Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

subtypning af Published: October 30, 2016 doi: 10.3791/54165
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universitätsmedizin Göttingen

Summary

Massespektrometri-baserede phyloproteomics (MSPP) blev anvendt til at skrive en samling af Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolater på stamme i forhold til multilocus sekvens maskinskrivning (MLST).

Abstract

MALDI-TOF MS giver mulighed for at skelne nogle bakterier ikke kun på niveau arter og underarter, men endog under, stammen være. Allele isoformer af de påviselige biomarkør ioner medfører isolat-specifikke masseskift. Massespektrometri-baserede phyloproteomics (MSPP) er en ny teknik, der kombinerer de massespektrometriske påviselige biomarkør masserne i en ordning, der giver mulighed for fradrag for phyloproteomic relationer fra isolere specifikke masseskift sammenlignet med et genom sekventeret henvisning stamme. De udledte aminosyresekvenser er derefter anvendt til at beregne MSPP-baserede dendrogrammer.

Her beskriver vi arbejdsgangen af MSPP ved at skrive en Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolere samling af syv stammer. Alle syv stammer var af human oprindelse og multilocus sekvens typning (MLST) viste deres genetiske mangfoldighed. MSPP-typning resulterede i syv forskellige MSPP sekvens typer, tilstrækkeligt afspejler deres grafilogenetic relationer.

C. jejuni ssp. doylei MSPP Ordningen omfatter 14 forskellige biomarkør ioner, hovedsagelig ribosomale proteiner i massen området fra 2 til 11 kDa. MSPP kan i princippet tilpasses andre massespektrometriske platforme med en udvidet masse rækkevidde. Derfor er denne teknik har potentiale til at blive et nyttigt redskab for stamme mikrobiel skrive.

Introduction

I det sidste årti, har matrix-assisteret laser desorption ionisering tid-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) frem for at være en højt værdsat standardmetode for mikrobiel slægt og identifikation art i klinisk mikrobiologi 1, 2. identifikation Arter er baseret på registrering af små protein fingeraftryk intakte celler eller cellelysater. Den typiske masse interval for et massespektrometer anvendes i rutinemæssig klinisk mikrobiologi er 2-20 kDa. Derudover kan den resulterende spektre anvendes til at skelne stammer på den nedenfor arter og under-underarter niveau 3. Tidlige banebrydende studier har identificeret specifikke biomarkør ioner for en særlig undergruppe af stammer i Campylobacter jejuni 4, Clostridium difficile 5, Salmonella enterica ssp. enterica serovar Typhi 6, Staphylococcus aureus 7-9, og Escherichia coli 10-12.

Kombinationen af ​​flere variable biomarkør masser, der svarer til allele isoformer giver mulighed for dybere subtypning. Tidligere vi med succes gennemført en metode til at konvertere disse variationer i masse profiler i meningsfulde og reproducerbare phyloproteomic relationer kaldes massespektrometri baseret phyloproteomics (MSPP) på en C. jejuni ssp. jejuni isolat samling 13. MSPP kan anvendes en massespektrometrisk svarende til DNA-sekvens baseret subtypning teknikker som multilocus sekvens typebestemmelse (MLST).

Campylobacter-arter er den hyppigste årsag til bakteriel gastroenteritis verdensplan 14, 15. Som følge af Campylobacteriose post-infektiøs følgesygdomme, nemlig Guillain-Barré syndrom, reaktiv arthritis og inflammatorisk tarmsygdom kan opstå 16. De vigtigste kilder til infektion erforurenet husdyr kød fra kylling, kalkun, svin, kvæg, får og ænder, mælk og overfladevand 15, 17. Derfor regelmæssige epidemiologiske overvågning studier i forbindelse med fødevaresikkerhed er nødvendige. MLST er "gold standard" i molekylær typning for Campylobacter arter 18. Fordi Sanger-sekventering baseret MLST fremgangsmåde er arbejdskrævende, tidskrævende og forholdsvis dyr, er MLST typning begrænset til relativt små isolere kohorter. Derfor er der et behov for billigere og hurtigere subtypning metoder. Dette behov kan opfyldes ved massespektrometriske metoder som MSPP.

Denne artikel præsenterer en detaljeret protokol for MSPP-typning ved hjælp af en samling af Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolater og sammenligning af dens potentiale med MLST.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forbered en sikker arbejdsplads ved at overveje Biosafety Betingelser

  1. Bliv fortrolig med laboratorie- og sikkerhedsregler, som er relevante for at arbejde med mikroorganismer. De fleste humane patogene mikroorganismer skal håndteres på biosikkerhed niveau 2 betingelser, men nogle, såsom Salmonella enterica serovar Typhi, kræver biosikkerhedsniveauet 3. Oplysninger om niveau håndtere hver patogen kan tilgås ved www.cdc.gov/biosafety.
  2. Uanset den biohazard klassificeringen af ​​den specifikke mikroorganisme, betragter alle materialer, der kom i kontakt med det infektiøse agens som smittefarligt affald, der skal autoklaveres før bortskaffelse. Respekt regionale retningslinjer for farlige materialer og biologiske stoffer sikkerhed. Sikre at egnede beholdere til øjeblikkelig og korrekt bortskaffelse af potentielt forurenede materialer (biologiske risici) er tilgængelige.
  3. Sørg for, at sterile instrumenter (vaccinationskort loops), løsninger og kulturmedier (agarplader) er tilgængelige, før de påbegynder bakteriekultur.
  4. Vask hænder med antiseptisk sæbe og varmt vand umiddelbart efter håndtering af infektiøse mikroorganismer.

