Summary
Masspektrometri baserade phyloproteomics (MSPP) användes för att skriva en samling av Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolat på stamnivå i jämförelse med multilocus sekvens typning (MLST).
Abstract
MALDI-TOF MS erbjuder möjligheten att differentiera vissa bakterier inte bara på arter och underarter nivå men till och med under, på stamnivå. Alleliska isoformer av de detekterbara biomarkörer joner resulterar i isolatspecifika mass skift. Masspektrometri baserade phyloproteomics (MSPP) är en ny teknik som kombinerar masspektrometriska detekterbara biomarkörer massor i ett system som tillåter avdrag för phyloproteomic relationer från isolera specifika mass skift jämfört med ett genom sekvensreferensstam. De härledda aminosyrasekvenserna används sedan för att beräkna MSPP-baserade dendrogram.
Här beskriver vi arbetsflödet för MSPP genom att skriva en Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolat samling av sju stammar. Alla sju stammar var av humant ursprung och multilocus sekvens typning (MLST) visade den genetiska mångfalden. MSPP-typning resulterade i sju olika MSPP sekvenstyper, tillräckligt återspeglar deras PHYlogenetic relationer.
C. jejuni ssp. doylei MSPP systemet ingår 14 olika biomarkörer joner, mestadels ribosomala proteiner i massområdet av 2-11 kDa. MSPP kan i princip anpassas till andra masspektrometriska plattformar med en utökad massområde. Därför har denna teknik potential att bli ett användbart verktyg för stamnivå mikrobiell typning.
Introduction
Under det senaste decenniet har matris assisterad laserdesorptionsjonisering time-of-flight masspektrometri (MALDI-TOF MS) avancerade till vara en högt värderad standardmetod för mikrobiell släkte och artbestämning i klinisk mikrobiologi 1, 2. Artbestämning baseras på registrering av små protein fingeravtryck av intakta celler eller cellysat. Den typiska massområdet för en masspektrometer som används i rutinmässig klinisk mikrobiologi är 2-20 kDa. Dessutom kan den resulterande spektra användas för att diskriminera stammar på nedanstående arter och under-underarter nivå tre. Tidiga banbrytande studier har identifierat särskilda biomarkörer joner för en särskild undergrupp av stammar i Campylobacter jejuni 4, Clostridium difficile 5, Salmonella enterica ssp. enterica serovar Typhi 6, Staphylococcus aureus 7-9 och Escherichia coli 10-12.
Kombinationen av flera variabla biomarkörer massa som motsvarar alleliska isoformer ger möjlighet för djupare subtyp. Tidigare framgångsrikt genomfört vi en metod för att konvertera dessa variationer i mass profiler i meningsfulla och reproducerbara phyloproteomic relationer kallas masspektrometri baserade phyloproteomics (MSPP) på en C. jejuni ssp. jejuni isolat samling 13. MSPP kan användas en masspektrometrisk ekvivalent med DNA-sekvensbaserade subtyp tekniker som multilocus-sekvensen typning (MLST).
Art av campylobacter är den vanligaste orsaken till bakteriell gastroenterit i världen 14, 15. Som en konsekvens av Campylobacteriosis post-infektiös sequela, nämligen kan Guillain-Barrés syndrom, reaktiv artrit och inflammatorisk tarmsjukdom uppstår 16. De viktigaste smittkällor ärförorenade boskap kött från kyckling, kalkon, svin, nötkreatur, får och ankor, mjölk och ytvatten 15, 17. Därför reguljära studier epidemiologisk övervakning i samband med livsmedelssäkerheten är nödvändiga. MLST är den "gyllene standarden" i molekylär typning för Campylobacter arter 18. Eftersom Sanger-sekvensering baserade MLST metod är arbetsintensiv, tidskrävande och relativt dyra, är MLST typning begränsad till relativt små isolat kohorter. Det finns därför ett behov av billigare och snabbare subtyp metoder. Detta behov kan tillgodoses genom masspektrometriska metoder som MSPP.
Detta dokument presenterar ett detaljerat protokoll för MSPP-typning med en samling av Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolat och jämförelse av dess potential med MLST.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered en säker arbetsplats genom att betrakta biosäkerhet Villkor
- Bekanta dig med de laboratorie- och säkerhetsföreskrifter som är relevanta för att arbeta med mikroorganismer. De flesta mänskliga patogena mikroorganismer måste hanteras på skyddsnivå 2 villkor, men några, såsom Salmonella enterica serovar Typhi kräver skyddsnivå 3. Information om nivån att hantera varje patogen kan nås på www.cdc.gov/biosafety.
- Oberoende av biologiskt klassificeringen av den specifika mikroorganismen, betraktar alla material som kom i kontakt med smittämnet som smittförande avfall som måste autoklaveras före deponering. Sätter regionala säkerhetsanvisningar för farliga ämnen och biologiska substanser. Se till att lämpliga behållare för omedelbar och korrekt hantering av potentiellt förorenade material (biohazards) finns tillgängliga.
- Se till att sterila instrument (inokulering slingor), lösningar och odlingsmedier (agarplattor) finns innan du börjar bakteriekultur.
- Tvätta händerna med antiseptisk tvål och varmt vatten omedelbart efter hantering av infektiösa mikroorganismer.
2. Välj Referens och samlingen isolat
- Välja och erhålla en standard genomet-sekvensereferens isolera tillsammans med sekvenserna av den kodade proteomet, helst i FASTA-format. Om fler genom-sekvense stammar är tillgängliga, inkludera dessa i analysen.
