JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Bestämning av biofilm Initiation på virusinfekterade celler av bakterier och svampar

Published: July 06, 2016
doi:
10.3791/54162
, , ,
1Department of Microbiology and Immunology,Midwestern University

Summary

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

Abstract

Studiet av polymikrobiella interaktioner över taxonomiska riken som inkluderar svampar, bakterier och virus har inte tidigare undersökts med avseende på hur virus medlemmar i microbiome påverka efterföljande mikrob interaktioner med dessa virusinfekterade värdceller. Den samlevnad av virus med bakterier och svampar är huvudsakligen närvarande på slemhinneytor i munhålan och könsorgan. Slemhinneceller, särskilt de med ihållande kronisk eller ihållande latenta virusinfektioner, kan ha en betydande inverkan på medlemmarna i microbiome genom virus förändring i antal och typ av receptorer som uttrycks. Ändring i värdcellmembranet arkitektur skulle resultera i förändrad förmåga efterföljande medlemmar i normalfloran och opportunistiska patogener att inleda det första steget i biofilmbildning, dvs följsamhet. Denna studie beskriver en metod för kvantifiering och visuell undersökning av HSV påverkan på inledandet av biofilm bildning (vidhäftning) av S. aureus och C. albicans.

Introduction

Den mänskliga microbiome innehåller olika organismer från flera taxonomiska riken som delar geografiska regioner i kroppen. Anslutning till cellytor är ett viktigt första steg i biofilm formation, som är en del av microbiome kolonisering processen. Ingår i microbiome kan vara virus som orsakar kroniska och ihållande infektioner. Den kroniska cellinfektion av dessa virus kan orsaka en förändring i förmodade receptorn tillgänglighet. 1,2 Dessutom cell inträde av intracellulära patogener kan också påverka värd membran fluiditet / hydrofobicitet som i sin tur kan påverka fastsättning av andra microbiome medlemmar, inklusive bakterier och svampar . För att förstå det samspel som kan uppstå mellan dessa olika patogener som samar lokalisera i samma geografiska områden i mänskliga värden, måste vi kunna studera interaktionen av patogener som representerar hela spektrumet av taxonomiska riken närvarande vid slemhinneytan.

t "> Den Herpesviridae är en familj av mikrober som finns i 100% av människor som ständiga medlemmar av microbiome 3,4. Dessutom kan de också ständigt kasta både i närvaro och frånvaro av symtom. Specifikt, herpes simplex virus-1 och herpes simplex-virus-2 (HSV-1 och HSV-2, respektive) är permanenta medlemmar av microbiome i oronasopharynx och könsorgan. i immunkompetenta individer, både HSV-1 och HSV-2 orsakar gingivostomatitis, liksom genital herpes 5-8. vid dessa platser, HSV orsakar en latent infektion kännetecknas av kronisk ihållande asymtomatiska viral shedding 9. Införsel av HSV i celler resulterar i förändringar i ytan uttryck för nectins, heparansulfat, lipidaggregat och herpesvirus inträde medlare / tumörnekros factor receptor (HVEM / TNFr) 10-25. Dessa potentiellt representerar delade receptorer för vissa bakterier och svampar, t ex S. aureus och C. albicans, som medan opportunistiska patogener,kan också uppehålla sig som medlemmar av mucosal microbiome av oronasopharynx 26,27. Inom oronasopharynx S. aureus och C. albicans upptar två distinkta områden av kolonisering. I värdar med naturliga tänder, är den orala mukosan som delas av HSV-1 och C. albicans, medan de främre nasala näsborrarna upptas av S. aureus 28. Trots in vitro resultat som S. aureus ansluter sig till mun epitelceller, 29,30 S. aureus är sällan isoleras från muntliga prov när normal vävnad är närvarande 29,30. Lite är känt om könsorganen co-kolonisations nischer utöver de kliniska resultaten som S. aureus är förknippad med aerob vaginit, som kännetecknas av genital inflammation, utsläpp och dyspareuni, medan C. albicans producerar slemhinneskada som liknar den som observerades i munhålan 31-35. Även om dessa medlemmar av orala och genitala microbiOme tvär taxonomiska riken lite är känt om deras interaktion som den påverkar deras förmåga att initiera biofilm formation genom att ansluta sig till värdcellytan fem. Detta protokoll har faktiskt tillämpas för att fastställa de funktionella konsekvenserna av co-kolonisering / infektion.

