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Immunology and Infection

Determinación de Biofilm Iniciación, el virus de las células infectadas por bacterias y hongos

doi: 10.3791/54162 Published: July 6, 2016

Abstract

El estudio de las interacciones polimicrobianas a través de los reinos taxonómicos que incluyen hongos, bacterias y virus no se han examinado previamente con respecto a cómo los miembros virales de la microbioma afectan las interacciones microbio posteriores con estas células huésped infectadas por virus. La cohabitación de virus con bacterias y hongos es principalmente presente en las superficies de la mucosa de la cavidad oral y el tracto genital. células de la mucosa, particularmente aquellos con infecciones virales latentes crónicas o persistentes persistentes, podrían tener un impacto significativo en los miembros de la microbioma través de la alteración del virus en el número y tipo de receptores expresados. Modificación en la arquitectura de la membrana de la célula huésped se traduciría en la capacidad alterada de los miembros posteriores de la flora normal y patógenos oportunistas para iniciar el primer paso en la formación de biopelículas, es decir, la adhesión. Este estudio describe un método para la cuantificación y control visual del efecto de HSV en el inicio de biofilm formación (adherencia) de S. aureus y C. albicans.

Introduction

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El microbioma humano incluye diversos organismos de varios reinos taxonómicos que comparten regiones geográficas en el cuerpo. La adherencia a las superficies celulares es un primer paso esencial en la formación de biopelículas, que es parte del proceso de colonización microbioma. Incluido en el microbioma puede haber virus que causan infecciones crónicas y persistentes. La infección de células crónica por estos virus puede causar una alteración en la disponibilidad del receptor putativo. 1,2 Además, la entrada de la célula por patógenos intracelulares también podría afectar a la fluidez de membrana host / hidrofobicidad que a su vez puede alterar la unión de otros miembros microbioma, incluyendo bacterias y hongos . Con el fin de entender las interacciones que pueden ocurrir entre estos múltiples patógenos que co-localizar en las mismas regiones geográficas del huésped humano, debemos ser capaces de estudiar la interacción de los agentes patógenos que representan el espectro de los reinos taxonómicos presentes en la superficie de la mucosa.

t "> El Herpesviridae son una familia de microbios presentes en el 100% de los seres humanos como miembros permanentes del microbioma 3,4. Además, pueden también ser derramada persistente tanto en presencia como en ausencia de síntomas. En concreto, el virus herpes simplex-1 y herpes simplex virus-2 (HSV-1 y HSV-2, respectivamente) son miembros permanentes del microbioma en el oronasopharynx y el tracto genital. en individuos inmunocompetentes, tanto HSV-1 y HSV-2 causa gingivoestomatitis, así como el herpes genital 5-8. en estos sitios, el VHS causa una infección latente, caracterizada por necrosis tumoral asintomática crónica persistente derramamiento viral 9. entrada del VHS en células da lugar a alteraciones en la expresión superficial de nectins, sulfato de heparán, balsas de lípidos y herpesvirus mediador de la entrada / receptor del factor de (HVEM / TNFr) 10-25. Estos receptores representan potencialmente compartidos para algunas bacterias y hongos, por ejemplo, S. aureus y C. albicans, que mientras que los patógenos oportunistas,También puede residir en calidad de miembros de la mucosa del microbioma oronasopharynx 26,27. Dentro de la oronasopharynx S. aureus y C. albicans ocupan dos sitios distintos de la colonización. En los anfitriones con los dientes naturales, la mucosa oral es compartida por HSV-1 y C. albicans, mientras que los orificios nasales nasal anterior están ocupados por S. aureus 28. Sin embargo, a pesar de los hallazgos in vitro que S. aureus se adhiere a las células epiteliales de la boca, 29,30 S. aureus es poca frecuencia aisladas de muestras orales cuando está presente el tejido normal 29,30. Poco se sabe en relación con nichos tracto genital co-colonización más allá de los hallazgos clínicos que S. aureus se asocia con la vaginitis aerobia, que se caracteriza por la inflamación genital, la descarga y la dispareunia, mientras que C. albicans produce lesiones de la mucosa similar a la observada en la cavidad oral 31-35. Por lo tanto, aunque estos miembros de la microbi oral y genitalome reinos taxonómicos transversales poco se conoce acerca de su interacción ya que afecta a su capacidad para iniciar la formación de biopelículas mediante la adhesión a la superficie de la célula huésped 5. Este protocolo se ha aplicado de manera efectiva para determinar las consecuencias funcionales de co-colonización / infección.

