Summary
Häri beskriver vi metoder för dissektion av foster och moderns vävnader från mänskliga placenta, följt av isolering och expansion av mesenkymala stamceller / stromaceller (MSC) från dessa vävnader.
Introduction
Mesenkymala stamceller / stromaceller (MSC) är på väg att bli en lovande kandidat för användning i cellbaserade terapier 1. De flesta program verkar rikta MSC-medierad vävnadsläkning eller immunreglering 2. I många av dessa tillämpningar kan allogen MSC vara lika effektivt som autolog MSC 3. Användningen av allogena MSC har den ekonomiska fördelen av att vara kompatibel med den storskaliga tillverkningen av flera celldoser från en enda källa vävnad 4 att behandla många patienter.
Historiskt sett har prekliniska och kliniska studier utnyttjade MSC-härledda från benmärgen 4. Benmärg är i allmänhet samlas från höftbenskammen hos en frivillig donator. Denna process är invasiva, och endast en liten volym av märg (~ 20 ml) uppsamlas genom en enda punktion. Generera kliniskt betydelsefulla antal MSC kräver omfattande i expansions vitro. Totipotent minskar med passagenummer
Moderkakan är en fetomaternal organ bestående av både foster och moderns vävnad 7, och därmed MSC foster eller moderdjuret kan vara teoretiskt, isolerad. Följande referenser ger detailed information om utvecklingen och patologi, samt mikroskopisk och makroskopisk undersökning av human placenta och närliggande organ 8,9. Moderkakan korrekt består till stor del av foster blodkärl och sekretoriska och stödja celler som kallas trofoblaster, som utgör de korionvilli omfattas av chorion frondosum (platta) 8. De grenade placenta villi badar i moderns blod levereras från livmoderspiral artärerna, som gör det möjligt näringsämne, hormon och gasutbyte mellan foster och moder. Moderkakan är förankrad i livmoderslemhinnan via moderns decidual stromaceller och foster extravillious trofoblaster varvas i extracellulärmatrix 8. Villi konvergera på fostrets chorionic plattan där de bildar navelsträngen 8.
Ett resultat av den första internationella workshop om Placental-Derived stamceller (2008) var en uppskattning av behovet av att standardisera isolering och characterization av celler från mänskligt placenta 10. På grund av anatomin av moderkakan, dissektion av olika vävnader, kan isolering av MSC och förväntade odlingsresultat vara överväldigande för nykomlingar på fältet. I detta protokoll, är skörden av placenta chorionic vävnader, följt av MSC isolering och expansion noggrant detaljerad. MSC karakterisering via flödescytometri och in vitro differentiering anses rutin 5,11-13, och därför endast kortfattat beskrivs här.
Som framhålls i en färsk systematisk litteraturöversikt 14 erhöll MSC från moderkakan korionvilli allmänhet antas vara foster. Även undersökte endast 18% av studierna ursprung MSC erhållna och av dem, bara hälften av studierna rapporterade foster MSC och den andra hälften rapporterade moderns eller blandade MSC populationer. Var och en av de tre vävnadskomponenter som beskrivs häri (chorionic villi, chorionic plattan och decidua basalis) är compSTÄNGD främst av den fetala membran / villi, och en liten andel av livmoderhärledda maternella celler, som sitter kvar på förlösta moderkakan. Vi tillhandahåller data som visar att isolera MSC från moderns sida av moderkakan, snarare än fostrets sidan av moderkakan, som vi tidigare har rapporterat 5,11, är en mer lämplig utgångsmaterial om modern MSC önskas. Detta protokoll beskriver också användningen av XY FISH att validera fetal eller maternell bidrag till cellkulturer. Även om detta är ett standardprotokoll från tillverkaren, är denna analys ofta försummas och dess betydelse underskattas 14.
Protocol
Den mänskliga forsknings etiska kommittéer på Mater Health Services, Kungliga Brisbane och kvinnors Hospital, Queensland University of Technology och University of Queensland godkände forskning och insamling av human placenta prover som används i studien. Alla protokoll följs nationella riktlinjer för forskning. Patienter förutsatt informerat skriftligt samtycke för användning av vävnad för forskningsändamål.