Protocol

1. HSV-stammar och hantering Obs: Rekombinant icke-spridning HSV-1 (KOS) gL86 och HSV-2 (KOS) 333gJ – med beta-galaktosidas reporter aktivitet användes tillhandahölls av V. Twiari 36,37. Använda virus från en enda massa och förvara vid -80 ° C med en 1: 1 förhållande av Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med 20% fetalt bovint serum (FBS) och skumma mjölk fram till användning. Innan viral massa lagring, bestämma viruskoncentration av o-nitrofenyl-β-D-galakt…

Representative Results

Nivån på robusthet av data kan erhållas från systemet som beskrivs i denna rapport visas i Figur 2 af 38. Genom att använda detta system moduleringen av stafylokocker och svamp interaktion med virusinfekterade celler och deras inverkan på varandras vidhäftning kan avgränsas. Dessa typer av studier kräver mikroskopisk undersökning av interaktionen, såsom visas i figurerna 3 och 4 38 för att avgöra huruvi…

Discussion

För närvarande ingen information finns tillgänglig på ett komplext samspel mellan permanent till halvpermanenta medlemmar i värd microbiome som korsar flera taxonomiska domäner, dvs prokaryota, eukaryota och virala. Därför har vi utvecklat en roman i modell vitro-system för att studera biofilm initiering av S. aureus och C. albicans på HSV-1 eller HSV-2 infekterade HeLa 229 (HeLa-celler) 38. HeLa cellmodellsystem presenterar en unik fördel. Detta beror p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This project was supported by Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) and Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).

