADR | BioLegend | 307628 | Cytometry |
PE-conjugated CD80 | BD Biosciences | 557227 | Cytometry |
PE-conjugated CD83 | BD Biosciences | 556855 | Cytometry |
PE-conjugated CD86 | BD Biosciences | 555665 | Cytometry |
APC-conjugated CD11c | BD Biosciences | 340544 | Cytometry |
PE-conjugated CD14 | Miltenyi biotec | 130-091-242 | Cytometry |
PE-conjugated BDCA3 | Miltenyi biotec | 130-090-514 | Cytometry |
APC-conjugated ILT3 | eBioscience | 12-5139-73 | Cytometry |
Isotype matched PerCP- conjugated Mab |
BioLegend | 400250 | Cytometry |
Isotype matched PE- conjugated Mab |
Miltenyi biotec | 130-091-835 | Cytometry |
Isotype matched APC- conjugated Mab |
Miltenyi biotec | 130-091-836 | Cytometry |
BD LSR II Flow Cytometer | BD Pharmingen | BD LSR II | Cytometry |
cytofix/cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Cytometry |
APC/CY7-conjugated CD25 | BD pharmingen | 557753 | Cytometry |
PE/CY7-conjugated CD4 | Biolegend | 300512 | Cytometry |
PerCP-conjugated CD3 | Biolegend | 300428 | Cytometry |
EasySep Human CD4+ T cell enrichment kit | STEMCELL Technologies | 19052 | Alloreaction study |
EasySep magnet | STEMCELL Technologies | 18000 | Alloreaction study |
Cell Trace CFSE cell proliferation kit | Molecular probes | C34554 | Alloreaction study |
HBSS | Gibco, Life Technologies | 14025092 | Alloreaction study |
Alexa Fluor 647-conjugated FoxP3 | BD Biosciences | 560889 | |
Milliplex MAP Human Cytokine/Chemokine magnetic bead panel |
Millipore | HCYTOMAG-60K | Cytokine analysis |
5 mL Polystyrene tube | Falcon | 352058 | Cytokine analysis |
Luminex Sheath Fluid | Millipore | SHEATHFLUID | Cytokine analysis |
FLEXMAP 3D system with xPONENT software | Luminex Corporation | FLEXMAP 3D | Cytokine analysis |
MitoTracker Red CMXRos | Cell Signalling | 9082 | Mitochondrial activity |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | Mitochondrial activity |
XF Assay Medium (OCR) | Seahorse Bioscience | 102352-000 | Metabolic adaptation |
Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | Metabolic adaptation |
XF Base Medium (ECAR) | Seahorse Bioscience | 102353-100 | Metabolic adaptation |
L-glutamine | Gibco, Life Technologies | 25030-081 | Metabolic adaptation |
Calibrant | Seahorse Bioscience | 100840-000 | Metabolic adaptation |
XF Cell Mito Stress kit | Seahorse Bioscience | 103015-100 | Metabolic adaptation |
XF Glycolysis Stress kit | Seahorse Bioscience | 103020-100 | Metabolic adaptation |
Seahorse | Seahorse Bioscience | XFe96 | Metabolic adaptation |