Obs: Detta isolat / kommer dessa isolat senare användas för att förutsäga identitet masstoppar observeras i masspektrometri (se avsnitt 7). - Välj och få en mängd potentiellt olika isolat på ett sådant sätt att de täcker fylogeni av art eller underart av intresse.
Obs: Kommer dessa isolat senare användas för att demonstrera variabiliteten av biomarkörer i befolkningen (se avsnitt 8). - Säkerställa att hela samlingen och referens isolat (er) är proPerly skrivs av respektive guldnormen för denna organism 18-20.
Obs: Det kan innehålla en mängd olika (under) -typing metoder, men kommer sannolikt att tillgripa MLST, som fortfarande är standardmetoden för att visa den genetiska mångfalden hos de flesta mikrobiella arter. - Att sluta sig till fylogeni inom insamling, beräkna en phylogram från skrivuppgifter, t.ex. genom att använda det ovägda par grupp metoden med aritmetiska medelvärdet (UPGMA) i MEGA6 programvara för MLST uppgifter 21. För MLST data också konsultera en MLST databas och tilldela sekvenstyper och respektive klon komplex 22.
Obs: Detta kommer senare att användas för att analysera kongruens av MSPP med den tidigare guldmyntfoten typningsmetod (se avsnitt 9).
3. Förbered en MALDI måltavla
VARNING: TFA är en stark syra. Felaktig användning av TFA bär risken för allvarliga frätskador på hud, ögon och kraftig irritation of de övre luftvägarna vid inandning. Därför måste stränga säkerhetsåtgärder respekteras och det krävs ordentlig personlig skyddsutrustning (PPE), inklusive skyddsglasögon, ansiktsskydd, lämpliga handskar, stövlar, eller ens en hel skyddsdräkt, vid hantering av TFA. Möjlig exponering för TFA måste styras genom att hantera ämnet under tillräcklig ventilation med en effektiv ventilation avgassystem. Vid otillräcklig ventilation måste andningsskydd med godkänt filter användas. Dessutom är TFA skadligt för vattenlevande organismer med långtidseffekter. Utsläpp av TFA i avloppsvatten till miljön måste undvikas.
Obs! Innan observation proverna på en MALDI mål, rengör måltavlan noggrant om plattan användes tidigare.
- Förbereda 100 ml 70% vattenlösning av etanol med användning av 30 ml avjoniserat vatten och 70 ml ren etanol.
- Förbereda 250 | il av en 80% vattenlösning av trifluorättiksyra (TFA) lösning genom blandning av 50il avjoniserat vatten och 200 | il 100% TFA i ett reaktionsrör och vortexa röret i 1 min.
- Rengör MALDI mål genom att sätta den i en glasskål och nedsänkning det i 70% vattenbaserad etanol för ca 5 min vid rumstemperatur.
- Skölj målet under varmt vatten.
- Med hjälp av en pappersnäsduk, torka måltavlan intensivt med 70% vattenlösning av etanol för att ta bort alla tidigare prov och andra potentiella skräp.
- Om ytterligare rengöring krävs, skölj under varmt vatten medan torka med en pappersnäsduk.
- Avlägsna återstående, och potentiellt osynliga, föroreningar, genom att täcka målytan med ett tunt lager av 80% vattenbaserad TFA (~ 100 l per 96 platser) och torka alla målpositioner rena med en pappersnäsduk.
- Slutligen, skölj målet att avlägsna syra, torka det torrt med en pappersnäsduk, och låt den stå i minst 15 minuter vid rumstemperatur för att förånga kvarvarande vätska.
4. Framställning av en45; -cyano-4-hydroxi-kanelsyra, modellösning som innehåller en inre kalibrerings
- Bered en mättad matrislösning genom upplösning av 10 mg α-cyano-4-hydroxi-kanelsyra (HCCA) i 1 ml av en blandning av 50% acetonitril, 47,5% vatten och 2,5% TFA. Kvarvarande olöst HCCA förblir om lösningen är mättad.
- Lägg till rekombinant humant insulin som en intern kalibrerings. För detta, förbereda en stamlösning till en slutlig koncentration av 10 pg / pl i 50% vattenhaltig acetonitril, alikvot och förvara vid -20 ° C för vidare användning.
5. MALDI-TOF-masspektrometri
Obs: Kultur villkor specifika för organismer av intresse måste användas. Prover för MALDI-TOF MS kan framställas antingen genom smeta beredning eller utvinning, beroende på organismen (se avsnitt 8.4.1). Medan etanol myrsyra syraextraktionsmetod ger tillräcklig inaktivering av patogener, har smeta preparat som skall utföras under sufficient biosäkerhet villkor som krävs (se avsnitt 1). Vanligtvis finns det ingen risk för infektion efter tillämpningen av matrisen, men för specifika patogener specifika inaktiveringsprotokoll krävs. Således kan exempelvis MALDI-TOF MS av Nocardia species kräver föregående lys av bakterierna i kokande vatten, följt av etanolutfällning av proteiner 23. EI Khéchine et al. utvecklat ett förfarande för inaktivering av mykobakterier, upphettning av bakteriekolonier vid 95 ° C under 1 h i skruvkork rör innehållande vatten och 0,5% Tween 20 24.
- smear Framställning
- Sprid ett knappnålshuvud storlek mängd av en bakteriekoloni direkt på en MALDI måltavla läge ( "spot").
- Överlagra varje fläck med 1 ni av HCCA regelbunden matris eller matris som innehåller den interna kalibrerings och låt kristallisera vid rumstemperatur. För bestämning av den exakta massan av kalibrerings topp, överlagra en regler spot med en pl Test Standard och 1 | j, l av HCCA matris innehållande den interna kalibrerings.
