Summary
Heri beskriver vi metoder til dissektion af føtale og maternelle væv fra menneskelige sigt placenta, efterfulgt af isolation og udvidelse af mesenkymale stamceller / stromale celler (MSC) fra disse væv.
Introduction
Mesenkymale stamceller / stromale celler (MSC) dukker op som en lovende kandidat til brug i cellebaserede behandlingsformer 1. De fleste programmer ser ud til at målrette MSC-medieret væv reparation eller immun regel 2. I mange af disse programmer, kan allogen MSC være så effektiv som autolog MSC 3. Brugen af allogen MSC har økonomisk fordel af at være kompatible med storstilet fremstilling af flere celledoser fra en enkelt kilde væv 4 til at behandle mange patienter.
Historisk set har prækliniske og kliniske studier udnyttes MSC-afledt fra knoglemarven 4. Knoglemarv er generelt indsamlet fra hoftebensrand en frivillig donor. Denne proces er invasiv, og kun et lille volumen af marv (~ 20 ml) opsamles gennem en enkelt punktering. Generering klinisk meningsfulde antal MSC kræver omfattende in vitro ekspansion. Celle potens aftager med passage nummer
Moderkagen er et fetomaternal organ bestående af både føtal og maternel væv 7, og dermed MSC af føtal eller maternel oprindelse kan være teoretisk, isoleret. De følgende referencer giver detailed oplysninger om udviklingen og patologien, samt mikroskopisk og makroskopisk undersøgelse af den humane placenta og adnexa 8,9. Moderkagen egentlig består hovedsageligt af føtale blodkar og sekretorisk og understøttende celler kaldet trofoblaster, der udgør chorionvilli omfattet af chorion frondosum (plade) 8. De forgrenede placentale villi er badet i moderens blod leveret fra uterin spiral arterier, så næringsstof, hormon og udveksling gas mellem foster og moder. Moderkagen er forankret til endometrium via maternelle decidua stromale celler og føtale extravillious trophoblaster veksler i ekstracellulær matrix 8. De villi konvergere på fostrets chorion plade hvor de danner navlestrengen 8.
Et resultat af den første internationale workshop om Placentale-afledte stamceller (2008) var en vurdering af behovet for at standardisere isolation og characterization af celler fra human placenta 10. På grund af anatomien af moderkagen, dissektion af de forskellige væv, kan isolering af MSC og forventede kultur resultater være overvældende for nyankomne til området. I denne protokol, høsten af placenta chorion væv, efterfulgt af MSC isolation og ekspansion er grundigt detaljeret. MSC karakterisering via flowcytometri og in vitro differentiering anses rutine 5,11-13, og således kun kortvarigt detaljeret her.
Som fremhævet i en nylig systematisk litteraturgennemgang 14, MSC fremstillet af de placenta chorion villi generelt antages at være føtal. Selvom kun 18% af studierne undersøgte oprindelsen af MSC opnåede, og af dem, kun halvdelen af studierne rapporterede føtal MSC og den anden halvdel rapporterede maternelle eller blandede MSC populationer. Hver af de tre vævskomponenter beskrevet heri (chorionvilli, chorion plade og decidua basalis) er composed primært af den føtale membran / villi, og en lille del af uterine-afledte celler fra moderen, som forbliver knyttet til det leverede placenta. Vi giver data, som viser, at isolering af MSC fra moderens side af placenta, snarere end den føtale side af placenta, som vi tidligere har rapporteret 5,11, er en mere passende udgangsmateriale, hvis der ønskes maternal MSC. Denne protokol beskrives også anvendelsen af XY FISH at validere føtal eller maternel bidrag til cellekulturer. Mens dette er en standard-protokol fra producenten, er denne analyse ofte overset og dens betydning undervurderet 14.
Protocol
Af det menneskelige forskningspotentiale etiske komitéer på Mater Health Services, Royal Brisbane og kvinders Hospital, Queensland University of Technology og University of Queensland godkendt forskning og indsamling af humane placenta prøver, der anvendes i undersøgelsen. Alle protokoller overholdt nationale retningslinjer forskning. Patienterne forudsat informeret skriftligt samtykke til brug af væv til forskningsformål.
Tredje trimester moderkager blev opnået fra raske mødre følgende rutine kejsersnit (CS) fødsler på sigt fra de ovennævnte hospitaler i Brisbane, Australien. Mandlige diskordante graviditeter for sigt prøver blev anvendt i denne undersøgelse for at skelne føtal fra celler fra moderen. Føtal køn var blevet bestemt ved ultralyd før fødslen og / eller visuel inspektion af den nyfødte ved fødslen af klinisk personale. X og Y-kromosom fluorescens in situ hybridisering (FISH) blev anvendt til yderligere at validere køn og føtal eller maternel oprindelse af væv konserveret fraoriginale moderkager.
1. Forud for Harvest, forberede følgende
Bemærk: Når du foretager op enzymløsninger, bør de specifikke krav og koncentrationer, som fabrikanten for hvert produkt følges. Enzymer ofte som en rå blanding af proteiner, derfor lignende enzymer fra forskellige virksomheder er tilbøjelige til at have forskellige aktiviteter / koncentrationer. Derfor producentens råd bør anerkendes og løsning forberedelse skal muligvis ændres i overensstemmelse hermed.
- Forbered eller købe 1,5 til 2 L total steril Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) for denne protokol.
- Forbered collagenase I stamopløsning ved at afveje collagenase type I og opløse 1 mg / ml i HBSS og vortex forsigtigt for at sikre fuldstændig opløsning. Bestem mængden af HBSS (indeholdende calcium og magnesium), der kræves for at bringe collagenase løsning på 100 enheder (U) / pi (1.000 x lager opløsning) og derefter filtrere ved hjælp af en 0,2 &# 181; m sprøjtefilter. Alikvote 1 ml volumener i 1,5 ml rør og opbevares ved -20 ° C indtil brug.
- Forbered dispase stamopløsning ved at opløse usterile dispase ved 10 mg / ml i Dulbeccos phosphatbufrede saltvand (DPBS) uden calcium eller magnesium. Fortynd med DPBS uden calcium eller magnesium til en slutkoncentration på 2,4 U / ml. Filtersteriliser gennem en 0,2 um sprøjtefilter. Alikvote 1 ml mængder i 1,5 ml rør og opbevares ved -20 ° C indtil brug.
- Forbered deoxyribonuclease (DNase) -I stamopløsning ved at opløse DNase-I ved 10 mg / ml i 0,15 M NaCl. Filter thorugh et 0,2 um sprøjtefilter. Alikvote 1 ml mængder i 1,5 ml rør og opbevares ved -20 ° C indtil brug.