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Protocol

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1. HSV Cepas y Manipulación

Nota: Recombinante la no propagación de HSV-1 (KOS) gL86 y HSV-2 (KOS) 333gJ - con el reportero de la actividad de beta-galactosidasa utilizado fueron proporcionados por V. Twiari 36,37.

  1. Utilice virus de un solo lote y se almacena a -80 ° C, a una proporción de 1: 1 de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 20% (FBS) y leche descremada hasta su uso. Antes del almacenamiento mucho viral, determinar la concentración de virus por o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG) y 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (X-Gal) ensayo.
  2. Determinar la viabilidad del virus y la multiplicidad de infección (MOI) por tinción con X-Gal para cada ensayo experimental usando el ensayo de la entrada del virus reportero, tal como se describe anteriormente (figura 1) 14.
  3. Diluir el virus (Opt-MEM) para MOI deseada. Fijar monocapas (paraformaldehído; 0,5 ml / pocillo) antes de la tinción. Coloque los controles de la viabilidad del virus en un microti separadater placa en paralelo con placas de ensayo polimicrobiana.

Manejo células HeLa 2. 299

  1. Crecer a 37 ° C, 5% de CO 2 en DMEM con 4,5 g / l de glucosa, 10% inactivado por calor suero fetal bovino (FBS), gentamicina (50 mg / ml) y L-glutamina. células de paso a 80% de confluencia con una solución de tripsina (ácido etilendiaminotetraacético, EDTA 0,53 M; 0,05% de tripsina; 5 ml / frasco).

3. C. Manipulación albicans

Nota: C. albicans obtenidos a partir de una fuente de laboratorio clínico se almacena a -80 ° C en Remmel leche descremada 2x medio.

  1. Cultura congelado Stock en Sabouraud Dextrosa Medio (37 ° C). Después de 24 horas la subcultura C. albicans sobre medio Fungisel (37 ° C; 48 hr) para su uso.
  2. Generar tubo germinal (GT) (formas recoger colonias representativas, 3 ml de FBS; 3 h; 37 ° C; Abs 600, 0,3). Después de la incubación, lavar GT (HBSS; 2x; 4.000 xg). Añadir GT lavado para HBSS calentado (37 y# 176; C; 0,32 Abs 600). formas GT debería ser el 99% de las células observadas según lo determinado por conteo de hemocitómetro.
  3. Hacer suspensiones forma de levadura (FA) de acciones por recoger colonias representativas Fungisel (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs 600). Contar el número de formas de YF / ml al microscopio utilizando un hemocitómetro. formas de fiebre amarilla deben ser del 99% de las células observadas según lo determinado por conteo de hemocitómetro.
  4. Hacer trabajo stock fúngica (250 l de GT o YF social en 25 ml de HBSS; 37 ° C; 10 5 UFC / ml)

4. S. Manipulación aureus

  1. Tienda S. aureus ATCC 25923 (-80 ° C; Remmel descremada leche 2x). Cultura en agar sangre de carnero (5%; 37 ° C; 24 h). Recoger colonias y traslado al manitol sales de medio plazo de 2 días para la acción (37 ° C; 18 h).
  2. Hacer S. aureus suspensión de acciones (3 ml de HBSS; 1,32 Abs 600; 10 8 UFC / ml)
    1. Hacer trabajar S. aureus acciones (100 lde las acciones en 25 ml de HBSS; 10 5 CFU / ml).

5. Candida y S. aureus Suspensiones

  1. Hacer mixta C. albicans y S. suspensión aureus (250 YF l o GT de valores y 100 l de S. aureus de valores en 25 ml de HBSS).

6. Ensayo polimicrobiana Biofilm

  1. Y placas de semillas 96 con 200 l de 2 x 10 5 HeLa células / ml (85% de nivel de confluencia). Placas de roca (30 - 45 min; 37 ° C) antes de la incubación (37 ° C; 5% de CO2; 18 h). Lavar las monocapas (1x; Opt-MEM) a continuación de la semilla con el HSV (HSV-1 (KOS) gL86 o HSV-2 (KOS) 33 GJ - en 100 l Opt-MEM; MOI 50 y 10). Incubar las placas (3 hr; 37 ° C; 5% de CO 2). Utilice sólo una cepa viral por día.
  2. Lavar monocapas infectadas (1x; salina tamponada con fosfato (PBS) con Mg 2 y Ca 2; 100 l). Reemplazar PBS con HBSS caliente dejando 25 & #181; l en cada pocillo.
    1. Añadir YF, GT y / o S. aureus suspensiones de trabajo (100 l; diana a células ratio = 5: 1; n = 16). tal como se indica en la Tabla 1 (Incubar las placas estáticas; 30 min; 37 ° C; 5% de CO 2).
  3. Después de la incubación, aspirar una columna en un momento inmediatamente rellenado con 300 l de PBS con Mg + 2 y Ca + 2. Repita este paso dos veces y luego añadir tampón de lisis de ensayo de radio-inmunoprecipitación (RIPA, filtro esterilizado; 200 l de una dilución 1:50).
  4. Rápidamente Se tritura el lisado de células HeLa a continuación, colocar 50 l en sales de manitol (MS) y medios de comunicación / o Fungisel (F) (Figura 2). Extender el lisado utilizando una varilla de vidrio doblado en un ángulo de 90 °. Se incuban las placas (18 horas a 37 ° C). contar manualmente el número de colonias por placa. Los controles consisten de S. aureus y / o C. albicans adherencia a las células HeLa no infectadas por VHS.