Tredje trimestern moderkakor erhölls från friska mödrar följande rutin kejsarsnitt (CS) födda på sikt från de ovan nämnda sjukhus i Brisbane, Australien. Manliga disharmoniska graviditeter för sikt prover användes i denna studie för att skilja foster från maternella celler. Foster kön hade bestämts av ultraljud före födseln och / eller visuell inspektion av det nyfödda barnet vid födseln av klinisk personal. X och Y kromosom fluorescens in situ hybridisering (FISH) användes för att ytterligare validera kön och fetalt eller moderdjuret av vävnad som bevarats frånursprungliga moderkakor.
1. Före skörd, Förbered Efter
Obs: När du gör upp enzymlösningar, bör de särskilda kraven och koncentrationer som tillhandahålls av tillverkaren för varje produkt följas. Enzymer tillhandahålls ofta som en rå blandning av proteiner, därför liknande enzymer från olika företag kommer sannolikt att ha olika aktiviteter / koncentrationer. Av denna anledning bör erkännas tillverkarens råd och lösning förberedelse kan behöva ändras i enlighet därmed.
- Förbereda eller köpa 1,5-2 L total steril Hanks balanserade saltlösning (HBSS) för detta protokoll.
- Förbereda kollagenas I stamlösning genom att väga upp kollagenas typ I och lösa upp 1 mg / ml i HBSS och vortexa försiktigt för att säkerställa fullständig upplösning. Bestämma volymen av HBSS (innehållande kalcium och magnesium) som krävs för att bringa kollagenaslösning till 100 enheter (U) / | il (1,000x stamlösning) och filtrera därefter genom en 0,2 &# 181; m sprutfilter. Alikvot 1 ml volymer till 1,5 ml rör och förvaras vid -20 ° C tills de behövdes.
- Förbereda dispas förrådslösning genom upplösning av icke-steril dispas vid 10 mg / ml i Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) utan kalcium eller magnesium. Ytterligare späda med DPBS utan kalcium eller magnesium till en slutlig koncentration av 2,4 U / ml. Filtrera sterilisera genom ett 0,2 | im sprutfilter. Alikvoter om 1 ml volymer i 1,5 ml rör och förvaras vid -20 ° C tills de behövdes.
- Förbereda deoxiribonukleas (DNas) -I förrådslösning genom upplösning av DNas-I vid 10 mg / ml i 0,15 M NaCl. Filtrera thorugh ett 0,2 | im sprutfilter. Alikvoter om 1 ml volymer i 1,5 ml rör och förvaras vid -20 ° C tills de behövdes.
- Förbered verksamt matsmältningen lösning genom att kombinera 100 U / ml kollagenas typ I, I.5 pg / ml DNas I och 2,4 U / ml dispas i serumfritt DMEM. Färskt tina och späd enzymlager omedelbart före användning. Ca, en 1: 1 förhållande av uppslutningslösningenvolym till vävnadsvolym krävs (t.ex. 10 ml vävnad, mätt i en 50 ml rör, kräver 10 ml uppslutningslösning).
- Bered en lösning av 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS och justera till pH 7,4 15. Store 25 ml-alikvoter vid -20 ° C för lång sikt eller vid 4 ° C under en vecka.
- Förbereda MSC odlingsmedium från DMEM-Low Glucose (DMEM-LG) supplementerat med 1x antibiotikum och antimykotika-lösning och 10% icke-värmeinaktiverat fetalt bovint serum. MSC-grade FBS kan köpas från många FBS leverantörer.
- Autoklav sterilisera dissektion utrustning i förväg enligt institutionens riktlinjer. Dessa inkluderar sax, pincett, skalpeller och en stor metall dissektion facket. Samla in ytterligare steril vävnadsodling plasten och förbrukningsartiklar (t.ex. skalpellblad, 50 ml och 15 ml rör, 25 ml, 10 ml och 5 ml pipetter och 75 eller 175 cm 2 cellodlingsflaskor).
- Använd standard primär cellodling laboratorieutrustning: en klass IIbiosafety skåp lämplig för primära cellisolering, cellodling inkubator inställd på 5% CO2 och 37 ° C, en rocker i en 37 ° C inkubator och en centrifug med en kapacitet för 50 ml rör.
- Använd lämplig personlig skyddsutrustning: en laboratorierock, 2 par handskar (hela tiden), skyddsglasögon och nära toed skor enligt institutionens riktlinjer.