- Forbered arbejder fordøjelse opløsning ved at kombinere 100 E / ml collagenase type I, I.5 ug / ml DNase I og 2,4 U / ml dispase i serum-frit DMEM. Frisk afrimning og fortyndes enzym lagre umiddelbart før brug. Cirka en 1: 1-forhold mellem fordøjelse opløsningvolumen til væv volumen er påkrævet (f.eks 10 ml væv, målt i en 50 ml rør, kræver 10 ml fordøjelse opløsning).
- Der fremstilles en opløsning af 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS og justeres til pH 7,4 15. Store 25 ml prøver ved -20 ° C for langsigtet eller ved 4 ° C i 1 uge.
- Forbered MSC dyrkningsmedium fra DMEM-Low Glucose (DMEM-LG) suppleret med 1x antibiotikum og antimykotisk opløsning og 10% ikke-varmeinaktiveret føtalt bovint serum. MSC-grade FBS kan købes fra mange FBS leverandører.
- Autoklaveres sterilisere dissektion udstyr i forvejen som pr institutionelle retningslinier. Disse omfatter sakse, pincetter, skalpeller, og en stor metal dissektion bakke. Indsamle yderligere steril vævskultur plastvarer og hjælpematerialer (f.eks skalpelblade, 50 ml og 15 ml rør, 25 ml, 10 ml og 5 ml pipetter, og 75 eller 175 cm2 cellekulturkolber).
- Brug standard laboratorium primær cellekultur udstyr: en klasse II biosafety skab egnet til primær celleisolering, cellekultur inkubator indstillet på 5% CO2 og 37 ° C, en rocker i en 37 ° C inkubator, og en centrifuge med plads til 50 ml rør.
- Brug egnede personlige værnemidler: et laboratorium frakke, 2 par handsker (på alle tidspunkter), sikkerhedsbriller og tæt-tåede sko som pr institutionelle retningslinier.
- Forbered passende rensning løsninger for humane blodprøver som pr institutionelle retningslinjer og flydende biologiske affaldscontainere på forhånd.
2. Isolering af placentale MSC
- Forberedelse af Placenta
- Kjole i det nødvendige personlige værnemidler. Opsæt den biologiske sikkerhed kabinet med nødvendige materialer, løsninger og affaldscontainere til at udføre proceduren indtil den enzymatiske fordøjelse (afsnit 2.5.6).
- Anskaf en placenta med informeret samtykke og etisk godkendelse. Saml moderkagen via kejsersnit section under aseptiske kirurgiske betingelser, og pakke i en steril pose eller spand til transport til laboratoriet.
- Under transport og forud for dissektion, opbevare placenta ved stuetemperatur eller 4 ° C.
Bemærk: Væv kan opbevares i op til 6 timer uden at påvirke cellekultur ydeevne.- Begræns tiden mellem placenta indsamling og vævsbehandling hvor det er muligt. Denne anbefaling er baseret på praktiske spørgsmål. I nogle tilfælde har vi forsinket celleisolering fremgangsmåde til op til 6 timer efter fødslen. I disse tilfælde er blevet holdt moderkager ved stuetemperatur eller 4 ° C (i laboratoriet eller på kollektionen center). Der blev ikke observeret nogen påviselige forskelle, ovennævnte almene donor variation, i MSC opnået fra placenta, når de blev opbevaret ved 4 ° C eller ved stuetemperatur.
- Karret med placenta i biologisk sikkerhedsskab. Åbne beholderen og overføre placenta i en steril bakke.
- Åbn ud fosterhinderne (fosterhinden eller amnion-chorion laeve) 8. Blive orienteret med de dele af moderkagen. De føtale side har navlestrengen indsættelse, som er i almindelighed centralt indsat i placenta. Moderens side (foret med decidua basalis), som er modsat den føtale side, har indlysende kimblade (eller lapper).
- Til at begynde dissektion, orientere placenta med navlestrengen vender opad i den sterile bakke.
Bemærk: Denne protokol er beregnet til at give tilstrækkelig mange celler med frø i én T175 kolbe fra hver af de tre vævstyper. Hver fordøjelse begynder med ca. 10 g væv. Dette er en lignende startnummer af kolber som MSC kulturer initieret fra en 20 ml knoglemarvsaspirat. Hvis der ønskes flere celler, så er mere væv kan høstes og protokollen kan skaleres lineært. Størrelserne af væv, der skal høstes er kun vejledende for, hvad der er praktisk med placentavæv. Der er få defining funktioner i placenta villi, som kan anvendes som et referencepunkt. De angivne dimensioner tjener som et skøn, og navlestrengen bruges som et vartegn på fostrets overflade.
- Dissektion af decidua (D) Tissue
- Flip moderkagen over, så moderens overflade (decidua basalis) vender opad. Sørg for, at fostrets side med navlestrengen indsætningspunktet vender nedad.
- Skær stykker af 0,5 cm tykkelse fra moderens side af placenta (indeholdende decidua basalis væv).
- Placer vævsstykker i en petriskål indeholdende HBSS under dissektion at holde vævsstykker hydreret.
- Overfør tilstrækkelig væv til at fylde et rør op til 10 ml-mærket i en 50 ml rør (dette er omtrent 10 g væv).
- Dissektion af chorion Plate (CP) Tissue
- Mekanisk fjerne af fosterhinden fra den føtale overflade placenta (ikke fosterhinden), forlader chorionic frondosum (chorion plade) intakt.
- Udskårne stykker ~ 1 cm bredt og 0,5 cm dybe fra chorion plade. Høste chorion plade fra område nærmest navlestrengen, væk fra kanten af placenta.
- Placer væv stykker i en petriskål indeholdende HBSS under dissektion at holde dem hydreret.
- Overfør tilstrækkelig væv til at fylde et 50 ml rør op til 10 ml mærket (~ 10 g væv).
- Dissektion af chorionvilli (CV) Tissue
- Dissekere CV væv ~ 1 cm 2 x 0,5-1 cm dyb fra placentavæv hvor CP allerede er fjernet. Igen, høst CV fra området nærmest navlestrengen, væk fra kanten af placenta. Prøv at bo på mindst 1 cm væk fra moderens side af placenta (indeholdende decidua basalis væv); målet er at høste væv fra det indre af placenta villi væv.
- Placer vævsstykker i en petriskål indeholdende HBSS under theseIndsatsen for at holde dem hydreret.
