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Genetics

के Subtyping Published: October 30, 2016 doi: 10.3791/54165
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universitätsmedizin Göttingen

Summary

मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित phyloproteomics (MSPP) कैम्पिलोबैक्टर जेजुनी एसएसपी का एक संग्रह टाइप करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। Doylei multilocus अनुक्रम टाइपिंग (MLST) की तुलना में तनाव के स्तर पर आइसोलेट्स।

Abstract

MALDI-TOF एमएस न केवल प्रजातियों और उप-प्रजाति के स्तर पर है, लेकिन इससे भी कम, तनाव के स्तर पर कुछ बैक्टीरिया को अलग करने की संभावना प्रदान करता है। detectable बायोमार्कर आयनों की allelic isoforms को अलग-विशिष्ट जन पारियों में परिणाम। मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित phyloproteomics (MSPP) एक उपन्यास तकनीक है कि एक योजना है कि अलग विशिष्ट जन एक जीनोम की तुलना पारियों से phyloproteomic संबंधों की कटौती की अनुमति देता में बड़े पैमाने पर spectrometric detectable बायोमार्कर जनता को जोड़ती संदर्भ तनाव अनुक्रम है। deduced एमिनो एसिड दृश्यों तो MSPP आधारित dendrograms गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है।

यहाँ हम एक कैम्पिलोबैक्टर जेजुनी एसएसपी टाइप करके MSPP के कार्यप्रवाह का वर्णन है। सात प्रकारों के doylei अलग संग्रह। सभी सात उपभेदों मानव उत्पत्ति और multilocus अनुक्रम टाइपिंग (MLST) के थे उनके आनुवंशिक विविधता का प्रदर्शन किया। MSPP टाइपिंग सात विभिन्न MSPP अनुक्रम प्रकार के परिणामस्वरूप, पर्याप्त रूप से उनकी बनावट को दर्शाती हैlogenetic संबंधों।

सी जेजुनी एसएसपी। doylei MSPP योजना 14 विभिन्न बायोमार्कर आयनों, 2 से 11 केडीए के जन रेंज में ज्यादातर ribosomal प्रोटीन भी शामिल है। MSPP सिद्धांत रूप में, एक विस्तारित जन रेंज के साथ अन्य बड़े पैमाने पर spectrometric प्लेटफार्मों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसलिए, इस तकनीक संभावित तनाव के स्तर माइक्रोबियल टाइपिंग के लिए एक उपयोगी उपकरण बन गया है।

Introduction

पिछले दशक के दौरान, मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption आयनीकरण समय की उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MALDI-TOF एमएस) नैदानिक सूक्ष्म जीव विज्ञान में 1, 2 में माइक्रोबियल जीनस और प्रजातियों की पहचान के लिए एक अत्यधिक मूल्यवान मानक तरीका हो उन्नत किया है। प्रजातियों की पहचान बरकरार कोशिकाओं या सेल lysates के छोटे प्रोटीन उंगलियों के निशान की रिकॉर्डिंग पर आधारित है। एक बड़े पैमाने पर नियमित नैदानिक ​​सूक्ष्म जीव विज्ञान में प्रयोग किया जाता स्पेक्ट्रोमीटर के लिए विशिष्ट जन रेंज 2-20 केडीए है। इसके अतिरिक्त, जिसके परिणामस्वरूप स्पेक्ट्रा नीचे-प्रजातियों में तनाव और नीचे-उप प्रजाति स्तर 3 भेदभाव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रारंभिक अग्रणी अध्ययन कैम्पिलोबैक्टर जेजुनी 4 में स्ट्रेन के लिए एक विशेष उपसमूह, क्लोस्ट्रीडियम बेलगाम 5, साल्मोनेला enterica एसएसपी के लिए विशिष्ट बायोमार्कर आयनों की पहचान की है। enterica serovar टाइफी 6, स्ताफ्य्लोकोच्चुस 7 - 9, और ई12 - 10 scherichia कोलाई।

कई चर बायोमार्कर allelic isoforms को इसी जनता के संयोजन गहरी subtyping के लिए विकल्प प्रदान करता है। इससे पहले, हम सफलतापूर्वक एक विधि एक सी पर सार्थक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य phyloproteomic संबंधों मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित phyloproteomics (MSPP) कहा जाता है में बड़े पैमाने पर प्रोफाइल में इन बदलावों को परिवर्तित करने के लिए लागू जेजुनी एसएसपी। जेजुनी अलग संग्रह 13। MSPP multilocus अनुक्रम टाइपिंग (MLST) की तरह डीएनए अनुक्रम आधारित subtyping तकनीकों के लिए एक बड़े पैमाने पर spectrometric बराबर इस्तेमाल किया जा सकता है।

कैम्पिलोबैक्टर प्रजाति दुनिया भर में बैक्टीरियल आंत्रशोथ का प्रमुख कारण 14, 15 हैं। कैम्पिलोबोक्टिरियोसिस के बाद संक्रामक sequela का एक परिणाम के रूप में, अर्थात्, Guillain Barre सिंड्रोम, प्रतिक्रियाशील गठिया और सूजन आंत्र रोग 16 पैदा कर सकते हैं। संक्रमण का मुख्य स्रोत हैंचिकन, टर्की, सूअर, पशु, भेड़ और बतख, दूध और पानी की सतह से 15, 17 से दूषित मांस पशुधन। इसलिए, खाद्य सुरक्षा के संदर्भ में नियमित रूप से महामारी विज्ञान के अध्ययन निगरानी जरूरी हैं। MLST "सोने के मानक 'कैम्पिलोबैक्टर प्रजातियों 18 के लिए आणविक टाइपिंग में है। क्योंकि सेंगर अनुक्रमण आधारित MLST विधि श्रम गहन, समय लेने वाली और अपेक्षाकृत महंगी है, MLST टाइपिंग अपेक्षाकृत छोटे अलग साथियों के लिए प्रतिबंधित है। इसलिए, वहाँ सस्ता और तेज subtyping तरीकों के लिए एक की जरूरत है। इस जरूरत को MSPP की तरह बड़े पैमाने पर spectrometric तरीकों से पूरा किया जा सकता है।

इस पत्र कैम्पिलोबैक्टर जेजुनी एसएसपी का एक संग्रह का उपयोग कर MSPP-टाइपिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। Doylei वियोजन और MLST के साथ अपनी क्षमता की तुलना।

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Protocol

1. जैव सुरक्षा की स्थिति पर विचार करके एक सुरक्षित कार्यस्थल तैयार

  1. प्रयोगशाला और सुरक्षा नियमों है कि सूक्ष्मजीवों के साथ काम करने के लिए प्रासंगिक हैं के साथ परिचित हो। अधिकांश मानव रोगजनक सूक्ष्मजीवों, जैव सुरक्षा के स्तर पर नियंत्रित किया जाना चाहिए इस तरह के साल्मोनेला enterica serovar टाइफी के रूप में 2 की स्थिति है, लेकिन कुछ, जैव सुरक्षा स्तर की आवश्यकता 3. प्रत्येक रोगज़नक़ www.cdc.gov/biosafety पर पहुँचा जा सकता से निपटने के स्तर पर जानकारी।
  2. विशिष्ट सूक्ष्मजीव की Biohazard वर्गीकरण की परवाह किए बिना, सभी सामग्री है कि संक्रामक कचरे के रूप में संक्रामक एजेंट है कि निपटान से पहले autoclaved जाना चाहिए के साथ संपर्क में आया मानते हैं। खतरनाक सामग्री और जैविक पदार्थों के लिए क्षेत्रीय सुरक्षा निर्देशों का सम्मान करें। सुनिश्चित संभावित दूषित सामग्री (biohazards) की तत्काल और उचित निपटान के लिए कि उपयुक्त कंटेनर उपलब्ध हैं।
  3. सुनिश्चित करें कि बाँझ उपकरणों (टीका छोरों), समाधान और संस्कृति मीडिया (अगर प्लेट) जीवाणु संस्कृति शुरू होने से पहले उपलब्ध हैं।
  4. तुरंत संक्रामक सूक्ष्मजीवों को संभालने के बाद एंटीसेप्टिक साबुन और गर्म पानी से हाथ धो लें।