2. Vælg reference og Collection isolater

  1. Udvælge og opnå en standard genom-sekventeret henvisning isolere sammen med sekvenserne af det kodede proteom, ideelt i FASTA format. Hvis flere genom-sekventeret stammer er tilgængelige, omfatter disse i analysen.
    Bemærk: Denne isolat / disse isolater vil senere blive brugt til at forudsige identiteten af ​​massen toppe observeret i massespektrometri (se afsnit 7).
  2. Vælg og få en række potentielt forskellige isolater på en sådan måde, at de dækker fylogeni af de arter eller underarter af interesse.
    Bemærk: Disse isolater vil senere blive brugt til at demonstrere variation af biomarkører i befolkningen (se afsnit 8).
  3. Sørg for, at hele samlingen og reference isolat (e) er properly typebestemt ved den respektive gold standard for denne særlige organisme 18-20.
    Bemærk: Dette kan omfatte en række forskellige (under) -typing metoder, men vil sandsynligvis ty til MLST, som stadig er den standard metode til at påvise genetiske mangfoldighed af de fleste mikrobielle arter.
  4. For at udlede fylogeni i samlingen, beregne en Fylogram fra skrive data, fx ved hjælp af den uvægtede par gruppen metode med aritmetiske gennemsnit (UPGMA) i MEGA6 software til MLST data 21. For MLST data, også konsultere en MLST database og tildele sekvens typer og respektive klonede komplekser 22.
    Bemærk: Dette vil senere blive brugt til at analysere kongruens af MSPP med tidligere guldstandarden typningsmetode (se afsnit 9).

3. Forbered en MALDI måltavle

ADVARSEL: TFA er en stærk syre. Forkert brug af TFA bærer risikoen for svære forbrændinger af huden, øjenskader og alvorlig irritation of de øvre luftveje ved indånding. Derfor skal strenge sikkerhedsforanstaltninger respekteres, og der er behov for ordentlig personlige værnemidler (PPE), herunder beskyttelsesbriller, ansigt skjolde, egnede handsker, støvler, eller endda en fuld beskyttelsesdragt, mens håndtering TFA. Mulig udsættelse for TFA skal styres af håndtering af stoffet under tilstrækkelig ventilation med en effektiv udsugning system. I tilfælde af utilstrækkelig ventilation, skal åndedrætsværn med godkendt filter anvendes. Derudover TFA er skadeligt for vandlevende organismer, med langvarige virkninger. skal undgås enhver frigivelse af TFA i spildevand til miljøet.

Bemærk: Før spotting prøverne på en MALDI mål, rengøre målpladen grundigt, hvis pladen blev anvendt tidligere.

  1. Forbered 100 ml 70% vandig ethanolopløsning ved hjælp af 30 ml deioniseret vand og 70 ml ren ethanol.
  2. Forbered 250 pi af en 80% vandig trifluoreddikesyre (TFA) opløsning ved at blande 50pi deioniseret vand og 200 pi 100% TFA i et reagensglas og omhvirvling af røret i 1 min.
  3. Rengør MALDI target ved at sætte det ind i en glasskål og submersing det i 70% vandig ethanol i ca. 5 minutter ved stuetemperatur.
  4. Skyl målet under varmt vand.
  5. Ved hjælp af et papir væv, tørre måltavle intensivt med 70% vandig ethanol løsning til at fjerne alle tidligere prøver og andre potentielle vragdele.
  6. Hvis yderligere rengøring er nødvendig, skylles under varmt vand, mens aftørring med en papirserviet.
  7. Fjerne resterende, og potentielt usynlige, forureninger, ved at dække måloverfladen med et tyndt lag af 80% vandig TFA (~ 100 pi pr 96 pletter) og tørrer alle målpositioner ren med en papirserviet.
  8. Til sidst skylles målet at fjerne syre, tørre det tørt med en papirserviet, og lad det i mindst 15 minutter ved stuetemperatur for at fordampe resterende væske.

4. Fremstilling af en45; cyano-4-hydroxy-kanelsyre-Matrix opløsning indeholdende et indre kalibrant

  1. Der fremstilles en mættet matrix opløsning ved at opløse 10 mg α-cyano-4-hydroxy-kanelsyre (HCCA) i 1 ml af en blanding af 50% acetonitril, 47,5% vand og 2,5% TFA. Resterende uopløst HCCA vil forblive, hvis opløsningen er mættet.
  2. Tilføj rekombinant humant insulin som en intern kalibrator. Til dette fremstilles en stamopløsning til en slutkoncentration på 10 pg / pl i 50% vandig acetonitril, alikvot og opbevares ved -20 ° C til yderligere anvendelse.

5. MALDI-TOF-massespektrometri

Bemærk: Dyrkningsbetingelser specifikke for organismerne af interesse skal anvendes. Prøver til MALDI-TOF MS kan fremstilles enten ved udstrygning præparat eller ekstraktion, afhængigt af organismen (se afsnit 8.4.1). Mens ethanol-myresyre ekstraktion metode giver tilstrækkelig inaktivering af patogener, smøre forberedelse skal udføres under sufficient biosikkerhed betingelser som påkrævet (se afsnit 1). Normalt er der ingen risiko for infektion efter påføring af matrixen, men for specifikke patogener der kræves specifikke inaktiveringsprotokoller. For eksempel MALDI-TOF MS af Nocardia arter kræver således tidligere lysis af bakterierne i kogende vand, efterfulgt af ethanoludfældning af proteiner 23. EI Khéchine et al. udviklet en procedure til inaktivering af Mycobacteria, opvarmning af bakteriekolonier ved 95 ° C i 1 time i glas med skruelåg indeholdende vand og 0,5% Tween 20 24.

