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Immunology and Infection

Determinazione del biofilm iniziazione su cellule infettate da virus da batteri e funghi

doi: 10.3791/54162 Published: July 6, 2016

Abstract

Lo studio delle interazioni polimicrobiche attraverso i regni tassonomici che includono funghi, batteri e virus non sono stati precedentemente esaminati rispetto a come i membri virali del microbiome influenzano le successive interazioni microbo con queste cellule ospiti infettate da virus. La convivenza virus con batteri e funghi è principalmente presente sulle superfici mucose della cavità orale e genitale. le cellule delle mucose, in particolare quelli con infezioni virali latenti croniche o persistenti persistenti, potrebbero avere un impatto significativo sulla membri della microbiome attraverso l'alterazione del virus in numero e tipo di recettori espressi. Modifiche nell'architettura membrana della cellula ospite comporterebbe capacità alterato di successivi componenti della flora normale e patogeni opportunisti di avviare il primo passo nella formazione di biofilm, cioè, l'aderenza. Questo studio descrive un metodo per la quantificazione e esame visivo effetto di HSV sulla apertura di Biofilformazione m (aderenza) di S. aureus e C. albicans.

Introduction

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Il microbioma umano comprende diversi organismi da più regni tassonomici che condividono aree geografiche nel corpo. L'adesione alla superficie delle cellule è un primo passo essenziale nella formazione di biofilm, che è parte del processo microbiome colonizzazione. Incluso nel microbiome può essere virus che causano infezioni croniche e persistenti. L'infezione cronica a cellule da questi virus può causare un'alterazione putativo disponibilità del recettore. 1,2 Inoltre, l'ingresso delle cellule da patogeni intracellulari potrebbe anche influenzare la fluidità di membrana host / idrofobia che a loro volta possono alterare l'attaccamento degli altri membri microbiome, compresi batteri e funghi . Al fine di comprendere le interazioni che possono verificarsi tra questi molteplici agenti patogeni che co-localizzano nelle stesse regioni geografiche del ospite umano, dobbiamo essere in grado di studiare l'interazione di agenti patogeni che rappresentano lo spettro di regni tassonomici presenti sulla superficie della mucosa.

t "> Il Herpesviridae sono una famiglia di microbi presenti nel 100% degli esseri umani come membri permanenti del microbiome 3,4. Inoltre, esse possono anche essere persistentemente versato sia in presenza che in assenza di sintomi. In particolare, herpes simplex virus-1 e herpes simplex virus 2 (HSV-1 e HSV-2, rispettivamente) sono membri permanenti del microbiome nella oronasopharynx e del tratto genitale. in individui immuno-competenti, sia HSV-1 e HSV-2 causa gengivostomatite, nonché herpes genitale 5-8. in questi siti, HSV provoca un'infezione latente caratterizzata da persistente asintomatica virale spargimento 9. ingresso di HSV in cellule provoca alterazioni nell'espressione superficiale di nectins, eparan solfato, raft lipidici e herpesvirus ingresso mediatore necrosi cronica / tumorale recettore del fattore (HVEM / TNFR) 10-25. Questi recettori potenzialmente rappresentano condivise per alcuni batteri e funghi, per esempio S. aureus e C. albicans, che pur patogeni opportunisti,può anche risiedere come membri del microbioma mucosa del oronasopharynx 26,27. All'interno del oronasopharynx S. aureus e C. albicans occupano due siti distinti di colonizzazione. In host con denti naturali, la mucosa orale è condiviso da HSV-1 e C. albicans, mentre le narici nasali anteriori sono occupati da S. aureus 28. Tuttavia, nonostante i risultati in vitro in cui S. aureus aderisce alle cellule epiteliali della bocca, 29,30 S. aureus è raramente isolata da campioni orali quando il tessuto normale è presente 29,30. Poco si sa riguardo a genitali nicchie tratto co-colonizzazione al di là dei risultati clinici che S. aureus è associata a vaginite aerobica, caratterizzata da infiammazione genitale, scarico e dispareunia, mentre C. albicans produce lesioni della mucosa simile a quello osservato nella cavità orale 31-35. Così, anche se questi membri della Microbi orale e genitaleome croce regni tassonomici poco si sa sulla loro interazione come urta la loro capacità di avviare la formazione di biofilm attraverso l'adesione alla superficie della cellula ospite 5. Questo protocollo è stato efficacemente applicato a determinare le conseguenze funzionali di co-colonizzazione / infezione.

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Protocol

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1. HSV ceppi e Manipolazione

Nota: ricombinante non diffondere HSV-1 (KOS) gL86 e HSV-2 (KOS) 333gJ - con l'attività reporter di beta-galattosidasi utilizzati sono stati forniti da V. Twiari 36,37.