2. संदर्भ का चयन करें और संग्रह आइसोलेट्स

  1. का चयन करें और एक मानक जीनोम अनुक्रम संदर्भ प्राप्त है, इनकोडिंग proteome के दृश्यों के साथ साथ अलग-थलग आदर्श FASTA प्रारूप में। अधिक जीनोम अनुक्रम उपभेदों उपलब्ध हैं, तो विश्लेषण में इन में शामिल हैं।
    नोट: यह अलग / इन वियोजन पर बाद में मास स्पेक्ट्रोमेट्री में मनाया बड़े पैमाने पर चोटियों की पहचान की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा (धारा 7 देखें)।
  2. का चयन करें और संभावित विविध वियोजन की एक किस्म प्राप्त करने के इस तरह है कि वे प्रजाति या ब्याज की उप-प्रजाति के फिलोजेनी कवर में।
    नोट: ये वियोजन पर बाद में जनसंख्या में बायोमार्कर की परिवर्तनशीलता को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा (धारा 8 देखें)।
  3. सुनिश्चित करें कि पूरे संग्रह और संदर्भ को अलग (एस) के समर्थक रहे हैं20 - Perly इस विशेष जीव 18 के लिए संबंधित सोने के मानक से टाइप।
    नोट: यह (उप) -typing तरीकों की एक किस्म शामिल हो सकते हैं, लेकिन संभावना MLST, जो अभी भी सबसे माइक्रोबियल प्रजातियों की आनुवंशिक विविधता को प्रदर्शित करने के लिए मानक तरीका है का सहारा होगा।
  4. संग्रह के भीतर फिलोजेनी अनुमान करने के लिए, टाइपिंग डेटा, जैसे एक से phylogram गणना MLST डेटा 21 के लिए MEGA6 सॉफ्टवेयर में गणित का मतलब (UPGMA) के साथ अनिर्धारित जोड़ी समूह विधि का उपयोग। MLST डेटा के लिए, यह भी एक MLST डेटाबेस से परामर्श और अनुक्रम प्रकार और संबंधित प्रतिरूप परिसरों 22 आवंटित।
    नोट: इस पर बाद में पहले स्वर्ण मानक टाइपिंग विधि (धारा 9 देखें) के साथ MSPP की congruency विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

3. एक MALDI लक्ष्य थाली तैयार

चेतावनी: टीएफए एक मजबूत एसिड है। टीएफए का अनुचित प्रयोग गंभीर त्वचा जलता है, आंख की क्षति और गंभीर जलन ओ के जोखिम भालूऊपरी श्वास नलिका च साँस है। इसलिए, कड़े सुरक्षा उपायों का सम्मान किया जाना चाहिए और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) सुरक्षा चश्मे, चेहरा ढाल, उचित दस्ताने, जूते, या यहां तक ​​कि एक पूर्ण सुरक्षा सूट सहित जरूरत है, TFA से निपटने है। टीएफए के लिए संभव जोखिम के लिए एक प्रभावी निकास वेंटिलेशन प्रणाली के साथ पर्याप्त वेंटिलेशन के तहत पदार्थ से निपटने के द्वारा नियंत्रित किया जाना चाहिए। अपर्याप्त वेंटिलेशन के मामले में मंजूरी दे दी फिल्टर के साथ एक श्वासयंत्र इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, TFA लंबे समय तक चलने प्रभाव के साथ जलीय जीवन के लिए हानिकारक है। पर्यावरण के लिए अपशिष्ट जल में टीएफए के किसी भी रिलीज से परहेज किया जाना चाहिए।

ध्यान दें: एक MALDI लक्ष्य पर नमूने खोलना से पहले, अच्छी तरह से लक्ष्य थाली साफ यदि प्लेट पहले से इस्तेमाल किया गया था।

  1. 100 मिलीलीटर 70% जलीय इथेनॉल समाधान 30 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी और 70 मिलीलीटर शुद्ध इथेनॉल का उपयोग कर तैयार करें।
  2. मिश्रण 50 से एक 80% जलीय trifluoroacetic एसिड (टीएफए) समाधान के 250 μl तैयारविआयनीकृत पानी और 200 μl एक प्रतिक्रिया ट्यूब में 100% TFA और 1 मिनट के लिए ट्यूब vortexing के μl।
  3. यह कमरे के तापमान पर के बारे में 5 मिनट के लिए 70% जलीय इथेनॉल में एक गिलास डिश में डालने और यह submersing द्वारा MALDI लक्ष्य साफ करें।
  4. गर्म पानी के तहत लक्ष्य कुल्ला।
  5. एक कागज ऊतक का उपयोग, 70% जलीय इथेनॉल समाधान के साथ अधिकता लक्ष्य थाली पोंछ सभी पिछले नमूने और अन्य संभावित मलबे को हटाने के लिए।
  6. आगे सफाई की आवश्यकता है, तो गर्म पानी के नीचे कुल्ला एक कागज ऊतक के साथ पोंछते हुए।
  7. अवशिष्ट, और संभवतः अदृश्य, को दूर, 80% की एक पतली परत जलीय टीएफए के साथ लक्ष्य की सतह को कवर द्वारा (~ 96 धब्बे प्रति 100 μl) और एक कागज ऊतक के साथ स्वच्छ सभी लक्ष्य पदों पोंछते।
  8. अंत में, लक्ष्य कुल्ला, एसिड को दूर यह एक कागज ऊतक का उपयोग सूखी पोंछे, और अवशिष्ट तरल लुप्त हो जाना करने के लिए कमरे के तापमान पर कम से कम 15 मिनट के लिए इसे छोड़ने के लिए।

4. एक की तैयारी45; -Cyano-4-हाइड्रोक्सी cinnamic एसिड मैट्रिक्स समाधान के लिए एक आंतरिक Calibrant युक्त

  1. 50% acetonitrile, 47.5% पानी, और 2.5% TFA के एक मिश्रण का 1 मिलीलीटर में 10 मिलीग्राम α-cyano-4-हाइड्रोक्सी cinnamic एसिड (HCCA) भंग द्वारा एक संतृप्त मैट्रिक्स समाधान तैयार है। अवशिष्ट undissolved HCCA यदि समाधान संतृप्त है रहेगा।
  2. पुनः संयोजक मानव इंसुलिन एक आंतरिक calibrant रूप में जोड़े। इस के लिए, आगे उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 50% जलीय acetonitrile, विभाज्य और दुकान में 10 स्नातकोत्तर / μl के अंतिम एकाग्रता के लिए एक शेयर समाधान तैयार है।

5. MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमेट्री

नोट: संस्कृति की स्थिति हित के जीवों के लिए विशिष्ट इस्तेमाल किया जाना चाहिए। MALDI-TOF एमएस के लिए नमूने या तो धब्बा तैयारी या निकासी के द्वारा तैयार किया जा सकता है, जीव पर निर्भर करता है (धारा 8.4.1 देखें)। जबकि इथेनॉल फार्मिक एसिड निष्कर्षण विधि रोगाणुओं की पर्याप्त निष्क्रियता प्रदान करता है, धब्बा तैयारी suff के तहत किया जाना हैआवश्यकता के रूप में icient जैव सुरक्षा की स्थिति (खंड 1 देखें)। आमतौर पर, वहाँ मैट्रिक्स के आवेदन के बाद संक्रमण का कोई खतरा नहीं है, लेकिन विशिष्ट रोगजनक के लिए विशिष्ट निष्क्रियता प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक हैं। इस प्रकार, उदाहरण के लिए नोकार्डिया प्रजातियों में से MALDI-TOF एमएस उबलते पानी, प्रोटीन 23 के इथेनॉल तेज़ी से निम्नलिखित में बैक्टीरिया के पिछले सेल की आवश्यकता है। ईआई Khéchine एट अल। माइक्रोबैक्टीरिया की निष्क्रियता के लिए एक प्रक्रिया विकसित की है, पेंच टोपी पानी और 0.5% के बीच 20 से 24 युक्त ट्यूबों में 1 घंटे के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर जीवाणु कॉलोनियों हीटिंग।

  1. स्मियर तैयारी
    1. सीधे एक MALDI लक्ष्य थाली स्थिति ( 'स्पॉट') पर एक जीवाणु कॉलोनी का एक सिरा आकार राशि बिखरा हुआ है।
    2. HCCA नियमित मैट्रिक्स या मैट्रिक्स आंतरिक calibrant युक्त 1 μl के साथ प्रत्येक स्थान ओवरले और कमरे के तापमान पर crystalize करने के लिए छोड़ दें। अंशांकन चोटी का सही द्रव्यमान का निर्धारण के लिए, एक नियंत्रण सपा उपरिशायी1 μl टेस्ट मानक और आंतरिक calibrant युक्त HCCA मैट्रिक्स के 1 μl के साथ ओ.टी.।
      नोट: यहाँ, परीक्षण मानक के रूप में कोलाई DH5 अल्फा का एक उद्धरण का इस्तेमाल किया जाता है कि MALDI-TOF एमएस में एक विशेषता प्रोटीन फिंगरप्रिंट को दर्शाता है। यह दो प्रोटीन है कि पता लगाने योग्य जन रेंज की ऊपरी सीमा का विस्तार के साथ यह नुकीला है।
  2. निष्कर्षण विधि
    1. फसल लगभग पाँच एक 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में एक टीका पाश के साथ एक अगर प्लेट संस्कृति से कालोनियों और डबल आसुत जल अच्छी तरह से 300 μl में निलंबित। 900 μl पूर्ण इथेनॉल जोड़ें और दोहराया pipetting द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से जब तक बैक्टीरियल कालोनियों पूरी तरह से निलंबित कर दिया है।
      नोट: इस चरण में यह संभव है और अच्छी तरह से -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करने के लिए स्थापित किया। इसके अतिरिक्त, रोगाणुओं की निष्क्रियता एक उपयुक्त अगर प्लेट इष्टतम विकास की स्थिति पर ऊष्मायन निम्नलिखित पर निकालने की 1-10 μl streaking द्वारा परीक्षण किया जा सकता है। में सफल रहासक्रियण माइक्रोबियल विकास के अभाव ने संकेत दिया है।
    2. 1 मिनट के लिए 13,000 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र, तैरनेवाला त्यागें, और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गोली सूखी। अच्छी तरह से 70% फार्मिक एसिड के 50 μl में ऊपर और नीचे pipetting द्वारा गोली Resuspend।
    3. acetonitrile के 50 μl और मिश्रण जोड़ें। 2 मिनट के लिए 13,000 XG पर centrifugation द्वारा मलबे निकालें। स्थानांतरण एक MALDI लक्ष्य थाली पर एक नमूना स्थिति पर तैरनेवाला की 1 μl और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए शुष्क करने छोड़ दें।
    4. आंतरिक calibrant युक्त HCCA मैट्रिक्स के 1 μl के साथ प्रत्येक स्थान ओवरले और कमरे के तापमान पर crystalize करने के लिए छोड़ दें।
  3. जन स्पेक्ट्रा की रिकॉर्डिंग
    नोट: पीक-उठा जन स्पेक्ट्रा से सिफारिश की मानक प्रक्रियाओं का उपयोग किया जाता है (Centroid एल्गोरिथ्म, एस / एन अनुपात:। 2; रिलायंस एनर्जी तीव्रता दहलीज: 2%; शिखर चौड़ाई 3 मीटर / z, आधारभूत घटाव: Tophat)
    1. निर्माताओं 'protoc के अनुसार साधन जांचनाराजभाषा।
    2. प्रत्येक स्थान के लिए, 100 शॉट के चरणों में 600 स्पेक्ट्रा इकट्ठा होते हैं।
      1. मास स्पेक्ट्रोमीटर के विन्यास सॉफ्टवेयर के "AutoXecute" टैब पर जाएँ। खोलें "विधि" छोड़ दिया क्लिक करके "विधि" बटन और विधि जैसे, "MBT_AutoX" लटकते मेनू से चुनने पर।
      2. "AutoXecute मेथड एडिटर" खोलने के लिए "विधि" मेनू के "संपादित करें ..." बटन सही बाएँ क्लिक करें। "संचय" टैब पर जाएँ। "ऊपर राशि" मान "600" और _x_ "शॉट कदम" मान "100" "में संतोषजनक शॉट्स" सेट।
  4. आंतरिक स्पेक्ट्रम अंशांकन प्रक्रिया
    नोट: मिनट माप त्रुटियों मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए निहित हैं। रुक-रुक कर साधन का प्रयोग करें, साधन तापमान और फिर से अंशांकन पर निर्भर करता है, प्राप्त की माप मूल्यों प्रयोगों के बीच भिन्न हो सकते हैं। निम्नलिखित पूर्व माप उपकरण अंशांकन और एक आंतरिक calibrant करने के बाद माप स्पेक्ट्रम अंशांकन अंतर-स्पेक्ट्रम तुलनीयता सुनिश्चित करने के लिए सबसे सटीक तरीका है।
    1. प्रत्येक अंशांकन चोटी सूची के लिए निम्न प्रक्रियाओं का प्रदर्शन:
      1. स्पेक्ट्रम ब्राउज़र प्रारंभ (जैसे, flexAnalysis और खुले स्पेक्ट्रम:। मेनू "फाइल" → "ओपन ...")
      2. calibrant चोटी के साथ बड़े पैमाने पर नियंत्रण सूची बनाएं: मेनू "विधि" → "ओपन ..."।
      3. विधि चुनें: MBT_Standard.FAMSMethod → ​​"ओपन"।
      4. संपादित मास नियंत्रण सूची: सभी Calibrants अनचेक करें।
      5. तल पर Calibrant चोटी जोड़ें: पीक लेबल "Insulin_HIStag [एम एच] + _ औसत"; m_z: "5808.29"; सहिष्णुता [पीपीएम]: "50"; Calibrant चेकबॉक्स जाँच करें।
      6. , जैसे, "MSPP calibrant सूची" के रूप में सहेजें।
    2. प्रत्येक स्पेक्ट्रम के लिए, सूची से calibrant चोटी चुनते हैं, "स्वचालित नियत करें" क्लिक करें और प्रेस "ठीक है"।
ove_title "> 6। सत्यापित करें आंतरिक अंशांकन प्रक्रिया