Obs: Här, liksom Test Standard ett extrakt av Escherichia coli DH5 alfa används som visar en karakteristisk protein fingeravtryck i MALDI-TOF MS. Den är spetsade den med två proteiner som sträcker sig den övre gränsen av den detekterbara massområde.
- extraktion Metod
- Harvest cirka fem kolonier från en agarplatta kultur med en ympning slinga och noggrant suspendera i 300 pl dubbeldestillerat vatten i en 1,5 ml reaktionsrör. Lägg 900 ul absolut etanol och blanda väl genom upprepad pipettering tills bakteriekolonierna har uppehåll.
Obs: I detta steg är det möjligt och väl etablerad för att lagra proverna vid -20 ° C. Dessutom kan inaktivering av patogener testas genom strimmor 1-10 pl av extraktet på en lämplig agarplatta efter inkubation vid optimala odlingsbetingelser. framgångsriktaktivering indikeras av avsaknad av mikrobiell tillväxt. - Centrifugera provet vid 13.000 xg under 1 min, kasta supernatanten och torka pelleten vid rumstemperatur under 10 minuter. Suspendera pelleten noggrant genom pipettering upp och ner i 50 | il 70% myrsyra.
- Tillsätt 50 pl av acetonitril och blanda. Ta bort skräp genom centrifugering vid 13.000 xg under 2 min. Överföring 1 pl supernatant på en provposition på en MALDI måltavla och låt torka i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Överlagra varje fläck med 1 ni av HCCA matris innehållande den interna kalibrerings och låt kristallisera vid rumstemperatur.
- Harvest cirka fem kolonier från en agarplatta kultur med en ympning slinga och noggrant suspendera i 300 pl dubbeldestillerat vatten i en 1,5 ml reaktionsrör. Lägg 900 ul absolut etanol och blanda väl genom upprepad pipettering tills bakteriekolonierna har uppehåll.
- Inspelning av Masspektra
Obs: Peak-picking från masspektra sker med hjälp av standardprocedurer rekommenderas (Centroid algoritm, S / N-förhållande. 2; rel Intensitet tröskel: 2%; toppbredd 3 m / z, baslinjesubtraktion: TopHat)- Kalibrera instrumentet enligt tillverkarens protocol.
- För varje plats, samla 600 spektra i 100-shots steg.
- Gå till "AutoXecute" -fliken i programvarukonfigurationen för masspektrometern. Öppna "metod" genom att vänsterklicka på "Metod" -knappen och välja metod, t ex "MBT_AutoX" i rullgardinsmenyn.
- Vänsterklicka på "Edit ..." höger i menyn "Method" för att öppna "AutoXecute Method Editor". Gå till "Ackumulering" -fliken. Ställ in "Summera" värde till "600" och "tillfredsställande skott i" värde _x_ "shot steg" till "100".
- Intern Spectrum Kalibreringsprocedur
Notera: Minute mätfel är inneboende masspektrometri. Beroende på intermittent instrument användning, instrument temperatur och omkalibrering kan de erhållna mätvärdena varierar mellan experiment. Efter pre-mätinstrument kalibrering och efter mätning spektrum kalibrering till en intern kalibrerings är den mest exakta sättet att garantera inter spektrum jämförbarhet.- Utför följande procedurer för varje kalibrerings topp lista:
- Starta spektrum webbläsare (t.ex. flexAnalysis och öppen spektrum. Menyn "Arkiv" → "Öppna ...")
- Skapa lista för kontroll av massa med kalibrerings topp: menyn "Method" → "Öppna ...".
- Välj metod: MBT_Standard.FAMSMethod → "Öppna".
- Redigera Mass Control List: Avmarkera alla kalibreringsverktyg.
- Lägg kalibrerings topp vid botten: Peak Etikett: "Insulin_HIStag [M + H] + _ avg"; m_z: "5808,29"; Tolerans [ppm]: "50"; Kontrollera kalibreringskryssrutan.
- Spara som, t.ex. "MSPP kalibrerings lista".
- För varje spektrum väljer kalibrerings topp i listan, klicka på "Automatic Assign" och tryck på "OK".
- Utför följande procedurer för varje kalibrerings topp lista:
- Experimentellt Bestäm Exakt massa av kalibrerings Peak.
- Förbered två ställen med ett pl Test Standard vardera (steg 5.1.1). Överlagra första med 1 pl vanlig HCCA matris, den andra med ett pl kalibrerings-spetsade matris.
- Skaffa masspektra från varje plats (avsnitt 5.3), och internt kalibrera till teststandarden toppar (avsnitt 5.4).
- Läggs över både spektra genom att öppna dem med webbläsaren spektrum (t.ex. flexAnalysis och öppen spektrum: menyn "Arkiv" → "Öppna ...") och att hitta toppen vid den förväntade massan (insulin m / z = 5,808.29), som skall vara närvarande i kalibrerings-spiked spektrum, men inte i det spektrum som erhålls med den regelbundna matrisen.
- Kontrollera att kalibrerings Peak inte skymmas av annan Biomarker av organismen av intresse.
- Förbered två punkter (avsnitt 5.1) med referensstammen och overlay den första med 1 pl regelbunden matris, den andra med ett pl kalibrerings-spetsade matris.
- Förvärva masspektra från båda platserna (avsnitt 5.3) och överlagra den resulterande spektra genom att öppna dem med webbläsaren spektrum (t.ex. flexAnalysis och öppen spektrum: menyn "Arkiv" → "Öppna ..."). Se till att kalibreringstoppen är klart synlig i spektret erhölls med den spetsade matrisen och inte skyms av en annan angränsande signalen. Om så inte är fallet, välj en annan kalibrerings för just denna organism.