  1. Smør Forberedelse
    1. Spred et knappenålshoved størrelse mængde af en bakteriel koloni direkte på en MALDI måltavle position ( "spot").
    2. Overlay hver plet med 1 pi HCCA regelmæssig matrix eller matrix med indre kalibrant og lad det krystallisere ved stuetemperatur. Til bestemmelse af nøjagtig masse af toppen kalibrering, overlejre en kontrol spot med 1 pi Test Standard og 1 pi HCCA matrix indeholdende den interne kalibrant.
      Bemærk: Her som Test Standard et ekstrakt af Escherichia coli DH5 alpha anvendes som demonstrerer et karakteristisk protein fingeraftryk i MALDI-TOF MS. Det spiked det med to proteiner, der udvider den øvre grænse af det påviselige masseinterval.
  2. ekstraktion Metode
    1. Harvest cirka fem kolonier fra en agarplade kultur med en podning loop og grundigt suspendere i 300 pi dobbeltdestilleret vand i et 1,5 ml reaktionsrør. Tilføj 900 pi absolut ethanol og blandes grundigt ved gentagen pipettering indtil bakteriekolonier er helt afbrudt.
      Bemærk: I dette trin er det muligt og veletableret at opbevare prøverne ved -20 ° C. Derudover kan inaktivering af patogener afprøves ved udstrygning 1-10 pi af ekstrakten på en egnet agarplade efter inkubation ved optimale vækstbetingelser. vellykket iaktivering er angivet ved fravær af mikrobiel vækst.
    2. Centrifugeres prøven ved 13.000 x g i 1 min, supernatanten fjernes, og tør pellet ved stuetemperatur i 10 minutter. Pellet resuspenderes grundigt ved pipettering op og ned i 50 pi 70% myresyre.
    3. Der tilsættes 50 pi acetonitril og blandes. Fjerne snavs ved centrifugering ved 13.000 xg i 2 min. Overfør 1 ml af supernatant onto en prøve position på en MALDI måltavle og lad det tørre i 5 minutter ved stuetemperatur.
    4. Overlay hver plet med 1 pi HCCA matrix indeholdende den interne kalibrant og lad det krystallisere ved stuetemperatur.
  3. Optagelse af Mass Spectra
    Bemærk: Peak-picking fra massespektre sker ved hjælp af standard procedurer anbefales (Centroid algoritme, S / N-forhold:. 2; rel Intensitet tærskel: 2%; Topbredden 3 m / z, baseline subtraktion: TopHat)
    1. Kalibrere instrumentet ifølge producenternes protocol.
    2. For hver plet, samle 600 spektre i 100-shots trin.
      1. Gå til "AutoXecute" fanen af ​​konfigurationssoftwaren af ​​massespektrometer. Åbn "Method" ved at venstreklikke på hen på knappen "Method" og vælge den metode, f.eks, "MBT_AutoX" fra rullemenuen.
      2. Venstre-klik på "Rediger ..." -knappen til højre i menuen "Method" for at åbne "AutoXecute Method Editor". Gå til "Ophobning" fanen. Indstil "Sum op" værdien til "600" og "tilfredsstillende skud i" _X_ "shot trin" værdien til "100".
  4. Intern Spectrum Kalibreringsprocedure
    Bemærk: Minut målefejl er uløseligt forbundet med massespektrometri. Afhængig af intermitterende instrument brug, instrument temperatur og re-kalibrering, kan de opnåede måleværdier varierer mellem eksperimenter. Efter præ-måling instrument kalibrering og post-måling spektrum kalibrering til en intern kalibrant er den mest præcise måde at sikre inter-spektrum sammenlignelighed.
    1. Udfør følgende procedurer for hver kalibrering peak liste:
      1. Start spektrum browser (fx flexAnalysis og åben spektrum:. Menuen "Filer" → "Åbn ...")
      2. Opret massekontrolprogram liste med kalibrant peak: Menuen "Method" → "Åbn ...".
      3. Vælg metode: MBT_Standard.FAMSMethod → ​​"Open".
      4. Rediger Mass Control List: Fjern markeringen alle kalibranter.
      5. Tilføj kalibrant peak nederst: Peak Label: "Insulin_HIStag [M + H] + _ avg"; m_z: "5808,29"; Tolerance [ppm]: "50"; Tjek kalibrator afkrydsningsfeltet.
      6. Gem som fx "MSPP kalibrant liste".
    2. For hvert spektrum, vælge den kalibrant peak fra listen, skal du klikke på "Automatic Assign", og tryk på "Ok".
ove_title "> 6. Kontroller den interne Kalibreringsprocedure

  1. Eksperimentelt Bestem Eksakt Masse af kalibrering Peak.
    1. Forbered to pletter med en pi Test Standard hvert (trin 5.1.1). Overlay den første med 1 pi regelmæssig HCCA matrix, den anden med en pi kalibrant-spiked matrix.
    2. Opnå massespektre fra hver plet (afsnit 5.3), og internt kalibrere til Test Standard toppe (afsnit 5.4).
    3. Overlay både spektre ved at åbne dem med spektret browser (fx flexAnalysis og åben spektrum: menuen "Filer" → "Åbn ...") og finde toppen på den forventede masse (insulin m / z = 5,808.29), som bør være til stede i den kalibrant-spiked spektrum, men ikke i spektret opnået med regelmæssig matrice.
  2. Kontroller at kalibrant Peak ikke skjules af andre biomarkør for organismen af ​​interesse.
    1. Forbered to pletter (afsnit 5.1) med reference stamme og overlay den første med 1 pi regelmæssig matrix, den anden med en pi kalibrant-spiked matrix.
    2. Anskaf massespektre fra begge pletter (afsnit 5.3) og overlay den resulterende spektre ved at åbne dem med spektret browser (fx flexAnalysis og åben spektrum: menuen "Filer" → "Åbn ..."). Sørg for, at kalibrant peak er klart synlig i spektret opnået med spidse matrix og ikke skjules af en anden tilstødende signal. Hvis dette ikke er tilfældet, skal du vælge en anden kalibrant for denne særlige organisme.
      Bemærk: Brug af en spidse intern kalibrant øger præcisionen til at bestemme variationer af biomarkør masser. Ved anvendelse af denne metode, kan detekteres masseforskelle ned til 1 Da. Alternativt kan også invariante masse hidrører fra organismer anvendes til kalibrering. Men per definition alle organisme-afledte masser skal betragtes som potentielt variabel, medmindre andet er bevist.