  1. प्रयोगात्मक कैलिब्रेशन चोटी के सटीक मास निर्धारित करते हैं।
    1. 1 μl टेस्ट स्टैंडर्ड प्रत्येक (कदम 5.1.1) के साथ दो स्थानों तैयार करें। 1 μl नियमित HCCA मैट्रिक्स, 1 μl calibrant-नुकीला मैट्रिक्स के साथ दूसरे के साथ पहली ओवरले।
    2. प्रत्येक स्थान (धारा 5.3) से जन स्पेक्ट्रा प्राप्त है, और आंतरिक रूप से टेस्ट स्टैंडर्ड चोटियों (धारा 5.4) को जांचना।
    3. उन्हें (जैसे, flexAnalysis और खुले स्पेक्ट्रम: मेनू "फाइल" → "ओपन ...") स्पेक्ट्रम ब्राउज़र के साथ खुलने से दोनों स्पेक्ट्रा ओवरले उम्मीद बड़े पैमाने पर और शिखर खोजने (इंसुलिन मी / z = 5,808.29), जिसमें मौजूद होना चाहिए calibrant-नुकीला स्पेक्ट्रम, लेकिन स्पेक्ट्रम नियमित मैट्रिक्स के साथ प्राप्त करने में नहीं।
  2. जाँच करें कि Calibrant पीक ब्याज के जीव के किसी भी अन्य Biomarker से छिप नहीं है।
    1. संदर्भ तनाव और ove के साथ दो स्थानों (धारा 5.1) तैयार1 μl नियमित मैट्रिक्स, 1 μl calibrant-नुकीला मैट्रिक्स के साथ दूसरे के साथ पहली Rlay।
    2. दोनों स्थानों से जन स्पेक्ट्रा (धारा 5.3) हासिल करने और स्पेक्ट्रम ब्राउज़र के साथ उन्हें खोलने के द्वारा परिणामस्वरूप स्पेक्ट्रा ओवरले (जैसे, flexAnalysis और खुले स्पेक्ट्रम: मेनू "फाइल" → "खोलें ...")। सुनिश्चित करें कि calibrant चोटी स्पेक्ट्रम नुकीला मैट्रिक्स के साथ प्राप्त की और एक अन्य आसन्न संकेत से छिप नहीं में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है। यदि यह मामला नहीं है, यह विशेष रूप से जीव के लिए एक और calibrant चुनें।
      नोट: एक नुकीला आंतरिक calibrant का प्रयोग काफी सटीक बायोमार्कर जनता के रूपांतरों का निर्धारण करने के लिए बढ़ जाती है। इस विधि का प्रयोग, 1 दा करने के लिए नीचे बड़े पैमाने पर मतभेदों का पता लगाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, यह भी अपरिवर्तनीय जीवों से होने वाले जनता calibrants के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, परिभाषा के द्वारा, सभी जीव व्युत्पन्न जनता संभावित चर पर विचार किया जाना चाहिए, जब तक अन्यथा सिद्ध किया है।

  1. उपाय संदर्भ तनाव के जन स्पेक्ट्रम, आंतरिक Calibrant साथ मैट्रिक्स नुकीला का उपयोग करना।
    1. सीधे एक MALDI लक्ष्य थाली स्थिति ( 'स्पॉट') पर एक जीवाणु कॉलोनी (धारा 5.1) या बैक्टीरियल प्रोटीन निकालने (धारा 5.2) के 1 μl का एक सिरा आकार राशि बिखरा हुआ है।
    2. आंतरिक calibrant युक्त HCCA मैट्रिक्स के 1 μl के साथ प्रत्येक स्थान ओवरले और कमरे के तापमान (धारा 5.1.2 / 5.2.4) पर crystalize करने के लिए लक्ष्य थाली छोड़ दें।
    3. संदर्भ तनाव के रिकार्ड जन स्पेक्ट्रा (धारा 5.3)।
  2. आंतरिक calibrant बड़े पैमाने पर करने के लिए संदर्भ स्पेक्ट्रम जांचना (यहाँ: मी / z = 5,806.29 पर इंसुलिन), और बाद में पूर्व प्रक्रिया आधारभूत घटाव (Tophat) और चौरसाई (पैरामीटर: SavitzkyGolay; चौड़ाई: 2 मी / z, 10 चक्र) के द्वारा।
    1. स्पेक्ट्रम ब्राउज़र (जैसे, flexAnalysis और खुले स्पेक्ट्रम शुरू: मेनू "फाइल" → "खोलें ...; ")।
    2. विधि चुनें: लटकती मेनू "विधि" → "ओपन ...", पसंद की विधि, जैसे, "MBT_Standard.FAMSMethod" → "ओपन" बाएँ क्लिक करें।
    3. अधोगामी मीनू "जांचना" से "आंतरिक ..." का चयन करके स्पेक्ट्रम जांचना। एक विंडो calibrant चोटी (एस) (खंड 5.4) लिस्टिंग खोलता है। calibrant शिखर (इंसुलिन) → बाएँ क्लिक वाम क्लिक करें "ठीक है"। "प्रक्रिया" लटकते मेनू से "प्रक्रिया स्पेक्ट्रा" चुनें।
    4. आधारभूत घटाव के लिए सही पक्ष पर स्पेक्ट्रम सूची में स्पेक्ट्रम को सक्रिय करें। चुनें "घटाएँ जन स्पेक्ट्रम आधारभूत" "प्रक्रिया" लटकते मेनू से।
    5. स्पेक्ट्रम सुचारू करने के लिए, सही पक्ष पर स्पेक्ट्रम सूची में स्पेक्ट्रम को सक्रिय करें। चुनें "चिकनी जन स्पेक्ट्रम आधारभूत" "प्रक्रिया" लटकते मेनू से।
  3. संदर्भ तनाव के जीनोम अनुक्रमण डेटा से, theoretica गणनाएल monoisotopic इसी अमीनो एसिड अनुक्रम में डीएनए अनुक्रम का अनुवाद एक अनुक्रम संरेखण संपादक का उपयोग करके इनकोडिंग प्रोटीन में से प्रत्येक की आणविक वजन। ExPASy जैव सूचना संसाधन पोर्टल (http://web.expasy.org/compute_pi/) पर इनपुट बॉक्स में इस प्रोटीन अनुक्रम कॉपी-पेस्ट करें। और प्रेस "यहाँ क्लिक करें" पीआई गणना / मेगावाट करने के लिए। सी के मामले में जेजुनी एसएसपी। doylei 14 detectable बायोमार्कर के द्रव्यमान की गणना।
  4. एक स्प्रेडशीट में परिणामों की प्रतिलिपि, एक और जीन पहचानकर्ता युक्त स्तंभ अगले आणविक वजन के साथ। क्रमबद्ध गणना की आणविक वजन से पंक्तियों जनता का आसान देखने की सुविधा के लिए। नोट: अन्य स्तंभों वैकल्पिक हैं; कार्यात्मक एनोटेशन बाद में व्याख्या के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है।
  5. de-methioninated फार्म की आणविक वजन के लिए स्प्रेडशीट, monoisotopic आणविक वजन से 135 दा घटाकर में एक दूसरे स्तंभ डालें। नोट: यह इसलिए है क्योंकि कुछ प्रोटीन पद से गुजरनाएन -terminal methionine के प्रोटिओलिटिक हटाने के द्वारा translational संशोधन।
  6. (तालिका 1) के ऊपर तैयार जीनोम की मेज से मापा बड़े पैमाने पर देखने से संदर्भ तनाव से गणना की आम जनता के लिए प्रत्येक प्रमुख मापा बायोमार्कर बड़े पैमाने पर निरुपित।
  7. बायोमार्कर आयनों की भविष्यवाणी की जीन उत्पादों को नहीं सौंपा जा सकता है, अन्य posttranslational संशोधनों (मेथिलिकरण, एसिटिलीकरण, prenylation, आदि पर विचार; संशोधनों का एक संकलन और जुड़े बड़े पैमाने पर परिवर्तन के लिए http://www.abrf.org/delta-mass देखना )। किसी भी अन्य ज्ञात posttranslational संशोधन है कि अक्सर हित के जीवों में मनाया जाता है मेज पर एक और स्तंभ जोड़ सकते हैं और आणविक वजन de-methioninated फार्म के लिए प्रक्रिया के अनुरूप पुनर्गणना के लिए।
  8. एक और स्प्रेडशीट टैब सेट अप, और बड़े पैमाने पर और एक अलग तालिका स्तंभ में पहचानकर्ता आयन प्रत्येक बायोमार्कर के लिए रिकॉर्ड है।