7. Estudios de Imagen </ P>

  1. Lavar cada cubreobjetos circular de vidrio (12 mm; 50 ml de acetona en 100 ml vaso de precipitados). cubreobjetos secos y esterilizar (Kimwipes; placas de Petri de vidrio). Coloque cubreobjetos estériles secos en los pocillos de placas de 24 pocillos estériles con pinzas esterilizadas alcohol de llama.
  2. Añadir células HeLa (1 ml; volumen 5x utilizado para placas de 96 pocillos) a los pocillos de placas de 24 pocillos que contienen los cubreobjetos de vidrio redondos estériles lavados. Añadir los virus, bacterias y hongos de acuerdo con la plantilla (Tabla 2) en 5x el volumen utilizado para las placas de 96 pocillos, a continuación, se incuba y el proceso tal como se describe en los pasos 6.2.1 a 6.4 anteriormente.
  3. Después del lavado final, fijar las células para microscopía inundando la corredera con metanol y permitiendo que se evapore. Almacenar las placas a temperatura ambiente hasta que la tinción.
  4. Para la microscopía de campo brillante (1,000x aumento original final) llenar los pocillos que contienen cubreobjetos fijados con metanol con agua desionizada. Inmediatamente aspirar agua. Cubra cada cubreobjetos con Gramos violeta cristal. Lave cubreobjetos libre de mancha no ligada (agua desionizada). Cubreobjetos secos in situ a continuación, se adhieren con medio a una diapositiva de marcado de montaje conjunto duro (Figura 3).
  5. Para la microscopía (objetivo 100x; 1,000x definitiva inicial de aumento) fluorescente de lavado cubreobjetos libre de metanol esencialmente como se describe en el paso 7.4. Seque los cubreobjetos en los pocillos.
    1. Después del secado, retire la cubierta se desliza y colocarlos en portaobjetos etiquetados. A continuación, añadir una cantidad suficiente de 1:20 dilución de isotiocianato de fluoresceína (FITC) y conjugado con virus herpes simplex tipo 1 + 2 anticuerpo gD para cubrir el cubreobjetos (1-5 l).
    2. Incubar los portaobjetos en una cámara húmeda a 37 ° C durante 30 minutos. Después de la incubación, lavar los cubreobjetos en 4 cambios de PBS.
    3. Después del lavado final, devuelva el cubreobjetos al portaobjetos etiquetados. Manchar con 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI; cámara de humedad, 37 ° C durante 30 minutos). Después de incubación, lavar los cubreobjetos en 4 Changes de PBS, a continuación, adhiera a la diapositiva etiquetados con juego duro medio de montaje.
    4. Dejar que el medio de montaje para curar durante 24 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Examinar los cubreobjetos bajo petróleo objetivo ya sea en un microscopio de campo claro o microscopio de fluorescencia con filtros de corte FITC y DAPI. Examinar imágenes de al menos 50 campos (100 células por mínima organismo) para la co-localización (Figura 4).

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Representative Results

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El nivel de fiabilidad de los datos que se pueden obtener a partir sistema descrito en este informe se muestra en la Figura 2 af 38. Mediante el uso de este sistema de la modulación de la interacción de estafilococos y hongos con las células infectadas por virus y sus efectos en la adherencia de cada uno puede ser delineado. Estos tipos de estudios requieren el examen microscópico de la interacción tal como se muestra en las figuras 3 y 4 38 con el fin de determinar si la interacción polimicrobiana se está produciendo en las mismas células. En este estudio de interacción diferencial de células se observó como resultado de HSV-modulación de la adhesión de estafilococos y hongos que es especie viral específica.