- Utarbeta lämpliga saneringslösningar för humana blodprover som per institutionella riktlinjer och flytande biologiskt avfall i förväg.
2. Isolering av placenta MSC
- Framställning av Placenta
- Klä sig i önskad personlig skyddsutrustning. Ställa in biologiska säkerhetsskåp med erforderliga material, lösningar och avfallsbehållare för att utföra förfarandet fram till den enzymatiska digestion (avsnitt 2.5.6).
- Skaffa en moderkaka med informerat samtycke och etisk godkännande. Samla moderkakan via kejsarsnitt sektion under aseptiska kirurgiska förhållanden, och paket i en steril påse eller hink för transport till laboratoriet.
- Under transport och före dissektion, lagra moderkakan vid rumstemperatur eller 4 ° C.
Notera: Vävnad kan förvaras i upp till 6 h utan att påverka cellodlingsprestanda.- Begränsa den tid mellan moderkakan insamling och vävnadsbehandling där så är möjligt. Denna rekommendation är baserad på praktiska frågor. I vissa fall har vi fördröjd cellisoleringsprocessen i upp till 6 h efter födseln. I dessa fall moderkakor har hållits vid rumstemperatur eller 4 ° C (i labbet eller på uppsamlingscentral). Inga detekterbara skillnader observerades, ovanstående allmänna givar variation, i MSC erhållna från moderkakor när de vid 4 ° C eller vid rumstemperatur förvarades.
- Placera behållaren med moderkakan i den biologiska säkerhetsskåp. Öppna behållaren och överföra moderkakan i en steril bricka.
- Fäll ut fosterhinnorna (fostersäcken eller amnion-chorionic laeve) 8. Bli orienterade med de delar av moderkakan. Fostrets sidan har navelsträngen införing, som är i allmänhet centralt insatt i moderkakan. Mödernet (fodrad med decidua basalis), som är motsatt den fetala sidan, har uppenbara hjärtblad (eller lober).
- Till att börja dissektion, orientera moderkakan med navelsträngen uppåt i den sterila facket.
Obs: Detta protokoll är utformad för att ge tillräckligt med celler för att utsäde i en T175 kolv från vart och ett av de tre vävnadstyper. Varje Digest börjar med cirka 10 g vävnad. Detta är en liknande start antal flaskor som MSC kulturer initieras från en 20 ml benmärgsaspirat. Om fler celler önskas, då mer vävnad kan skördas och protokollet kan skalas linjärt. Storleken på vävnad som skördas är bara ett tecken på vad som är praktiskt med moderkakan vävnad. Det finns få defining funktioner i moderkakan villi, som kan användas som en referenspunkt. De angivna måtten fungera som en uppskattning och navelsträngen används som ett landmärke på fostrets yta.
- Dissektion av decidual (D) Vävnad
- Vänd moderkakan över så moderns yta (decidua basalis) är vänd uppåt. Se till att fostrets sida med navelsträngen insättningspunkten är vänd nedåt.
- Skär bitar av 0,5 cm tjocklek från moderns sida av moderkakan (innehållande decidua basalis vävnad).
- Placera vävnadsbitar i en petriskål med HBSS under dissekering för att hålla vävnaden bitar hydrerad.
- Överföra tillräcklig vävnad för att fylla ett rör upp till 10 ml-märket i ett 50 ml rör (detta är cirka 10 g vävnad).
- Dissektion av Chorionic Plate (CP) Vävnad
- Mekaniskt bort av fosterhinnan från fostrets ytan av moderkakan (inte fostersäcken), lämnar chorionic frondosum (chorionic plattan) intakt.
- Skär bitar ~ 1 cm bred och 0,5 cm djup från chorionic plattan. Skörda chorionic plattan från området närmast navelsträngen, bort från kanten av moderkakan.
- Placera vävnadsbitar i en petriskål med HBSS under dissekering för att hålla dem hydratiserade.
- Överföra tillräcklig vävnad för att fylla en 50 ml rör upp till 10 ml-märket (~ 10 g vävnad).
- Dissektion av korionvilli (CV) Vävnad
- Dissekera CV vävnad ~ 1 cm 2 x 0,5-1 cm djup från placental vävnad där CP har redan tagits bort. Återigen, skörd CV från området närmast navelsträngen, bort från kanten av moderkakan. Försök att stanna minst 1 cm från moderns sida av moderkakan (innehållande decidua basalis vävnad); Målet är att skörda vävnad från det inre av placenta villi vävnad.
