Introduction
내생 포자는 대사 세균이 불리한 환경에서 지속 할 수 있도록 박테리아의 휴면 형태이다. 많은 포자 - 형성 박테리아 포자 형성 영양 결핍에 의해 유도되지만,이 공정은 산소 또는 다른 스트레스 1 pH를 노출의 변화에 의해 제어 될 수있다. 이들 대사 휴면 포자 형태 동안 박테리아는 UV 방사선, 탈수, 고온 및이 냉동 레지스트. 포자 형성 과정에 대한 지식의 대부분 모델에서 생체 연구 고초균에서 온다. 포자 형성 과정은 DNA 복제 및 축 3,4- 필라멘트의 형성으로 시작된다. 비대칭 격막은이 불평등 크기의 구획에 셀을 분할한다. 더 큰 구획은, 머더 셀은 더 작은 구획은 forespore을 삼키기. 머더 셀과 도만을 방출 포자 결국 lyses 머더 세포 성숙의 유전자 발현을 조정 forespore 두주변 환경 1에 t 포자.
포자 구조 및 조성은 다양한 세균 종에 걸쳐 보존되어있다. 포자 코어는 식물 세포보다 낮은 수분 함량을 갖고 dipicolinic 산 (DPA) -1,2- 풍부하다. 포자 형성하는 동안, DPA 물 교환 포자 코어로 펌핑된다. 코어 주변 대부분의 포자 형성 균에, 발아 (germinants)을 자극하는 작은 분자를 인식하는 수용체 2 위치, 내부 포자 막이다. 단 포자의 내막 밖에있는 세포벽의 펩티도 글리 칸 층이다. 특수한 펩티 층 (피질) 세포벽 펩티을 둘러싸고 [N 아세틸 글루코사민 (NAG)와 N-acetylmuramic 산 (NAM)이 교대] 세포벽 펩티 같은 많은 구성 요소로 구성된다. 그러나, 피질의 NAM 잔기의 약 50 %가 무람-δ 락탐 5,6- 변환되었습니다 단백질이 여러 층이다.
발아 과정을 제어하는 포자 형성 세균 매우 중요하다. 싹 트는 수용체는 해당 germinants 2와 상호 작용할 때 발아가 시작됩니다. 많은 포자 - 형성 박테리아에서 이러한 germinants 2 이의 아미노산, 당, 뉴클레오티드, 이온 또는 이들의 조합이다. C. 디피 포자 발아 특정 담즙산 [예를 들어, 타우로 콜린 산 (TA)] 및 아미노산 (예컨대, 글리신) 7-10의 조합에 의해 개시된다. C. 사이의 차이가 있지만 디피 발아 경로와에서 공부 경로 다른 포자 형성같은 B와 박테리아, 서브 틸리 모든 공통 식물 세포는 포자 발아 2,8 성장할 수 있도록 포자 외피 저하하는 절대 조건이다. 또는 SLEC (B. 서브 틸리에서 발견) (많은 클로스 트리 디아에서 발견) 코어 텍스 저하는 SCLEs CwlJ / SleB에 의해 달성 될 수있다. 피질 가수 분해 세포벽 및 포자의 제한을 감소시킨다. 이는 전체 코어 수분 보충, 세포 대사 (2)에 필요한 단백질의 대부분을 재 활성화에 필요한 단계 수 있습니다.
포자가 발아 할 때 위상이 어두운 상태로 공정 상 밝은 상태로부터 휴면 포자 변화는 600에서 광학 밀도 (OD)의 변화에 의해 측정 할 수있다 나노 11. 이전의 보고서는 OD의 변화의 대부분은 포자 12 DPA의 출시로 인해 있음을 시사한다. 우리의 최근의 연구 동안, 우리는 C.의 타이밍을 비교하고자 남과 어울리지 않는 포자 발아 및 모니터링되는DPA와 피질 조각 9 릴리스. 그들은 포자를 발아가 발표되기 시작으로이 연구는 피질 조각의 방출을 모니터링하는 것이 중요했다.
여기에서 사용되는 비색 분석이 환원 말단에 당류를 검출하는 방법에 기초 하였다 Ghuysen 외. (13)을 개발 하였다. 다른 사람이 환원당 (14)의 검출을위한 프로토콜을 설명했습니다 또는 이러한 프로토콜 15을 수정 한 때문에이 주제에 대한 문헌은 혼란 스러울 수 있습니다. 여기서, C. 발아에서 해방 환원당의 비색 검출 상세히에게 단계별 방법 우리 남과 어울리지 않는 포자. 이 연구는 C.를 사용하지만 남과 어울리지 않는 포자는 다른 포자 형성 균의 포자의 발아 중에 방출 된 환원당이 프로토콜 9,16,17 검출 할 수있다.