  1. Utilizzare virus da un singolo lotto e conservare a -80 ° C in un rapporto 1: 1 di mezzo di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) con siero fetale bovino 20% (FBS) e latte scremato fino al momento dell'uso. Prima stoccaggio lot virale, determinare la concentrazione di virus o -nitrophenyl-β-D-galattopiranoside (ONPG) e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside (X-Gal) dosaggio.
  2. Determinare la vitalità virus e molteplicità di infezione (MOI) di X-Gal colorazione per ogni seduta sperimentale mediante saggio entrata del virus giornalista, come descritto in precedenza (Figura 1) 14.
  3. Diluire il virus (Opt-MEM) a MOI desiderato. Fissare monostrati (paraformaldeide; 0,5 ml / pozzetto) prima della colorazione. Posizionare controlli virus redditività in un microti separataPiastra ter in parallelo con le piastre test polimicrobiche.

2. HeLa 299 Manipolazione cellulare

  1. Crescere a 37 ° C, 5% CO 2 in DMEM con 4,5 g / L di glucosio, 10% inattivato al calore siero fetale bovino (FBS), gentamicina (50 ug / ml) e L-glutammina. cellule Passage a 80% di confluenza con la soluzione di tripsina (acido etilendiamminotetraacetico, 0,53 M EDTA 0,05% tripsina; 5 ml / fiasco).

3. C. Manipolazione albicans

Nota: C. albicans ottenuti da una fonte di laboratorio clinico è conservato a -80 ° C in Remmel latte scremato 2x media.

  1. Cultura congelate Stock su Sabouraud destrosio Medium (37 ° C). Dopo 24 ore la sottocultura C. albicans su terreno Fungisel (37 ° C; 48 HR) per l'uso.
  2. Genera tubo germe (GT) forme (pick colonie rappresentative, 3 ml di FBS, 3 ore; 37 ° C; Abs 600, 0.3). Dopo l'incubazione, lavare GT (HBSS; 2x; 4.000 xg). Aggiungere GT lavata per riscaldato HBSS (37 &# 176; C; 0,32 Abs 600). forme GT dovrebbe essere il 99% delle cellule osservate come determinato dal conteggio emocitometro.
  3. Fai la forma di lievito (YF) stock sospensioni con la scelta di colonie rappresentative Fungisel (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs 600). Contare il numero di forme YF / ml al microscopio con un emocitometro. forme YF dovrebbero essere il 99% delle cellule osservate come determinato dal conteggio emocitometro.
  4. Fare lavoro stock fungine (250 ml di GT o YF magazzino in 25 ml di HBSS; 37 ° C; 10 5 CFU / ml)

4. S. Manipolazione aureus

  1. Conservare S. aureus ATCC 25923 (-80 ° C; Remmel scremato 2x latte). Cultura su agar sangue di pecora (5%; 37 ° C; 24 ore). Scegli colonie rappresentante e trasferimento mannitolo sali media entro 2 giorni per il magazzino (37 ° C; 18 ore).
  2. Fai S. aureus sospensione madre (3 ml di HBSS; 1.32 Abs 600; 10 8 UFC / ml)
    1. Fai S. lavoro aureus azionari (100 pldello stock in 25 ml di HBSS; 10 5 CFU / ml).

5. Candida e S. aureus Sospensioni

  1. Fare misto C. albicans e S. sospensione aureus (250 ml YF o GT magazzino e 100 ml di S. aureus magazzino in 25 ml di HBSS).

6. polimicrobiche biofilm Assay

  1. Seed 96 pozzetti con 200 ml di 2 x 10 5 HeLa cellule / ml (85% livello di confluenza). Lastre di roccia (30 - 45 min; 37 ° C) prima di incubazione (37 ° C, 5% di CO 2 incubatore; 18 h). Monostrati lavaggio (1x; Opt-MEM) poi sementi con HSV (HSV-1 (KOS) gL86 o HSV-2 (KOS) 33 gJ - in 100 ml Opt-MEM; MOI 50 e 10). Incubare le piastre (3 ore; 37 ° C, 5% di CO 2). Utilizzare un solo ceppo virale al giorno.
  2. Lavare monostrati infettati (1x; tampone fosfato (PBS) con Mg +2 e Ca +2; 100 ml). Sostituire PBS con caldo HBSS lasciando 25 & #181; l in ciascun pozzetto.
    1. Aggiungere YF, GT e / o S. sospensioni aureus lavoro (100 ml; porta a rapporto cellulare = 5: 1; n = 16). come indicato nella Tabella 1 Incubare le piastre (statici; 30 min; 37 ° C; 5% CO 2).
  3. Dopo l'incubazione, aspirare una colonna alla volta immediatamente ricarica da 300 ml PBS con Mg +2 e Ca +2. Ripetere questa operazione due volte, quindi aggiungere la radio-immunoprecipitazione tampone di lisi (RIPA; filtro sterilizzato, 200 ml di una diluizione 1:50).
  4. Rapidamente triturate il lisato cellulare HeLa poi posto su 50 pl sali mannitolo (MS) e media / o Fungisel (F) (figura 2). Distribuire il lisato utilizzando una bacchetta di vetro piegata a 90 °. Incubare le piastre (18 ore a 37 ° C). contare manualmente il numero di colonie per piastra. I controlli sono costituiti da S. aureus e / o C. albicans aderenza alle cellule HeLa HSV-non infetti.