- Placera vävnadsbitar i en petriskål med HBSS under disseInsatser för att hålla dem hydratiserade.
- Överföra tillräcklig vävnad för att fylla en 50 ml rör upp till 10 ml-märket (~ 10 g vävnad).
- Malning och enzymatisk nedbrytning av D, CP, och CV Placental Vävnader
- Eftersom det finns ~ 10 g D, CP eller CV vävnader i tre olika 50 ml rör, fylla varje rör med ca 40 ml HBSS och upprepade gånger vända på röret för att tvätta vävnaden (upprepa för ~ 10 sek).
- Dekantera supernatanten och upprepa denna tvättsteg 2-3 gånger tills lösningen är i stort sett fri från blod. Använd en 10 ml pipett eller långa pincett för att garantera vävnaden bitar inte går förlorade ut ur röret (n) när dekantering av supernatanten.
- Återgå vävnadsbitar till en 10 cm petriskål med minimal vätsketransport. Chop / finhacka vävnaden i fina bitar av cirka 1-5 mm 3 med sax eller rakblad.
- Överför det malda vävnaden tillbaka till lämpligt märkt (D, CP eller CV) 50 ml rör.
- Lägga färsk prepared smälta media i åtminstone en 1: 1-förhållande med vävnaden (t.ex. 10 ml av vävnad plus 10 ml av uppslutnings media). Sätt tillbaka locket på varje rör och invertera rören flera gånger för att blanda.
- Inkubera vävnaderna i rören med smälta media under 1-2 timmar vid 37 ° C. En fuktad atmosfär och 5% CO2 är inte nödvändiga för detta steg.
Notera: Rapid skakning krävs för att effektivt kunna dissociera cellerna från vävnaden och maximera MSC utbyte. Begränsad avkastning kommer att framgå av mycket få celler knutna till odlingskolven vid 48 timmar och en första passage längre än 1-2 veckor. Inkubationstiden och skakning metod är beroende av den 37 ° C inkubator tillgängliga i laboratoriet och kan kräva optimering.- För en inkubator med en snabb och styrbar skakmekanism, plats vävnad och smälta medium i ett 50 ml rör eller steril konisk kolv, placera i inkubator och ställa skakhastigheten till 250 rpm. Detta kommer att resultera i en fullständig digerering avvävnaden i en timme.
- Alternativt, för en inkubator med en försiktig skakning eller ingen gungmekanism, skaka manuellt röret snabbt och kraftfullt för hand i 10 sekunder var 30 min för 1,5-2 timmar. Enzymet Inkubationstiden är en lämplig tid att göra sig av avfall, rensa biosäkerhet skåpet av onödiga saker, byta laboratorierock om nedsmutsade och förbereda för nästa del av förfarandet.
- Insamling av mononukleära celler och plätering i Kolvar
Obs: Från föregående steg, finns det tre 50 ml rör (D, CP eller CV) med smälta vävnadsbitar. När vävnaden uppslutningslösningen utvecklas en grumligt utseende och vita blodkärlen är uppenbara i vävnaden, är matsmältningen komplett.- Tillsätts 30 ml MSC medium innehållande FBS till varje rör för att inaktivera de enzymer som finns i uppslutningslösningen.
- Att separera mononukleära celler från stora osmält skräp, Pulscentrifugera 50 ml rör. Kortfattat, tillåtacentrifugen att nå 340 x g i 5 sekunder och sedan stanna. Detta kommer att tvinga stora skräp för att pelletera på botten av röret, medan de mononukleära cellerna i flytande suspension.
Obs: De mononukleära cellerna blir kvar i vätskefasen om röret är endast kortfattat (pulsad) centrifugeras. Om centrifugering förlängs, kommer de mononukleära cellerna också pelle vid botten av röret med vävnaden bitar, vilket resulterar i oönskad cellförlust. - Samla in supernatanten, innehållande de mononukleära cellerna, och överföra denna till en ny 50 ml rör med en pipett.
- Tillsätt 30 ml av media eller HBSS till den kvarvarande placental vävnad skräp och skaka kraftigt. Detta kommer att ge kvarvarande fristående mononukleära celler i suspension och möjliggöra en andra skörd av förmodade MSC från vävnaden.