Obs: Med hjälp av en tillsats intern kalibrerings avsevärt ökar precisionen för att bestämma variationer av biomarkörer massorna. Med användning av denna metod, kan massskillnader ner till en Da detekteras. Alternativt kan också invarianta massorna som härrör från organismerna användas som kalibrerings. Men per definition alla organismhärledda massorna måste betraktas som potentiellt variabel, om inte annat bevisas.
- Mät Masspektrum av referensstammen, Använda Matrix spetsade med den inre kalibrerings.
- Sprid ett knappnålshuvud storlek mängd av en bakteriekoloni (avsnitt 5.1) eller ett pl av bakteriell proteinextrakt (avsnitt 5.2) direkt på en MALDI måltavla läge ( "spot").
- Överlagra varje fläck med 1 ni av HCCA matris innehållande den interna kalibrerings och lämna målplattan att kristallisera vid rumstemperatur (avsnitt 5.1.2 / 5.2.4).
- Spela masspektra av referensstammen (avsnitt 5.3).
- Internt kalibrera referensspektrum till kalibreringsmassa (här: insulin vid m / z = 5,806.29), och därefter för-process genom baslinjesubtraktion (TopHat) och utjämning (parametrar: SavitzkyGolay; bredd: 2 m / z, 10 cykler).
- Starta spektrum webbläsare (t.ex. flexAnalysis och öppen spektrum: menyn "Arkiv" → "Öppna ...; ").
- Välj metod: menu pulldown "Metod" → "Öppna ...", Vänsterklicka den metod som, till exempel, "MBT_Standard.FAMSMethod" → "Öppna".
- Kalibrera spektrum genom att välja "Intern ..." i rullgardinsmenyn "Kalibrera". Ett fönster öppnas som listar kalibreringstoppen (s) (avsnitt 5.4). Vänsterklicka kalibreringstoppen (Insulin) → Vänsterklicka på "OK". Välj "Process spektra" från "Process" rullgardinsmenyn.
- För baslinjesubtraktion aktivera spektrumet i listan spektrum vid den högra sidan. Välj "Subtrahera Masspektrum Baseline" från "Process" rullgardinsmenyn.
- Att jämna spektrumet, aktivera spektrumet i listan spektrum vid den högra sidan. Välj "Smooth Masspektrum Baseline" från "Process" rullgardinsmenyn.
- Från genomet sekvenseringsdata av referensstammen, beräkna theoretical monoisotopisk molekylvikten för var och en av de kodade proteinerna genom att översätta den DNA-sekvens in i den motsvarande aminosyrasekvensen med användning av en sekvensinpass redaktör. Kopiera-klistra in den här proteinsekvensen i inmatningsrutan längst ExPASy Bioinformatics Resource Portal (http://web.expasy.org/compute_pi/). och tryck på "Klicka här" för att beräkna pl / Mw. I fallet med C. jejuni ssp. doylei beräkna massan av 14 detekterbara biomarkörer.
- Kopiera resultatet in i ett kalkylblad, med en kolonn innehållande genen identifieraren och nästa molekylvikten. Sortera raderna av beräknad molekylvikt för att underlätta enklare uppslagning av massorna. Obs: Andra kolonner är valfria; funktionell anteckning kan vara särskilt användbar senare för tolkning.
- Sätt en andra kolumn i kalkylbladet för molekylvikten av de-methioninated form subtrahera 135 Da från monoisotopisk molekylvikt. Obs: Det beror på att vissa proteiner genomgår posttranslationell modifiering av proteolytiskt avlägsnande av den N-terminala metioninet.
- Tilldela varje större uppmätt biomarkör massa till de beräknade massorna från referensstammen genom att slå upp den uppmätta massan från genomet tabellen ovan framställda (tabell 1).
- Om biomarkörer joner inte kan tilldelas förutsagda genprodukter, överväga andra posttranslationella modifieringar (metylering, acetylering, prenylering, etc., se http://www.abrf.org/delta-mass för en sammanställning av modifieringar och tillhörande massändringar ). För någon annan känd posttranslationell modifiering som ofta observeras i organismerna av intresse till en kolumn i tabellen och räkna molekylvikt analogt med processen för de-methioninated formen.
- Ställ in en annan flik kalkylblad, och spela in varje biomarkör ion massan och identifierare i en separat tabellkolumn.
8. Bedöm Biomarker Variabiliteti befolknings
- Kalibrera masspektra erhölls från samlingen isolat, som gjort för referensstammen (s) (avsnitt 5.4.2).
- Identifiera variant biomarkörer i masspektra. En variant Massan kännetecknas av frånvaron av en massa känd från referensspektrum och utseende av en ny massa inte är närvarande i referensen. Mass Skillnaden måste överensstämma med en enda aminosyrautbyte (tabell 2), eller en kombination därav.
- Vid ett isolat per rad, spela den uppmätta massan för varje biomarkör och den förutspådda isoformen i respektive tabellkolumner.
Not: I sällsynta fall kan vissa mass skiften vara hänförligt till flera olika aminosyrautbyten, t ex, både, N växlas av D och Q växlas av E, och vice versa, att resultera i en massförskjutning av 0,985 Da (tabell 2). Denna inneboende problem kan inte lösas genom masspektrometri ensam. Därför olika isoformer på proteinsekvensen nivå med samma massamåste behandlas som en enda MSPP typ. Parallell Sanger-sekvensering av de särskilda biomarkörer jon gener bekräftat att detta problem inte uppstår när MSPP-skriva C. jejuni ssp. doylei isolera samling som används i denna studie. - Bekräfta nya MSPP typer genom PCR-amplifiering och sekvensering de respektive biomarkörer gener. I sin tur tjänar detta också som en bekräftelse på att biomarkör identitet har korrekt tilldelat.
