Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.
Immunrespons resultater fra et komplekst samspil mellem antigenet uspecifikke medfødte immunsystem og antigenspecifikke adaptive immunsystem. Immunsystemet er en konstant balance i at opretholde tolerance over for selv-molekyler og hurtig reaktion på patogener. Dendritiske celler (DC'er) er kraftige professionelle antigenpræsenterende celler, der linker det medfødte immunsystem til det adaptive immunsystem og balance den adaptive respons mellem selv og ikke-selv. Afhængigt af modning signaler, kan umodne dendritiske celler selektivt stimuleret til at differentiere til immunogene eller tolerogene DC'er. Immunogene dendritiske celler tilvejebringer spredning signaler til antigenspecifikke T-celler til klonal ekspansion; mens tolerogene dendritceller regulere tolerance ved antigen-specifik T-celle-deletion eller klonal ekspansion af regulatoriske T-celler. På grund af denne unikke egenskab, er dendritiske celler meget efterspurgt som terapeutiske midler mod cancer og autoimmune diseases. Dendritiske celler kan belastes med specifikke antigener in vitro og injiceret i det menneskelige legeme til at montere et specifikt immunrespons både immunogen og tolerogen. Dette arbejde viser et middel til at generere in vitro fra monocytter, umodne monocyt dendritiske celler (moDCs), toleranceudviklende og modne moDCs der afviger i overflademarkør ekspression, funktion og metaboliske fænotyper.
DC blev først beskrevet af Paul Langerhans (Langerhanske celler) i slutningen af det nittende århundrede som der refereres til af Jolles 1 og præget af Ralph Steinman og Zanvil Cohn i 1973 som anerkendt dem som professionelle antigen-præsenterende celler 2. DC'er er fundet i perifert blod og i de fleste væv i kroppen, navnlig rigelige i væv, der udsættes for det eksterne miljø, såsom huden (til stede som Langerhanske celler) og i garnering i næsen, lunger, mave og tarme, der muliggør dem at støde ydre antigener. Umodne DC'er har endocytisk kapacitet, men relativt lav kapacitet til at stimulere T-celler 3. Umodne DC'er udtrykker forskellige mønstergenkendelse receptorer (PRRS) at fange patogen-associeret molekylære mønstre (PAMPs) eller skade-associeret molekylære mønstre (dæmper) 4. Aktivering faresignaler drive modning mod immunogene DC'er mens selv-molekyler resulterer i T-celle unresponsiveness og apoptose 5. Immunogene DC'er er kendetegnet ved opregulering af MHC-molekyler og co-stimulatoriske overflademolekyler og deres evne til prime naive T-celler 6,7.
Umodne DC'er kan også modnet til en Treg-inducerende eller tolerogen tilstand som reaktion på vitamin D3-metabolitten 1a, 25 (O) 2-D3 og visse immunsuppressive midler som interleukin-10 (IL-10), dexamethason og rapamycin 8-9. Tolerogeniske DC'er er kendetegnet ved deres ekspression af immunoreceptor tyrosin-baserede inhibitoriske motiver (ITIM'er) indeholdende overfladereceptorer og ligander. Signal transduktion af ITIM'er indeholder ILT familiemedlemmer, ILT3 og ILT4 i tolerogeniske udviklingslandene hæmmer alloproliferation og køre Foxp3 + treg ekspansion 10,11. Disse unikke egenskaber af tolerogeniske DC'er fører til deres dybe potens in vivo, nemlig evnen til at inducere varig tolerance over for transplanterede allogene transplantater og supprESS udviklingen af autoimmune sygdomme. Tolerogeniske DC'er kan ses derfor som en undertype af modne polariseret DC'er, som fungerer ved inhibering af immunaktivering.