Materials

C.albicans
BBL Sabouraud Dextrose BD 211584
Fungisel Agar Dot Scientific 7205A
S.aureus
Mannitol Salt Agar Troy Biologicals 7143B
Sheep blood agar Troy Biologicals 221239
Hela cells
1xDMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate Corning 10-017-CM
Gentamicin 50mg/ml Sigma 1397 50µg/ml final concentration in the complete DMEM
Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53M EDTA)Solution 1X Corning 25-052-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150 10% final concentration in the complete DMEM
Other medium and reagents
ONPG Thermo Scientific 34055
Ultra-Pure X gal Invitrogen 15520-018
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) Corning 20-021-CV
1XPBS Dot Scientific 30042-500
RIPA Lysis Life Technologies 89901
Staining
Methanol Fisher Scientific A433P-4
HSV 1&2, specific for gD ViroStat 196
DAPI SIGMA D8417-5MG
Gram Crystal Violet Troy Biologicals 212527
Supplies
Petri dish 100X15 Dot Scientific 229693 
Petri dish 150X15 Kord Valmark 2902
96-Well plates Evergreen Scientific 222-8030-01F
24-well plates Evergreen Scientific 222-8044-01F
Culture tubes 100×13 Thomas Scientific 9187L61
Cover slip circles, 12mm Deckglaser CB00120RA1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palu, G., et al. Effects of herpes-simplex virus type-1 infection on the plasma-membrane and related functions of HeLa S3 cells. J Gen Virol. 75, 3337-3344 (1994).
  2. Vitiello, G., et al. Lipid composition modulates the interaction of peptides deriving from herpes simplex virus type I glycoproteins B and H with biomembranes. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1808, 2517-2526 (2011).
  3. Bradley, H., Markowitz, L. E., Gibson, T., McQuillan, G. M. Seroprevalence of Herpes Simplex Virus Types 1 and 2-United States, 1999-2010. J. Infect. Dis. 209, 325-333 (2014).
  4. Szpara, M. L., et al. Evolution and diversity in Human Herpes Simplex Virus genomes. J Virol. 88, 1209-1227 (2014).
  5. Arduino, P. G., Porter, S. R. Herpes Simplex Virus Type I infection: overview on relevant clinico-pathological features. J Oral Pathol Med. 37, 107-121 (2008).
  6. Looker, K. J., Garnett, G. P. A systematic review of the epidemiology and interaction of herpes simplex virus types 1 and 2. Sex. Transm. Infect. 81, 103-107 (2005).
  7. Taylor, T. J., Brockman, M. A., McNamee, E. E., Knipe, D. M. Herpes simplex virus. Front Biosci. 7, 752-764 (2002).
  8. Bernstein, D. I., et al. Epidemiology, clinical presentation, and antibody response to primary infection with Herpes Simplex Virus Type 1 and Type 2 in young women. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 56, 344-351 (2013).
  9. Sacks, S. L., et al. HSV shedding. Antiviral Res. 63, 19-26 (2004).
  10. Brandhorst, T. T., et al. Structure and Function of a Fungal Adhesin that Binds Heparin and Mimics Thrombospondin-1 by Blocking T Cell Activation and Effector Function. PLoS Pathog. 9, (2013).
  11. Green, J. V., et al. Heparin-Binding Motifs and Biofilm Formation by Candida albicans. Journal of Infectious Diseases. 208, 1695-1704 (2013).
  12. Khalil, M. A., Sonbol, F. I. Investigation of biofilm formation on contact eye lenses caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus. Niger. J. Clin. Pract. 17, 776-784 (2014).
  13. Shanks, R. M. Q., et al. Heparin stimulates Staphylococcus aureus biofilm formation. Infection and Immunity. 73, 4596-4606 (2005).
  14. Tiwari, V., et al. Role for 3-O-sulfated heparan sulfate as the receptor for herpes simplex virus type 1 entry into primary human corneal fibroblasts. J Virol. 80, 8970-8980 (2006).
  15. Delboy, M. G., Patterson, J. L., Hollander, A. M., Nicola, A. V. Nectin-2-mediated entry of a syncytial strain of herpes simplex virus via pH-independent fusion with the plasma membrane of Chinese hamster ovary cells. Virol J. 3, (2006).
  16. Di Giovine, P., et al. Structure of Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Bound to the Human Receptor Nectin-1. PLoS Pathog. 7, (2011).
  17. Hauck, C. R. Cell adhesion receptors – signaling capacity and exploitation by bacterial pathogens. Medical Microbiology and Immunology. 191, 55-62 (2002).
  18. Kramko, N., et al. Early Staphylococcus aureus-induced changes in endothelial barrier function are strain-specific and unrelated to bacterial translocation. Int. J. Med. Microbiol. 303, 635-644 (2013).
  19. Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Molecular vision. 17, 3166-3174 (2011).
  20. Sato, R., et al. Impaired cell adhesion, apoptosis, and signaling in WASP gene-disrupted Nalm-6 pre-B cells and recovery of cell adhesion using a transducible form of WASp. Int. J. Hematol. 95, 299-310 (2012).
  21. Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-alpha in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 2878-2887 (2009).
  22. Stump, J. D., Sticht, H. Mutations in herpes simplex virus gD protein affect receptor binding by different molecular mechanisms. J Molecu Model. 20, (2014).
  23. Zelano, J., Wallquist, W., Hailer, N. P., Cullheim, S. Expression of nectin-1, nectin-3, N-cadherin, and NCAM in spinal motoneurons after sciatic nerve transection. Experimental Neurology. 201, 461-469 (2006).