8. आकलन Biomarker परिवर्तनशीलताजनसंख्या में

  1. संग्रह से प्राप्त जन स्पेक्ट्रा जांचना आइसोलेट्स, के रूप में संदर्भ तनाव (एस) (धारा 5.4.2) के लिए किया।
  2. जन स्पेक्ट्रा में संस्करण बायोमार्कर को पहचानें। एक संस्करण में बड़े पैमाने पर एक जन संदर्भ स्पेक्ट्रम और एक उपन्यास बड़े पैमाने संदर्भ में मौजूद नहीं की उपस्थिति से भी जाना जाता है के अभाव की विशेषता है। बड़े पैमाने पर अंतर एक भी अमीनो एसिड एक्सचेंज (तालिका 2), या इनका मिश्रण के अनुरूप होना चाहिए।
  3. पंक्ति के प्रति एक अलग पर, प्रत्येक बायोमार्कर और संबंधित तालिका स्तंभों में भविष्यवाणी की isoform के लिए बड़े पैमाने पर मापा रिकॉर्ड है।
    नोट: शायद ही कभी, कुछ बड़े पैमाने पर बदलाव के कई अलग अलग अमीनो एसिड के आदान-प्रदान के कारण हो सकता है, जैसे, दोनों, एन डी द्वारा विमर्श और क्यू ई द्वारा विमर्श किया, और इसके विपरीत, 0.985 दा (तालिका 2) के एक बड़े पैमाने पर बदलाव में परिणाम। यह आंतरिक समस्या अकेले मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा हल नहीं किया जा सकता है। इसलिए, प्रोटीन अनुक्रम स्तर पर विभिन्न isoforms ही बड़े पैमाने पर हो रहीएक भी MSPP प्रकार के रूप में इलाज किया जाना चाहिए। विशेष बायोमार्कर आयन जीन की समानांतर सेंगर अनुक्रमण पुष्टि की है कि इस समस्या है, जबकि सी-MSPP टाइपिंग नहीं होती थी जेजुनी एसएसपी। doylei इस अध्ययन में इस्तेमाल संग्रह अलग।
  4. पीसीआर amplifying और संबंधित बायोमार्कर जीन अनुक्रमण द्वारा उपन्यास MSPP प्रकार की पुष्टि करें। बारी में, यह भी पुष्टि है कि बायोमार्कर पहचान सही ढंग से आवंटित किया गया है के रूप में कार्य करता है।
    1. संस्कृति बैक्टीरियल इष्टतम विकास शर्तों के तहत आइसोलेट्स। संस्कृति सी जेजुनी एसएसपी। microaerophilic की स्थिति (5% ओ 2, 10% सीओ 2, 85% एन 2) के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% भेड़ रक्त के साथ पूरक कोलंबिया अगर पर उपभेदों doylei। सीए के लिए सेते 48 घंटा। एक अलग अगर प्लेट का प्रयोग करें प्रत्येक पार संक्रमण से बचने के लिए अलग-थलग करने के लिए।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक उपयुक्त डीएनए निष्कर्षण किट / स्वचालित मशीनरी का उपयोग बैक्टीरियल आइसोलेट्स के जीनोमिक डीएनए निकालें।
      3. <li> 3 टेबल में सूचीबद्ध प्राइमरों का उपयोग संबंधित बायोमार्कर जीन बढ़ाना निम्न शर्तों के तहत सभी पीसीआर प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन करना:। 30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण; 30 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर annealing; 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ाव।
    3. निर्धारित बनाने के लिए जीनोमिक डीएनए का एक उचित मात्रा का उपयोग करते हुए सेंगर अनुक्रमण द्वारा प्रत्येक amplicon के डीएनए अनुक्रम और प्रवर्धन प्राइमरों में से एक (आमतौर पर यह द्वारा किया जाता है (डीएनए का आमतौर पर 600-700 एनजी सीए 100 एनजी / μl की एकाग्रता में पर्याप्त है) एक सेवा प्रदाता का उपयोग करें)।
  5. एक अलग तालिका में (तालिका 4 देखें), एक उचित अनुवाद उपकरण (जैसे, Transseq: http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/) का उपयोग करके प्रत्येक उपन्यास isoform के लिए deduced प्रोटीन अनुक्रम रिकॉर्ड 25।

9. एक MSPP आधारित फाइलोजेनी की गणना और सोने के मानक के तुलना करें

  1. जुटना विशेष बायोमार्कर एमिनो एसिड दृश्यों के लिए टी से संबंधितऐसे BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) 26 या बायोमार्कर स्प्रेडशीट के रूप में एक अनुक्रम संरेखण संपादक का उपयोग कर एक सतत अनुक्रम में वियोजन, वह MSPP प्रकार।
  2. क्लस्टरिंग द्वारा फिलोजेनी की गणना के रूप में सोने के मानक टाइपिंग डेटा, जैसे, UPGMA क्लस्टरिंग 21 के लिए किया।
  3. सोने के मानक 4, 13 के साथ प्राप्त करने के लिए एक MSPP आधारित फिलोजेनी की तुलना करें।