7. Gli studi di imaging </ P>

  1. Lavare ogni coprioggetto di vetro rotondo (12 mm; 50 ml di acetone in 100 ml bicchiere). coprioggetto secche e sterilizzare (Kimwipes; piatti di vetro Petri). Mettere vetrini sterili a secco nei pozzetti di sterili 24 pozzetti con l'alcool di fiamma pinze sterilizzate.
  2. Aggiungere cellule HeLa (1 ml; il volume 5x utilizzato per 96 pozzetti) ai pozzetti di 24 pozzetti contenenti i vetrini rotondi sterili lavati. Aggiungere i virus, batteri e funghi secondo la dima (Tabella 2) al 5x il volume usato per le piastre a 96 pozzetti, poi incubare e processo come descritto ai punti 6.2.1 a 6.4 sopra.
  3. Dopo l'ultimo lavaggio, fissare le cellule per la microscopia inondando il vetrino con metanolo e permettendogli di evaporare. Conservare le piastre a temperatura ambiente fino a colorazione.
  4. Per microscopia in campo luminoso (1,000x finale ingrandimento originale) riempire i pozzetti contenenti coprioggetto metanolo-fisso con acqua deionizzata. Immediatamente aspirare l'acqua. Coprire ogni vetrino con cristalvioletto Grammi. Lavare coprioggetto libera di macchia non legato (acqua deionizzata). Coprioggetto secchi in situ poi aderire con set mediamente dura ad una slitta etichettato montaggio (Figura 3).
  5. Per la microscopia a fluorescenza (obiettivo 100X; 1,000x originale ingrandimento finale) lavaggio coprioggetto privo di metanolo essenzialmente come descritto al punto 7.4. Asciugare il coprioggetto nei pozzetti.
    1. Dopo l'essiccazione, rimuovere i vetrini e metterli su vetrini etichettati. Quindi aggiungere una quantità sufficiente di diluizione 1:20 di isotiocianato di fluorescina (FITC) coniugata Herpes simplex virus di tipo 1 + 2 GD anticorpi per coprire il vetrino (1 - 5 ml).
    2. Incubare i vetrini in una camera umida a 37 ° C per 30 min. Dopo l'incubazione, lavare i coprioggetti in 4 cambi di PBS.
    3. Dopo l'ultimo lavaggio, restituire il vetrino alla diapositiva etichettati. Macchia con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; camera umida; 37 ° C per 30 min). Dopo l'incubazione lavare i coprioggetti in 4 chanGES di PBS, poi apporre la diapositiva etichettato con set dura mezzo di montaggio.
    4. Lasciare che il mezzo di montaggio per la cura per 24 ore a temperatura ambiente al buio. Esaminare i coprioggetti sotto dell'obiettivo olio sia su un microscopio a campo chiaro o microscopio a fluorescenza con filtri di taglio FITC e DAPI. Esaminate immagini di almeno 50 campi (100 cellule per minimo organismo) per co-localizzazione (Figura 4).

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Representative Results

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Il livello di solidità dei dati ottenibili da sistema descritto in questa relazione è illustrata nella Figura 2 af 38. Attraverso l'utilizzo di questo sistema di modulazione di interazione stafilococco e funghi con le cellule infettate da virus e il loro effetto sulla reciproca aderenza può essere delineata. Questi tipi di studi richiedono esame microscopico dell'interazione come mostrato nelle figure 3 e 4, 38 al fine di determinare se l'interazione polymicrobial avviene sulle stesse cellule. In questo studio dell'interazione cella differenziale si osserva come risultato di HSV-modulazione di aderenza stafilococcica e fungina che è la specie virali specifici.