  1. Mål Massespektrum af reference Strain, Brug Matrix Spiked med den interne kalibrant.
    1. Spred et knappenålshoved størrelse mængde af en bakteriel koloni (afsnit 5.1) eller en pi af bakterielt protein ekstrakt (afsnit 5.2) direkte på en MALDI måltavle position ( "spot").
    2. Overlay hver plet med 1 pi HCCA matrix med den interne kalibrant og efterlade målpladen at krystallisere ved stuetemperatur (afsnit 5.1.2 / 5.2.4).
    3. Optag masse spektre af referencen stamme (afsnit 5.3).
  2. Internt kalibrere referencespektret til kalibrant masse (her: insulin ved m / z = 5,806.29), og efterfølgende pre-proces ved baseline subtraktion (TopHat) og udglatning (parametre: SavitzkyGolay; bredde: 2 m / z, 10 cykler).
    1. Start spektrum browser (fx flexAnalysis og åben spektrum: menuen "Filer" → "Open ...; ").
    2. Vælg metode: rullemenu "Method" → "Åbn ...", Venstre-klik den foretrukne metode, fx "MBT_Standard.FAMSMethod" → "Open".
    3. Kalibrer spektrum ved at vælge "Intern ..." fra rullemenuen "Kalibrer". Et vindue åbnes notering kalibrant top (s) (afsnit 5.4). Venstre-klik på kalibrant peak (Insulin) → Venstre-klik på "OK". Vælg "Process spektre" fra "Process" rullemenuen.
    4. For baseline subtraktion aktivere spektret i listen spektrum i højre side. Vælg "Træk Massespektrum Baseline" fra "Process" rullemenuen.
    5. For at udjævne spektret, aktivere spektret i listen spektrum i højre side. Vælg "Glat Massespektrum Baseline" fra "Process" rullemenuen.
  3. Fra genomet sekventering data af referencestammen, beregne theoretical monoisotopisk molekylvægt af hver af de kodede proteiner ved at oversætte DNA-sekvens i tilsvarende aminosyresekvens ved anvendelse af en sekvens alignment editor. Copy-paste dette protein sekvens i input boksen ExPASy Bioinformatics Resource Portal (http://web.expasy.org/compute_pi/). og tryk på "Klik her" at beregne pi / Mw. I tilfælde af C. jejuni ssp. doylei beregne massen af 14 detekterbare biomarkører.
  4. Kopier resultaterne i et regneark, med en kolonne indeholdende genet identifikator og den næste molekylvægten. Sorter rækkerne ved beregnet molekylvægt at lette lettere opslag af masserne. Bemærk: Andre kolonner er valgfri; funktionel annotation kan være særligt nyttigt senere for fortolkning.
  5. Indsæt en anden kolonne i regnearket for molekylvægten af ​​de-methioninated form subtrahere 135 Da fra monoisotopisk molekylvægt. Bemærk: Dette er fordi nogle proteiner undergår indlægtranslationel modifikation af proteolytisk fjernelse af N-terminale methionin.
  6. Tildel hvert større målte biomarkør masse til de beregnede masserne fra referencestammen ved at se op den målte masse fra genomet tabellen ovenfor fremstillede (tabel 1).
  7. Hvis biomarkør ioner ikke kan tildeles forudsagte genprodukter, overveje andre posttranslationelle modifikationer (methylering, acetylering, prenylering, osv, se http://www.abrf.org/delta-mass for en samling af ændringer og de tilhørende masseændringer ). For enhver anden kendt posttranslationelle modifikation, der ofte observeret i de organismer af interesse føje en anden kolonne i tabellen og genberegne molekylvægten analog med fremgangsmåden for de-methioninated formular.
  8. Opsæt en anden fane regneark, og registrerer for hver biomarkør ion massen og identifikator i en separat tabel kolonne.

8. Vurdere Biomarkør Variabiliteti Befolkning

  1. Kalibrer massespektre opnået fra indsamling isolater som på henvisningen stamme (r) (afsnit 5.4.2).
  2. Identificer variante biomarkører i massespektret. En variant masse er kendetegnet ved fraværet af en masse kendt fra referencespektret og udseendet af en hidtil ukendt masse ikke er til stede i referencen. Massen forskel skal svare til en enkelt aminosyre udveksling (tabel 2), eller en kombination deraf.
  3. På ét isolat pr række, registrerer den målte masse for hver biomarkør og den forudsagte isoform i de respektive tabelkolonner.
    Bemærk: I sjældne tilfælde kan nogle masseskift tilskrives flere forskellige aminosyre børser, fx både, N udveksles af D og Q udveksles af E, og omvendt, resultere i en masse skift af 0,985 Da (tabel 2). Denne iboende problem kan ikke løses ved massespektrometri alene. Derfor forskellige isoformer på proteinsekvensen niveau med samme masseskal behandles som en enkelt MSPP type. Parallel Sanger sekventering af de særlige biomarkør ion gener bekræftet, at dette problem ikke skete mens MSPP-skrive C. jejuni ssp. doylei isolere samling anvendt i denne undersøgelse.
  4. Bekræft hidtil ukendte MSPP typer af PCR-amplifikation og sekventering af de respektive biomarkør gener. Til gengæld danner også bekræftelse på, at biomarkør identitet er blevet tildelt korrekt.
    1. Kultur bakterielle isolater under optimale vækstbetingelser. Kultur C. jejuni ssp. doylei stammer på Columbia agar suppleret med 5% fåreblod ved 37 ° C under mikroaerofile betingelser (5% O2, 10% CO2, 85% N2). Inkuber i ca. 48 timer. Brug en separat agarplade for hvert isolat for at undgå krydskontaminering.
    2. Uddrag genomisk DNA fra de bakterielle isolater med et egnet DNA-ekstraktion kit / automatiserede maskiner ifølge producentens anvisninger.
      3. <li> forstærke respektive biomarkør gener ved anvendelse af primerne, der er anført i tabel 3 Udfør alle PCR-reaktioner under følgende betingelser:. denaturering ved 94 ° C i 30 sek; annealing ved 55 ° C i 30 sek; forlængelse ved 72 ° C i 30 sek.
    3. Bestem DNA-sekvensen af ​​hvert amplikon af Sanger-sekventering under anvendelse af en passende mængde af genomisk DNA (sædvanligvis 600-700 ng DNA er tilstrækkelig ved en koncentration på ca. 100 ng / pl) og en af ​​amplifikationsprimerne (normalt dette gøres ved brug af en service provider).
  5. I en separat tabel (se tabel 4), optage afledte proteinsekvens for hver roman isoform ved hjælp af en passende oversættelse værktøj (f.eks Transseq: http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/) 25.