- Pulscentrifugera röret en andra gång, och återigen överföra supernatanten till ett nytt 50 ml rör. Upprepa detta steg en tredje gång för att maximera effektiviteten samlingav mononukleära celler från varje vävnadskälla.
- Pool supernatanterna från var och en av de individuella vävnadstyper i två 50 ml rör. Detta kommer att ge 6 rör totalt (2 rör av varje D, CP och CV). Centrifugera varje rör i 5 minuter vid 340 x g. Detta steg kommer att pelletera de mononukleära cellerna till botten av rören.
- Dekantera försiktigt eller pipett bort supernatanten i avfallet. Det är onödigt att försöka eliminera varje droppe supernatant.
Notera: Cellpelleten kommer att vara sköra på grund av ett stort antal röda blodkroppar. Var noga med att inte av misstag kasta pelleten om du dekantering direkt från 50 ml rör. - Efter avlägsnande av det mesta av supernatanten, knacka försiktigt på röret flera gånger med ett finger för att driva bort cellpelleten. Kombinera de pellets, så att det finns ett enda rör för varje D, CP eller CV vävnad och återsuspendera var och en i 35 ml MSC medium.
- Valfritt: Filtrera mononukleära fraktionen genom en 100 pm maskcell sil in up i ett 50 ml rör för avlägsnande av cellklumpar eller fibröst material.
Anmärkning: Care krävs eftersom filtren lätt kan täppa upp och över-fyllning. Dessutom kan luftbubblor hindra filter från dränering. Om detta inträffar långsamt lyfta filtret ut ur röret för att tillåta luft att strömma under filtret, tvätta filtret igenom med cellodlingsmedia eller utbyte till ett nytt filter. Exklusive filtreringssteget verkar inte ändra avkastning eller kvalitet av de efterföljande MSC kulturer.- Eventuellt kan en röd blodkropp (RBC) lys eller densitetsgradientcentrifugering utföras i detta skede 15. Men är vår erfarenhet att RBC inte stör MSC fäste eller spridning och därför RBC lys är inte nödvändigt. Mononukleära celler kunde räknas i detta steg om RBC avlägsnande genomfördes 15. Även om, kommer den stora majoriteten av celler på detta stadium inte är MSC, men var fetala ursprungs trofoblaster, endotelceller och hematopoetiska celler, liksom mainterna ursprung hematopoietiska celler och decidual stromaceller.
- Överför cellsuspensionen för varje D, CP eller CV vävnad till en enda T175-kolv och odling i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- Post Isolation-cell Expansion
- Vid 48 timmar efter den initiala isoleringen, avlägsna mediet från vardera av kolvarna (D, CP och CV) och ersätt med 35 ml färskt MSC media. Det förbrukade mediet och lösgjorda celler kan kastas, som förmodade MSC antas vara fäst på vävnadsodlingskolv 16. Retur kolvar till inkubatorn under ytterligare 24 h.
- Efter ytterligare 24 h av odling, tvätta flaskorna två gånger med DPBS (25 ml) för att avlägsna skräp och RBK. Snurra vätskan runt botten av kolven för att driva bort de röda blodkropparna. Använd en pipett för att ta bort vätska och skräp. Tillsätt 35 ml MSC medium till kolvarna och återgå kolvarna till inkubatorn.
- Byt media två gånger per vecka, och icubate kulturer tills cellmono är 80- 90% sammanflytande. Denna initiala expansionen tar 4-14 dagar, beroende på kvaliteten av vävnaden, mängd utgångsmaterial och effektivitet och tid för inkubation med uppslutningslösningen.
3. subkultur av pMSCs
- När kulturer är 80-90% sammanflytande, tvätta två gånger med 20 ml 1x HBSS eller DPBS och kasta tvättar. Lägg trypsin-substitut till varje kolv (dvs använda 5 ml för en T175 kolv).
- Inkubera kolvarna under 5 min vid 37 ° C för att frigöra MSC från vävnadsodlingsytan. Peka på kolvens sidor varje ~ 2 min för att underlätta lösgöring.