- Kultur bakterieisolat under optimala odlingsbetingelser. Kultur C. jejuni ssp. doylei påfrestningar på Columbia-agar kompletterad med 5% fårblod vid 37 ° C under mikroaerofila betingelser (5% O 2, 10% CO2, 85% N2). Inkubera under ca. 48 tim. Använd en separat agarplatta för varje isolat för att undvika korskontaminering.
- Extrahera genomiskt DNA av de bakterieisolat med användning av en lämplig DNA-extraktion kit / automatiserade maskiner i enlighet med tillverkarens instruktioner. <li> Amplify respektive biomarkörer gener med användning av de primrar som anges i tabell 3 Utför alla PCR-reaktioner under följande förhållanden:. denaturering vid 94 ° C under 30 sek; hybridisering vid 55 ° C under 30 sek; förlängning vid 72 ° C under 30 sek.
- Bestämma DNA-sekvensen för varje amplikon av Sånger-sekvensering med användning av en lämplig mängd av genomiskt DNA (vanligtvis 600-700 ng DNA är tillräcklig vid en koncentration av ca 100 ng / | j, l) och en av amplifieringsprimrarna (vanligtvis görs detta genom att användning av en tjänsteleverantör).
9. Beräkna en MSPP baserad Fylogeni och jämför till Gold Standard
- Sätt ihop de särskilda biomarkörer aminosyrasekvenser som tillhör than MSPP typ av isolaten i en kontinuerlig sekvens med hjälp av en sekvensinpass redaktör, såsom BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) 26 eller biomarkör kalkylblad.
- Beräkna fylogeni av kluster som gjort för guldmyntfoten skriva uppgifter, till exempel, UPGMA klustring 21.
- Jämför MSPP-baserade fylogeni till den som erhålls med guldmyntfoten 4, 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidigare har vi lyckats etablera en MSPP system för C. jejuni ssp. jejuni 13. Här syftar vi att utvidga metoden till syskon underarter C. jejuni ssp. doylei. I detta specifika inställning, sju C. jejuni ssp. doylei isolat förvärvades från den belgiska samling av mikroorganismer / Laboratory of Microbiology UGent BCCM / LMG Gent, Belgien. Alla sju isolat används för våra analyser var av humant ursprung. Genomet-sekvense stam ATCC 49349 (LMG 8843), isolerades ursprungligen från avföring från en 2-årig australiensiska barn med diarré tjänade som referens. Från samlingen, sex ytterligare påfrestningar fanns: LMG 9143, LMG 9243, och LMG 9255 isolerades från avföring från barn som lider diarré och bor i Bryssel, Belgien; LMG 7790 (ATCC 49350) som isolerats från en gastric biopsiprov av en individ från Tyskland; och LMG 8870 (NCTC A613 / 87) samt LMG 8871 (NCTC A603 / 87), båda isolerade från olika blodprover dras från sydafrikanska barn.
Alla C. jejuni ssp. doylei isolat vid -80 ° C såsom Cryobank lager, nyligen upptinade för varje analys och odlade genom att använda Columbia agarbas kompletterad med 5% fårblod och inkubation under 48 h vid 37 ° C under mikroaerofila betingelser (5% O lagrades 2, 10% CO2, 85% N2).
I motsats till inrättandet av MSPP teknik för C. jejuni ssp. jejuni 13 var det inte möjligt att basera metoden på en isoform databas som härrör från en större sekvens samling. Endast en enda C. jejuni ssp. doylei posten var närvarande i rMLST databasen, och detta motsvarade referensstammen C. jejuni ssp. doylei ATCC 49.349 27. Därför varje biomarkör massförskjutning upptäcks i jämförelse med stammen C. jejuni ssp. doylei ATCC 49.349 var en ny post i isoform databasen och behövde bekräftas av Sanger-sekvensering.
För att analysera den mångfald av den erhållna C. jejuni ssp. doylei isolat, MLST utfördes och en MLST-baserade UPGMA-dendrogram inklusive sju granskade C. jejuni ssp. doylei isolat och C. jejuni ssp. jejuni stam 81-176 som utgruppen beräknas (Figur 1). Varje C. jejuni ssp. doylei isolat tillhörde en annan MLST-sekvens typ, faller in i två subclusters. Stam LMG7790 hade den längsta fylogenetiska avstånd jämfört med den återstående C. jejuni ssp. doylei isolat.
Den inspelningsbara MALDI-TOF referens masspektrum C. jejuni ssp. doylei (Figur 2).
Inom insamling var varierande isoformer detekterades för L32-M, L33, det hypotetiska proteinet som kodas av gi | 152.939.117, S20-M, och S15-M (Figur 3). De återstående massorna tilldelats biomarkörer joner var oföränderlig i den testade C. jejuni ssp. doylei isolat. Aminosyrasubstitutionen motsvarande de massförskjutningar har identifierats genom PCR-amplifiering och Sanger-sekvensering av särskild gen med användning av primrarna som anges i tabell 3. Tabell 4 tar upp de aminosyrasekvenserna för alla biomarkörer joner ingår i MSPP systemet samt de detekterade alleliska isoformer.