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Representative Results

इससे पहले, हम सफलतापूर्वक सी के लिए एक योजना की स्थापना की MSPP जेजुनी एसएसपी। जेजुनी 13। यहाँ, हम विधि का विस्तार करने के लिए भाई subspecies सी के उद्देश्य से जेजुनी एसएसपी। doylei। इस विशिष्ट स्थापित करने में, सात सी जेजुनी एसएसपी। doylei वियोजन सूक्ष्मजीवों माइक्रोबायोलॉजी UGent BCCM / एलएमजी गेन्ट बेल्जियम की / प्रयोगशाला के बेल्जियम के संग्रह से हासिल किया गया। हमारे विश्लेषण के लिए इस्तेमाल सभी सात वियोजन मानव मूल के थे। जीनोम अनुक्रम तनाव ATCC 49349 (LMG 8843), मूल रूप से एक 2 वर्षीय ऑस्ट्रेलियाई बच्चे के मल से अलग दस्त के साथ संदर्भ के रूप में कार्य किया। एलएमजी 9143, एलएमजी 9243, और 9255 एलएमजी दस्त से पीड़ित और ब्रुसेल्स, बेल्जियम में रहने वाले बच्चों के मल से अलग;: संग्रह से छह अतिरिक्त उपभेदों उपलब्ध थे एलएमजी 7790 (ATCC 49350) जर्मनी से एक व्यक्ति की एक गैस्ट्रिक बायोप्सी नमूना से अलग; और एलएमजी 8870 (एनसीटीसी A613 / 87) के रूप में अच्छी तरह एलएमजी 8871 (एनसीटीसी A603 / 87), दोनों दक्षिण अफ्रीकी बच्चों से तैयार विभिन्न रक्त के नमूनों से पृथक।

सभी सी जेजुनी एसएसपी। doylei वियोजन cryobank स्टॉक, हौसले कोलंबिया अगर आधार microaerophilic की स्थिति (5% ओ के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए 5% भेड़ रक्त और ऊष्मायन के साथ पूरक का उपयोग करके प्रत्येक के विश्लेषण के लिए thawed और सुसंस्कृत रूप में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया 2, 10% सीओ 2, 85% एन 2)।

सी के लिए MSPP तकनीक की स्थापना के विपरीत जेजुनी एसएसपी। जेजुनी 13 यह एक isoform डेटाबेस एक बड़ा अनुक्रम संग्रह से ली गई पर विधि के आधार पर करने के लिए संभव नहीं था। केवल एक ही सी जेजुनी एसएसपी। doylei प्रविष्टि rMLST डेटाबेस में मौजूद था, और इस संदर्भ तनाव सी के लिए corresponded जेजुनी एसएसपी। doylei ATCC 49349 27। इसलिए, प्रत्येक जैवमार्कर बड़े पैमाने पर बदलाव तुलना सी तनाव में पता चला जेजुनी एसएसपी। doylei ATCC 49349 isoform डेटाबेस में एक नई प्रविष्टि और सेंगर अनुक्रमण द्वारा पुष्टि किए जाने की जरूरत थी।

प्राप्त सी की विविधता विश्लेषण करने के लिए जेजुनी एसएसपी। doylei वियोजन, MLST प्रदर्शन किया गया था और एक MLST आधारित सात सहित UPGMA-dendrogram सी की जांच की जेजुनी एसएसपी। doylei वियोजन और सी जेजुनी एसएसपी। outgroup गणना (चित्रा 1) के रूप में जेजुनी तनाव 81-176। प्रत्येक सी जेजुनी एसएसपी। doylei अलग एक अलग MLST-अनुक्रम प्रकार के थे, दो subclusters में गिरने। तनाव LMG7790 सबसे लंबे समय तक दूरी वंशावली था शेष सी की तुलना में जेजुनी एसएसपी। doylei आइसोलेट्स।

रिकॉर्ड करने MALDI-TOF सी के संदर्भ जन स्पेक्ट्रम जेजुनी एसएसपी। doylei (चित्रा 2) के साथ गणना की आणविक जनता की तुलना से पहचाना जा सकता है निहित।

152939117, S20-एम, और S15-एम (चित्रा 3) | संग्रह के भीतर अलग-अलग isoforms L32-एम, L33, काल्पनिक प्रोटीन सैनिक द्वारा इनकोडिंग के लिए पाया गया। बायोमार्कर आयनों को सौंपा शेष जनता का परीक्षण सी में अचल थे जेजुनी एसएसपी। doylei आइसोलेट्स। एमिनो एसिड प्रतिस्थापन बड़े पैमाने पर बदलाव के लिए इसी के साथ ही पीसीआर प्रवर्धन और विशेष जीन में 3 टेबल। तालिका 4 सूचियों सभी बायोमार्कर आयनों की एमिनो एसिड दृश्यों MSPP योजना में शामिल सूचीबद्ध प्राइमरों का उपयोग करने का सेंगर अनुक्रमण द्वारा पहचान की गई है पता चला allelic isoforms।

एक MSPP आधारित phyloproteomic UPGMA-पेड़ (चित्रा 4) एक ही सात सी के लिए गणना की गई जेजुनी एसएसपी। doylei वियोजन और सी जेजुनी एसएसपी। outgroup संदर्भ तनाव में उनके आणविक वजन के क्रम में सभी 14 बायोमार्कर आयनों की concatenated एमिनो एसिड दृश्यों का उपयोग कर के रूप में जेजुनी तनाव 81-176। प्रत्येक को अलग-एक व्यक्ति MSPP अनुक्रम प्रकार का प्रतिनिधित्व किया। हालांकि प्राप्त phyloproteomic संबंधों को पूरी तरह से MLST, सी द्वारा प्राप्त लोगों के लिए समान नहीं थे जेजुनी एसएसपी। doylei फिर दो subclusters में व्यवस्थित आइसोलेट्स। पहले subcluster एलएमजी 8843, एलएमजी 8870, और 9243 एलएमजी, एलएमजी 9255 द्वारा दूसरा, एलएमजी 9143 द्वारा बनाई गई थी, एलएमजी 8871 और एलएमजी 7790. MLST-विश्लेषण के साथ देखा के रूप में, अलग-थलग LMG7790 MSPP- में सबसे लंबे समय तक phyloproteomic दूरी से पता चला विश्लेषण।