- Overfør tilstrækkelig væv til at fylde et 50 ml rør op til 10 ml mærket (~ 10 g væv).
- Hakning og enzymatisk spaltning af D, CP, og CV placentavæv
- Da der er ~ 10 g D, CP eller CV væv i tre forskellige 50 ml rør, fylde hvert rør med ca. 40 ml HBSS og gentagne gange invertere røret for at vaske vævet (gentag for ~ 10 sec).
- Dekanteres og gentag dette vasketrin 2-3 gange, indtil opløsningen er stort set fri for blod. Brug en 10 ml pipette eller lange pincet til at sikre vævsstykkerne ikke går tabt ud af røret (rørene), når dekantering af supernatanten.
- Retur væv brikker til en 10 cm petriskål med minimal væske overførsel. Chop / hakkekød vævet i fine stykker af ca. 1-5 mm 3 med saks eller barberblad.
- Overfør hakket væv tilbage i behørigt mærket (D, CP eller CV) 50 ml rør.
- Tilføj frisk prepared fordøje medier i mindst 1: 1 forhold med vævet (fx 10 ml væv plus 10 ml fordøje medier). Sæt hætten på hvert rør og vend rørene flere gange for at blande.
- Inkubér væv i rørene med fordøje medier i 1-2 timer ved 37 ° C. En fugtig atmosfære og 5% CO2 er ikke nødvendige til dette trin.
Bemærk: Rapid rystning er nødvendig for effektivt at dissociere celler fra vævet og maksimere MSC udbytte. Begrænset udbytte vil være tydeligt ved meget få celler fæstnet til kulturen kolben ved 48 timer og en første passage gang længere end 1-2 uger. Inkubationstiden og ryste metode er afhængig af den 37 ° C inkubator til rådighed i laboratoriet og kan kræve optimering.- For en inkubator med en hurtig og styrbar rystermekanismen, sted væv og fordøje medium i et 50 ml rør eller steril konisk kolbe, sted i inkubator og indstille rystehastighed til 250 rpm. Dette vil resultere i en fuldstændig fordøjelse afvævet i 1 time.
- Alternativt, for en inkubator med en blid vuggende eller ingen vippemekanisme, manuelt ryste røret hurtigt og kraftigt i hånden i 10 sek hver 30 min i 1,5 til 2 timer. Enzymet Inkubationstiden er et passende tidspunkt at skille affald, rydde biosikkerhed kabinet af unødvendige ting, ændre laboratoriekittel hvis snavset og forberede den næste del af proceduren.
- Indsamling af mononukleære celler og Plating ind Kolber
Bemærk: Fra det forrige trin, er der tre 50 ml rør (D, CP eller CV) med fordøje væv stykker. Når vævet digest opløsningen udvikler et uklart udseende og hvide blodkar er indlysende i vævet, fordøjelsen er fuldstændig.- 30 ml af MSC medium indeholdende FBS til hvert rør for at inaktivere enzymerne indeholdt i fordøjelsen opløsning.
- At adskille mononukleære celler fra den store ufordøjet affald, Pulscentrifugering af 50 ml rør. Kort fortalt tilladercentrifugen at nå 340 x g i 5 sekunder og derefter stoppe. Dette vil tvinge stort affald for at pelletere ved bunden af røret, samtidig med at de mononukleære celler i flydende suspension.
Bemærk: De mononukleare celler forbliver i den flydende fase, hvis røret er kun kortvarigt (pulseret) centrifugeret. Hvis centrifugering er forlænget, vil de mononukleære celler også pelletere ved bunden af røret med vævsstykker, der fører til uønsket celletab. - Opsaml supernatanten indeholdende de mononukleære celler, og overføre disse til et nyt 50 ml rør med en pipette.
- 30 ml af medier eller HBSS til den resterende placenta væv snavs og rystes kraftigt. Dette vil bringe resterende løsrevne mononukleære celler i suspension og aktivere en anden høst af formodede MSC fra vævet.
- Pulscentrifugering røret en anden gang, og igen overføres supernatanten til et nyt 50 ml rør. Gentag dette trin for tredje gang for at maksimere indsamling effektivitetaf mononukleære celler fra hver vævskilde.
- Pool supernatanterne fra hver af de enkelte vævstyper i to 50 ml rør. Dette vil give 6 rør alt (2 rør i hver D, CP og CV). Centrifuger hvert rør i 5 minutter ved 340 x g. Dette trin vil bundfælde mononukleære celler til bunden af rørene.
- dekanteres eller pipette off supernatanten i affaldet omhyggeligt. Det er unødvendigt at forsøge at fjerne hver dråbe supernatant.
Bemærk: Cellepelleten vil være skrøbelig på grund af et stort antal af røde blodlegemer. Pas på ikke at uheld kassere pillen, hvis du dekantering direkte fra 50 ml rør. - Efter fjernelse af det meste af supernatanten, knips forsigtigt røret flere gange med en finger for at løsne cellepelleten. Kombiner pelletene, således at der er et enkelt rør for hver D, CP eller CV væv og resuspender hver i 35 ml MSC medier.
- Valgfrit: filtreres mononukleære fraktion gennem en 100 um mesh celle si sæt up i et 50 ml rør til fjernelse celleklumper eller fibrøst materiale.
Bemærk: Care er påkrævet som filtrene nemt kan tilstoppe og over-fyld. Derudover kan luftbobler blokere filtre fra dræning. Hvis dette sker, langsomt løfte filtret ud af røret for at tillade luft at strømme under filteret vaskes filteret igennem med celledyrkningsmedier eller en ombytning til et nyt filter. Eksklusive filtreringstrinnet synes ikke at ændre udbyttet eller kvaliteten af de efterfølgende MSC-kulturer.- Eventuelt kan et rødt blodlegeme (RBC) lysis eller densitetsgradientcentrifugering udføres på dette stadium 15. vores erfaring er, at RBC ikke interfererer med MSC fastgørelse eller proliferation og derfor RBC lysis ikke er nødvendig. Mononukleære celler kunne tælles på dette trin, hvis RBC fjernelse blev udført 15. Selv vil langt størstedelen af celler på dette stadium ikke være MSC, men være føtale oprindelse trofoblaster, endotelceller og hæmatopoietiske celler samt maEKSTERNE oprindelse hæmatopoietiske celler og decidua-stromaceller.