I øjeblikket er der to generelle undergrupper af dendritiske celler i humant perifert blod: plasmacytoide DC'er og myeloide DC'er 12. Cirkulerende DC'er er sjældne konstituerende til mindre end 2% af leukocytter i menneskeblod, og dette udgør en vanskelighed til isolering af et passende antal DC'er at studere deres immunregulatoriske funktioner. For at overvinde dette problem, er monocyt differentieres DC'er anvendes som en in vitro model for studiet af dendritiske celle funktion. Disse in vitro DC'er har lignende receptorer og funktioner i forhold til in vivo DC'er. Detaljeret sammenligning af in vivo DC'er og in vitro genererede monocytderiverede DC'er (moDCs) er undersøgt af andre laboratorier 13, 14, 15. Det er også rapporteret, at moDCs og CD1c + DCs svarede på antigen-præsenterende og inducere T-celle funktion 15.
I dette papir, beskriver vi en fremgangsmåde til generering af umodne moDCs fra perifere blodmonocytter og derefter differentiere dem i immunogene og tolerogeniske DC'er. Disse monocytafledte dendritiske celler (moDCs) er karakteriseret ved deres overflademarkører, cytokinprofil, immunregulatoriske funktioner og metaboliske tilstande. Immunogene og tolerogene dendritiske celler producerer forskellige cytokiner, som resulterer i udvidelse af enten allogene T-celler eller regulatoriske T-celler. I dette papir, er cytokin profilering udført med systemer, der anvender multiplex teknologi. Vækstmedium af celler inkuberes med antistof immobiliseret farvekodede perler og læse i en kompakt analysator. Metaboliske tilstande af DC'er analyseres med ekstracellulære flux analysatorer, der måler oxygenforbrugshastighed, en indikator for cellulær respiration, og ekstracellulære forsuringshastighed som afspejler glycolytiskeflux i dendritiske celler. Måling af disse bioenergetik satser tilvejebringer et middel til at spore ændringer i cellulær metabolisme, der er afgørende i dendritisk celle udvikling og funktion.
Dette papir beskriver en metode til at generere fra monocytter umodne moDCs, tolerogeniske moDCs og modne moDCs. De vigtige skridt i denne protokol er diskuteret i detaljer i de følgende afsnit. Det er vigtigt at bemærke, at humant perifert blod anvendes som udgangsmateriale i denne protokol og universelle forholdsregler for håndtering af humant blod bør praktiseres. Selv om det er teknisk muligt at udlede DC'er fra knoglemarv hos mennesker 24, er in vitro DC differentiering af celler fundet i perifert blod foretrækkes på grund af tilgængeligheden af perifert blod sammenlignet med knoglemarv. Blandt de celler findes i perifert blod, er hæmatopoietiske CD34 + stamceller og monocytter almindeligt anvendt til in vitro generering af DC'er. Hæmatopoietiske CD34 + stamceller dyrkes med GM-CSF og TNF-α til at udlede CD1a + og CD14 + delmængder, som derefter yderligere differentieret i Langerhanslignende celler og dendritiske celler. Omvendt monocytter dyrkes i GM-CSF og IL-4 til at generere umodne moDCs. Flere protokoller anvendes til berigelse af monocytter fra perifert blod; for eksempel ved tilslutning til plast retter, slæmning og isolation kits 25, 26 Fordelene ved vedhæftning protokollen er minimale skader på celler og relativt omkostningseffektivt dog celle renhed kan blive kompromitteret.; og en ekstra trin er nødvendigt at løsne cellerne til yderligere forsøg. Elutriation er en teknik, der adskiller celler baseret på deres størrelse og tæthed. Fordelene ved slæmning er cellelevedygtighed og monocytter kan let anvendes til yderligere forsøg; men denne teknik er begrænset af tilgængeligheden af en elutriator og den manglende evne til at separere forskellige populationer af celler (T-celler og monocytter) med lignende bundfældelsesparametrene. Kommercielt tilgængelige isolation kits anvender magnetiske mikroperler til enten positivt vælge ellervælge den monocytiske befolkning negativt. Nogle protokoller er forudindtaget mod monocyt isolation ved hjælp af den negative udvælgelse som de isolerede monocytter forblive "uberørt" (ikke bundet af markører eller mikrokugler). I denne protokol, blev CD14 perler brugt til positive udvalgte humane monocytter fra PBMC'er. CD14 mangler et cytoplasmatisk domæne og binding af antistof til CD14 ikke udløser signaltransduktion. Desuden vil mikroperlerne løsnes fra monocytter efter dyrkning og dermed ikke hindrer differentieringsprocessen. Desuden er CD14 kraftigt udtrykt på de fleste monocytter og svagt på neutrofiler og nogle myeloide dendritiske celler, derfor denne fremgangsmåde til isolation resulterer i højere celle renhed end de andre metoder 17.