  24. Akhtar, J., et al. HVEM and nectin-1 are the major mediators of herpes simplex virus 1 (HSV-1) entry into human conjunctival epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 4026-4035 (2008).
  25. Heo, S. K., et al. LIGHT enhances the bactericidal activity of human monocytes and neutrophils via HVEM. J. Leukoc. Biol. 79, 330-338 (2006).
  26. . National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report. Am J Infect Control. 32, 470-485 (2004).
  27. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 39, 1093-1093 (2004).
  28. Colacite, J., et al. Pathogenic potential of Staphylococcus aureus strains isolated from various origins. Ann. Microbiol. 61, 639-647 (2011).
  29. Colombo, A. V., et al. Quantitative detection of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa in human oral epithelial cells from subjects with periodontitis and periodontal health. J. Med. Microbiol. 62, 1592-1600 (2013).
  30. Merghni, A., Ben Nejma, M., Hentati, H., Mahjoub, A., Mastouri, M. Adhesive properties and extracellular enzymatic activity of Staphylococcus aureus strains isolated from oral cavity. Microb Pathogen. 73, 7-12 (2014).
  31. Donders, G. G. G., et al. Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. Bjog. 109, 34-43 (2002).
  32. Li, J. R., McCormick, J., Bocking, A., Reid, G. Importance of vaginal microbes in reproductive health. Repro Sci. 19, 235-242 (2012).
  33. Jarvis, W. R. The epidemiology of colonization. Infect Cont Hosp Epidemiol. 17, 47-52 (1996).
  34. Okonofua, F. E., Akonai, K. A., Dighitoghi, M. D. Lower genital-tract infections in infertile nigerian women compared with controls. Genitourin Med. 71, 163-168 (1995).
  35. Nenoff, P., et al. Mycology – an update Part 2: Dermatomycoses: Clinical picture and diagnostics. J Der Deutschen Dermatol Gesellschaft. 12, 749-779 (2014).
  36. Hubbard, S., et al. Contortrostatin, a homodimeric disintegrin isolated from snake venom inhibits herpes simplex virus entry and cell fusion. Antivir. Ther. 17, 1319-1326 (2012).
  37. Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-α in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50, 2878-2887 (2009).
  38. Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Herpes simplex virus (HSV) modulation of Staphylococcus aureus. and Candida albicans.initiation of HeLa 299 cell-associated biofilm. Curr Microbiol. , (2016).
  39. Alva-Murillo, N., Lopez-Meza, J. E., Ochoa-Zarzosa, A. Nonprofessional phagocytic cell receptors involved in Staphylococcus aureus internalization. Biomed Res Internat. , (2014).
  40. Calderone, R. A., Scheld, W. M. Role of fibronectin in the pathogenesis of candidal infections. Reviews of infectious diseases. 9, 400-403 (1987).
  41. Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European journal of cell biology. 79, 672-679 (2000).
  42. Mao, L., Franke, J. Symbiosis, dysbiosis, and rebiosis-The value of metaproteomics in human microbiome monitoring. Proteomics. 15, 1142-1151 (2015).
  43. Christopher, R. A., Kowalczyk, A. P., McKeown-Longo, P. J. Localization of fibronectin matrix assembly sites on fibroblasts and endothelial cells. J Cell Sci. 110, 569-581 (1997).
  44. Heino, J., Kapyla, J. Cellular receptors of extracellular matrix molecules. Current Pharm Des. 15, 1309-1317 (2009).
  45. Hynes, R. O., et al. A large glycoprotein lost from the surfaces of transformed cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 312, 317-342 (1978).
  46. Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology. 24, 389-399 (2005).
  47. Schwarzbauer, J. E., DeSimone, D. W. Fibronectins, their fibrillogenesis, and in vivo functions. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
  48. Abdelmegeed, E., Shaaban, M. I. Cydooxygenase inhibitors reduce biofilm formation and yeast-hypha conversion of fluconazole resistant Candida albicans. J. Microbiol. 51, 598-604 (2013).
  49. Gow, N. A. Germ tube growth of Candida albicans. Current topics in medical mycology. 8, 43-55 (1997).
  50. Liu, Y. P., Filler, S. G. Candida albicans Als3, a multifunctional adhesin and invasin. Eukaryot. Cell. 10, 168-173 (2011).
  51. Lu, Y., Su, C., Liu, H. Candida albicans hyphal initiation and elongation. Trends Microbiol. 22, 707-714 (2014).
  52. Kabir, M. A., Hussain, M. A., Ahmad, Z. Candida albicans: A model organism for studying fungal pathogens. ISRN microbiology. 2012, 538694 (2012).
  53. Ovchinnikova, E. S., Krom, B. P., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Evaluation of adhesion forces of Staphylococcus aureus along the length of Candida albicans hyphae. BMC Microbiol. 12, (2012).
  54. Peters, B. M., et al. Staphylococcus aureus adherence to Candida albicans hyphae is mediated by the hyphal adhesin Als3p. Microbiology-Sgm. 158, 2975-2986 (2012).

Tags

BiofilmViral InfectionOpportunistic PathogensStaphylococcus AureusCandida AlbicansHSVCMVAdenovirusHeLa CellsC. AlbicansGerm TubeYeast FormAdherenceAttachmentMicrobiomeMultiplicity Of InfectionReporter VirusParaformaldehyde GlutaraldehydeDMEMTrypsinHBSSOD 600

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi. J. Vis. Exp. (113), e54162, doi:10.3791/54162 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image