S. aureus y C. albicans (GT y YF) adherido a las mismas células HeLa control de HSV-no infectados. Esta co-localización en las células indica una falta de Phys inferencia iCal con la adherencia de cada uno de células HeLa y que los niveles medidos de la adherencia diferencial medidos fueron probablemente mediada por HSV (Figura 3A, A1) 38. Sin embargo, al HSV-1 o HSV-2 infectadas células HeLa no co-localización de estafilococos y C. se observó albicans. (Figuras 3B, B1, B2, B3, C1, C2). Usando microscopía fluorescente (conjugado con FITC anti-HSV-gD anticuerpo monoclonal) confirmó además que S. aureus no apareció para co-localizar con C. albicans ni HSV-1 o HSV-2 (Figuras 4A, A1, A2, A3, A4, B1, B2, B3). Esta cooperación entre el VHS y Candida extenderse a ambas formas de tubo de levadura y germinales (Figuras 2A-F) de C. albicans. Esta especificidad de la asociación entre la tríada de microbios refleja la especificidad de la colonización visto en una escala mucho más amplia en la mucosa oronasopharynx anfitrión.

1 "> Figura 1
Figura 1. X-gal tinción de fotos de Dosis Dependiente La infección por HSV-1 en células HeLa. Células HeLa infectadas con HSV-1 en varias MOI y X-Gal manchado. Células (A) HeLa en bien de la placa de 96 pocillos con X-Gal de control de células HeLa modelo de infectados manchado; 20 aumentos inicial; (B) células HeLa en bien de placa de 96 pocillos con células HeLa X-Gal manchado infectadas con HSV-1 a una multiplicidad de infección (MOI) de 10; 20 aumentos inicial; Células (C) HeLa en bien de placa de 96 pocillos con células HeLa X-Gal manchado infectadas con HSV-1 a una multiplicidad de infección (MOI) de 50; 20 aumentos inicial; barra de escala se aplica a todos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

archivos / ftp_upload / 54162 / 54162fig2.jpg "/>
La Figura 2. Efecto de HSV-1 (paneles A, C, E) y HSV-2 (paneles B, D, F) a multiplicidades de infección (MOI) de 50 y 10 en la adherencia de S. aureus y / o C. albicans a células HeLa. (A) S. aureus (Sa) de unión a 1 HSV-células infectadas en presencia de C. tubos germinales albicans (GT) o formas de levadura (YF); (B) S. aureus (Sa) de unión a 2 HSV-células infectadas en presencia de C. tubos germinales albicans (GT) o formas de levadura (YF); (C) C. tubos germinales albicans (GT) que se unen a 1 HSV-células infectadas en presencia de S. aureus (Sa), (D) C. tubos germinales albicans (GT) que se unen a 2 HSV-células infectadas en presencia de S. aureus (Sa); (E) C. formas de levadura albicans (YF) que se unen a 1 HSV-células infectadas en presencia de S. aureus (Sa); (F) C. formas de levadura albicans (YF) que se unen a 2 HSV-células infectadas en presencia de S. aureus (Sa). Todos los puntos de datos son la media +/- SEM, n = 16 normalizado con el control libre de virus. * = Significativamente diferente (p <0,05) de control de células HeLa no infectadas. # = Significativamente diferente (p <0,05) desde el punto emparejado indicada por el soporte; barra de escala se aplica a todos. 38 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. La falta de S. aureus y C. albicans interacciones en células HeLa infectadas por HSV-1 y HSV-2. HSV-1 y HSV-2 infectadas (MOI 50) monocapas de células HeLa con S. aureus y C. albicans (5: 1 objetivo a célula). Para campo claro microscopía, monocapas de células se tiñeron con cristal violeta de Gram, entonces examinadas por microscopía de luz. Las células que fueron positivos para Candida o S. aureus (100 células individuales por señal microbio / por cubreobjetos) fueron escaneados en segundo lugar para la presencia de señales microbio co-localización adicionales (1,000x ampliación inicial). (A & A1) S. aureus (Sa) y C. albicans formas de levadura (FA) o formas de tubos germinales (GT) co-localizar en las células HeLa no infectadas; (A2, insertar). Porcentaje de células HeLa con co-localizada o microbios individuales; (B - B3) La falta de S.. aureus y C. albicans co-localización en presencia de HSV-1; (C - C2) Falta de S. aureus y C. albicans co-localización en presencia de HSV-2. La media ± SEM; barra de escala se aplica a todos. 38rget = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. La falta de co-localización de S. aureus con C. HeLa monocapas de células desafío albicans en células HeLa infectadas por HSV-1 o HSV-2. HSV-infectados con S. aureus y C. albicans (5: 1 objetivo a célula) teñidas (anticuerpo anti gD de HSV FITC-conjugado, y DAPI). Las imágenes son representativas de los resultados de la detección de células que eran señal positiva para HSV después explorado por Candida y S. aureus (100 células individuales por señal microbio por cubreobjetos) que luego se escanea en segundo lugar para la presencia de señales microbio co-localización adicionales (1,000x ampliación inicial; Nikon). (A - A4) C. albicans (A2, inserto; DAPI) co-localizar con HSV-1; (B- B3) C. albicans co-localizada con HSV-2 (B1, insertar, C. albicans DAPI). La media ± SEM; barra de escala se aplica a todos. 38 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1 2 3 4 6 7 8 9 10 11 12
tubos GT YF MSSA GT / MSSA YF / MSSA GT YF MSSA GT / MSSA YF / MSSA
MEDIOS DE COMUNICACIÓN F F SRA SRA F SRA F F F SRA SRA F SRA F
UN
segundo
do
re
mi
F
GRAMO
MARIDO