En MSPP Baserade phyloproteomic UPGMA-träd (figur 4) beräknades för samma sju C. jejuni ssp. doylei isolat och C. jejuni ssp. jejuni stam 81-176 som utgruppen med användning av de sammankedjade aminosyrasekvenserna för alla 14 biomarkörer joner i ordning av deras molekylvikt i referensstammen. Varje isolat representerade en individuell MSPP-sekvens typ. Även om de erhållna phyloproteomic förbindelser inte var helt identiska med dem som erhållits genom MLST, C. jejuni ssp. doylei isolat återigen anordnade i två subclusters. Den första subcluster bildades av LMG 8843, LMG 8870, och LMG 9243, den andra av LMG 9255, LMG 9143, LMG 8871 och LMG 7790. Som framgår med MLST-analys, isolera LMG7790 visade längsta phyloproteomic avståndet i MSPP- analys.
Figur 1: MLST-baSED fylogenetiska UPGMA-träd. Balanced MLST-baserade UPGMA-dendrogram konstruerat från sju C. jejuni ssp. doylei isolat och C. jejuni ssp. jejuni stam 81-176. Stam färgkod: LMG 8843 (svart), LMG 8870 (grå), LMG 9243 (blå), LMG 9255 (turkos), LMG 9143 (grön), och LMG 8871 (rosa), LMG 7790 (gul), och 81- 176 (vit). Typen MLST-sekvens ges bakom namnet på varje isolat. Varje C. jejuni ssp. doylei isolera tillhör en annan MLST-sekvens typ. X-axeln visar länkavstånden. Stam LMG 7790 visar den längsta fylogenetiska avstånd jämfört med de återstående sex isolat. Stammar LMG 8843, LMG 8870, och LMG 9243 samt LMG 9255, LMG 9143, och LMG 8871 bildar två olika subclusters inom C. jejuni ssp. doylei kluster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Preliminär tilldelning av genomiska korrelat till C. jejuni ssp. doylei ATCC 49349 (LMG 8843) till observerade biomarkörer massorna. Baserat på de beräknade massorna (genomsnittliga isotopsammansättningen) av förväntade ORF från hela genomsekvensen av C. jejuni ssp. doylei stam ATCC 49.349, var biomarkörer massor tilldelas motsvarande proteinkodande sekvenserna. Men inom mätområdet, de biomarkörer massorna för de ribosomala subenheter L31 (MW = 7315 Da), S17 (MW = 9549 Da), och S18 (MW = 10285 Da) såväl som deras de-methioninated isoformer (infälld m / z = 7,000-7,200 Da) kunde inte entydigt tilldelad. Därför L31, S17, och S18 ingick inte i C. jejuni ssp. doylei MSPP systemet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Specifika biomarkörer mass toppar C. jejuni ssp. doylei MSPP systemet. I varje panel masspektra av alla sju testade C. . jejuni ssp doylei isolat (färgkod som i figur 1) som motsvarar de speciella MSPP typer har överlagras för att indikera biomarkör massförskjutningar på grund av alleliska isoformer: (A) L36 + H +; (B) L34 + H +; (C) L32-M + H +; (D +; (E) S14-M + H +; (F) L29 + H +, L28-M + H +, och L35-M + H +; (G) L24-M + H +; (H) gi | 152939117 + H +; (I) L27-M + H +; (J) S20-M + H +; (K) S15-M + H +; (L) S19-M + H +; (M) en intensiv mass skymmer variabel potential biomarkör toppen av ribosomalt protein S18; (N) S20-M + 2H +; (O) L15-M + 2H +; X-axeln: massa [Da] · laddnings ett förhållande, skala 200 Da. Y-Axlar: intensitet [godtyckliga enheter], spektra anpassas individuellt till en jämförbar ljudnivå för bättre visualisering av lågintensiva toppar. "-M" Efter namnet på en ribosomal subenhet anger de-methioninated isoformen. Klicka hennee för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. MSPP Baserade phyloproteomic UPGMA-trädet avbildas phyloproteomic UPGMA-trädet innehåller samma sju C. jejuni ssp. doylei isolat och C. jejuni ssp. jejuni stam 81-176 som i figur 1. En färgad fläck (färgkod som i figur 1) indikerar varje stam. För bättre jämförelse isolaten är anordnade i inmatningsordningen, som var fastställandet som erhållits från MLST baserade trädet. Axeln under dendrogram visar länkavstånden. Även de erhållna phyloproteomic relationer är inte helt identisk med den fylogenetiska MLST-baserade träd, är den globala bilden jämförbara. Befolkningen delas upp i två grupper: de tre isolaten LMG 8843, LMG 8870, och LMG 9243 bildar en cluster, medan LMG 9255, LMG 9143, LMG 8871 och LMG 7790 bildar en andra kluster. Inom detta kluster LMG 7790 visar den längsta phyloproteomic sträcka jämfört med den subcluster bildas av LMG 9255, LMG 9143, och LMG 8871. Inom denna subcluster LMG 9143 växlar läge i förhållande till LMG 9255. Men även med användning av MSPP-metoden varje isolat representerar en enskild MSSP-sekvens typ. klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Beräknad massorna av alla kommenterade ORF av C. jejuni ssp. doylei ATCC 49349-stammen. Förteckning över alla beräknade monoisotopisk molekylvikter av varje protein som kodas i C. jejuni ssp. doylei ATCC 49349 genomet. Den ExPASy Bioinformatics Resource Portal användes för beräkning av de särskilda molekylmassor. Kolumn B visar de methioninated isoformerna medan kolumn C listar de-methioninated isoformer. Biomarkörer massor som ingår i C. jejuni ssp. doylei MSPP system är markerade i rött. Obs! Biomarkör protein L36 inte kommenterad i genomet sekvens av C. jejuni ssp. doylei ATCC49349. Klicka här för att ladda ner filen.