S. aureus e C. albicans (GT e YF) aderito alle stesse cellule di controllo HeLa HSV-non infetti. Questa co-localizzazione su cellule indica una mancanza di phys inferenza iCal con reciproca adesione delle cellule HeLa e che i livelli misurati di aderenza differenziale misurati erano probabilmente HSV-mediata (figura 3A, A1) 38. Tuttavia, su HSV-1 o HSV-2 infettate cellule HeLa non co-localizzazione di stafilococchi e C. è stata osservata albicans. (Figure 3B, B1, B2, B3, C1, C2). Utilizzando la microscopia a fluorescenza (FITC-coniugato anti-HSV-gD anticorpo monoclonale) ha inoltre confermato che S. aureus non sembra di co-localizzare con C. albicans né HSV-1 oppure HSV-2 (figure 4A, A1, A2, A3, A4, B1, B2, B3). Questa cooperazione tra HSV e Candida estesa ad entrambi lievito e germi forme tubo (Figure 2A-F) di C. albicans. Questa specificità di associazione tra il triade di microbi riflette la specificità della colonizzazione visto su una scala molto più ampia nella mucosa oronasopharynx host.

1 "> Figura 1
Figura 1. X-gal colorazione Immagini di dosaggio dipendente HSV-1 infezione in cellule HeLa. Cellule HeLa infettate con HSV-1 a vari MOI e X-Gal macchiato. Cellule (A) HeLa in ben 96 dei pozzetti con controllo cellulare X-Gal macchiato mock-infettati HeLa; 20x di ingrandimento iniziale; (B) cellule HeLa in pozzetto di 96 pozzetti con cellule HeLa X-Gal tinto infettati con HSV-1 ad una molteplicità di infezione (MOI) di 10; 20x di ingrandimento iniziale; Cellule (C) HeLa in pozzetto di 96 pozzetti con cellule HeLa X-Gal tinto infettati con HSV-1 ad una molteplicità di infezione (MOI) di 50; 20x di ingrandimento iniziale; scala grafica si applica a tutti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

file / ftp_upload / 54162 / 54162fig2.jpg "/>
Figura 2. Effetto di HSV-1 (pannelli A, C, E) e HSV-2 (pannelli B, D, F) alla molteplicità di infezione (MOI) di 50 e 10 sulla aderenza S. aureus e / o C. albicans a cellule HeLa. (A) S. aureus (Sa) legandosi a HSV-1 cellule infettate in presenza di C. tubi albicans germinali (GT) o forme di lievito (YF); (B) S. aureus (Sa) legandosi a HSV-2 cellule infettate in presenza di C. tubi albicans germinali (GT) o forme di lievito (YF); (C) C. tubi albicans germinali (GT) vincolanti per HSV-1 le cellule infettate in presenza di S. aureus (Sa); (D) C. tubi albicans germinali (GT) vincolanti per HSV-2 cellule infettate in presenza di S. aureus (Sa); (E) C. forme di lievito albicans (YF) vincolanti per HSV-1 le cellule infettate in presenza di S. aureus (Sa); (F) C. forme di lievito albicans (YF) vincolanti per HSV-2 cellule infettate in presenza di S. aureus (Sa). Tutti i punti di dati sono media +/- SEM, n = 16 normalizzato al controllo privo di virus. * = Significativamente differenti (p <0,05) dal controllo delle cellule HeLa non infetta. # = Significativamente differenti (p <0.05) dal punto accoppiato indicato dalla staffa; barra della scala si applica a tutti. 38 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Mancanza di S. aureus e C. albicans Interactions on HSV-1 e HSV-2 cellule HeLa infetti. HSV-1 e HSV-2 infettate (MOI 50) monostrati di cellule HeLa con S. aureus e C. albicans (5: 1 target per cella). Per il campo luminoso microscopia, monostrati di cellule sono state colorate con violetto di cristallo di Gram, poi esaminate al microscopio ottico. Le cellule che erano positivi per la Candida o S. aureus (100 cellule individuali a segnale microbo / per vetrino) sono stati secondariamente analizzato per la presenza di ulteriori segnali microbo co-localizzazione (1,000x ingrandimento iniziale). (A e A1) S. aureus (Sa) e C. forme albicans lievito (YF) o forme di tubi di germe (GT) co-localizzare sulle cellule HeLa non infettate; (A2, inserire). Percentuale di cellule HeLa con il co-localizzate o singoli microbi; (B - B3) Mancanza di S.. aureus e C. albicans co-localizzazione in presenza di HSV-1; (C - C2) Mancanza di S. aureus e C. albicans co-localizzazione in presenza di HSV-2. Media ± SEM; barra della scala si applica a tutti. 38rget = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. La mancanza di co-localizzazione di S. aureus con C. albicans su HSV-1 o HSV-2 cellule HeLa infetti. HSV-infezione HeLa monostrati cellulari sfida con S. aureus e C. albicans (5: 1 obiettivo di cella) macchiata (anticorpo anti HSV gD FITC-coniugato, e DAPI). Le immagini sono rappresentative di risultati di screening delle cellule che erano segnale positivo per HSV poi scansionato per la Candida e S. aureus (100 cellule individuali a segnale microbo per vetrino), che sono stati poi secondariamente analizzato per la presenza di ulteriori segnali microbo di co-localizzazione (1,000x ingrandimento iniziale; Nikon). (A - A4) C. albicans (A2, inserto; colorazione DAPI) co-localizzare con HSV-1; (B- B3) C. albicans co-localizzato con HSV-2 (B1, inserto, C. albicans colorazione DAPI). Media ± SEM; barra della scala si applica a tutti. 38 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