- Overfør cellesuspensionen for hver D, CP eller CV væv i en enkelt T175 kolbe og kultur i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Indlæg Isolation-celle Expansion
- På 48 timer efter den oprindelige isolering, fjerne mediet fra hver af kolberne (D, CP og CV) og erstatte med 35 ml frisk MSC medier. Det brugte medium og løsrevne celler kan kasseres, da formodede MSC, antages at være knyttet til vævskultur kolbe 16. Retur kolber til inkubatoren i yderligere 24 timer.
- Efter yderligere 24 timer af kultur, vaskes kolberne to gange med DPBS (25 ml) for at fjerne snavs og RBC'er. Swirl væsken omkring bunden af kolben for at fjerne røde blodlegemer. Brug en pipette til at fjerne væske og snavs. Tilsættes 35 ml MSC medier til kolberne og returnere kolberne til inkubatoren.
- Erstat medier to gange om ugen, og icubate kulturer indtil cellemonolagene er 80- 90% sammenflydende. Denne indledende ekspansion tager 4-14 dage, afhængigt af kvaliteten af det væv, mængde udgangsmateriale og effektivitet og inkubationstid med digest opløsning.
3. Subkultur af PMSC'er
- Når kulturer er 80-90% sammenflydende, vask to gange med 20 ml 1x HBSS eller DPBS og kassér vaske. Tilføj trypsin-erstatning til hver kolbe (dvs. bruge 5 ml til en T175 kolbe).
- Inkubér kolber til 5 minutter ved 37 ° C for at befri MSC fra vævskultur overflade. Tap siderne af kolben hver ~ 2 min for at lette frigørelse.
- Når celler frigøres fra overfladen og i en enkelt cellesuspension, vaske cellerne fra kolben med MSC medier og opsamle cellerne i rør. De MSC medier vil udvande og deaktivere trypsin-erstatning (brug ~ 15 ml MSC medier pr T175 kolbe).
- Overfør indholdet af hver vævskulturkolbe til en 50ml rør.
- Centrifugerør ved 340 xg i 5 min for at pelletere cellerne.
- Supernatanten fjernes, og resuspender cellepellets i 1 ml MSC medier.
- Fortynd 10 pi af cellesuspensionen i 10 pi trypanblåt. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer og beregne det totale antal celler 15.
- Overfør celler til nye flasker ved 1.150 celler / cm2 i friske MSC medier og inkuberes i en vævskultur-inkubator. På dette seeding tæthed, frø 200.000 MSC i hver ny T175 kolbe i 35 ml MSC medier. Feed cellerne to gange om ugen indtil 80-90% sammenflydende. Seed efterfølgende passager på 1.150 celler / cm2 eller 200.000 MSC i hver T175 kolbe.
- Når Passage 1 (P1) eller P2 celler konfluerende, Cryopreservering størstedelen af cellerne til fremtidig brug, og kun én T175 kolbe til yderligere formering og karakterisering reseed. De opformerede celler kan bruges på P3 eller P4 for mesodermal differentiering assays og celle karakterisering via flow cytometri.
Bemærk: I tidlige passager, kan der være meget få tyndt adskilte kolonier, men den lokale celledensitet inden for hver koloni kan være meget høj. Dette er ikke ideelt, da den lokale tætte pakning af celler vil resultere i kontaktinhibering, forsinke vækst og reducere kultur ydeevne. Vi anbefaler, når tætte kolonier observeres, bør cellerne høstes og podet ind i en ny kolbe. Denne omfordeling proces giver celler med plads til at formere sig, og den samlede kultur ydeevne vil blive forbedret. - At Cryopreservering MSC, indsamle ~ 1 x 10 6 celler i 1 ml 90% FCS og 10% dimethylsulfoxid (DMSO) og fryse under anvendelse af standardprotokoller.
Bemærk: I afsnittet repræsentative resultater, der er beskrivelser af MSC karakterisering ved anvendelse af flowcytometri, mesodermal differentiering og XY FISH-analyse til at bestemme kønnet på de tre forskellige (D, CP og CV) udvidede cellepopulationer. I vores undersøgelse, placentaer var fra mandlige spædbørn; således alleføtale celler kunne skelnes som mandlige (Y-kromosom), og alle maternelle celler kunne skelnes som hun (X-kromosomet kun).
Representative Results
Placenta MSC isolation procedure er opsummeret i figur 1. De tre områder af placenta anatomi hvorfra MSC blev isoleret, er fremhævet i figur 2. Dette er de maternelle decidua, samt de overvejende føtale væv i chorion plade og chorionvilli. Mange lærebøger, artikler og detaljer online ressourcer på udvikling og funktionelle rolle af de forskellige placentale væv (se henvisning 8).
Morfologi af kulturer 48 timer efter isolering og fjernelse af vævsrester.
Efter 48 timers kultur vil MSC'er har fastgjort til vævsdyrkningsplastic, mens RBC'er og de fleste andre cellerester ikke vil have vedlagt. På dette tidspunkt, skal mediet erstattes med 35 ml frisk dyrkningsmedium. Forud for dette medium udveksling, er det vanskeligt at foretage præcise observationer på grund af denstort antal RBC, som vil hindre visuel vurdering. Udseendet af kultursupernatanten kan variere betydeligt mellem placenta donorer. Denne variation kan ses visuelt i eksempel 1 og 2 (figur 3A). Disse to MSC isolationer, som syntes at være meget forskellige, blev udført samtidig fra to forskellige moderkager. Men når vasket, begge kulturer optrådte lignende (se vasket eksempel 3, figur 3A).
Under et mikroskop, efter 48 timers medier udveksling, kun nogle få celler vil være fastgjort til kolben (figur 3B), og cellerne vil blive vist signifikant forskellig fra mere udførligt ekspanderede MSC'er. Nogle snavs og RBC vil være synlig som flydende eller vedhæftede klumper og disse vil ikke påvirke væksten af MSC'erne. De længere fibroblastceller klæbet til bunden af kolben vil sandsynligvis være en blanding af celler, herunder MSC, hæmatopoietiske,trophoblastisk eller endotelceller. Igen, ikke-MSC-celler ikke gå på kompromis MSC kulturer, som disse celler generelt ikke vil overleve mere end 1-2 passager i MSC dyrkningsbetingelser. Trods en vis variation i den indledende udseende kulturer, de efterfølgende ekspansion resultater er generelt i overensstemmelse.
Morfologi MSC-kulturer over tid.