Tabell 2:. Mass förändringar inducerade av aminosyraförändringar på grund av enstaka SNP Alla potentiella single nucleotide polymorphisms kontrollerades för den resulterande aminosyrautbyte med hjälp av standard genetiska koden. Alla tysta mutationer kastades, och nonsynonymous mutationer samman tillsammans med Resulting massförändring. Klicka här för att ladda ner filen.
Tabell 3: Oligonukleotidprimrar som användes för sekvensering av C. jejuni ssp. doylei gener som ingår i MSPP-systemet klicka god här för att ladda ner filen.
Tabell 4: Översikt över alla isoformer som ingår i C. jejuni ssp. doylei MSPP-systemet. Tabellen innehåller alla biomarkörer joner som ingår i C. jejuni ssp. doylei MSPP scheme. Aminosyrasekvensen av referensstammen ATCC 49349 ges helt. För ytterligare detekterbara isoformer, endast specifika aminosyrasubstitutioner listade. Aminosyranumreringen innehåller alltid start metionin; om masspektrometri visar sin frånvaro, är det skrivet inom parentes (M). För varje isoform molekylmassa, massa skillnad referensstammen ATCC 49349 isoformer och frekvens inom isoformen dataset anges. Klicka här för att ladda ner filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest kritiska steget i upprättandet av en MSPP system är entydig genetiska bestämningen av biomarkör jon identiteter. Om det inte är möjligt att identifiera en biomarkör utan tvekan, då bör uteslutas från systemet 13.
C. jejuni ssp. doylei systemet omfattar 14 olika biomarkörer joner. Dessa är 5 lägre jämfört med C. jejuni ssp jejuni MSPP systemet. 13 .Det viktigaste skillnaden mellan den detekterbara C. jejuni ssp. jejuni och C. jejuni ssp. doylei biomarkörer var den posttranslationella avlägsnande av den amino-terminal metionin i fallet med L31 (-M) och L35 (-M) 13.
Såsom visas i den testade C. jejuni ssp. doylei isolera samling, var MSPP kunna åtskilja samtliga sju olika MLST sekvenstyper. Detta innebär att varje testad isolat tillhörde en specifik MSPP SEQUrens typ. Dessutom ger MSPP underart differentiering mellan C. jejuni ssp. jejuni och C. jejuni ssp. doylei.
I allmänhet, potential att diskriminera isolat vid under-stamnivå genom MSPP är lägre jämfört med DNA-sekvensbaserade metoder som MLST. Om man antar en väletablerad isoform databas, är subtyp av bakterieisolat mycket snabbare och mycket billigare jämfört med DNA-sekvenseringsmetoder 4, 13.
Den största fördelen med MSPP i jämförelse med hierarkiska klustermetoder ICMS-spektra som att använda principalkomponentanalys (PCA) 4, 10, 28 eller UPGMA analys av matematiska matris som resultatet av jämförelsen av binära topp matchande profiler 29, 30 är dess höga inneboende reproducerbarhet. Även om olika kulturella förhållanden såsom olika culture media, olika agar avgifter, olika inkubationstemperatur och olika inkubationsperioder påtagligt påverka de phyloproteomic relationer beräknats av PCA, de inte påverkar MSPP härledda relationerna 6, 13. Den främsta orsaken till denna höga reproducerbarhet är oberoende toppintensiteten och kvalitet spektrum massa i allmänhet 13. Om en MSPP relevant topp i masspektrumet för ett isolat inte kan identifieras utan tvivel, är det nödvändigt att spela in masspektrumet för den individuella isolat igen.
Den MSPP metoden kan anpassas, i princip varje mikrobiella arter. Speciellt den subtyp av kliniskt relevanta mikrobiella arter som Clostridium difficile, Escherichia coli, Staphylococcus aureus och Salmonella enterica ssp. Enterica är potentiella framtida tillämpningar. Om uttrycket av virulensfaktorer eller resistensgener korrelerar med Phyloproteomic relation, kan MSPP bli ett innovativt verktyg i rutin klinisk diagnostik. Antalet detekterbara toppar och därmed antalet biomarkörer joner som ingår i MSPP systemet skulle potentiellt kunna ökas genom användning av specifik extraktion och / eller lyseringsprotokoll, i synnerhet i fallet med svampar 31.
De senast använda MALDI-TOF-tekniker kan huvudsakligen upptäcka bara de mycket rika ribosomproteiner. Dessa mycket rikliga proteiner stör nästan alla andra mindre proteiner såsom virulensfaktorer i masspektrumet. Mindre proteiner kunde detekteras genom att länka ESI-TOF-MS (elektrospray jonisering tid löptidsmasspektrometri) och HPLC (högupplösande vätskekromatografi) 32. Men för närvarande är denna metod alltför arbets- och kostnadskrävande att karakterisera större isolera kohorter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | 34967 | |
| Autoflex III TOF/TOF 200 system | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | GT02554 G201 | Mass spectrometer |
| bacterial test standard BTS | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 604537 | |
| BioTools 3.2 SR1 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 263564 | Software Package |
| Bruker IVD Bakterial Test Standard | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 8290190 | 5 tubes |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG8843 | ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;strain 093 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG9143 | Goossens Z90 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG7790 | ATCC 49350;CCUG 18265;Kasper 71;LMG 8219;NCTC 11847 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG9243 | Goossens N130 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG8871 | NCTC A603/87 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG9255 | Goossens B538 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG8870 | NCTC A613/87 |
| Columbia agar base | Merck, Darmstadt, Germany | 1.10455 .0500 | 500 g |
| Compass for FlexSeries 1.2 SR1 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 251419 | Software Package |
| defibrinated sheep blood | Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Germany | SR0051 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | 02854 Fluka | |
| formic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | F0507 | |
| HCCA matrix | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 604531 | |
| Kimwipes paper tissue | Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z188956 | |
| MALDI Biotyper 2.0 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 259935 | Software Package |
| Mast Cryobank vials | Mast Diagnostica, Reinfeld, Germany | CRYO/B | |
| MSP 96 polished steel target | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 224989 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 51304 | |
| recombinant human insulin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | I2643 | |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | T6508 | |
| water, molecular biology-grade | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | W4502 |
References
- Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
- Bader, O. MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical mycology. Proteomics. 13 (5), 788-799 (2013).