9. Beregn en MSPP-baserede Fylogeni og sammenlign til Gold Standard

  1. Sammenkæde de særlige biomarkør aminosyresekvenserne tilhører than MSPP type isolaterne i en kontinuerlig sekvens ved hjælp af en sekvens alignment editor, såsom BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) 26 eller biomarkør regneark.
  2. Beregn fylogeni ved clustering som på guldstandarden skrive data, f.eks UPGMA klyngedannelse 21.
  3. Sammenlign MSPP-baserede fylogeni til den, der opnås med den gyldne standard 4, 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tidligere vi med succes etableret en MSPP ordning for C. jejuni ssp. jejuni 13. Her har vi til formål at udvide metoden til søskende underart C. jejuni ssp. doylei. I dette specifikke indstilling, syv C. jejuni ssp. doylei isolater blev erhvervet fra den belgiske samling af mikroorganismer / Laboratorium for Microbiology UGent BCCM / LMG Gent, Belgien. Alle syv isolater anvendes til vores analyser var af human oprindelse. Genomet-sekventeret stamme ATCC 49349 (LMG 8843), oprindeligt isoleret fra fæces fra en 2-årig australsk barn med diarré tjente som reference. Fra indsamling, yderligere seks stammer var til rådighed: LMG 9143, LMG 9243, og LMG 9255 isoleret fra afføring fra børn, der lider diarré og bor i Bruxelles, Belgien; LMG 7790 (ATCC 49350) isoleret fra en gastrisk biopsiprøve af en person fra Tyskland; og LMG 8870 (NCTC A613 / 87) samt LMG 8871 (NCTC A603 / 87), begge isoleret fra forskellige blodprøver hentet fra sydafrikanske børn.

Alle C. jejuni ssp. doylei isolater blev opbevaret ved -80 ° C som Cryobank lagre, frisk optøet ved hver analyse og dyrket ved anvendelse af Columbia-agar base, suppleret med 5% fåreblod og inkubation i 48 timer ved 37 ° C under mikroaerofile betingelser (5% O 2, 10% CO2, 85% N2).

I modsætning til etableringen af MSPP teknik til C. jejuni ssp. jejuni 13 var det ikke muligt at basere metoden på en isoform database afledt af en større sekvens samling. Kun en enkelt C. jejuni ssp. doylei post var til stede i rMLST databasen, og det svarede til referencen stammen C. jejuni ssp. doylei ATCC 49.349 27. Derfor har hver biomarkør masseskift påvist i sammenligning med stamme C. jejuni ssp. doylei ATCC 49.349 var en ny post i isoform database og skulle bekræftes af Sanger sekventering.

For at analysere de mange forskellige det opnåede C. jejuni ssp. doylei isolater, MLST blev udført, og en MLST-baserede UPGMA-dendrogram herunder syv undersøgte C. jejuni ssp. doylei isolater og C. jejuni ssp. jejuni stamme 81-176 som udgruppe beregnet (figur 1). Hver C. jejuni ssp. doylei isolat tilhørte en anden MLST-sekvens type, falder i to subclusters. Stamme LMG7790 havde den længste fylogenetiske afstand i forhold til den resterende C. jejuni ssp. doylei isolater.

Den skrivbare MALDI-TOF referencemasse spektrum af C. jejuni ssp. doylei (figur 2).

I samlingen, blev påvist forskellige isoformer for L32-M, L33, det hypotetiske protein kodet af gi | 152.939.117, S20-M, og S15-M (figur 3). De resterende masser tildelt biomarkør ioner var uforanderlig i det testede C. jejuni ssp. doylei isolater. Aminosyre-substitution svarende til de masseskift er blevet identificeret ved PCR-amplifikation og Sanger sekventering af det bestemt gen anvendelse af primerne, der er anført i tabel 3. Tabel 4 opregner de aminosyresekvenserne af alle biomarkør ioner indgår i MSPP ordningen, og de detekterede allele isoformer.