I dette repræsentative eksempel syv dage efter isolation, små fibroblastiske MSC kolonier var synlige, selv om ikke-MSC-celler også kunne ses som runde eller løst bundne celler (figur 4A). De vedhæftede celler hvad blev oprindeligt betegnet en "koloni enhed danner -fibroblast "(CFU-F) 17 og senere betegnet MSC 18. Tretten dage efter isolering, fibroblastiske MSC kolonier var store (figur 4B). Generelt vil monolaget være 80-90% konfluente på dette tidspunkt, og cellerne bør være passa Ged. Fra passagen 2 og fremefter vil placenta MSC monolag udvikle den karakteristiske whirlpool-lignende morfologi ved sammenløb (figur 4C). Medmindre cellerne passeres ved lav densitet, vil CFU-F-dannelse ikke længere observeres. Ved lav densitet, placenta-afledt MSC har en mindre, mere firkantet udseende end voksen knoglemarv-afledte MSC 1. Mens placenta-afledt MSC og knoglemarv-afledte MSC udviser lignende opformeringsrater, placenta-afledte celler er mindre tilbøjelige til hurtig ældning 5.
Karakterisering af placental MSC in vitro.
Hver udvidet celle population skal karakteriseres for at sikre, at den opfylder standard MSC kriterier 16, herunder (1) plast vedhæftning (2) tilstedeværelsen af mesenkymale overflademarkører og fraværet af hæmatopoietiske overflademarkører, og (3) evnen til at undergå mesodermal differentiering.
Som vist i figur 4, MSC'erne i kultur er plast vedhængende og har en fibroblastisk morfologi; dette validerer, at cellerne opfylder de første kriterier, der definerer MSC 16.
Placentale MSC display mesenchymal overflademarkører.
Den anden definition MSC karakteristik er tilstedeværelsen af mesenchymale overflademarkører og fraværet af hæmatopoietiske overflademarkører 16. Da der ikke er nogen enkelt markør i stand til endeligt at identificere et MSC, er paneler af markører generelt anvendes i forbindelse med flowcytometri analyse for at identificere celler, der er mesenkymale, men ikke hæmatopoietiske. I det repræsentative datasæt leveres her (figur 5A), evaluerede vi celle udtryk for mesenkymale markører CD73, CD105, CD90, CD146, og CD44, de hæmatopoietiske markører CD45 og CD34, og HLA-DR, som well som endotel markør CD31. Alle af antistofferne anvendes i denne placenta MSC karakterisering, er anført i tabellen Materialer / udstyr. Farvning blev udført som pr fremstiller instruktioner, med analysemetoder, der er beskrevet her 19.
Cellerne var positive for de mesenchymale markører CD73, CD105, CD44, og negative for celleoverflademarkørerne CD45, CD34, HLA-DR og CD31, som forventet 5,20. Cirka 37% og 57% af cellerne i vores repræsentant datasæt var positive for CD90 og CD146 21, hhv. Både CD90 og CD146 er almindeligt anvendt MSC markører 21. MSC celleoverfladen markør profiler kan være forskellige, afhængigt af MSC væv kilde, medium sammensætning, eller passage nummer 22. I vores mange års erfaring, har vi ikke observeret forurening af placenta-afledt MSC langsigtet med ikke-mesenkymale celler efter 1-2 passages 5,11.
Placental MSC display mesenkymal differentiering potentiale
Per definition skal MSC besidder in vitro mesodermal differentiation kapacitet 5,13. Mesodermal differentiering potentiale er almindeligt vurderes gennem enten tri- eller bi-slægt differentiering analyser. Bi-slægt assays generelt vurdere osteogen og adipogenisk differentiering kapacitet, mens tri-slægt assays desuden vurdere chondrogen differentiering kapacitet. I de repræsentative resultater præsenteres her, viser vi, at de udvidede MSC befolkninger udgør både kalkaflejringer, indikerer osteogen differentiering og lipidvakuoler, indikerer adipogenese (figur 5B).
At karakterisere MSC populationer her rapporterede, vi podet celler i 24 dyrkningsbrønde ved 6 x 10 4 celler i 1 ml induktion medium. Mediet komponenter er angivet i tabellen Materialer / udstyr. Mens induktionsmedium formuleringer er almindelige i litteraturen, der er betydelig variation i offentliggjorte formuleringer. Derfor vi kort liste vores induktion medium formuleringer og farvning tilgange her. Osteogen induktion medium indeholdt DMEM-HG, 10% FBS, 1x antibiotikum antimykotisk opløsning, 10 mM β-glycerol fosfat, 100 nM dexamethason, og 50 uM L-ascorbinsyre-2-phosphat. Adipogenisk induktionsmedium indeholdt DMEM-HG, 10% FBS, 1x antibiotikum antimykotisk opløsning, 10 ug / ml insulin, 100 nM dexamethason, 200 uM indomethacin, og 500 uM 3-isobutyl-1-methyl xanthin. Her blev kulturer holdt i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator og dyrkes i 14 dage. Induktion medium blev udvekslet to gange om ugen i løbet af dyrkningsperioden. Efter 14 dages induktion, blev kulturer karakteriseret til enten knogle-lignende matrix (osteogenese) eller lipidvakuoler (adipogenese) som pr vores prevskellige publikation fem. Osteogen calcium matrix deposition analyse blev opnået ved først bortsugning mediet, fastsættelse af kulturerne med 4% paraformaldehyd i 20 minutter, vask af monolaget med DPBS og derefter farvning med alizarinrødt S ifølge producentens instruktioner. Adipogenisk induktion blev vurderet ved bortsugning mediet, fastsættelse af kulturerne med 4% paraformaldehyd i 20 minutter, vask af monolaget, og farvning med Oil Red O-opløsning ifølge producentens instruktioner. Farvede kalkaflejringer og olie vakuoler blev derefter visualiseret med et lysmikroskop, og billeder gemmes til senere brug.
I tidligere publikationer, har vi kendetegnet differentieringen potentiale placenta-afledt MSC mere udførligt 4,5. Placenta-afledt MSC osteogenesis ligner knoglemarv-afledte MSC, mens adipogenese er generelt mindre effektiv i placenta-afledt MSC 5 </ Sup>. Vi har ikke rutinemæssigt foretager chondrogen differentiering af flere grunde, selv om dette er tidligere blevet rapporteret af os for placenta-MSC 5. For det første, mens mesodermal differentiering kapacitet er et iboende træk ved MSC, er det sandsynligt, af sekundær betydning 23-25, især hvor den terapeutiske fordel forventes at blive afledt af MSC parakrine sekreter 26. For det andet, selv om Dominici et al. Foreslog minimale kriterier for den kliniske produktion af voksent menneske knoglemarv-afledte MSC 16, nyere undersøgelser tyder MSC fra forskellige nicher har forskellige iboende egenskaber og differentiering kapaciteter 5,13,27-32. Faktisk Parolini et al. Foreslog, at placenta-afledt MSC bør differentiere til "en eller flere mesodermale" afstamninger stedet alle tre afstamninger 10. Endelig er mange MSC undersøgelser udelukker chondrogen differentiering, som det sker gennem en lignendeintracellulær signalvej som osteogenese (TGFp familie pathway) 33-35.