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
- Zautner, A. E., et al. Discrimination of multilocus sequence typing-based Campylobacter jejuni subgroups by MALDI-TOF mass spectrometry. BMC Microbiol. 13, 247 (2013).
- Reil, M., et al. Recognition of Clostridium difficile PCR-ribotypes 001, 027 and 126/078 using an extended MALDI-TOF MS system. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 30 (11), 1431-1436 (2011).
- Kuhns, M., Zautner, A. E., et al. Rapid discrimination of Salmonella enterica serovar Typhi from other serovars by MALDI-TOF mass spectrometry. PLoS One. 7 (6), e40004 (2012).
- Wolters, M., et al. MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineages. Int J Med Microbiol. 301 (1), 64-68 (2011).
- Josten, M., et al. Analysis of the matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum of Staphylococcus aureus identifies mutations that allow differentiation of the main clonal lineages. J Clin Microbiol. 51 (6), 1809-1817 (2013).
- Lu, J. J., Tsai, F. J., Ho, C. M., Liu, Y. C., Chen, C. J. Peptide biomarker discovery for identification of methicillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains by MALDI-TOF. Anal Chem. 84 (13), 5685-5692 (2012).
- Novais, A., et al. MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for the discrimination of high-risk Escherichia coli clones from phylogenetic groups B2 (ST131) and D (ST69, ST405, ST393). Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2014).
- Matsumura, Y., et al. Detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli ST131 and ST405 clonal groups by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 52 (4), 1034-1040 (2014).
- Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF Mass Spectrometry Strain Typing during a Large Outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), e101924 (2014).
- Zautner, A. E., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP): A novel microbial typing Method. Scientific Reports. 5, (2015).
- The global view of campylobacteriosis. WHO. World Health Organisation (WHO), , Available from: http://www.who.int/foodsafety/publications/campylobacteriosis/en/ (2013).
- Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
- Zautner, A. E., et al. Seroprevalence of campylobacteriosis and relevant post-infectious sequelae. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (6), 1019-1027 (2014).
- Zautner, A. E., Herrmann, S., Groß, U. Campylobacter jejuni - The Search for virulence-associated factors. Archiv Fur Lebensmittelhygiene. 61 (3), 91-101 (2010).
- Dingle, K. E., et al. Multilocus sequence typing system for Campylobacter jejuni. J Clin Microbiol. 39 (1), 14-23 (2001).
- Dingle, K. E., et al. Molecular characterization of Campylobacter jejuni clones: a basis for epidemiologic investigation. Emerg Infect Dis. 8 (9), 949-955 (2002).
- Cody, A. J., et al. Real-time genomic epidemiological evaluation of human Campylobacter isolates by use of whole-genome multilocus sequence typing. J Clin Microbiol. 51 (8), 2526-2534 (2013).
- Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 30 (12), 2725-2729 (2013).
- Jolley, K. A., Chan, M. S., Maiden, M. C. mlstdbNet - distributed multi-locus sequence typing (MLST) databases. BMC Bioinformatics. 5, 86 (2004).
- Verroken, A., et al. Evaluation of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Nocardia Species. J Clinl Microbiol. 48 (11), 4015-4021 (2010).
- El Khéchine, A., Couderc, C., Flaudrops, C., Raoult, D., Drancourt, M. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification of Mycobacteria in Routine Clinical Practice. PLoS ONE. 6 (9), e24720 (2011).
- Goujon, M., et al. A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI. Nucleic Acids Research. 38, Web Server issue 695-699 (2010).
- Hall, T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series. 41, 95-98 (1999).
- Jolley, K. A., et al. Ribosomal multilocus sequence typing: universal characterization of bacteria from domain to strain. Microbiology. 158, 1005-1015 (2012).
- Suarez, S., et al. Ribosomal proteins as biomarkers for bacterial identification by mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. J Microbiol Methods. 94 (3), 390-396 (2013).
- Teramoto, K., et al. Phylogenetic classification of Pseudomonas putida strains by MALDI-MS using ribosomal subunit proteins as biomarkers. Anal Chem. 79 (22), 8712-8719 (2007).
- Teramoto, K., Kitagawa, W., Sato, H., Torimura, M., Tamura, T., Tao, H. Phylogenetic analysis of Rhodococcus erythropolis based on the variation of ribosomal proteins as observed by matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry without using genome information. J Biosci Bioeng. 108 (4), 348-353 (2009).
- Bernhard, M., Weig, M., Zautner, A. E., Gross, U., Bader, O. Yeast on-target lysis (YOTL), a procedure for making auxiliary mass spectrum data sets for clinical routine identification of yeasts. J Clin Microbiol. 52 (12), 4163-4167 (2014).
- Stark, T., et al. Mass spectrometric profiling of Bacillus cereus strains and quantitation of the emetic toxin cereulide by means of stable isotope dilution analysis and HEp-2 bioassay. Anal Bioanal Chem. 405 (1), 191-201 (2012).