1 2 3 4 6 7 8 9 10 11 12
tubi GT YF MSSA GT / MSSA YF / MSSA GT YF MSSA GT / MSSA YF / MSSA
MEDIA F F SIGNORINA SIGNORINA F SIGNORINA F F F SIGNORINA SIGNORINA F SIGNORINA F
UN
B
C
D
E
F
sol
H

Tabella 1.
Generale Determinazione Modello di microbica aderenza in polimicrobiche Interazioni GT = Candida albicans tubo germe fenotipo.; YF = C. albicans forma di lievito fenotipo; MSSA = meticillina sensibile aureus Staphylococcus; MS = sali mannitolo media; F = Fungisel media. Cliccate qui per scaricare questo file.

piastra 1 1 2 3 4 5 6
solo le cellule HeLa HeLa + GT HeLa + YF HeLa + Sa HeLa + GT + Sa HeLa + YF + Sa
UN
B
C
D
Tavola 2
HSV cellule HeLa + HSV HSV + HeLa + GT > HSV + HeLa + YF HSV + HeLa + Sa HSV + HeLa + GT + Sa HSV + HeLa + YF + Sa
UN
B
C
D

Tabella 2.
Modello generale per Visual Analisi polimicrobiche interazioni con cellule HSV-infetti e non infetti HeLa GT = Candida albicans tubo germe fenotipo.; YF = C. albicans forma di lievito fenotipo; SA = meticillina sensibili Staphylococcus aureus; HSV = virus herpes simplex.ve.com/files/ftp_upload/54162/54162table2.xlsx "target =" _ blank "> Clicca qui per scaricare il file.

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Discussion

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Al momento non sono disponibili informazioni sulle interazioni complesse tra permanente ai membri semi-permanenti del microbiome host che attraversano più domini tassonomici, vale a dire, procarioti, eucarioti e virali. Perciò abbiamo sviluppato un nuovo sistema modello in vitro per lo studio del biofilm iniziazione da S. aureus e C. albicans on HSV-1 oppure HSV-2 infettato 229 cellule HeLa 38 (HeLa). Il sistema modello cellule HeLa presenta un vantaggio unico. Ciò è dovuto alla loro mancanza di fibronectina superficie, che serve come un recettore per entrambi S. aureus e C. albicans 39-41. Dal momento che l'apicale 42 della superficie degli epiteli delle mucose manca normalmente fibronectina, questo sistema più da vicino imita quella osservata in infezione naturale e della colonizzazione 43-47. Così, siamo in grado di esaminare in modo più diretto le specifiche commedie virale fatturato recettore voce di ruolo nella successiva adesione da parte di altri membri del microbioma.

Iscrizione Uso abile non diffondere HSV-1 e HSV-2, questi risultati mostrano che l'ingresso cella di HSV-1 oppure HSV-2 rende cellule refrattari a super-infezione da S. aureus, migliorando C. albicans aderenza in un modo dipendente dalla concentrazione di virus (Figura 4). È interessante notare che gli effetti di HSV-1 sulle forme GT vs YF, era il contrario di quello misurato per HSV-2, una scoperta che potrebbe avere un impatto significativo sulla promozione di candidosi vaginale nelle presentazioni cliniche 48-51. Da una prospettiva patogenesi, è generalmente accettato che il fenotipo GT di C. albicans è la forma patogena, con l'YF lo stato commensale 51-54. L'aderenza del C. albicans GT che sono stati co-incubate con S. aureus mostrato un modello alterato di legarsi alle cellule HeLa infettate da HSV, rispetto a quello misurato per YF - S. vincolanti aureus. HSV-1 migliorata aderenza del GT alle cellule HeLa, ma per un sigsignificativamente minore misura (p <0,05) di quella misurata per YF aderenza, come discusso sopra, cioè, il controllo 270% per YF aderenza e controllo 190% per aderenza GT. Inoltre, mentre S. aureus non aveva effetto sulla HSV-1 valorizzazione del legame GT, il cocco negato l'aderenza migliorata mediato dalla presenza di HSV-2. Il modello inversa è stata osservata per S. effetto aureus sull'interazione YF con le cellule infettate da virus. Questa predilezione per diverse forme fungine di HSV-1 (YF) vs. HSV-2 (GT) può svolgere un ruolo dirigere mantenimento dello stato commensale in vivo. Per quanto riguarda l'effetto della forma GT su S. vincolante aureus, la GT quasi completamente abolito l'inibizione HSV-1 di adesione stafilococchi alle cellule HeLa. Al contrario, anche se la capacità di GT associare a HSV-2 cellule infettate era significativamente aumentata rispetto a HSV-1, la presenza di S. aureus bloccato l'aumento mediato HSV-2 in aderenza.