Blodmonocytter kan opdeles i DC'er eller makrofager og skæbne monocytter i høj grad afhænger af cytokin miljø. I dette papir, er moDCs genereres ved tilsætning af granulocyt-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) Og Interleukin 4 (IL-4) til humane perifere blodmonocytter. GM-CSF er påkrævet for monocyt overlevelse og IL-4 udøver en inhiberende aktivitet på makrofag differentiering; og det kombinatoriske tilsætning af GM-SCSF og IL-4 til monocytter giver en større procentdel af umodne moDCs sammenlignet med individuel cytokin 27. Der er andre protokoller, der genererer moDCs ved tilsætning tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α), interferon-alfa (IFN-α) og interleukin 13 (IL-13) til perifere blodmonocytter 28, 29, 30. Kombinationen af GM-CSF og IL-4 blev optimeret i 1990'erne og nu en accepteret protokol, der genererer plast umodne DC'er differentieret i immunogene eller tolerogeniske moDCs og polariseret i Th1, Th2 eller Th17 fremme moDCs.
Umodne moDCs er differentieret i tolerogeniske moDCs ved tilsætning af vitamin D3 og dexamethason. Der er flere protokoller til at generere tolerogeniske DC'er for eksempel vianuklear faktor-kappa B (NF-kB) inhibering, β-catenin-aktivering, vitamin D3, Dexamethason og rapamycin 31, 32, 33, 34, 35, 9, 36, 37. Selvom både vitamin D3 og dexamethason alene er blevet rapporteret at inducere en tolerogenisk virkning på DC'er, kombinationen af vitamin D3 og dexamethason resultere i en større undertrykkelse af alloproliferation end når der anvendes individuelle lægemidler. Derfor blev den eksisterende protokol for frembringelse af toleranceudviklende DC'er modificeret til en kombination af vitamin D3 og dexamethason. Denne metode er ved at blive accepteret som en model for humane tolerogeniske DC'er med et terapeutisk værktøj. Det er også vigtigt at bemærke, at den rekonstituerede vitamin D3 og dexamethason har en kort holdbarhed.
I denne protokol, blev Lipopolysaccharider (LPS) tilsat som en DC modning inducer. Umodne moDCs kan også induceres til modning bruge pro-inflammatorisk cocktail:(TNF-α), Interleukin 1-beta (IL-1β), interleukin 6 (IL-6) og prostaglandin E2) eller pro-inflammatoriske cytokiner (TNF-a og interferon gamma (IFN-Γ)). Pro-inflammatoriske cocktail genererer modne moDCs med høj co-stimulerende og migrerende funktioner, men de producerer relativt lave niveauer af IL-12 38. TNF-α eller IFN-Γ alene ikke er i stand til at inducere en stabil dendritisk fænotype 39. LPS stimulerer Toll-lignende receptor 4 (TLR4), medierer aktiveringen af NF-kB og mitogenaktiveret proteinkinaser (MAPK'er) for at inducere DC modning. DC modning induceret af LPS viser en opregulering af DC modning markører (CD83, CD86, HLA-DR) og førte også til produktionen af IL-12p70. Desuden kan dette trin modificeres yderligere til at parre LPS med TLR3 agonister til at producere modne DC'er til kliniske cancervacciner. I dette papir, er tolerogeniske DC'er vist at være resistente over for modning ved LPS behandling. Disse semi-modne lignende DC'er er ikke immunogene og ikke ReleaSE proinflammatoriske cytokiner 40.
