A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.
Studiet av interaksjonene polymikrobielle på tvers av de taksonomiske riker som omfatter sopp, bakterier og virus er ikke tidligere blitt undersøkt med hensyn til hvordan virale medlemmer av mikrobiomer påvirke etterfølgende mikrobe interaksjoner med disse virus-infiserte vertsceller. Den ko-bolig virus med bakterier og sopp er hovedsakelig til stede på de mucosale overflater i munnhulen og kjønnsorgan. Slimhinneceller, spesielt de med vedvarende kronisk eller vedvarende latente virusinfeksjoner, kan ha en betydelig innvirkning på medlemmer av mikrobiomer gjennom virus endring i antall og type reseptorer uttrykt. Modifikasjon i vertscellemembran arkitektur ville resultere i endrede egenskaper av etterfølgende medlemmer av den normale flora og opportunistiske patogener for å initiere den første trinnet i biofilmdannelse, dvs. tilslutning. Denne studien beskriver en fremgangsmåte for kvantifisering og visuell undersøkelse av HSV virkning på initiering av biofilm dannelse (etterlevelse) av S. aureus og C. albicans.
Den menneskelige mikrobiomer omfatter ulike organismer fra flere taksonomiske riker som deler geografiske regioner i kroppen. Overholdelse av celleoverflater er et viktig første skritt i biofilmdannelse, som er en del av mikrobiomer kolonisering prosessen. Inkludert i mikrobiomer kan være virus som forårsaker kroniske og vedvarende infeksjoner. Den kroniske celle infeksjon av disse virusene kan føre til en endring i antatte reseptor tilgjengelighet. 1,2 I tillegg er celleinntrengning via intracellulære patogener kan også påvirke vert membranfluiditet / hydrofobisitet som igjen kan forandre feste av andre mikrobiomer medlemmer, inklusive bakterier og sopp . For å forstå samspillet som kan oppstå mellom disse flere patogener som co-lokalisere i de samme geografiske områder av den menneskelige vert, må vi være i stand til å studere samspillet mellom patogener som representerer hele spekteret av taksonomiske riker tilstede på slimhinneoverflaten.
t "> The herpesvirus er en familie av mikrober som er tilstede i 100% av menneskene som faste medlemmer av mikrobiomer 3,4. I tillegg kan de også bli vedvarende felle både i nærvær og fravær av symptomer. Nærmere bestemt, herpes simplex virus-1 og herpes simplex virus-2 (HSV-1 og HSV-2, henholdsvis) er faste medlemmer av mikrobiomer i oronasopharynx og kjønnsorgan. i immun-kompetente individer, både HSV-1 og HSV-2 årsak gingivostomatitis, samt genital herpes 5-8. på disse områdene, fører til HSV en latent infeksjon preget av kronisk vedvarende asymptomatisk viral Shedding 9. oppføring av HSV i cellene resulterer i endringer i overflaten uttrykk for nectins, heparansulfat, lipid flåter og herpesvirus oppføring megler / tumor nekrose faktor reseptor (HVEM / TNFR) 10-25. Disse potensielt representerer felles reseptorer for noen bakterier og sopp, for eksempel S. aureus og C. albicans, som samtidig opportunistiske patogenerkan også ligge som medlemmer av slimhinne mikrobiomer av oronasopharynx 26,27. Innenfor oronasopharynx S. aureus og C. albicans okkupere to forskjellige områder av kolonisering. I verter med naturlige tenner, er den orale mucosa deles av HSV-1 og C. albicans, mens de fremre nese svelget er okkupert av S. aureus 28. Men til tross for in vitro funn som S. aureus holder munnen epitelceller, 29,30 S. aureus er sjelden isolert fra muntlige prøver da normalt vev er til stede 29,30. Lite er kjent om kjønnsorgan co-kolonisering nisjer utover de kliniske funn som S. aureus er forbundet med aerob vaginitt, karakterisert ved genital inflammasjon, utslipp og dyspareuni, mens C. albicans produserer slimhinnere lignende den som ble observert i munnhulen 31-35. Derfor, selv om disse medlemmene av den muntlige og genital microbiome kryss taksonomiske riker lite er kjent om deres interaksjon som det påvirker deres evne til å initiere biofilmdannelse gjennom tilslutning til vertscelleoverflaten 5. Denne protokollen har blitt effektivt brukt til å bestemme de funksjonelle konsekvensene av co-kolonisering / infeksjon.Foreløpig ingen informasjon er tilgjengelig på komplekse interaksjoner mellom permanent til semi-faste medlemmer av verts mikrobiomer som krysser flere taksonomiske domener, dvs. prokaryote, eukaryote og virale. Derfor utviklet vi en roman in vitro modellsystem for å studere biofilm initiering av S. aureus og C. albicans på HSV-1 eller HSV-2-infiserte HeLa-229 (HeLa celler) 38. Den HeLa cellemodellsystem presenterer en unik fordel. Dette er på grunn av deres mangel på…
The authors have nothing to disclose.
This project was supported by Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) and Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).
C.albicans | |||
BBL Sabouraud Dextrose | BD | 211584 | |
Fungisel Agar | Dot Scientific | 7205A | |
S.aureus | |||
Mannitol Salt Agar | Troy Biologicals | 7143B | |
Sheep blood agar | Troy Biologicals | 221239 | |
Hela cells | |||
1xDMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CM | |
Gentamicin 50mg/ml | Sigma | 1397 | 50µg/ml final concentration in the complete DMEM |
Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53M EDTA)Solution 1X | Corning | 25-052-CI | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | 10% final concentration in the complete DMEM |
Other medium and reagents | |||
ONPG | Thermo Scientific | 34055 | |
Ultra-Pure X gal | Invitrogen | 15520-018 | |
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) | Corning | 20-021-CV | |
1XPBS | Dot Scientific | 30042-500 | |
RIPA Lysis | Life Technologies | 89901 | |
Staining | |||
Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
HSV 1&2, specific for gD | ViroStat | 196 | |
DAPI | SIGMA | D8417-5MG | |
Gram Crystal Violet | Troy Biologicals | 212527 | |
Supplies | |||
Petri dish 100X15 | Dot Scientific | 229693 | |
Petri dish 150X15 | Kord Valmark | 2902 | |
96-Well plates | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | |
24-well plates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
Culture tubes 100×13 | Thomas Scientific | 9187L61 | |
Cover slip circles, 12mm | Deckglaser | CB00120RA1 |