S. aureus -cell interazione, poiché S. aureus aderito esclusivamente alle cellule HeLa non infetti. Inoltre, l'esame microscopico delle cellule mostrano che Candida e HSV-1 e HSV-2 co-localizzate. Usato insieme qui i risultati di questo studio parallelo in vivo osservazioni sito specificità per la colonizzazione indica l'utilità di questo modello per lo studio delle interazioni polimicrobiche.

L'uso efficace del protocollo qui descritto dipende da una varietà di fattori. In primo luogo, l'uso di diffusione del virus carente. Ciò permette ad un Examina pulitozione della voce e delle cellule virali segnalazione effetto ha su successive interazioni microbo, senza la complicazione di cambiamenti che possono verificarsi a causa di avvolgere acquisizione prima di lasciare la cella. Inoltre, l'uso di virus difettoso permette un ambiente più sicuro per la movimentazione di biosicurezza classe due patogeni. In secondo luogo, questo protocollo consente l'uso di entrambe le varianti di aderenza virali e microbiche. Uso di varianti che legano solo a recettori specifici consente delineazione dei recettori condivise tra microbi, o, in alternativa, il rilevamento di nuovi recettori. Attraverso l'uso di anticorpi monoclonali ai recettori, c'è il potenziale per la visualizzazione della localizzazione adhesin sulla superficie microbica e fornisce uno strumento per studiare l'espressione adhesin alterata. Questo protocollo non è adatto per lo studio dei microbi che non può essere isolato selettivamente sul terreno differenziale. La metodologia dipende anche dalla disponibilità di anticorpo monoclonale proteine ​​virus-specifici. Sebbene unnalisi in questo studio è stata rafforzata dal differenziale di dimensioni tra lieviti e batteri, uso del differenziale fluorescente tag, ad esempio Texas rosso, microbo anticorpo monoclonale specifico sarebbe un efficace lavoro-around dovrebbero microbi in questione è simile nella morfologia e le dimensioni.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
C.albicans
BBL Sabouraud Dextrose BD 211584
Fungisel Agar Dot Scientific 7205A
S.aureus
Mannitol Salt Agar Troy Biologicals 7143B
Sheep blood agar Troy Biologicals 221239
Hela cells
1x DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate Corning 10-017-CM
Gentamicin 50 mg/ml Sigma 1397 50 µg/ml final concentration in the complete DMEM
Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53 M EDTA)Solution 1x Corning 25-052-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150 10% final concentration in the complete DMEM
Other medium and reagents
ONPG Thermo Scientific 34055
Ultra-Pure X gal Invitrogen 15520-018
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) Corning 20-021-CV
1x PBS Dot Scientific 30042-500
RIPA Lysis Life Technologies 89901
Staining
Methanol Fisher Scientific A433P-4
HSV 1&2, specific for gD ViroStat 196
DAPI SIGMA D8417-5MG
Gram Crystal Violet Troy Biologicals 212527
Supplies
Petri dish 100 x 15 Dot Scientific 229693 
Petri dish 150 x 15 Kord Valmark 2902
96-Well plates Evergreen Scientific 222-8030-01F
24-well plates Evergreen Scientific 222-8044-01F
Culture tubes 100 x 13 Thomas Scientific 9187L61
Cover slip circles, 12 mm Deckglaser CB00120RA1