Tabla 1.
Determinación Plantilla general de la adherencia microbiana en polimicrobianas Interacciones GT = Candida albicans fenotipo tubo germinal.; YF = C. albicans forma de levadura fenotipo; SASM = Staphylococcus aureus meticilina sensibles; MS = sales de manitol medio; F = Fungisel medio. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

placa 1 1 2 3 4 5 6
solamente células HeLa HeLa + GT HeLa + YF HeLa + Sa HeLa + GT + Sa HeLa + YF + Sa
UN
segundo
do
re
La placa 2
HSV células HeLa + HSV HSV + HeLa + GT > HSV + HeLa + YF HSV + HeLa + Sa HSV + HeLa + GT + Sa HSV + HeLa + YF + Sa
UN
segundo
do
re

Tabla 2.
Plantilla general para el análisis visual de polimicrobianas interacciones con las células infectadas por el VHS y no infectados HeLa GT = Candida albicans fenotipo tubo germinal.; YF = C. albicans forma de levadura fenotipo; SA = meticilina Staphylococcus aureus sensible; HSV = virus del herpes simple.ve.com/files/ftp_upload/54162/54162table2.xlsx "target =" _ blank "> Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Actualmente no hay información disponible sobre las interacciones complejas entre permanente a los miembros semi-permanentes del microbioma de acogida que se cruzan múltiples dominios taxonómicos, es decir, procariotas, eucariotas y virales. Por lo tanto, hemos desarrollado un novedoso sistema de modelo in vitro para estudiar la iniciación del biofilm por S. aureus y C. albicans en HSV-1 o HSV-2 infectadas 229 células HeLa (HeLa) 38. El sistema modelo de células HeLa presenta una ventaja única. Esto es debido a su falta de expresión de fibronectina superficie, que sirve como un receptor tanto para S. aureus y C. 39-41 albicans. Desde la 42 superficie apical de los epitelios de las mucosas que normalmente carece de fibronectina, este sistema más estrechamente imita la observada en la infección natural y la colonización 43-47. Por lo tanto, somos capaces de examinar de manera más directa las obras viral rotación de entrada del receptor específicos a seguir en la adherencia posterior por otros miembros de la microbioma.

Uso de entrada competentes no propagación de HSV-1 y HSV-2, estos resultados muestran que la entrada en la célula de HSV-1 o HSV-2 hace que las células refractarios a la super-infección con S. aureus, mientras que la mejora de C. adherencia albicans de una manera dependiente de la concentración de virus (Figura 4). Curiosamente, los efectos de HSV-1 en los formularios GT frente a la fiebre amarilla, era el reverso de la medida para el VHS-2, un hallazgo que puede tener un impacto significativo en la promoción de la candidiasis vaginal en presentación clínica 48-51. Desde una perspectiva de la patogénesis, en general se acepta que el fenotipo GT de C. albicans es la forma patógena, con el YF el estado comensal 51-54. La adherencia de C. albicans GT que se co-incubaron con S. aureus mostró un patrón alterado de la unión a las células HeLa infectadas con el HSV, en comparación con el medido para YF - S. unión aureus. HSV-1 mejora la adherencia de GT a las células HeLa, sino a un sigsignificativamente menor medida (p <0,05) que la medida de la adherencia YF, como se mencionó anteriormente, es decir, el control del 270% para la adherencia YF y el control del 190% para la adherencia de GT. Además, mientras que S. aureus no tuvo efecto en HSV-1 mejora de la unión GT, el coccus negado la adherencia mejorada mediada por la presencia de HSV-2. El patrón inverso se observó para S. aureus efecto en la interacción con YF células infectadas por virus. Esta predilección por las diferentes formas de hongos por HSV-1 (YF) frente a HSV-2 (GT) puede jugar un papel de mantenimiento del estado dirigiendo comensal in vivo. Con respecto al efecto de la forma en GT S. aureus vinculante, la GT suprimió casi completamente la inhibición HSV-1 de la adhesión de estafilococos a las células HeLa. En cambio, aunque la capacidad de GT a asociar con 2 HSV-células infectadas se incrementó significativamente en comparación con HSV-1, la presencia de S. aureus bloqueó el aumento mediado por HSV-2 en la adherencia.