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Protocol
1. 생성 샘플
- 열 C를 활성화 디피는 얼음에 30 분 및 저장을 위해 65 ° C에서 포자.
참고 : C를 앞서 설명한 바와 같이 7,9,10 디피 포자를 제조 및 정제 할 수있다. - X는 샘플의 수는 분석 중에 촬영하는 X + 1 용액에서 발아 용액을 제조 하였다.
참고 : 박테리아의 종류가 연구되고 포자에 발아 솔루션은 고유의 것입니다. C.을 분석하십시오 디피 포자 발아, 우리는 10 mM 트리스 (PH 7.5), 150 mM의 NaCl을 탈 이온수 100 mM의 글리신 및 10 mM의 타우로 콜린 산의 용액을 사용 하였다. - 분석을 시작하기 전에, 피질 조각 검출을위한 빈 역할을하는 포자없이 발아 솔루션의 1.0 ml의 샘플을 그립니다.
- OD 빨리 발아 솔루션 및 소용돌이에 ~ 3.0 (600)에 포자를 추가합니다.
참고 : B. 우리의 발아 연구 내용 서브 틸리 스, 우리는 같은 OD를 사용 (6)C. 용으로 00 포자 디피.
참고 : 포자의이 금액은 C. 동안 모니터링 피질 조각 방출을 위해 잘 작동 남과 어울리지 않는 포자 발아. 이 분석에 사용 된 포자의 크기는 각각의 박테리아 균주 또는 실험적으로 결정되어야한다. - 즉시 14,000 × g에서 1 분 동안 실온에서 원심 분리 포자를 첨가 한 후 1.2 ml의 샘플을 제거한다. 이것은 제로 시점이다.
- 후속 피질 단편 분석을위한 신선한 튜브 원심 분리 된 샘플로부터 상등액 1.0 ㎖에 옮긴다.
주 : 테르븀 형광 9,18,19에 기초한 분석을 이용하여 상기 용액에서 DPA의 검출을위한 별도의 100 μL 샘플을 제거 DPA가 모니터링해야해야한다. - -80 ° C에서 수집 된 샘플을 고정.
- 모든 시점이 완료 될 때까지 반복하여 일정한 간격으로 1.4 및 1.5 단계를 반복합니다.
참고 : 시간의 원심 분리 및 샘플링 시점 적은 일에 필요하기 때문에2 분 떨어져 우리의 절차를 수행하는 동안 불가능했던, 그래서 우리의 샘플링 간격은 한 번에 14 분 동안 매 2 분이었다. - 0, 12.5, 25, 50, 100, 250, 500, 5000 : 설탕 검출 및 정량화를 감소시키기위한 포지티브 대조군으로서, N의 -acetylglucosamine (nmol의) 다음의 양을 포함한다. 껍질 샘플과 동시에 이들 샘플을 준비하고, 표준 곡선이 포자를 발아에 의해 생성 된 데이터와 관련되도록 껍질 샘플과 함께 실행.
- 모든 시점의 샘플을 수집 한 후, 샘플을 동결 건조.
참고 : 우리는 2 ml의 스크류 캡 튜브에 우리의 샘플을 동결 건조.
2. 코어 텍스 조각을 측정
- 1 %의 페놀 및 0.5 % β 메르 캅토 에탄올이 보충 된 3 N HCl을 120 μL에 재현 탁하여 동결 건조 샘플.
- 2 ml의 스크류 캡 튜브에 재현 탁 샘플을 전송합니다.
참고 : 재현성를 들어, 모든 동결 건조 된 시료를 재현 탁하고 전송되어 있는지 확인합니다. <리> 4 시간 동안 95 ° C에서 재순환 수조에서 샘플을 품어. - 그들은 멋진 때까지 배양 한 후, 얼음에 샘플을 배치합니다.
- 3 M NaOH를 120 μL로 샘플을 중화.
- 포화 중탄산 나트륨 용액 80 ㎕를 각 샘플 및 와류에 5 % 아세트산 무수물 용액 80 μL를 추가한다.
- 실온에서 10 분 동안 샘플을 인큐베이션.
- 정확히 3 분 동안 다시 95 ° C의 물을 욕조에 샘플을 전송합니다.