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References

  1. Palu, G., et al. Effects of herpes-simplex virus type-1 infection on the plasma-membrane and related functions of HeLa S3 cells. J Gen Virol. 75, 3337-3344 (1994).
  2. Vitiello, G., et al. Lipid composition modulates the interaction of peptides deriving from herpes simplex virus type I glycoproteins B and H with biomembranes. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1808, 2517-2526 (2011).
  3. Bradley, H., Markowitz, L. E., Gibson, T., McQuillan, G. M. Seroprevalence of Herpes Simplex Virus Types 1 and 2-United States, 1999-2010. J. Infect. Dis. 209, 325-333 (2014).
  4. Szpara, M. L., et al. Evolution and diversity in Human Herpes Simplex Virus genomes. J Virol. 88, 1209-1227 (2014).
  5. Arduino, P. G., Porter, S. R. Herpes Simplex Virus Type I infection: overview on relevant clinico-pathological features. J Oral Pathol Med. 37, 107-121 (2008).
  6. Looker, K. J., Garnett, G. P. A systematic review of the epidemiology and interaction of herpes simplex virus types 1 and 2. Sex. Transm. Infect. 81, 103-107 (2005).
  7. Taylor, T. J., Brockman, M. A., McNamee, E. E., Knipe, D. M. Herpes simplex virus. Front Biosci. 7, 752-764 (2002).
  8. Bernstein, D. I., et al. Epidemiology, clinical presentation, and antibody response to primary infection with Herpes Simplex Virus Type 1 and Type 2 in young women. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 56, 344-351 (2013).
  9. Sacks, S. L., et al. HSV shedding. Antiviral Res. 63, 19-26 (2004).
  10. Brandhorst, T. T., et al. Structure and Function of a Fungal Adhesin that Binds Heparin and Mimics Thrombospondin-1 by Blocking T Cell Activation and Effector Function. PLoS Pathog. 9, (2013).
  11. Green, J. V., et al. Heparin-Binding Motifs and Biofilm Formation by Candida albicans. Journal of Infectious Diseases. 208, 1695-1704 (2013).
  12. Khalil, M. A., Sonbol, F. I. Investigation of biofilm formation on contact eye lenses caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus. Niger. J. Clin. Pract. 17, 776-784 (2014).
  13. Shanks, R. M. Q., et al. Heparin stimulates Staphylococcus aureus biofilm formation. Infection and Immunity. 73, 4596-4606 (2005).
  14. Tiwari, V., et al. Role for 3-O-sulfated heparan sulfate as the receptor for herpes simplex virus type 1 entry into primary human corneal fibroblasts. J Virol. 80, 8970-8980 (2006).
  15. Delboy, M. G., Patterson, J. L., Hollander, A. M., Nicola, A. V. Nectin-2-mediated entry of a syncytial strain of herpes simplex virus via pH-independent fusion with the plasma membrane of Chinese hamster ovary cells. Virol J. 3, (2006).
  16. Di Giovine, P., et al. Structure of Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Bound to the Human Receptor Nectin-1. PLoS Pathog. 7, (2011).
  17. Hauck, C. R. Cell adhesion receptors - signaling capacity and exploitation by bacterial pathogens. Medical Microbiology and Immunology. 191, 55-62 (2002).
  18. Kramko, N., et al. Early Staphylococcus aureus-induced changes in endothelial barrier function are strain-specific and unrelated to bacterial translocation. Int. J. Med. Microbiol. 303, 635-644 (2013).
  19. Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Molecular vision. 17, 3166-3174 (2011).
  20. Sato, R., et al. Impaired cell adhesion, apoptosis, and signaling in WASP gene-disrupted Nalm-6 pre-B cells and recovery of cell adhesion using a transducible form of WASp. Int. J. Hematol. 95, 299-310 (2012).
  21. Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-alpha in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 2878-2887 (2009).
  22. Stump, J. D., Sticht, H. Mutations in herpes simplex virus gD protein affect receptor binding by different molecular mechanisms. J Molecu Model. 20, (2014).
  23. Zelano, J., Wallquist, W., Hailer, N. P., Cullheim, S. Expression of nectin-1, nectin-3, N-cadherin, and NCAM in spinal motoneurons after sciatic nerve transection. Experimental Neurology. 201, http://dx.doi.org/10.1016/j.expneurol.2006.04.026 461-469 (2006).
  24. Akhtar, J., et al. HVEM and nectin-1 are the major mediators of herpes simplex virus 1 (HSV-1) entry into human conjunctival epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 4026-4035 (2008).
  25. Heo, S. K., et al. LIGHT enhances the bactericidal activity of human monocytes and neutrophils via HVEM. J. Leukoc. Biol. 79, 330-338 (2006).
  26. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report. Am J Infect Control. 32, 470-485 (2004).
  27. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 39, 1093-1093 (2004).