S. aureus células beta interacción, ya que S. aureus adhiere únicamente a las células HeLa no infectadas. Además, el examen microscópico de las células muestran que Candida y HSV-1 y HSV-2 co-localizados. Utilizan juntos aquí los hallazgos de este estudio paralelo al vivo observaciones sitio de especificidad en la colonización de lo que indica la utilidad de este modelo para el estudio de las interacciones polimicrobiana.

El uso eficaz del protocolo descrito en el presente documento depende de una variedad de factores. En primer lugar, el uso de virus deficiente propagación. Esto permite una Examina limpiación de la señalización de entrada y la célula viral efecto tiene sobre las interacciones microbio posteriores, sin la complicación de los cambios que pueden ocurrir debido a envolver adquisición antes de salir de la célula. Además, el uso de virus defectuoso permite un entorno más seguro para el manejo de la bioseguridad de clase dos patógenos. En segundo lugar, este protocolo permite el uso de ambas variantes de adherencia virales y microbianas. El uso de variantes que sólo se unen a receptores específicos permite la delineación de los receptores compartidos entre los microbios, o, alternativamente, la detección de nuevos receptores. A través del uso de anticuerpos monoclonales a los receptores, existe el potencial para la visualización de la localización de la adhesina en la superficie microbiana y proporciona una herramienta para estudiar la expresión adhesina alterado. Este protocolo no es adecuado para el estudio de microbios que no pueden ser aislados selectivamente en medio diferencial. La metodología también es dependiente de la disponibilidad del anticuerpo monoclonal a las proteínas específicas del virus. Aunque unanálisis en este estudio se ha mejorado por el diferencial de tamaño entre la levadura y las bacterias, el uso de diferencialmente marcados con fluorescencia, por ejemplo, rojo Texas, el anticuerpo monoclonal específico microbio sería un eficaz trabajo en torno a si los microbios en cuestión ser similares en morfología y tamaño.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
C.albicans
BBL Sabouraud Dextrose BD 211584
Fungisel Agar Dot Scientific 7205A
S.aureus
Mannitol Salt Agar Troy Biologicals 7143B
Sheep blood agar Troy Biologicals 221239
Hela cells
1x DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate Corning 10-017-CM
Gentamicin 50 mg/ml Sigma 1397 50 µg/ml final concentration in the complete DMEM
Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53 M EDTA)Solution 1x Corning 25-052-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150 10% final concentration in the complete DMEM
Other medium and reagents
ONPG Thermo Scientific 34055
Ultra-Pure X gal Invitrogen 15520-018
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) Corning 20-021-CV
1x PBS Dot Scientific 30042-500
RIPA Lysis Life Technologies 89901
Staining
Methanol Fisher Scientific A433P-4
HSV 1&2, specific for gD ViroStat 196
DAPI SIGMA D8417-5MG
Gram Crystal Violet Troy Biologicals 212527
Supplies
Petri dish 100 x 15 Dot Scientific 229693 
Petri dish 150 x 15 Kord Valmark 2902
96-Well plates Evergreen Scientific 222-8030-01F
24-well plates Evergreen Scientific 222-8044-01F
Culture tubes 100 x 13 Thomas Scientific 9187L61
Cover slip circles, 12 mm Deckglaser CB00120RA1