참고 :이 단계는 민감하고 긴 시간이 하향 신호의 개발에 영향을 미칠 수있는 시간입니다. - 수조에서 샘플을 제거하고 얼음에 냉각.
- 각 튜브와 소용돌이에 6.54 % K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O의 400 μl를 추가합니다.
- 정확히 7 분 동안 95 ℃에서 재순환 수욕 샘플을 인큐베이션.
참고 :이 단계는 민감하고 긴 시간이 하향 신호의 개발에 영향을 미칠 수있는 시간입니다. - 없애다5 분 동안 얼음에 샘플 및 장소.
3. 색상 시약
- 샘플을 얼음 (단계 2.12)에 있지만, 컬러 시약을 준비한다. (; 에를리히 시약 DMAB) 빙초산의 1.9 ml의에서 P는 -dimethylaminobenzaldehyde의 0.320 g을 녹여.
참고 : 시약 시간, 온도, 빛에 민감하고 사전에 할 수 없습니다. - DMAB가 완전히 용해 후 10 N 염산과 소용돌이의 100 μl를 추가합니다.
- 빙초산과 소용돌이의 5 ML을 추가합니다.
4. 비색 반응
- 전송 각 100 ㎕ 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 피질 샘플을 냉각시켰다.
- 각 샘플에 갓 준비 색 용액 700 μl를 추가합니다.
- 즉시 37 ° C의 물을 욕조에 샘플을 전송하고 정확히 20 분 동안 품어.
- 무려 96 웰 플레이트에 각 시료 200 μl를 전송합니다.
- 접시에 585 nm에서 샘플을 정량화리더. 샘플은 노란색에서 시작해야하며, 긍정적 인 반응이 보라색으로 이동합니다. 더 피질에 존재하는, 깊은 보라색 색상입니다.
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Representative Results
표 1 NAG 표준을 사용하여 통상적 인 결과를 나타낸다. 데이터는 표준 곡선을 생성하는데 사용된다. 표 2는 100 mM의 글리신 및 10mM의 TA (발아 촉진 조건) 또는 100 mM의 글리신 만 (비 발아 조건)으로 보충 발아 버퍼에서 발아 시험에서 전형적인 결과를 나타낸다. TA, C.가없는 디피 포자가 발아하지 않고, 용액의 피질 단편의 존재 하에서 거의 변화가있다. 그러나 두 TA 글리신, C.의 존재 남과 어울리지 않는 포자는 발아 및 솔루션에 피질 조각을 놓습니다. 이는 반응 샘플의 시간 경과에 OD 585의 상승이 관찰된다. 이 분석 중에 발표 피질 조각 (nmol의)의 총 금액은 (1B)도 유사한 표준 곡선을 사용하여 계산 하였다. 이 분석에서, 피질의 대부분은 가수 분해 (또는 해제) 15분 포스트에 의해(; 이전 출판 (7)과 일치 그림 2) 포자의 대부분이이 기간에 발아 것을 제안 싹 트는 노출.
색상 시약의 샘플을 개발 한 후, 대부분의 샘플. 육안으로 보라색 색상을 보여 1 N- 아세틸 글루코사민에서 발생하는 대표적인 샘플을 보여줍니다하지 않을 수 있습니다. 샘플의 대부분은 눈에 보이는 보라색 색상을 표시하지 않습니다. 그러나, 250 nmol의, 500 nmol의 5,000 nmol의 샘플은 음성 대조군 (0 nmol의)에서 시각적으로 다른 나타납니다. OD 585 nm에서 측정 할 때, 신호가 가장 선형 회귀 (= 0.999 R (2))에 맞는 생성.
그림 1. 감지 N 아세틸 글루코사민 (A) N 아세틸 글루코사민 샘플 (0 nmol의 12.5 nmol의,25 nmol의, 50 nmol의, 100 nmol의, 250 nmol의, 500 nmol의, 5000 nmol의)은 상술 된 절차에 따라 동결 건조와 반응시켰다. (B) 시료를 96- 웰 플레이트 및 585 nm에서 검출 된 반응 물질의 양에 첨가 하였다. 신호는 표준 곡선을 생성 하였다. 