  28. Colacite, J., et al. Pathogenic potential of Staphylococcus aureus strains isolated from various origins. Ann. Microbiol. 61, 639-647 (2011).
  29. Colombo, A. V., et al. Quantitative detection of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa in human oral epithelial cells from subjects with periodontitis and periodontal health. J. Med. Microbiol. 62, 1592-1600 (2013).
  30. Merghni, A., Ben Nejma, M., Hentati, H., Mahjoub, A., Mastouri, M. Adhesive properties and extracellular enzymatic activity of Staphylococcus aureus strains isolated from oral cavity. Microb Pathogen. 73, 7-12 (2014).
  31. Donders, G. G. G., et al. Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. Bjog. 109, 34-43 (2002).
  32. Li, J. R., McCormick, J., Bocking, A., Reid, G. Importance of vaginal microbes in reproductive health. Repro Sci. 19, 235-242 (2012).
  33. Jarvis, W. R. The epidemiology of colonization. Infect Cont Hosp Epidemiol. 17, 47-52 (1996).
  34. Okonofua, F. E., Akonai, K. A., Dighitoghi, M. D. Lower genital-tract infections in infertile nigerian women compared with controls. Genitourin Med. 71, 163-168 (1995).
  35. Nenoff, P., et al. Mycology - an update Part 2: Dermatomycoses: Clinical picture and diagnostics. J Der Deutschen Dermatol Gesellschaft. 12, 749-779 (2014).
  36. Hubbard, S., et al. Contortrostatin, a homodimeric disintegrin isolated from snake venom inhibits herpes simplex virus entry and cell fusion. Antivir. Ther. 17, 1319-1326 (2012).
  37. Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-α in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50, 2878-2887 (2009).
  38. Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Herpes simplex virus (HSV) modulation of Staphylococcus aureus. and Candida albicans.initiation of HeLa 299 cell-associated biofilm. Curr Microbiol. (2016).
  39. Alva-Murillo, N., Lopez-Meza, J. E., Ochoa-Zarzosa, A. Nonprofessional phagocytic cell receptors involved in Staphylococcus aureus internalization. Biomed Res Internat. (2014).
  40. Calderone, R. A., Scheld, W. M. Role of fibronectin in the pathogenesis of candidal infections. Reviews of infectious diseases. 9, Suppl 4 400-403 (1987).
  41. Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European journal of cell biology. 79, 672-679 (2000).
  42. Mao, L., Franke, J. Symbiosis, dysbiosis, and rebiosis-The value of metaproteomics in human microbiome monitoring. Proteomics. 15, 1142-1151 (2015).
  43. Christopher, R. A., Kowalczyk, A. P., McKeown-Longo, P. J. Localization of fibronectin matrix assembly sites on fibroblasts and endothelial cells. J Cell Sci. 110, (Pt 5) 569-581 (1997).
  44. Heino, J., Kapyla, J. Cellular receptors of extracellular matrix molecules. Current Pharm Des. 15, 1309-1317 (2009).
  45. Hynes, R. O., et al. A large glycoprotein lost from the surfaces of transformed cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 312, 317-342 (1978).
  46. Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology. 24, http://dx.doi.org/10.1016/j.matbio.2005.06.008 389-399 (2005).
  47. Schwarzbauer, J. E., DeSimone, D. W. Fibronectins, their fibrillogenesis, and in vivo functions. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
  48. Abdelmegeed, E., Shaaban, M. I. Cydooxygenase inhibitors reduce biofilm formation and yeast-hypha conversion of fluconazole resistant Candida albicans. J. Microbiol. 51, 598-604 (2013).
  49. Gow, N. A. Germ tube growth of Candida albicans. Current topics in medical mycology. 8, 43-55 (1997).
  50. Liu, Y. P., Filler, S. G. Candida albicans Als3, a multifunctional adhesin and invasin. Eukaryot. Cell. 10, 168-173 (2011).
  51. Lu, Y., Su, C., Liu, H. Candida albicans hyphal initiation and elongation. Trends Microbiol. 22, 707-714 (2014).
  52. Kabir, M. A., Hussain, M. A., Ahmad, Z. Candida albicans: A model organism for studying fungal pathogens. ISRN microbiology. 2012, 538694 (2012).
  53. Ovchinnikova, E. S., Krom, B. P., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Evaluation of adhesion forces of Staphylococcus aureus along the length of Candida albicans hyphae. BMC Microbiol. 12, (2012).
  54. Peters, B. M., et al. Staphylococcus aureus adherence to Candida albicans hyphae is mediated by the hyphal adhesin Als3p. Microbiology-Sgm. 158, 2975-2986 (2012).
Determinazione del biofilm iniziazione su cellule infettate da virus da batteri e funghi
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Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi. J. Vis. Exp. (113), e54162, doi:10.3791/54162 (2016).More

Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi. J. Vis. Exp. (113), e54162, doi:10.3791/54162 (2016).

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