En MSPP-baserede phyloproteomic UPGMA-træ (figur 4) blev beregnet for den samme syv C. jejuni ssp. doylei isolater og C. jejuni ssp. jejuni stamme 81-176 som udgruppe hjælp af de sammenkædede aminosyresekvenser af alle 14 biomarkør ioner i rækkefølge efter deres molekylvægt i referencestammen. Hver isolat repræsenterede en individuel MSPP-sekvens typen. Skønt de opnåede phyloproteomic forbindelser var ikke fuldt identiske med dem opnået ved MLST, C. jejuni ssp. doylei isolater igen arrangeret i to subclusters. Den første subcluster blev dannet af LMG 8843, LMG 8870, og LMG 9243, den anden ved LMG 9255, LMG 9143, LMG 8871 og LMG 7790. Som det ses med MLST-analyse viste isolere LMG7790 den længste phyloproteomic afstand i MSPP- analyse.

figur 1
Figur 1: MLST-based fylogenetisk UPGMA-træ. Balanced MLST-baserede UPGMA-dendrogram konstrueret ud fra syv C. jejuni ssp. doylei isolater og C. jejuni ssp. jejuni stamme 81-176. Stamme farvekode: LMG 8843 (sort), LMG 8870 (grå), LMG 9243 (blå), LMG 9255 (turkis), LMG 9143 (grøn), og LMG 8871 (lyserød), LMG 7790 (gul), og 81- 176 (hvid). Den MLST-sekvens typen gives bag navnet på hvert isolat. Hver C. jejuni ssp. doylei isolere tilhører en anden MLST-sekvens typen. X-aksen viser liftkontakterne afstande. Stamme LMG 7790 viser den længste fylogenetiske afstand i forhold til de resterende seks isolater. Stammer LMG 8843, LMG 8870, og LMG 9243 samt LMG 9255, LMG 9143, og LMG 8871 danner to forskellige subclusters i C. jejuni ssp. doylei klynge. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Foreløbig tildeling af genomiske korrelater til C. jejuni ssp. doylei ATCC 49349 (LMG 8843) til observerede biomarkør masserne. Baseret på de beregnede masse (gennemsnitlig isotopiske sammensætning) af forudsagte ORF'er fra hele genomet sekvens af C. jejuni ssp. doylei stamme ATCC 49.349 blev biomarkør masserne tildelt det tilsvarende protein-kodende sekvenser. Men inden måleområdet, de biomarkør masserne for ribosomale subunits L31 (MW = 7315 Da), S17 (MW = 9549 Da), og S18 (MW = 10.285 Da) samt deres de-methioninated isoformer (indsat m / z = 7,000-7,200 Da) ikke kunne entydigt tildelt. Derfor L31, S17, og S18 var ikke inkluderet i C. jejuni ssp. doylei MSPP ordningen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Specifikke biomarkør masse toppe af C. jejuni ssp. doylei MSPP ordningen. I hvert panel massespektret af alle syv testede C. . jejuni ssp doylei isolater (farvekode som i figur 1), der svarer til de bestemte MSPP typer er blevet overlejret at indikere biomarkør masseskift grund allele isoformer: (A) L36 + H +; (B) L34 + H +; (C) L32-M + H +; (D +; (E) S14-M + H +; (F) L29 + H +, L28-M + H +, og L35-M + H +; (G) L24-M + H +; (H) gi | 152.939.117 + H +; (I) L27-M + H +; (J) S20-M + H +; (K) S15-M + H +; (L) S19-M + H +; (M) en intens masse slørende variabel potentiel biomarkør top af ribosomalt protein S18; (N) S20-M + 2H +; (O) L15-M + 2H +; X-Akser: masse [Da] · charge-1 ratio, skala 200 Da. Y-Akser: intensitet [arbitrære enheder], blev spektre individuelt tilpasset til en sammenlignelig støjniveau for bedre visualisering af lavintensive toppe. "-M" Efter navnet på en ribosomal underenhed angiver de-methioninated isoform. Klik hendee for et større version af denne figur.

Figur 4
Figur 4:. MSPP-baserede phyloproteomic UPGMA-tree Den afbildede phyloproteomic UPGMA-træ indeholder de samme syv C. jejuni ssp. doylei isolater og C. jejuni ssp. jejuni stamme 81-176 som i figur 1. En farvet plet (farvekode som i figur 1) viser hver stamme. For bedre sammenligning isolaterne er anbragt i input rækkefølge, som var fastsættelse opnået fra MLST-baserede træ. Aksen under dendrogram angiver liftkontakterne afstande. Selvom de opnåede phyloproteomic relationer ikke er helt identisk med den fylogenetiske MLST-baserede træ, det globale billede er sammenlignelige. Befolkningen deler sig i to grupper: de tre isolerer LMG 8843, LMG 8870, og LMG 9243 udgør en clustis, mens LMG 9255, LMG 9143, LMG 8871 og LMG 7790 formular en anden klynge. Inden for denne klynge LMG 7790 viser den længste phyloproteomic afstand i forhold til subcluster dannet af LMG 9255, LMG 9143, og LMG 8871. Inden for denne subcluster LMG 9143 skifter position i forhold til LMG 9255. Men selv ved hjælp af MSPP-metoden hver isolere repræsenterer en individuel MSSP-sekvens type. klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: Beregnet masse af alle kommenterede ORF'er til C. jejuni ssp. doylei ATCC 49.349-stammen. Liste over alle beregnede monoisotopisk molekylvægte på hvert protein kodet i C. jejuni ssp. doylei ATCC 49349-genomet. Den ExPASy Bioinformatik Resource Portal blev anvendt til beregning af de særlige molekylære masser. Kolonne B viser de methioninated isoformer mens kolonne C viser de de-methioninated isoformer. Biomarkør masserne inkluderet i C. jejuni ssp. doylei MSPP ordning er fremhævet med rødt. Bemærk: biomarkør protein L36 er ikke kommenteret i genomet sekvens af C. jejuni ssp. doylei ATCC49349. Klik her for at downloade denne fil.

Tabel 2:. Masse forandringer som følge af aminosyreændringer følge enlige SNPs Alle potentielle enkelt nucleotid polymorfismer blev undersøgt for den resulterende aminosyreudvekslingen anvendelse af standard genetiske kode. Alle tavse mutationer blev kasseret, og ikke-synonyme mutationer kompileret sammen med resulting masse forandringer. Klik her for at downloade denne fil.