Placental MSC er maternel oprindelse ved hjælp af denne fremgangsmåde til kultur, trods den anatomiske placering af udgangsmaterialet.
Mange publikationer antage, at celler isoleret fra føtal chorion udbytte føtal MSC ved kultur 14. Men som vi har rapporteret tidligere 5, alle kulturer stammer fra føtal chorion, ved hjælp af denne protokol, hurtigt blive beriget for moderens MSC som ville intuitivt forventes for de maternelle decidua MSC kulturer. I disse repræsentative resultater anvendte vi placentavæv fra mandlige babyer, således at det var muligt let at afgrænse den føtale og maternelle celle bidrag i de ekspanderede cellepopulationer. Til disse undersøgelser anvendte vi XY FISH kit anført i Table of Materials / Udstyr og fulgte fabrikantens anvisninger.
(figur 6) . Ved passage 2, cellepopulationerne afledes af de maternale væv var ~ 100% celler fra moderen (XX), og føtale celler (XY) kunne ikke påvises. Dette antyder, at fysisk dissektion af maternel væv førte til berigelse af celler fra moderen i de efterfølgende kulturer. Det er dog vigtigt at overveje de kultur resultater fra føtal chorionvilli og chorion plade-afledt kulturer. Ved passage 0, både føtal chorionvilli og chorion plade afledte kulturer var ~ 85% XY eller føtalt oprindelse, hvilket indikerer, at målrettet dissektion beriget med fosterceller (figur 6). Ved passage 0, begge kulturer indeholdt ~ 15% maternel celle (XX) kontaminering. Overraskende, ved passage 2 blev begge føtale kulturer befolket med ~ 100% celler fra moderen (XX), og føtale celler (XY)var ikke længere påviselige. XY FISH-analyse afslører, at moderen celler (XX kromosomer) hurtigt og konsekvent overtagelse kulturerne afledt af føtale chorion væv. Dette er et kritisk kultur observation, der ofte overses 5. De nærmere detaljer for denne analyse er inkluderet i denne protokol, fordi det viser den meget vigtige iagttagelse, at celler fra moderen hurtigt befolker alle kulturer, når DMEM suppleret med 10% FBS anvendes uden yderligere faktorer med henblik på at støtte de føtale-afledte befolkninger.
Figur 1:. Oversigt over placenta MSC isolation procedure (trin 1) orientere dig med moderkagen anatomi. (Trin 2) Manuelt dissekere 10 g væv fra enten decidua, chorionvilli eller chorion plade med en saks. (Trin 3) Hakkekød than dissekerede dele af decidua, chorionvilli eller chorion plade væv i fine stykker med en saks eller en skalpel.
(Trin 4) Befri celler fra de fine stykker via en 1-2 timers fordøjelse i dispase og collagenase I.
(Trin 5) separere cellerne fra det fibrøse væv ved puls centrifugering og / eller vask dem gennem en celle si. Indsamle og resuspender celler i dyrkningsmedium og anbringes i dyrkningskolber. Klik her for at se en større version af dette tal.
Mesenkymale stromale celler (MSC) vil blive udvalgt på grundlag af deres tilbøjelighed til plast adhærens og evne til at overleve og formere sig i dyrkningsmediet. Endelig i resultatafsnittet, den udvidede MSC kan karakteriseres og opbevares til anvendelse i fremtidige forsøg.
Figur 2:. Anatomi af det menneskelige sigt placenta og væv isoleret på denne procedure Den første væv, der skal høstes, er moderens decidua. Decidua er væv, der er tilbage som et tyndt lag på overfladen af placenta efter den er kastet fra livmodervæggen (decidua er identificeret ved de grønne markører). Det andet væv, der skal høstes fra det indre af moderkagen er fosterets chorionvilli (blå markører). Den tredje væv, der skal høstes, er føtal chorion plade (røde markører) (tilpasset fra henvisning 36). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Morfologi af kulturer 48 timer efter isolering og rebevæge vævsrester. (A) Udseendet af kultursupernatanten kan variere betydeligt mellem placenta donorer før afvaskning resterne. Eksempel kulturer 1 og 2 demonstrerer denne variation. Disse to isolationer blev udført samtidigt, men fra to forskellige placenta. Når vaskede kulturer vil være klart for RBC'er og vævsrester som vist i eksempel 3. De efterfølgende ekspansion resultater er generelt overens. (B) Efter 48 timers medier udveksling, vil kun nogle få celler fæstnet til kolben. Scale bar = 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Morfologi MSC kulturer over tid (A) Syv dage efter isolation, lille fibroblastic MSC kolonier er synlige selv om ikke-MSC-celler også vil være til stede som runde eller løst bundne celler. (B) 13 dage efter isolation, fibroblastiske MSC kolonier er store og ofte monolaget af MSC er sammenflydende og klar til passage. (C) Fra passage 2 og fremefter, vil MSC monolag udvikle en karakteristisk spabad-lignende morfologi ved sammenløb. Scale bar = 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:. MSC karakterisering ved flowcytometri og mesodermal differentiation (A) placenta chorionvilli-afledte MSC vise en klassisk MSC markør profil ved flowcytometrianalyse, selv for disse celleoverflade- markører, expressionen er den samme for alle typer humant MSC. Hvert histogram viser signalintensiteten (x-akse) kontra den normaliserede celletal på y-aksen (% af Max). I denne repræsentative datasæt var cellerne positive for CD73, CD105 og CD44, og negativ for de hæmatopoietiske markører CD45 og CD34 og HLA-DR. (B) Placenta MSC generelt undergår robust osteogen differentiering, men (C) adipogenisk differentiering kan være mindre effektiv end med knoglemarv-afledte MSC. Billeder i billedtekster B og C blev taget ved 40X forstørrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Placenta MSC er maternel oprindelse ved hjælp af denne fremgangsmåde til kultur, trods den anatomiske placering af udgangsmaterialet.Graferne viser kvantificering af fostrets (mandlig, XY) og moderens (kvinde, XX) celle sammensætning af placenta MSC kulturer isoleret fra decidua, chorion villi og chorion plade væv ved hver anden passage. Celler fra moderen (XX) hurtigt og reproducerbart overtage kulturer afledt fra de føtale chorion væv. Føtal = male = XY kromosomer detekteret i en individuel celle, maternelle = kvindelige = XX kromosomer detekteret i en individuel celle. Data præsenteret her var fra N = 3 uafhængige donor moderkager fra mandlige babyer, med et minimum på 100 celler farvet for XY FISH og talt for hvert datapunkt. Barer repræsenterer gennemsnit, og fejlsøjler afspejler en standardafvigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Moderkagen er et fysisk stor fetomaternal orgel, hvorfra føtal eller maternel MSC kan isoleres 22. Heri, vi givet en detaljeret oversigt over placenta anatomi og instruktion om, hvordan man specifikt dissekere decidua (maternal), chorion villi (føtal), og chorion plade (føtalt) væv (Trin 2,2-2,4). Efterfølgende har vi skitseret en robust protokol, der muliggør MSC isolation fra hver af disse tre væv (Trin 2,5-2,6). Placental MSC ekspansion er effektiv og kulturer ligne knoglemarv-afledte MSC kulturer (figur 3 og 4). Osteogen differentiering er pålidelige (figur 5B), mens adipogenisk differentiering er generelt mindre effektiv (figur 5C) 5.