आकृति 1
चित्रा 1: MLST-बाएसईडी वंशावली UPGMA-वृक्ष। बैलेंस्ड MLST आधारित UPGMA-dendrogram सात सी से निर्माण जेजुनी एसएसपी। doylei वियोजन और सी जेजुनी एसएसपी। जेजुनी तनाव 81-176। तनाव रंग कोड: एलएमजी 8843 (काला), एलएमजी 8870 (ग्रे), एलएमजी 9243 (नीला), एलएमजी 9255 (फ़िरोज़ा), एलएमजी 9143 (हरा), और एलएमजी 8871 (गुलाबी), एलएमजी 7790 (पीला), और 81- 176 (सफेद)। MLST-अनुक्रम प्रकार प्रत्येक को अलग के नाम के पीछे दी गई है। हर सी जेजुनी एसएसपी। doylei को अलग एक अलग MLST-अनुक्रम प्रकार के अंतर्गत आता है। एक्स अक्ष लिंकेज दूरी इंगित करता है। तनाव एलएमजी 7790 सबसे लंबे समय तक दूरी वंशावली शेष छह वियोजन की तुलना से पता चलता है। खींच एलएमजी 8843, एलएमजी 8870, और 9243 एलएमजी के साथ ही एलएमजी 9255, एलएमजी 9143, और एलएमजी सी के भीतर 8871 फार्म का दो अलग subclusters जेजुनी एसएसपी। doylei क्लस्टर। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: सी के जीनोमिक संबद्ध की अंतरिम कार्यभार जेजुनी एसएसपी। doylei ATCC 49349 (LMG 8843) मनाया बायोमार्कर आम जनता के लिए। सी के पूरे जीनोम अनुक्रम से भविष्यवाणी की ORFs की गणना की जनता (औसत समस्थानिक रचना) के आधार पर जेजुनी एसएसपी। तनाव doylei ATCC 49349, बायोमार्कर जनता इसी प्रोटीन दृश्यों कोडिंग को सौंपा गया। हालांकि, माप सीमा के भीतर, ribosomal सब यूनिटों L31 के लिए बायोमार्कर जनता (मेगावाट = 7315 दा), S17 (मेगावाट = 9549 दा), और S18 (मेगावाट = 10285 दा) के साथ ही उनके de-methioninated isoforms (इनसेट मी / z = 7,000-7,200 दा) स्पष्ट रूप से नहीं सौंपा जा सकता है। इसलिए, L31, एस 17, और S18 सी में शामिल नहीं थे जेजुनी एसएसपी। doylei MSPP योजना है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: सी के विशिष्ट बायोमार्कर बड़े पैमाने पर चोटियों जेजुनी एसएसपी। जन स्पेक्ट्रा doylei MSPP योजना। प्रत्येक पैनल में सभी सात सी का परीक्षण किया । जेजुनी एसएसपी doylei वियोजन (रंग चित्र 1 में के रूप में कोड) विशेष MSPP प्रकार के लिए इसी allelic isoforms के कारण बायोमार्कर बड़े पैमाने पर बदलाव के संकेत करने के लिए मढ़ा गया है: (ए) L36 + एच +; (बी) L34 + एच +; (सी) L32-एम एच +; (डी +; (ई) S14-एम एच +; (एफ) L29 + एच +, L28-एम एच +, और L35-एम एच +; (G) L24-एम एच +; (एच) सैनिक | 152939117 + एच +; (मैं) L27-एम एच +; (जे) S20-एम एच +; (कश्मीर) S15-एम एच +; (एल) S19-एम एच +; (एम) के एक गहन बड़े पैमाने पर ribosomal प्रोटीन S18 के चर संभावित बायोमार्कर चोटी ढक; (एन) S20-एम + 2H +; (ओ) L15-एम + 2H +; एक्स-अक्ष: जन [da] · आरोप 1 के अनुपात, पैमाने 200 दा। वाई अक्ष: तीव्रता [मनमाना इकाइयों], स्पेक्ट्रा व्यक्तिगत रूप से कम तीव्रता चोटियों के बेहतर दृश्य के लिए एक तुलनीय शोर के स्तर को समायोजित किया गया। एक ribosomal सबयूनिट के नाम के बाद "एम" de-methioninated isoform इंगित करता है। उसकी क्लिक करेंई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्रा 4
चित्रा 4:। MSPP आधारित phyloproteomic UPGMA-वृक्ष दर्शाया phyloproteomic UPGMA-वृक्ष ही सात सी में शामिल जेजुनी एसएसपी। doylei वियोजन और सी जेजुनी एसएसपी। चित्रा 1 के रूप में जेजुनी तनाव 81-176। एक रंग का स्थान (चित्रा 1 में के रूप में रंग कोड) प्रत्येक तनाव इंगित करता है। बेहतर तुलना के लिए वियोजन इनपुट आदेश है, जो MLST आधारित पेड़ से प्राप्त आदेश था में व्यवस्थित कर रहे हैं। dendrogram नीचे अक्ष लिंकेज दूरी इंगित करता है। हालांकि प्राप्त phyloproteomic संबंधों को पूरी तरह से वंशावली MLST आधारित वृक्ष के समान नहीं हैं, वैश्विक तस्वीर तुलनीय है। आबादी को दो समूहों में विभाजन: तीन अलग कर एलएमजी 8843, एलएमजी 8870, और एलएमजी 9243 फार्म एक clustएर, जबकि एलएमजी 9255, एलएमजी 9143, एलएमजी 8871 और एलएमजी 7790 फार्म का एक दूसरे क्लस्टर। भीतर इस क्लस्टर एलएमजी 7790 subcluster इस subcluster एलएमजी के भीतर एलएमजी 9255, एलएमजी 9143, और एलएमजी 8871. द्वारा गठित की तुलना में सबसे लंबे समय तक दूरी phyloproteomic चलता 9143 एलएमजी 9255. के संबंध में स्थिति स्विच हालांकि, यहां तक ​​MSPP-विधि प्रत्येक को अलग प्रतिनिधित्व का उपयोग कर एक व्यक्ति MSSP-अनुक्रम प्रकार। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: सी के सभी एनोटेट ORFs की गणना की जनता जेजुनी एसएसपी। doylei ATCC 49349 तनाव। सी में इनकोडिंग प्रत्येक प्रोटीन के सभी गणना monoisotopic आणविक भार की सूची जेजुनी एसएसपी। doylei ATCC 49349 जीनोम। ExPASy जैव सूचना संसाधन पोर्टल विशेष आणविक जनता की गणना के लिए इस्तेमाल किया गया था। कॉलम बी methioninated isoforms जबकि स्तंभ C को सूची बद्ध de-methioninated isoforms सूचीबद्ध करता है। Biomarker जनता सी में शामिल जेजुनी एसएसपी। doylei MSPP योजना लाल रंग में डाला जाता है। नोट: बायोमार्कर प्रोटीन L36 सी के जीनोम अनुक्रम में एनोटेट नहीं है जेजुनी एसएसपी। ATCC49349 doylei। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2:। मास परिवर्तन एकल SNPs के कारण एमिनो एसिड परिवर्तन से प्रेरित सभी संभावित एकल nucleotide बहुरूपताओं जिसके परिणामस्वरूप एमिनो एसिड मानक आनुवंशिक कोड का उपयोग आदान प्रदान के लिए जांच की गई। सभी मूक म्यूटेशन खारिज कर दिया गया था, और nonsynonymous म्यूटेशन resu के साथ एक साथ संकलितबड़े पैमाने पर परिवर्तन lting। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 3: Oligonucleotide सी का अनुक्रमण के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों जेजुनी एसएसपी। doylei MSPP-योजना में शामिल जीन इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

सारणी 4: सभी isoforms का अवलोकन सी में शामिल जेजुनी एसएसपी। doylei MSPP-योजना है। इस तालिका सूचियों सभी बायोमार्कर आयनों सी में शामिल जेजुनी एसएसपी। doylei MSPP सुप्रीम कोर्टवो मुझे। संदर्भ तनाव ATCC 49349 के अमीनो एसिड अनुक्रम पूरी तरह से दिया जाता है। आगे detectable isoforms के लिए, केवल विशिष्ट एमिनो एसिड प्रतिस्थापन सूचीबद्ध हैं। एमिनो एसिड नंबरिंग हमेशा शुरू methionine शामिल हैं; यदि मास स्पेक्ट्रोमेट्री इसके अभाव इंगित करता है, यह कोष्ठक (एम) में लिखा है। प्रत्येक isoform आणविक जन के लिए, जन के अंतर को संदर्भित करने के लिए तनाव ATCC 49349 isoforms और आवृत्ति isoform डाटासेट के भीतर संकेत दिया है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एक MSPP योजना की स्थापना में सबसे महत्वपूर्ण कदम बायोमार्कर आयन पहचान का स्पष्ट आनुवंशिक दृढ़ संकल्प है। यदि यह संभव निस्संदेह एक बायोमार्कर की पहचान करने के लिए नहीं है, तो यह योजना 13 से बाहर रखा जाना चाहिए।