그림 2 :. 발아 결과의 그래픽 표현은 표 2의 계산 nmol의 피질 시간 대 꾸몄다했다. (●) 100 mM의 글리신 + 10 mM의 TA; (■) 100 mM의 글리신. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| NAG 농도 (nmol의) | OD 585 |
| 0 | 0.047 |
| 12.5 | 0.054 |
| (25) | 0.066 |
| (50) | 0.084 |
| (100) | 0.128 |
| (250) | 0.285 |
| (500) | 0.556 |
| 5,000 | 4.0 |
| 빈 = | 0.046 |
표 1 : NAG 표준.
| 클로스 트리 디움 디피 포자 발아 | ||||
| 발아 용액 (10 mM 트리스 (산도 7.5), 150 mM의 염화나트륨) | ||||
| 100 mM의 글리신 + 10 mM의 TA | 100 mM의 글리신 | |||
| 시간 (분) | OD 585 | 계산 (nmol의) | OD 585 | 계산 (nmol의) |
| 0 | 0.046 | 0.00 | 0.047 | 0.00 |
| 이 | 0.048 | 2.54 | 0.048 | 1.27 |
| 4 | 0.05 | 5.07 | 0.049 | 2.54 |
| 6 | 0.055 | 11.41 | 0.05 | 3.80 |
| 8 | 0.059 | 16.49 | 0.05 | 3.80 |
| (10) | 0.06 | 17.76 | 0.051 | 5.07 |
| (12) | 0.061 | 19.02 | 0.05 | 3.80 |
| (14) | 0.063 | 21.56 | 0.051 | 5.07 |
표 2 : 포자 Germinati 샘플결과에.
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Discussion
자극 후, 발아 과정을 거치고 포자 고분자 합성에 대한 필요없이 저항 특성을 잃는다. 포자 발아가 트리거되면 포자 코어는 물이 교환 DPA를 발표한다. 인해 휴면 포자의 높은 DPA 콘텐츠 포자 코어는 팽창이 장벽으로, 아마도 작용하여 팽윤 코어 방지 강렬한 삼투압 및 전문 펩티, 피질 중이다.
상기 방법은 보라색의 색조에 변화 측정으로 환원당의 존재를 검출하기 에를리히 시약 (황색 용액)을 사용한다. 피질 가수 분해 중에 NAG NAM 및 당류가 해방된다 (가수 분해 효소의 정도에 따라, 당은 이당류 또는 다당류로 해방 될 수있다). 염산 (2.1 단계)에 의해 글리코 시드 결합의 가수 분해는 무료로 감소 끝 7 단당류를 생성합니다. neutraliz 후수산화 나트륨 동량 (250 단계)와 산을 보내고, 상기 NAG 주변 알콜 및 NAM 단당류를 아세트산 무수물로 아 실화된다 (13) (260 단계). 이어서, 미 반응의 무수 아세트산 시료 (단계 280)를 가열하여 아세트산으로 변환된다. 모건과 엘슨 (20)에 의해 가정으로, 단말기 알데히드는 자발적으로 에놀 형태로 변환한다. 알칼리성 조건 (2.10 공정)에서이 에놀 형태는 보라색 15, 20을 생성 에를리히 시약 (스텝 4.3)과 반응하여 옥사 졸 유도체를 생성하기 위해 상기 인접 아세틸과 반응 할 수있다.
위에서 설명한 본 방법은 포자를 발아 B. 모두 피질 단편의 검출을위한 일관성있는 신뢰성있는 결과를 얻을 서브 틸리와 C. 디피 9,16,17은. 분석법은 시간, 온도 및 절차 정밀도로 수행되는 반응을 보장하기 위해 특별한주의가 필요합니다. 적절한주의없이반응 조건은 실험 (13) 사이에 실패하거나 재생하지 않도록 상세히, 그것은 쉽다. 그러나, 실험실 환경에서의 분석의 어플리케이션에서 NAG 표준 보조제를 포함. NAG 양성 대조군 표준은 간 실험적인 변화 (예를 들어, 반응 시간에, 약간의 차이 또는 컬러 시약의 효과)에 대한 모든 실험 컨트롤에 포함되어 있습니다. 전용 버퍼 조건 피질 모두를 가수 분해 할 수없는 포자와 반응하여 반응 색의 변화가 굴복하지 않습니다.
이 방법으로 가장 일반적인 문제는 간 실험 변동 또는 신호의 완전한 부족이다. 변동성에 대한 제어하려면 포자 준비는 식물 세포 파편이 없어야합니다. 이 세포 파편은 펩티도 글리 조각 (NAG와 NAM)를 포함하고 발아 포자에 대한 높은 배경 신호가 발생합니다. 순수한 포자 준비 (> 99.9 % 포자)을 보장하기 위해, literatu 참조방법은 유기체 순수한 포자 현탁액을 준비 할 재 7,9,21-23을 공부한다.