Mange tilflyttere til området vil antage, at kulturer afledt af føtal chorion villi eller chorion plade væv vil blive beriget for føtal MSC. Men i vores hænder fetal celle berigelse er kun forbigående, når standard MSC ekspansion medium såsom DMEM-LG + 10% FBS udnyttes 5. Her giver vi repræsentative resultater ved hjælp placentale væv hidrørende fra en mandlig baby. Ved at bruge placenta væv fra en mandlig baby, fostercellerne er let identificerbar som havende XY kromosomer, mens celler fra moderen kan identificeres som havende XX kromosomer. Figur 6 viser XY FISH resultater for en repræsentativ kultur. Mens føtal MSC (XY) er beriget (op til 80%) i de oprindelige kulturer afledt af føtalt chorionvilli eller chorion plade væv, er disse samme kulturer hurtigt overhalet (~ 100%) ved maternel (XX) MSC over de to første passager . I standardmedium, sammensat af DMEM-LG + 10% FBS, de få maternel-afledte MSC, der forurener føtale væv udkonkurrerer de føtale-afledte celler i kultur.
Et afgørende skridt er skitseret i denne protokol er en opskrivning af placenta anatomi og hvorfra føtalog moderens væv kan mest effektivt høstes. Som skitseret i afsnittet repræsentative resultater, er dissektion af fostervæv muliggøre forbigående berigelse for føtal-afledte MSC. Forbedringer i ekspansion medium formulering, gennem specifik eksogen vækstfaktor medium tilskud bør tillade selektiv udvidelse af føtale-afledte MSC befolkninger, og fremstille en celle produkt, der er beriget for føtal snarere end moderen celler (vores gruppe er ved at udvikle sådanne medium formuleringer). Fremstillingen af føtale MSC populationer kan have en række fordele, som føtal MSC er påstået at have større angiogenese og immunosuppressive egenskaber end tilsvarende maternelle MSC populationer 37.
I hver af de beskrevne isolation protokoller, vi brugte ca. 10 g væv. En hel placenta er typisk 500-750 g, og i tidligere arbejde, vi viste, at gennem automatiseret væv fordøje og en celle ekspansion bioreaktor proccesser, at det bør være muligt at fremstille over 7.000 kliniske celledoser fra en enkelt placenta 4. Disse tal understreger mulighederne egnethed placenta-afledt MSC i allogene MSC behandlingsformer, og betydningen af denne metode, uanset MSC oprindelse (føtal eller maternel). Fra et terapeutisk perspektiv er det mest afgørende, at brugerne har en fuld forståelse af cellen produktet og evnen til pålideligt at fremstille denne celle produkt. Vi håber, at vores video vil hjælpe forskere til at forstå placenta anatomi, isolere MSC fra placenta, og foregribe den sandsynlige føtal eller maternel celle sammensætning af deres kulturer.
Acknowledgments
RP blev understøttet af en National Health og Medical Research Council (NHMRC) Postdoc Training Fellowship. VS blev understøttet af en University of Queensland International Postgraduate Student stipendium. MRD blev støttet af NHMRC og Inner Wheel Australien.
Vi takker klinisk og plejepersonale for at bistå i patient samtykke og prøvetagning. Vi takker Prof. Nickolas Fisk, Prof. Kerry Atkinson og Dr. Rohan Lourie for indsigtsfulde diskussioner i obstetrik, feto-placenta udvikling og placenta anatomi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| HBSS | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Long name: Hanks Balanced Salt Solution |
| FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
| trypsin-substitute | Gibco/Invitrogen | 12563-029 | Long name: TrypLE Select |
| DMEM-LG | Gibco/Invitrogen | 11885-092 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-Low Glucose |
| DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
| PBS (Mg+Ca+ free) | Gibco/Invitrogen | 14190-250 | Long name: Dulbecco's Phosphate buffered saline, magnesium and calcium free |
| Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
| paraformaldehyde powder or 4% solution | any | ||
| Collagenase I | Invitrogen | 17100-017 | 2,500 U/ml |
| Dnase I | Sigma | D5025 | 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | 10 mg/ml in water (20,000 U/ml). |
| Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables: | |||
| 50 ml centrifuge tubes | Falcon or any brand | ||
| petri dishes, sterile plactic (25 cm and 10 cm diameter) | Nunc | ||
| Cell strainers (100 μm) | Becton Dickinson | 352340 | |
| 175 and 75 cm2 (T175 and T75) tissue culture flasks | Nunc | ||
| 5 ml, 10 ml, 25 ml sterile serolgical pipettes | any brand | ||
| Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | |||
| tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Sterile scissors and tweezers | |||
| Tube racks | |||
| Pipette-boy or equivalent | |||
| Gilson type pipetters and sterile tips 1,000 µl, 200 µl, 20 µl. | |||
| rocking or shaking incubator (37 °C) | |||
| personal protective equipment | |||
| cleaning solutions (suitable for blood) | |||
| waste containers, correct disposal bins for tissue/blood | |||
| Reagents for MSC characterization | |||
| Antibody (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | Isotype |
| CD73 (AD2) | Miltenyi Biotec | 130-095-183 | Mouse IgG1 |
| CD105 (43A4E1) | Miltenyi Biotec | 130-094-941 | Mouse IgG1 |
| CD90/Thy-1 (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-403 | Mouse IgG1 |
| CD45 (5B1) | Miltenyi Biotec | 130-080-202 | Mouse IgG2a |
| CD34 (AC136) | Miltenyi Biotec | 130-090-954 | Mouse IgG2a |
| HLA-DR (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-298 | Mouse IgG2a |
| CD31 (PECAM-1) | BD Pharmingen | 555446 | Mouse IgG1 |
| CD146 (541-10B2) | Miltenyi Biotec | 130-092-849 | Mouse IgG1 |
| CD44 (DB105) | Miltenyi Biotec | 130-095-180 | Mouse IgG1 |
| Isotype Controls (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | |
| Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-214 | |
| Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-212 | |
| Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
| Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-091-837 | |
| Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-098-849 | |
| MACS Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Osteogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
| DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
| FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
| Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| β-Glycerol Phophate | Sigma | 50020 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | For calcium matrix staining |
| Adipogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
| DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
| FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
| Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
| insulin | Sigma | I2643 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378 | |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine | Sigma | I5879 | |
| Oil Red O solution | Sigma | O1391-250ML | For lipid vacuole staining |
| XY FISH kit to determine fetal or maternal origin of cells | |||
| XY chomosome FISH kit | Vysis (Abbott Molecular) | 07J20-050 | Long name: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Direct Labeled Fluorescent DNA Probe Kit |
References
- Brooke, G., et al. Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells. Semin Cell dev Biol. 18, 846-858 (2007).