Tabel 3: Oligonukleotidprimere anvendt til sekventering af C. jejuni ssp. doylei gener indgår i MSPP-ordningen Klik her for at downloade denne fil.

Tabel 4: Oversigt over alle isoformer inkluderet i C. jejuni ssp. doylei MSPP-ordning. Denne tabel viser alle biomarkør ioner indgår i C. jejuni ssp. doylei MSPP schæm. Aminosyresekvensen af ​​referencen stamme ATCC 49.349 gives fuldstændigt. For yderligere detekterbare isoformer, er kun specifikke aminosyresubstitutioner anført. Aminosyrenummerering omfatter altid start-methionin; hvis massespektrometri indikerer fravær, står der i parentes (M). For hver isoform molekylmasse, til masse forskel referere stamme ATCC 49349 isoformer og frekvens inden isoformen datasæt er angivet. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den mest kritiske skridt i etableringen af ​​en MSPP ordningen er den utvetydige genetiske bestemmelse af biomarkør ion identiteter. Hvis det ikke er muligt at identificere en biomarkør utvivlsomt, så det bør være udelukket fra ordningen 13.

C. jejuni ssp. doylei Ordningen omfatter 14 forskellige biomarkør ioner. Disse er 5 mindre i forhold til C. jejuni ssp. jejuni MSPP ordning 13 .Den væsentligste forskel mellem den påviselige C. jejuni ssp. jejuni og C. jejuni ssp. doylei biomarkører var den posttranslationelle fjernelse af det aminoterminale methionin i tilfælde af L31 (-M) og L35 (-M) 13.

Som vist i det testede C. jejuni ssp. doylei isolere indsamling, MSPP var i stand til at diskriminere alle syv forskellige MLST sekvens typer. Det betyder, at hver testet isolat tilhørte en bestemt MSPP sequining type. Derudover MSPP tillader underarter differentiering mellem C. jejuni ssp. jejuni og C. jejuni ssp. doylei.

Generelt potentiale til at diskriminere isolater ved den nedenfor stamme af MSPP er lavere i forhold til DNA-sekvensen-baserede metoder som MLST. Antages en veletableret isoform databasen subtypebestemmelse af bakterielle isolater er meget hurtigere og meget billigere i forhold til DNA-sekventering metoder 4, 13.

Den største fordel ved MSPP sammenlignet med hierarkiske clustering metoder til ICMS-spektre såsom brug af principal komponent analyse (PCA) 4, 10, 28 eller UPGMA analyse af den matematiske matrix, der resulterer af sammenligningen af binære topsammenligning profiler 29, 30 er dens høje iboende reproducerbarhed. Mens forskellige kulturelle forhold, såsom forskellige culture medier, forskellige agar afgifter, forskellige inkubationstemperatur, og forskellige inkubationsperioder væsentligt påvirker phyloproteomic relationer beregnet ved PCA, de ikke påvirker MSPP udledt relationer 6, 13. Den væsentligste årsag til denne høj reproducerbarhed er uafhængighed peak intensitet og massespektrum kvalitet i almindelighed 13. Hvis en MSPP tilsvarende top i massespektret af et isolat ikke kan identificeres utvivlsomt er det nødvendigt at registrere massespektret af den enkelte isolat igen.

Den MSPP metoden kan tilpasses, i princippet hvert mikrobielle arter. Især den subtypning af kliniske relevante mikrobielle arter som Clostridium difficile, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, og Salmonella enterica ssp. Enterica er potentielle fremtidige ansøgninger. Hvis ekspressionen af ​​virulensfaktorer eller resistensgener korrelerer med Phyloproteomic forhold, kan MSPP blive et innovativt værktøj i rutinemæssige klinisk diagnostik. Antallet af påviselige toppe og dermed antallet af biomarkør ioner indgår i MSPP ordning kan potentielt øges ved at anvende specifikke ekstraktion og / eller lyse- protokoller, især i tilfælde af svampe 31.

De nyligt anvendte MALDI-TOF teknikker kan hovedsageligt opdage kun de meget rigelige ribosomale proteiner. Disse meget rigelige proteiner interfererer med næsten alle andre mindre proteiner, såsom virulensfaktorer i massespektret. Mindre proteiner kunne påvises ved binding ESI-TOF-MS (elektrospray ionisering time of flight-massespektrometri) og HPLC (højtryksvæskekromatografi) 32. Men i øjeblikket denne metode er også arbejdskraft og omkostningskrævende at karakterisere større isolere kohorter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany 34967
Autoflex III TOF/TOF 200 system Bruker Daltonics, Bremen, Germany GT02554 G201 Mass spectrometer
bacterial test standard BTS Bruker Daltonics, Bremen, Germany 604537
BioTools 3.2 SR1 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 263564 Software Package
Bruker IVD Bakterial Test Standard Bruker Daltonics, Bremen, Germany 8290190 5 tubes
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8843 ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;strain 093
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9143 Goossens Z90
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG7790 ATCC 49350;CCUG 18265;Kasper 71;LMG 8219;NCTC 11847
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9243 Goossens N130
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8871 NCTC A603/87
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG9255 Goossens B538
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate  Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium LMG8870 NCTC A613/87
Columbia agar base  Merck, Darmstadt, Germany 1.10455 .0500 500 g
Compass for FlexSeries 1.2 SR1 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 251419 Software Package
defibrinated sheep blood  Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Germany SR0051
ethanol Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany 02854 Fluka
formic acid Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany F0507
HCCA matrix Bruker Daltonics, Bremen, Germany 604531
Kimwipes paper tissue Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany Z188956
MALDI Biotyper 2.0 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 259935 Software Package
Mast Cryobank vials Mast Diagnostica, Reinfeld, Germany CRYO/B
MSP 96 polished steel target Bruker Daltonics, Bremen, Germany 224989
QIAamp DNA Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 51304
recombinant human insulin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany I2643
trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany T6508
water, molecular biology-grade Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany W4502