분석은 어떤 검출 신호를 산출하지 않을 경우, 우리는 동결 건조 단계는 변동성을 도입 할 수 있음을 관찰했다. 때문에, 진공이 해제되어있는 강제로, 우리는 건조 시료 분말 샘플 튜브의 송풍 될 수 있다는 발견. 줄이기 위해 / 샘플 튜브의 꼭대기에 구멍을 찌를 작은 주사기 바늘을 사용하여,이 발생하지 않도록. 도입 구멍의 작은 영역이 방해되는 (이제 분말 형태) 동결 건조 된 시료의 가능성을 감소시킬 것이다. 위의 방법에서 언급 한 바와 같이 마지막으로, 여러 배양 단계는 시간이 매우 민감하다. 모든 타이밍 단계를주의 깊게 모니터링되어 있는지 확인합니다. 이 분석을위한 중요한 고려 사항은 피질 단편을 검출하기 위해 발아 포자로부터 방출되어야한다는 것이다. 피질은 큰 조각으로 가수 분해되어있는 경우,이 조각은 rele 수 너무 클 수 있습니다포자 코트 통해 ased. 신호를 생성하지 않는 실험 문제를 해결할 때 중요한 고려 사항이지만, 우리는 이전에 잠재적 인 문제에서와 같이 피질 조각의 크기를 고려에 조건이 여기에 나열된 솔루션의 포자와 다른 문제 해결의 옵션을 발아하는 데 사용하는지 확인하는 것이 좋습니다 분석.
모든 발아 버퍼 / 조건이 분석에 적합하다. 이 분석이 발아 공정 (13), 당 또는 자체 임의 싹 트는, 환원당을 감소 포함 된 발아 완충액 중에 해방 환원당의 존재를 검출하기 때문에 (예를 들면, 포도당)이 분석에서의 신호 강도가 될 것이다. 이 경우, 고압 액체 크로마토 그래피 (HPLC)는 피질 단편 24-26의 존재를 검출하는데 사용될 수있다. 모든 실험실 그러한 장비가 장착되어 있지 때문에, 본원에 기재된 방법은 대부분에서 사용될 수있다실험실 및 간단하고 쉽게 정량화 결과를 제공합니다.
세균 포자에 의해 발아은 주로 바실러스 몇 클로스 트리 디움 종 2,8에서 연구되고있다. 차이가 존재하지만이 공정은 일반적으로 보존된다. 중요한 것은, 모든 유기체는 모델 포자 형성 제 9,27에서 관찰 포자 발아의 메커니즘을 사용하여 발아. 발아가보다 다양한 생물체에서 연구되고 있기 때문에, 상술 한 분석은 포자 발아 중에 피질 단편을 검출하기 위해 이러한 미생물에 적용될 수있다. 이 새로운 연구 생물에이 방법을 적용함으로써, 연구자들은 피질 가수 분해 다양한 발아 단백질의 역할을 확인할 수 있습니다.
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Acknowledgments
설명이 프로젝트는 알레르기 및 전염병 국립 연구소에서 보너스 번호 5R01AI116895에 의해 지원됩니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 알레르기 및 전염병 국립 연구소 또는 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml screw cap tube | USA scientific | 1420-3700 | |
| p1000 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p200 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p20 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| 100 - 1,250 μl pipet tips | VWR | 89079-486 | |
| 1 - 200 μll pipet tips | VWR | 89079-458 | |
| N-acetyl-D-glucosamine | Sigma | A3286-25G | |
| Hydrochloric Acid - 10 N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| Acetic Anhydride | Alfa Aesar | L04295 | |
| Sodium Bicarbonate | BDH | BDH0280-500G | |
| Potassium Tetraborate tetrahydrate | Alfa Aesar | 39435 | |
| Sodium Hydroxide | BDH | BDH8019-500G | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma | 156477-100G | |
| Saturated Phenol | Fisher | BP1750-400 | |
| 2-Mercaptoethanol | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | Molecular Devices | ||
| Acetic Acid, Glacial | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| Heated, Circulating Water Bath | VWR Scientific | Model 1136 | |
| Microtest 96 | Falcon | 353072 | 96 well clear tissue culture plates |
| Culture tubes | VWR | 89000-506 | |
| Lyophilizer | |||
| Heat Blocks | |||
| Vortex Machine |
References
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