- Wei, X., et al. Mesenchymal stem cells: a new trend for cell therapy. Acta Phamacol Sin. 34, 747-754 (2013).
- Ma, S., et al.
- Timmins, N. E., et al. Closed system isolation and scalable expansion of human placental mesenchymal stem cells. Biotechnol Bioeng. 109, 1817-1826 (2012).
- Barlow, S., et al. Comparison of human placenta- and bone marrow-derived multipotent mesenchymal stem cells. Stem Cell Dev. 17, 1095-1107 (2008).
- Jones, B. J., Brooke, G., Atkinson, K., McTaggart, S. J. Immunosuppression by placental indoleamine 2,3-dioxygenase: a role for mesenchymal stem cells. Placenta. 28, 1174-1181 (2007).
- Parolini, O., et al. Toward cell therapy using placenta-derived cells: disease mechanisms, cell biology, preclinical studies, and regulatory aspects at the round table. Stem Cell Dev. 19, 143-154 (2010).
- Benirschke, K., Burton, G. J., Baergen, R. N. Pathology of the Human Placenta. , 6 edn (2012).
- Moore, K., Persaud, T., Torchia, M. The developing human: clinically oriented embryology. , Elsevier/ Saunders. (2013).
- Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem cells. 26, 300-311 (2008).
- Brooke, G., et al. Manufacturing of human placenta-derived mesenchymal stem cells for clinical trials. Brit J Haematol. 144, 571-579 (2009).
- Pelekanos, R. A., et al. Intracellular trafficking and endocytosis of CXCR4 in fetal mesenchymal stem/stromal cells. BMC cell biology. 15, 15 (2014).
- Chen, Y. S., et al. Small molecule mesengenic induction of human induced pluripotent stem cells to generate mesenchymal stem/stromal cells. Stem Cells Transl Med. 1, 83-95 (2012).
- Heazlewood, C. F., et al. High incidence of contaminating maternal cell overgrowth in human placental mesenchymal stem/stromal cell cultures: a systematic review. Stem Cells Transl Med. 3, 1305-1311 (2014).
- Horn, P., Bork, S., Wagner, W. Standardized isolation of human mesenchymal stromal cells with red blood cell lysis. Methods Mol Biol. 698, 23-35 (2011).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol. 2, 83-92 (1974).
- Caplan, A. I.
- Futrega, K., et al. The microwell-mesh: A novel device and protocol for the high throughput manufacturing of cartilage microtissues. Biomaterials. 62, 1-12 (2015).
- Liu, Y., Goldberg, A. J., Dennis, J. E., Gronowicz, G. A., Kuhn, L. T. One-step derivation of mesenchymal stem cell (MSC)-like cells from human pluripotent stem cells on a fibrillar collagen coating. PloS one. 7, 33225 (2012).
- Maleki, M., Ghanbarvand, F., Reza Behvarz, M., Ejtemaei, M., Ghadirkhomi, E. Comparison of mesenchymal stem cell markers in multiple human adult stem cells. Int J Stem Cell. 7, 118-126 (2014).
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
- Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal stem cells: revisiting history, concepts, and assays. Cell stem cell. 2, 313-319 (2008).
- Bianco, P., et al. The meaning, the sense and the significance: translating the science of mesenchymal stem cells into medicine. Nature med. 19, 35-42 (2013).
- Da Silva Meirelles, L., Caplan, A. I., Nardi, N. B. In search of the in vivo identity of mesenchymal stem cells. Stem cells. 26, 2287-2299 (2008).
- Caplan, A. I., Correa, D. The MSC: an injury drugstore. Cell Stem Cell. 9, 11-15 (2011).
- Wegmeyer, H., et al. Mesenchymal Stromal Cell Characteristics Vary Depending on Their Origin. Stem Cell Dev. , (2013).
- Guillot, P. V., Gotherstrom, C., Chan, J., Kurata, H., Fisk, N. M. Human first-trimester fetal MSC express pluripotency markers and grow faster and have longer telomeres than adult MSC. Stem cells. 25, 646-654 (2007).
- Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hemol. 36, 642-654 (2008).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem cell res. 8, 58-73 (2012).
- da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P. C., Nardi, N. B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119, 2204-2213 (2006).
- James, A. W. Review of Signaling Pathways Governing MSC Osteogenic and Adipogenic Differentiation. Scientifica (Cairo). 2013, 684736 (2013).
- Xu, C., et al. Cross-Talking between PPAR and WNT Signaling and Its Regulation in Mesenchymal Stem Cell Differentiation. Curr Stem Cell Res Ther. , (2015).
- Zhuang, H., et al. Molecular Mechanisms of PPAR-gamma Governing MSC Osteogenic and Adipogenic Differentiation. Curr Stem Cell Res Ther. , (2015).
- Moore, K., Persaud, T., Torchia, M. Before We Are Born: Essentials of Embryology and Birth Defects. , Elsevier Health Sciences. 8 edn (2011).
- Zhu, Y., et al. Placental mesenchymal stem cells of fetal and maternal origins demonstrate different therapeutic potentials. Stem Cell Res Ther. 5, 48 (2014).