सी जेजुनी एसएसपी। doylei योजना 14 विभिन्न बायोमार्कर आयनों भी शामिल है। इन 5 कम सी की तुलना में जेजुनी एसएसपी। जेजुनी MSPP योजना 13 व्याप्ति detectable सेल्सियस के बीच सबसे महत्वपूर्ण अंतर जेजुनी एसएसपी। जेजुनी और सी जेजुनी एसएसपी। doylei बायोमार्कर L31 (एम) और L35 (एम) 13 के मामले में एमिनो टर्मिनल methionine के posttranslational हटाने था।

परीक्षण किया सी में दिखाया गया है जेजुनी एसएसपी। doylei संग्रह को अलग-थलग, MSPP सभी सात अलग MLST अनुक्रम प्रकार के भेदभाव करने में सक्षम था। इसका मतलब यह है कि हर परीक्षण किया अलग एक विशिष्ट MSPP sequ के थेखिलाडि़यों प्रकार। इसके अतिरिक्त, MSPP सेल्सियस के बीच उप-प्रजाति भेदभाव की अनुमति देता है जेजुनी एसएसपी। जेजुनी और सी जेजुनी एसएसपी। doylei।

सामान्य में, संभावित भेदभाव को कम MLST तरह डीएनए अनुक्रम आधारित विधियों की तुलना में है MSPP से नीचे तनाव के स्तर पर आइसोलेट्स। एक अच्छी तरह से स्थापित isoform डेटाबेस मान लिया जाये, बैक्टीरियल वियोजन की subtyping डीएनए अनुक्रमण तरीकों 4, 13 की तुलना में बहुत तेजी से और बहुत सस्ता है।

इस तरह के प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) 4, 10, 28 या प्रोफाइल गणितीय मैट्रिक्स कि बाइनरी पीक मिलान की तुलना के परिणाम का विश्लेषण UPGMA 29, 30 का उपयोग कर के रूप में ICMS-स्पेक्ट्रा के श्रेणीबद्ध क्लस्टरिंग तरीकों की तुलना में MSPP का सबसे बड़ा फायदा इसकी उच्च आंतरिक reproducibility है। जबकि इस तरह के अलग-अलग संस्कृतियों के रूप में विभिन्न सांस्कृतिक स्थितियोंई मीडिया, विभिन्न अगर आरोप, अलग ऊष्मायन तापमान, और अलग अलग ऊष्मायन अवधि काफी पीसीए द्वारा गणना phyloproteomic संबंधों को प्रभावित है, वे MSPP deduced संबंधों 6, 13 को प्रभावित नहीं करते। इस उच्च reproducibility के लिए मुख्य कारण शिखर तीव्रता और सामान्य 13 में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम गुणवत्ता की स्वतंत्रता है। एक अलग से जन स्पेक्ट्रम में एक MSPP प्रासंगिक चोटी indubitably पहचान नहीं की जा सकती है, तो इसे फिर से व्यक्ति को अलग से जन स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड करने के लिए आवश्यक है।

MSPP विधि सिद्धांत रूप में रूपांतरित किया जा सकता है, हर माइक्रोबियल प्रजातियों के लिए। विशेष रूप से, क्लोस्ट्रीडियम बेलगाम, कोलाई, स्ताफ्य्लोकोच्चुस, और साल्मोनेला enterica एसएसपी। Enterica तरह नैदानिक प्रासंगिक माइक्रोबियल प्रजातियों के subtyping संभावित भविष्य के आवेदन कर रहे हैं। डाह कारकों या प्रतिरोध जीनों की अभिव्यक्ति phyl के साथ संबद्ध हैंoproteomic संबंध, MSPP नियमित नैदानिक ​​निदान में एक अभिनव उपकरण बन सकता है। Detectable चोटियों और इस तरह बायोमार्कर आयनों MSPP योजना में शामिल की संख्या की संख्या संभवतः विशेष रूप से कवक 31 के मामले में, विशेष निकासी और / या सेल प्रोटोकॉल का उपयोग करके बढ़ाया जा सकता है।

हाल ही में उपयोग MALDI-TOF तकनीक मुख्य रूप से केवल अत्यधिक प्रचुर मात्रा में ribosomal प्रोटीन का पता लगाने कर सकते हैं। ये अत्यधिक प्रचुर मात्रा में प्रोटीन लगभग सभी तरह के जन स्पेक्ट्रम में विषैलापन कारकों के रूप में अन्य छोटे प्रोटीन के साथ हस्तक्षेप। छोटे प्रोटीन ईएसआई-TOF एमएस (उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री की electrospray आयनीकरण समय) और एचपीएलसी (उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी), 32 को जोड़ने के द्वारा पता लगाया जा सकता है। हालांकि, वर्तमान में इस पद्धति का भी श्रम और लागत बड़ा अलग साथियों को चिह्नित करने के लिए गहन है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany 34967
Autoflex III TOF/TOF 200 system Bruker Daltonics, Bremen, Germany GT02554 G201 Mass spectrometer
bacterial test standard BTS Bruker Daltonics, Bremen, Germany 604537
BioTools 3.2 SR1 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 263564 Software Package
Bruker IVD Bakterial Test Standard Bruker Daltonics, Bremen, Germany 8290190 5 tubes
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8843 ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;strain 093
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9143 Goossens Z90
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG7790 ATCC 49350;CCUG 18265;Kasper 71;LMG 8219;NCTC 11847
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9243 Goossens N130
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8871 NCTC A603/87
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9255 Goossens B538
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8870 NCTC A613/87
Columbia agar base  Merck, Darmstadt, Germany 1.10455 .0500 500 g
Compass for FlexSeries 1.2 SR1 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 251419 Software Package
defibrinated sheep blood  Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Germany SR0051
ethanol Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany 02854 Fluka
formic acid Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany F0507
HCCA matrix Bruker Daltonics, Bremen, Germany 604531
Kimwipes paper tissue Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany Z188956
MALDI Biotyper 2.0 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 259935 Software Package
Mast Cryobank vials Mast Diagnostica, Reinfeld, Germany CRYO/B
MSP 96 polished steel target Bruker Daltonics, Bremen, Germany 224989
QIAamp DNA Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 51304
recombinant human insulin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany I2643
trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany T6508
water, molecular biology-grade Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany W4502

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References

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आनुवंशिकी अंक 116 MALDI-TOF नीचे-प्रजाति भेदभाव phyloproteomics ICMS, MSPP सूक्ष्म जीव विज्ञान
के Subtyping<em&gt; कैम्पिलोबैक्टर जेजुनी</em&gt; एसएसपी।<em&gt; doylei</em&gt; का प्रयोग वियोजन मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित PhyloProteomics (MSPP)
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Zautner, A. E., Lugert, R., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP). J. Vis. Exp. (116), e54165, doi:10.3791/54165 (2016).

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