- När cellerna lossnat från ytan och i en enda cellsuspension, tvätta cellerna från kolven med MSC medium och samla upp cellerna i rör. MSC media kommer att späda ut och inaktivera trypsin-substitut (använd ~ 15 ml MSC media per T175 kolv).
- Överför innehållet i varje vävnadsodlingskolv till en 50ml rör.
- Centrifugera rören vid 340 xg under 5 min för att pelletera cellerna.
- Kassera supernatanten och resuspendera cellpelletarna i 1 ml av MSC medium.
- Späd 10 pl av cellsuspensionen i 10 fil trypanblått. Räkna celler med användning av en hemocytometer och beräkna det totala antalet celler 15.
- Överför celler till nya flaskor vid 1.150 celler / cm2 i färskt MSC media och inkubera i en vävnadsodlingsinkubator. Vid denna såddtäthet, utsäde 200.000 MSC i varje ny T175 kolv i 35 ml MSC media. Mata cellerna två gånger per vecka fram till 80-90% sammanflytande. Seed efterföljande passager vid 1150 celler / cm2 eller 200.000 MSC i varje T175-kolv.
- När passagen 1 (P1) eller P2 celler konfluenta, cryopreserve majoriteten av celler för framtida användning, och reseed endast en T175-kolv för ytterligare förökning och karakterisering. De förökade celler kan användas vid P3 eller P4 för mesodermalt differentieringsanalyser och cellkarakterisering via flow cytometry.
Notera: I tidiga passager, kan det finnas mycket få glest separerade kolonier, men den lokala celltätheten inom varje koloni kan vara mycket hög. Detta är inte idealiskt, eftersom den lokala täta packningen av cellerna kommer att resultera i kontakthämning, fördröja tillväxten och minska odlings prestanda. Vi rekommenderar när täta kolonier observeras, bör cellerna skördas och såddes i en ny kolv. Denna omfördelning process ger celler med plats för att föröka sig och övergripande kultur prestanda kommer att förbättras. - Att cryopreserve MSC, samla ~ 1 x 10 6 celler i 1 ml av 90% FCS och 10% dimetylsulfoxid (DMSO) och frysa användning av standardprotokoll.
Obs: I resultatet avsnittet representant, finns beskrivningar av MSC karakterisering med hjälp av flödescytometri, mesodermal differentiering och XY FISH-analys för att bestämma kön tre olika (D, CP och CV) expanderade cellpopulationer. I vår studie, moderkakor var från manliga spädbarn; således allafetala celler kan särskiljas som manliga (Y-kromosom) och alla maternella celler kunde (endast X-kromosom) urskiljas som hona.
Representative Results
Placenta MSC isoleringsförfarandet sammanfattas i Figur 1. De tre områden på placenta anatomi som MSC isolerades markeras i figur 2. Dessa är moderns decidua, liksom i stort sett fetala vävnader i chorionic plattan och korionvilli. Många läroböcker, artiklar och online-resurser detalj utveckling och funktionell roll de olika moderkakan vävnader (se referens 8).
Morfologin hos kulturerna 48 h efter isolering och avlägsnande av vävnadsrester.
Efter 48 timmar av kultur, kommer MSC har fäst till vävnadsodlingsplast, medan de röda blodkropparna och de flesta andra cellulära skräp inte kommer att ha fäst. Vid denna tidpunkt, måste mediet ersättas med 35 ml färskt odlingsmedium. Före denna mediumutbyte, är det svårt att göra exakta observationer på grund av denett stort antal röda blodkropparna, vilket hindrar visuell bedömning. Utseendet på odlingssupernatanten kan variera avsevärt mellan placenta givare. Denna variation kan ses visuellt i exempel 1 och 2 (figur 3A). Dessa två MSC isoleringar, som föreföll vara mycket annorlunda, utfördes samtidigt från två olika moderkakor. Men när tvättas, verkade båda kulturerna likartade (se tvättas exempel 3, figur 3A).
Under ett mikroskop, efter 48 tim media utbyte, endast ett fåtal celler kommer att knytas till kolven (figur 3B), och cellerna kommer att visas avsevärt skiljer sig från mer utförligt expanderade MSCs. Vissa skräp och de röda blodkropparna kommer att synas som flytande eller bifogade klumpar och dessa kommer inte att störa tillväxten av MSC. De längre fibroblastceller vidhäftade till botten av kolven kommer sannolikt att vara en blandning av celler, inklusive MSC, hematopoetisk,trofoblastisk eller endotelceller. Återigen, de icke-MSC-celler inte äventyra MSC kulturer, eftersom dessa celler inte kommer i allmänhet att överleva mer än 1-2 passager i MSC odlingsbetingelser. Trots viss variation i den inledande utseende av kulturer, de efterföljande expansions resultaten är i allmänhet konsekvent.