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References

  1. Palu, G., et al. Effects of herpes-simplex virus type-1 infection on the plasma-membrane and related functions of HeLa S3 cells. J Gen Virol. 75, 3337-3344 (1994).
  2. Vitiello, G., et al. Lipid composition modulates the interaction of peptides deriving from herpes simplex virus type I glycoproteins B and H with biomembranes. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1808, 2517-2526 (2011).
  3. Bradley, H., Markowitz, L. E., Gibson, T., McQuillan, G. M. Seroprevalence of Herpes Simplex Virus Types 1 and 2-United States, 1999-2010. J. Infect. Dis. 209, 325-333 (2014).
  4. Szpara, M. L., et al. Evolution and diversity in Human Herpes Simplex Virus genomes. J Virol. 88, 1209-1227 (2014).
  5. Arduino, P. G., Porter, S. R. Herpes Simplex Virus Type I infection: overview on relevant clinico-pathological features. J Oral Pathol Med. 37, 107-121 (2008).
  6. Looker, K. J., Garnett, G. P. A systematic review of the epidemiology and interaction of herpes simplex virus types 1 and 2. Sex. Transm. Infect. 81, 103-107 (2005).
  7. Taylor, T. J., Brockman, M. A., McNamee, E. E., Knipe, D. M. Herpes simplex virus. Front Biosci. 7, 752-764 (2002).
  8. Bernstein, D. I., et al. Epidemiology, clinical presentation, and antibody response to primary infection with Herpes Simplex Virus Type 1 and Type 2 in young women. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 56, 344-351 (2013).
  9. Sacks, S. L., et al. HSV shedding. Antiviral Res. 63, 19-26 (2004).
  10. Brandhorst, T. T., et al. Structure and Function of a Fungal Adhesin that Binds Heparin and Mimics Thrombospondin-1 by Blocking T Cell Activation and Effector Function. PLoS Pathog. 9, (2013).
  11. Green, J. V., et al. Heparin-Binding Motifs and Biofilm Formation by Candida albicans. Journal of Infectious Diseases. 208, 1695-1704 (2013).
  12. Khalil, M. A., Sonbol, F. I. Investigation of biofilm formation on contact eye lenses caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus. Niger. J. Clin. Pract. 17, 776-784 (2014).
  13. Shanks, R. M. Q., et al. Heparin stimulates Staphylococcus aureus biofilm formation. Infection and Immunity. 73, 4596-4606 (2005).
  14. Tiwari, V., et al. Role for 3-O-sulfated heparan sulfate as the receptor for herpes simplex virus type 1 entry into primary human corneal fibroblasts. J Virol. 80, 8970-8980 (2006).
  15. Delboy, M. G., Patterson, J. L., Hollander, A. M., Nicola, A. V. Nectin-2-mediated entry of a syncytial strain of herpes simplex virus via pH-independent fusion with the plasma membrane of Chinese hamster ovary cells. Virol J. 3, (2006).
  16. Di Giovine, P., et al. Structure of Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Bound to the Human Receptor Nectin-1. PLoS Pathog. 7, (2011).
  17. Hauck, C. R. Cell adhesion receptors - signaling capacity and exploitation by bacterial pathogens. Medical Microbiology and Immunology. 191, 55-62 (2002).
  18. Kramko, N., et al. Early Staphylococcus aureus-induced changes in endothelial barrier function are strain-specific and unrelated to bacterial translocation. Int. J. Med. Microbiol. 303, 635-644 (2013).
  19. Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Molecular vision. 17, 3166-3174 (2011).
  20. Sato, R., et al. Impaired cell adhesion, apoptosis, and signaling in WASP gene-disrupted Nalm-6 pre-B cells and recovery of cell adhesion using a transducible form of WASp. Int. J. Hematol. 95, 299-310 (2012).
  21. Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-alpha in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 2878-2887 (2009).
  22. Stump, J. D., Sticht, H. Mutations in herpes simplex virus gD protein affect receptor binding by different molecular mechanisms. J Molecu Model. 20, (2014).
  23. Zelano, J., Wallquist, W., Hailer, N. P., Cullheim, S. Expression of nectin-1, nectin-3, N-cadherin, and NCAM in spinal motoneurons after sciatic nerve transection. Experimental Neurology. 201, http://dx.doi.org/10.1016/j.expneurol.2006.04.026 461-469 (2006).
  24. Akhtar, J., et al. HVEM and nectin-1 are the major mediators of herpes simplex virus 1 (HSV-1) entry into human conjunctival epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 4026-4035 (2008).
  25. Heo, S. K., et al. LIGHT enhances the bactericidal activity of human monocytes and neutrophils via HVEM. J. Leukoc. Biol. 79, 330-338 (2006).
  26. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report. Am J Infect Control. 32, 470-485 (2004).
  27. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 39, 1093-1093 (2004).
  28. Colacite, J., et al. Pathogenic potential of Staphylococcus aureus strains isolated from various origins. Ann. Microbiol. 61, 639-647 (2011).
  29. Colombo, A. V., et al. Quantitative detection of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa in human oral epithelial cells from subjects with periodontitis and periodontal health. J. Med. Microbiol. 62, 1592-1600 (2013).
  30. Merghni, A., Ben Nejma, M., Hentati, H., Mahjoub, A., Mastouri, M. Adhesive properties and extracellular enzymatic activity of Staphylococcus aureus strains isolated from oral cavity. Microb Pathogen. 73, 7-12 (2014).
  31. Donders, G. G. G., et al. Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. Bjog. 109, 34-43 (2002).
  32. Li, J. R., McCormick, J., Bocking, A., Reid, G. Importance of vaginal microbes in reproductive health. Repro Sci. 19, 235-242 (2012).
  33. Jarvis, W. R. The epidemiology of colonization. Infect Cont Hosp Epidemiol. 17, 47-52 (1996).
  34. Okonofua, F. E., Akonai, K. A., Dighitoghi, M. D. Lower genital-tract infections in infertile nigerian women compared with controls. Genitourin Med. 71, 163-168 (1995).
  35. Nenoff, P., et al. Mycology - an update Part 2: Dermatomycoses: Clinical picture and diagnostics. J Der Deutschen Dermatol Gesellschaft. 12, 749-779 (2014).
  36. Hubbard, S., et al. Contortrostatin, a homodimeric disintegrin isolated from snake venom inhibits herpes simplex virus entry and cell fusion. Antivir. Ther. 17, 1319-1326 (2012).
  37. Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-α in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50, 2878-2887 (2009).
  38. Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Herpes simplex virus (HSV) modulation of Staphylococcus aureus. and Candida albicans.initiation of HeLa 299 cell-associated biofilm. Curr Microbiol. (2016).
  39. Alva-Murillo, N., Lopez-Meza, J. E., Ochoa-Zarzosa, A. Nonprofessional phagocytic cell receptors involved in Staphylococcus aureus internalization. Biomed Res Internat. (2014).
  40. Calderone, R. A., Scheld, W. M. Role of fibronectin in the pathogenesis of candidal infections. Reviews of infectious diseases. 9, Suppl 4 400-403 (1987).
  41. Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European journal of cell biology. 79, 672-679 (2000).
  42. Mao, L., Franke, J. Symbiosis, dysbiosis, and rebiosis-The value of metaproteomics in human microbiome monitoring. Proteomics. 15, 1142-1151 (2015).
  43. Christopher, R. A., Kowalczyk, A. P., McKeown-Longo, P. J. Localization of fibronectin matrix assembly sites on fibroblasts and endothelial cells. J Cell Sci. 110, (Pt 5) 569-581 (1997).
  44. Heino, J., Kapyla, J. Cellular receptors of extracellular matrix molecules. Current Pharm Des. 15, 1309-1317 (2009).
  45. Hynes, R. O., et al. A large glycoprotein lost from the surfaces of transformed cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 312, 317-342 (1978).
  46. Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology. 24, http://dx.doi.org/10.1016/j.matbio.2005.06.008 389-399 (2005).
  47. Schwarzbauer, J. E., DeSimone, D. W. Fibronectins, their fibrillogenesis, and in vivo functions. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
  48. Abdelmegeed, E., Shaaban, M. I. Cydooxygenase inhibitors reduce biofilm formation and yeast-hypha conversion of fluconazole resistant Candida albicans. J. Microbiol. 51, 598-604 (2013).
  49. Gow, N. A. Germ tube growth of Candida albicans. Current topics in medical mycology. 8, 43-55 (1997).
  50. Liu, Y. P., Filler, S. G. Candida albicans Als3, a multifunctional adhesin and invasin. Eukaryot. Cell. 10, 168-173 (2011).
  51. Lu, Y., Su, C., Liu, H. Candida albicans hyphal initiation and elongation. Trends Microbiol. 22, 707-714 (2014).
  52. Kabir, M. A., Hussain, M. A., Ahmad, Z. Candida albicans: A model organism for studying fungal pathogens. ISRN microbiology. 2012, 538694 (2012).
  53. Ovchinnikova, E. S., Krom, B. P., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Evaluation of adhesion forces of Staphylococcus aureus along the length of Candida albicans hyphae. BMC Microbiol. 12, (2012).
  54. Peters, B. M., et al. Staphylococcus aureus adherence to Candida albicans hyphae is mediated by the hyphal adhesin Als3p. Microbiology-Sgm. 158, 2975-2986 (2012).
Determinación de Biofilm Iniciación, el virus de las células infectadas por bacterias y hongos
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Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi. J. Vis. Exp. (113), e54162, doi:10.3791/54162 (2016).More

Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi. J. Vis. Exp. (113), e54162, doi:10.3791/54162 (2016).

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