Begrænsningerne ved denne protokol ligge i differentieringsprocessen. Processen tager 8 dage fra dag 0 til dag 7, som udgør en vanskelighed, der skal tilpasses til high throughput analyser. En ændring i protokollen er forpligtet til at forkorte differentiering processen endnu give høje antal af levedygtige DC'er i de forskellige stater. For det andet er de udviklingslandene genereres ved tilsætning af cytokiner i denne protokol, og disse cytokiner ikke opretholde DC befolkning i længere tid. Endvidere er cytokiner anvendes i koncentrationer meget højere end in vivo og kunne resultere i forudindtaget udvikling af veje, der ikke er fysiologisk identisk med in vivo DC'er. For eksempel in vitro kulturer af DC-forstadier er blevet vist at reagere på GM-CSF, som ikke er en væsentlig cytokin for normal DC differentiering in vivo 41. Ikke desto mindre kan cytokinstimulering være en nyttig metode til gensats høje antal af DC in vitro for eksperimenter. Evnen til at underkaste disse celler genereret fra denne protokol til andre analyser såsom immunfluorescensfarvning, flowcytometri, allo reaktion studier og metaboliske undersøgelser øger anvendeligheden af denne metode. Disse in vitro udviklingslandene tjene som en god model for at forbedre kendskabet til DC udvikling, modning og antigen præsentation, som er tidligere vanskeligt at gøre med de sjældne antal in vivo DC'er.
DCs 'evne til at regulere immunologisk immunitet versus tolerance gør dem attraktive kandidater i terapi mod cancer og autoimmune sygdomme 42, 43, 44, 45. Immunogene DC'er genereret på denne protokol kan bruges til at forbedre vaccination effektivitet mod infektionssygdomme og tumorer; mens tolerogeniske DC'er kan anvendes til at styre uønsket T-cellereaktioner og forebygge afvisninger efter transplantation. Den indvikledebalance mellem immunitet og tolerance afhænger uhyre på DC differentiering status. DC differentiering er et koordineret cellulært program, der er styret af flere signalveje og stofskiftet. Forskellige differentieringsfaktorer tilstande af DC forskellige i bioenergetic og biosyntese behov; for eksempel aktiverede DC'er kræver mere energiske metaboliske tilpasninger vigtige for overlevelse og migration i forhold til udviklingslandene på hviletilstand. Det er vigtigt at bemærke, at vitamin D3, dexamethason og rapamycin er kendt for deres evne til at inducere tolerogeniske DC'er, er blevet beskrevet at påvirke DC metabolisme. I dette papir, blev den energiske metabolisme af moDCs fra forskellige differentieringsfaktorer tilstande karakteriseret ved anvendelse ekstracellulære flux analysatorer og tolerogeniske moDCs udviste den højeste metaboliske plasticitet og LPS-induceret modning faldt denne plasticitet. Anabolske stofskifte understøtter DCs modning mens kataboliske metabolisme påvirkninger toleranceudviklende DC fungerer 46. de DC'ergenereret fra denne protokol kan bruges til at vurdere, om ændring af det metaboliske tilstand udviklingslandene er nøglen til at ændre immunitet og tolerance i terapi. Afslutningsvis præsenterede vi en protokol til generering af umodne, toleranceudviklende og modne moDCs afgørende for at studere DC'er 'immunregulatoriske funktioner.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Styrelsen for Videnskab, Teknologi og Reasearch Core Funding (til JEC).
Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | PBMC isolation |
Syringe | Becton, Dickinson | 302832 | PBMC isolation |
1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | PBMC isolation |
15 mL falcon tube | Falcon | 352096 | PBMC isolation |
50 mL falcon tube | Falcon | 352070 | PBMC isolation |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | PBMC isolation |
0.2 µm filter | Sartorius stedim biotech | 17597 | PBMC isolation |
MACs kit | Miltenyi biotec | 130-042-201 | Monocyte enrichment |
MiniMACS Separator | Miltenyi biotec | 130-042-102 | Monocyte enrichment |
Cell culture grade water | Invitrogen, Life Technologies | Cell culture | |
RPMI | Gibco, Life Technologies | 11875-093 | Cell culture |
FBS | Hyclone | SH30070103 | Cell culture |
Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140 | Cell culture |
Phosphate Buffered Saline |
Gibco, Life Technologies | 10010-031 | Cell culture |
NEAA | Gibco, Life Technologies | 11140-040 | Cell culture |
EDTA | Gibco, Life Technologies | 15575 | Cell culture |
HEPES | Gibco, Life Technologies | 15630-080 | Cell culture |
Sodium Pyruvate | Gibco, Life Technologies | 11360-070 | Cell culture |
GM-CSF | Miltenyi biotec | 130-093-868 | Cell culture |
IL-4 | Miltenyi biotec | 130-093-924 | Cell culture |
Vitamin D3 | Sigma | D1530 | Cell culture |
Dexamethasone | Sigma | D2915 | Cell culture |
LPS | Sigma | l2755 | Cell culture |
trypan blue | Gibco, Life Technologies | 15250-061 | Cell culture |
PerCP-conjugated HLADR | BioLegend | 307628 | Cytometry |
PE-conjugated CD80 | BD Biosciences | 557227 | Cytometry |
PE-conjugated CD83 | BD Biosciences | 556855 | Cytometry |
PE-conjugated CD86 | BD Biosciences | 555665 | Cytometry |
APC-conjugated CD11c | BD Biosciences | 340544 | Cytometry |
PE-conjugated CD14 | Miltenyi biotec | 130-091-242 | Cytometry |
PE-conjugated BDCA3 | Miltenyi biotec | 130-090-514 | Cytometry |
APC-conjugated ILT3 | eBioscience | 12-5139-73 | Cytometry |
Isotype matched PerCP- conjugated Mab |
BioLegend | 400250 | Cytometry |
Isotype matched PE- conjugated Mab |
Miltenyi biotec | 130-091-835 | Cytometry |
Isotype matched APC- conjugated Mab |
Miltenyi biotec | 130-091-836 | Cytometry |
BD LSR II Flow Cytometer | BD Pharmingen | BD LSR II | Cytometry |
cytofix/cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Cytometry |
APC/CY7-conjugated CD25 | BD pharmingen | 557753 | Cytometry |
PE/CY7-conjugated CD4 | Biolegend | 300512 | Cytometry |
PerCP-conjugated CD3 | Biolegend | 300428 | Cytometry |
EasySep Human CD4+ T cell enrichment kit | STEMCELL Technologies | 19052 | Alloreaction study |
EasySep magnet | STEMCELL Technologies | 18000 | Alloreaction study |
Cell Trace CFSE cell proliferation kit | Molecular probes | C34554 | Alloreaction study |
HBSS | Gibco, Life Technologies | 14025092 | Alloreaction study |
Alexa Fluor 647-conjugated FoxP3 | BD Biosciences | 560889 | |
Milliplex MAP Human Cytokine/Chemokine magnetic bead panel |
Millipore | HCYTOMAG-60K | Cytokine analysis |
5 mL Polystyrene tube | Falcon | 352058 | Cytokine analysis |
Luminex Sheath Fluid | Millipore | SHEATHFLUID | Cytokine analysis |
FLEXMAP 3D system with xPONENT software | Luminex Corporation | FLEXMAP 3D | Cytokine analysis |
MitoTracker Red CMXRos | Cell Signalling | 9082 | Mitochondrial activity |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | Mitochondrial activity |
XF Assay Medium (OCR) | Seahorse Bioscience | 102352-000 | Metabolic adaptation |
Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | Metabolic adaptation |
XF Base Medium (ECAR) | Seahorse Bioscience | 102353-100 | Metabolic adaptation |
L-glutamine | Gibco, Life Technologies | 25030-081 | Metabolic adaptation |
Calibrant | Seahorse Bioscience | 100840-000 | Metabolic adaptation |
XF Cell Mito Stress kit | Seahorse Bioscience | 103015-100 | Metabolic adaptation |
XF Glycolysis Stress kit | Seahorse Bioscience | 103020-100 | Metabolic adaptation |
Seahorse | Seahorse Bioscience | XFe96 | Metabolic adaptation |