Morfologi MSC kulturer över tiden.
I detta representativa exempel sju dagar efter isolering, små fibroblastiska MSC kolonier var synliga, även om icke-MSC-celler också kan ses som runda eller löst bundna celler (Figur 4A). De bifogade cellerna vad som ursprungligen kallas en "kolonienhet bildar -fibroblast "(CFU-F) 17 och senare kallas MSC 18. Tretton dagar efter isolering, fibroblastiska MSC kolonier var stor (figur 4B). I allmänhet kommer monoskiktet vara 80-90% konfluenta vid denna punkt och cellerna bör vara passa ged. Från passagen 2 och framåt, kommer placenta MSC mono utveckla den karakteristiska bubbelpool liknande morfologi vid sammanflödet (Figur 4C). Såvida cellerna passe vid låg densitet, kommer CFU-F bildning inte längre iakttas. Vid låg densitet, placenta-härlett MSC har en mindre, kvadrerare utseende än adult benmärg-härledda MSC 1. Medan placenta-härlett MSC och benmärgshärledda MSC uppvisa liknande förökningshastigheter, moderkakan härledda celler är mindre benägna till snabb senescens 5.
Karakterisering av placenta MSC in vitro.
Varje expanderade cellpopulationen måste karakteriseras så att den överensstämmer med standard MSC kriterierna 16, inklusive (1) plast vidhäftning (2) närvaron av mesenkymala ytmarkörer och frånvaron av hematopoietiska ytmarkörer, och (3) förmågan att genomgå mesodermal differentiering.
Såsom visas i fig 4, MSCs i odling är plast vidhäftande och har en fibroblastisk liknande morfologi; Detta bekräftar att cellerna uppfyller det första kriteriet som definierar MSC 16.
Placental MSC display mesenkymala ytmarkörer.
Den andra definiera MSC kännetecken är förekomsten av mesenkymala ytmarkörer och frånvaron av hematopoietiska ytmarkörer 16. Eftersom det inte finns någon enskild markör kan definitivt identifiera en MSC, är paneler av markörer i allmänhet används i samband med flödescytometri analys för att identifiera celler som mesenkymala, men inte hematopoetisk. I den representativa datamängden ges här (figur 5A), utvärderade vi celluttryck av mesenkymala markörer CD73, CD105, CD90, CD146 och CD44, de hematopoetiska markörer CD45 och CD34 och HLA-DR, som well som endotel markör CD31. Alla antikroppar som används i denna placenta MSC karakteriseringsprocessen listas i tabellen för material / utrustning. Färgning utfördes enligt tillverkarens instruktioner, med analysmetoder som beskrivs här 19.
Cellerna var positivt för mesenkymala markörer CD73, CD105, CD44, och negativa för cellytmarkörer CD45, CD34, HLA-DR och CD31, som förväntat 5,20. Ungefär var 37% och 57% av celler i vår representant datauppsättning positiv för CD90 och CD146 21, respektive. Både CD90 och CD146 läses allmänt MSC markörer 21. MSC cellytmarkör profiler kan vara olika beroende på MSC vävnadskälla, mediumsammansättning, eller passage nummer 22. I vår mångåriga erfarenhet har vi inte observerat långsiktig förorening av placenta-härlett MSC med icke-mesenkymala celler efter 1-2 passages 5,11.
Placental MSC display mesenkymala differentieringspotential
Definitionsmässigt måste MSC ha in vitro mesodermal differentieringskapacitet 5,13. Mesodermal differentiering potential vanligen bedömas genom antingen tri- eller bi-härstamning differentiering analyser. Bi-härstamning analyser bedöma vanligtvis osteogen och adipogena differentiering kapacitet, medan tri-härstamning analyser dessutom bedöma kondrogena differentieringskapacitet. I representativa resultat som presenteras här visar vi att de expanderade MSC populationer bildar både kalkavlagringar, som tyder på osteogen differentiering, och lipid vakuoler, tyder på adipogenes (Figur 5B).