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  2. Bader, O. MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical mycology. Proteomics. 13 (5), 788-799 (2013).
  3. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
  4. Zautner, A. E., et al. Discrimination of multilocus sequence typing-based Campylobacter jejuni subgroups by MALDI-TOF mass spectrometry. BMC Microbiol. 13, 247 (2013).
  5. Reil, M., et al. Recognition of Clostridium difficile PCR-ribotypes 001, 027 and 126/078 using an extended MALDI-TOF MS system. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 30 (11), 1431-1436 (2011).
  6. Kuhns, M., Zautner, A. E., et al. Rapid discrimination of Salmonella enterica serovar Typhi from other serovars by MALDI-TOF mass spectrometry. PLoS One. 7 (6), e40004 (2012).
  7. Wolters, M., et al. MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineages. Int J Med Microbiol. 301 (1), 64-68 (2011).
  8. Josten, M., et al. Analysis of the matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum of Staphylococcus aureus identifies mutations that allow differentiation of the main clonal lineages. J Clin Microbiol. 51 (6), 1809-1817 (2013).
  9. Lu, J. J., Tsai, F. J., Ho, C. M., Liu, Y. C., Chen, C. J. Peptide biomarker discovery for identification of methicillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains by MALDI-TOF. Anal Chem. 84 (13), 5685-5692 (2012).
  10. Novais, A., et al. MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for the discrimination of high-risk Escherichia coli clones from phylogenetic groups B2 (ST131) and D (ST69, ST405, ST393). Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2014).
  11. Matsumura, Y., et al. Detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli ST131 and ST405 clonal groups by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 52 (4), 1034-1040 (2014).
  12. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF Mass Spectrometry Strain Typing during a Large Outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), e101924 (2014).
  13. Zautner, A. E., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP): A novel microbial typing Method. Scientific Reports. 5, (2015).
  14. The global view of campylobacteriosis. WHO. World Health Organisation (WHO), , Available from: http://www.who.int/foodsafety/publications/campylobacteriosis/en/ (2013).
  15. Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
  16. Zautner, A. E., et al. Seroprevalence of campylobacteriosis and relevant post-infectious sequelae. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (6), 1019-1027 (2014).
  17. Zautner, A. E., Herrmann, S., Groß, U. Campylobacter jejuni - The Search for virulence-associated factors. Archiv Fur Lebensmittelhygiene. 61 (3), 91-101 (2010).
  18. Dingle, K. E., et al. Multilocus sequence typing system for Campylobacter jejuni. J Clin Microbiol. 39 (1), 14-23 (2001).
  19. Dingle, K. E., et al. Molecular characterization of Campylobacter jejuni clones: a basis for epidemiologic investigation. Emerg Infect Dis. 8 (9), 949-955 (2002).
  20. Cody, A. J., et al. Real-time genomic epidemiological evaluation of human Campylobacter isolates by use of whole-genome multilocus sequence typing. J Clin Microbiol. 51 (8), 2526-2534 (2013).
  21. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 30 (12), 2725-2729 (2013).
  22. Jolley, K. A., Chan, M. S., Maiden, M. C. mlstdbNet - distributed multi-locus sequence typing (MLST) databases. BMC Bioinformatics. 5, 86 (2004).
  23. Verroken, A., et al. Evaluation of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Nocardia Species. J Clinl Microbiol. 48 (11), 4015-4021 (2010).
  24. El Khéchine, A., Couderc, C., Flaudrops, C., Raoult, D., Drancourt, M. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification of Mycobacteria in Routine Clinical Practice. PLoS ONE. 6 (9), e24720 (2011).
  25. Goujon, M., et al. A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI. Nucleic Acids Research. 38, Web Server issue 695-699 (2010).
  26. Hall, T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series. 41, 95-98 (1999).
  27. Jolley, K. A., et al. Ribosomal multilocus sequence typing: universal characterization of bacteria from domain to strain. Microbiology. 158, 1005-1015 (2012).
  28. Suarez, S., et al. Ribosomal proteins as biomarkers for bacterial identification by mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. J Microbiol Methods. 94 (3), 390-396 (2013).
  29. Teramoto, K., et al. Phylogenetic classification of Pseudomonas putida strains by MALDI-MS using ribosomal subunit proteins as biomarkers. Anal Chem. 79 (22), 8712-8719 (2007).
  30. Teramoto, K., Kitagawa, W., Sato, H., Torimura, M., Tamura, T., Tao, H. Phylogenetic analysis of Rhodococcus erythropolis based on the variation of ribosomal proteins as observed by matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry without using genome information. J Biosci Bioeng. 108 (4), 348-353 (2009).
  31. Bernhard, M., Weig, M., Zautner, A. E., Gross, U., Bader, O. Yeast on-target lysis (YOTL), a procedure for making auxiliary mass spectrum data sets for clinical routine identification of yeasts. J Clin Microbiol. 52 (12), 4163-4167 (2014).
  32. Stark, T., et al. Mass spectrometric profiling of Bacillus cereus strains and quantitation of the emetic toxin cereulide by means of stable isotope dilution analysis and HEp-2 bioassay. Anal Bioanal Chem. 405 (1), 191-201 (2012).

Tags

Genetik MALDI-TOF under-arter differentiering phyloproteomics ICMS, MSPP mikrobiologi
subtypning af<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Isolater Brug massespektrometri-baserede PhyloProteomics (MSPP)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zautner, A. E., Lugert, R., Masanta, … More

Zautner, A. E., Lugert, R., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP). J. Vis. Exp. (116), e54165, doi:10.3791/54165 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter