Summary

Optimal Lentivírus produção e cultura celular condições para sucesso pilhas transdução primária brônquicas humanas epiteliais

Published: July 22, 2016
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Summary

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

Abstract

A cultura in vitro de células primárias humanas epiteliais brônquicas (HBE) usando condições de interface ar-líquido fornece um modelo útil para estudar os processos de diferenciação e função das células das vias aéreas. Nos últimos anos, o uso de vectores lentivirais para a entrega do transgene tornou-se prática comum. Embora existam relatórios de transdução de células epiteliais das vias respiratórias totalmente diferenciadas com certos lentivírus digitado pseudo-não-HIV, a eficiência global de transdução é geralmente inferior a 15%. O protocolo aqui apresentado proporciona um método fiável e eficiente para a produção de lentivírus e a transdução de células epiteliais brônquicas humanas primárias. Usando células epiteliais brônquicas indiferenciadas, transdução em meio de crescimento epitelial brônquica, enquanto as células fixar, com uma multiplicidade de infecção de factor de 4 fornece eficiências perto de 100%. Este protocolo descreve, passo-a-passo, a preparação e concentração dos vectores lentivirais de título elevado e thprocesso de transdução de e. Discute-se as experiências que determinaram as condições de cultura ideais para atingir transduções altamente eficientes de células epiteliais brônquicas humanas primárias.

Introduction

O desenvolvimento de lentivírus, pseudotipados replicação deficiente (LV) forneceu aos investigadores um método seguro e eficiente para entregar transgenes in vitro 1. Devido à sua expressão a longo prazo, estes LV também poderia ser utilizada para a entrega de agentes terapêuticos in vivo 2,3. A produção de LV requer a co-transfecção de células de rim embrionário humano (HEK) com vários plasmídeos: vector de transferência, gag / pol de empacotamento, rev embalagem, e envelope glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV-G) plasmídeos. Sistemas de empacotamento de terceira geração são considerados mais seguros do que os sistemas de segunda geração, porque o gene rev é codificada num plasmídeo de empacotamento separada, reduzindo assim a possibilidade de recombinação para produzir um lentivírus competente de replicação. Embora os sistemas de embalagem de segunda geração deu cinco unidades de transdução totais mais elevados de dobra, a divisão do genoma viral original para criaro sistema de terceira geração diminuiu o nível de transdução de apenas minimamente 3,4.

Enquanto linhas celulares podem ser transduzidas mais facilidade e eficiência, os investigadores mudaram seu foco para as células primárias, porque estes são mais representativos de tecidos in vivo 5,6. No entanto, as células primárias são refratários a transdução. Enquanto a transdução de células epiteliais das vias aéreas totalmente diferenciadas têm sido relatados, a eficiência global não excedeu 15% 7.

Aqui descrito é um protocolo que permite a produção de LVS-de título elevado. Uma abordagem passo-a-passo é delineada para atingir quase 100% de eficiência de transdução em células HBE primários. Mais especificamente, o protocolo descreve as condições óptimas de cultura para ter sucesso 3 instrumentais. Resumidamente, as células HEK 293T são transfectadas usando o pCDH lentiviral vector de expressão com o promotor de EF-1 dirigindo a expressão de verde fluorescente melhoradaproteína (eGFP) ou mCherry, uma proteína fluorescente vermelha, e um sistema de empacotamento de terceira geração. LVs libertados para os meios de comunicação são coletadas de 24 a 72 horas mais tarde. As partículas de vírus são concentradas com polietilenoglicol (PEG), um método conveniente e fácil de concentração virai, antes da estimação título utilizando um kit de ensaio imuno antigénio p24 ligado a enzima (ELISA). Subsequentemente, as células HBE primárias indiferenciadas são transduzidas em meios de proliferação (meio de crescimento epitelial brônquica ou BEGM) 8, quando a montar (depois de ser tripsinizadas), a uma multiplicidade de infecção factor 4 (MOI), a adição de brometo de hexadimetrina e incubando durante 16 horas ( pernoite). As células são então deixadas diferenciar. Uma vez que o transgene é expresso viral a longo prazo (usando o promotor apropriado, ver discussão), expressão vai ser mantida durante toda a diferenciação em um epitélio das vias respiratórias pseudo ou pode ser induzida (utilizando um promotor indutível) após a diferenciação.

<p class = "jove_content"> Este protocolo é de grande interesse para pesquisadores que desejam usar células HBE primários em vez de linhas celulares, e pode ser adaptável a outros difíceis de transdução de tipos de células.

Protocol

1. Fase 1: Cultura da HEK 293T Prepare meios células HEK (referido como meio de HEK) por adição de 10% (v / v) de soro fetal de bovino (FBS) e 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina a elevada glicose de Eagle Modificado Meio de Dulbecco (DMEM). Bata de um prato de 10 cm de cultura de tecidos com colagénio I. Mistura de 30 ul de colagénio I, em 2 ml de água destilada. Espalhar a mistura sobre o prato e incubar durante 2 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. Remover a mistura e d…

Representative Results

A Figura 1 ilustra diferentes passos chave de avaliar células e soluções durante o processo de transfecção. A Figura 1A mostra a confluência óptimo das células HEK293T antes da transfecção para a produção de vírus. É importante que as células são distribuídos uniformemente ao longo do prato. Figura 1b revela o precipitado em uma gota da mistura de transfecção utilizando brilhantes óptica de campo e uma objectiva 10X. …

Discussion

O protocolo aqui descrito assegura perto de 100% de eficiência de transdução. No entanto, existem passos durante o processo, que são importantes para alcançar este objectivo. Por exemplo, durante o processo de transfecção, a presença de precipitados na mistura de transdução (gota) ou no prato do dia após a transdução (Figuras 1b e d) são ambos relevantes para uma boa transfecção. A ausência de um precipitado ou a presença de aglomerados pode ser devido a uma omissão d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Agência de Recuperação Vida Alliance Organ, da Universidade de Miami para fornecer pulmões. Agradecemos também o Dr. Lisa Künzi para a preparação de DNA utilizado para os experimentos mostrados na figura 2B e 3-D, Dr. Ben Gerovac e Lisa Novak para o vírus mCherry utilizado para os experimentos nas Figuras 3A a C. Também agradecemos Gabriel Gaidosh a partir da instalação de imagem do Departamento de Oftalmologia da Universidade de Miami.

Este estudo foi patrocinado por doações do NIH, a Fundação CF eo hospedeiros de bordo Medical Research Institute com o Dr. Matthias Salathe.

Materials

HEK293T/17 cells ATCC CRL-11268
Fetal bovine serum (FBS)  Sigma 12306C use at 10%
DMEM Thermo Scientific 11995-040
Penicillin/Streptomycin (100x) Thermo Scientific 15140-122 use at 1x
Collagen I BD Biosciences 354231 dilute 1:75 in distilled water
Calphos Clontech 631312 Transfection kit containing 2M Calcium solution, 2X HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O
Polythylene glycol 8000 VWR scientific 101108-210 stock of 40%
Amphotericin B Sigma A9528 use at 1x
Trypsin Sigma T4799
Soybean trypsin inhibitor Sigma T9128
Transwell 12mm Corning 3460
Collagen IV Sigma C7521 dilute 1:10 in distilled water
Hexadimethrine bromide Sigma H9268 stock of 2mg/ml
Puromycin (10.000x) Thermo Scientific A11138-03 use at 1x
Alliance HIV-1 p24 ELISA PerkinElmer NEK050001KT
F12 Thermo Scientific 11765-054
pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro System Biosciences CD532A-2 lentiviral expression vector
pMD2-VSVG Addgene 12259 packaging DNA
pMDLg/pRRE Addgene 12251 packaging DNA
pRSV-rev Addgene 12253 packaging DNA

References

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Cite This Article
Baumlin-Schmid, N., Salathe, M., Fregien, N. L. Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (113), e54176, doi:10.3791/54176 (2016).

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