Att karakterisera MSC populationer som rapporteras här, ympades vi celler i 24 odlingsbrunnar vid 6 x 10 4 celler i 1 ml induktionsmedium. Mediet komponenter listas i tabellen för material / utrustning. Medan induktionsmedel formuleringar är vanliga i litteraturen, det finns en stor variation i publicerade formuleringar. Av denna anledning listar vi kort våra induktionsmediet formuleringar och färgningsmetoder här. Osteogen induktionsmedium innehöll DMEM-HG, 10% FBS, 1x antibiotisk antimykotisk lösning, 10 mM β-glycerol fosfat, 100 nM dexametason, och 50 ^ M L-askorbinsyra 2-fosfat. Adipogena induktionsmedium innehöll DMEM-HG, 10% FBS, 1x antibiotisk antimykotisk lösning, 10 | j, g / ml insulin, 100 nM dexametason, 200 ^ M indometacin och 500 pM 3-isobutyl-1-metyl xantin. Här, var kulturer upprätthölls i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator och odlades under 14 dagar. Induktionsmedium byttes två gånger per vecka under odlingsperioden. Efter 14 dagar induktion, var kulturer karakteriseras antingen benliknande matris (osteogenes) eller lipid vakuoler (adipogenes) enligt vår föregåendeious publikation 5. Osteogen kalciummatrixdeposition analys uppnåddes genom att först aspirera bort mediet, fastställande av kulturer med 4% paraformaldehyd under 20 min, tvättning av monoskiktet med DPBS och därefter färgning med Alizarin Red S enligt tillverkarens instruktioner. Adipogena induktion bedömdes genom aspirering av mediet, fastställande av kulturer med 4% paraformaldehyd under 20 min, tvättning av monoskiktet, och färgning med Oil Red O lösning enligt tillverkarens instruktioner. Färgade kalkavlagringar och olje vakuoler sedan visualiseras i ljusmikroskop, och bilderna sparas för framtida referens.
I tidigare publikationer har vi karaktäriserat differentieringspotential placenta härrörande MSC större utsträckning 4,5. Placenta-härledd MSC osteogenes liknar benmärgshärledda MSC, medan adipogenes är i allmänhet mindre effektiva i placenta-härlett MSC 5 </ Sup>. Vi inte rutinmässigt utför kondrogen differentiering av flera skäl, även om detta har tidigare rapporterats av oss för placenta-MSC 5. För det första, medan mesodermalt differentieringskapaciteten är ett kännetecken för MSC, är det sannolikt av underordnad betydelse 23-25, i synnerhet när den terapeutiska nyttan härledas från MSC parakrina utsöndringar 26. För det andra, även om Dominici et al. Föreslog minimala kriterier för klinisk produktion av humant vuxen benmärg-härledda MSC 16, senare studier indikerar MSC från olika nischer har olika inneboende egenskaper och differentieringskapacitet 5,13,27-32. I själva verket, Parolini et al. Föreslog att placenta-härlett MSC bör differentiera till "en eller flera mesodermala" härstamningar snarare än alla tre härstamningar 10. Slutligen, många MSC studier utesluta kondrogen differentiering som sker genom ett liknandeintracellulär signalväg som osteogenes (TGF familjen väg) 33-35.
Placental MSC är maternal ursprung med användning av denna metod för odling, trots den anatomiska placeringen av utgångsmaterialet.
Många publikationer antar att celler isolerade från foster chorion avkastningen foster MSC på kultur 14. Men som vi tidigare 5 har rapporterats, alla kulturer härledda från fetal chorion, med hjälp av detta protokoll, snabbt blir berikad för moderns MSC som skulle intuitivt kan förväntas för moderns decidual MSC kulturer. I dessa representativa resultat använde vi placental vävnad från manliga spädbarn så att det var möjligt att enkelt beskriva fostrets och moderns cell bidrag i det expanderade cellpopulationer. För dessa studier använde vi XY FISH kit som anges i tabellen för material / utrustning, och följde tillverkarens instruktioner.
(figur 6) . Genom passage 2, de cellpopulationer härledda från de maternella vävnaderna var ~ 100% maternella celler (XX), och fetala celler (XY) var omöjlig att upptäcka. Detta tyder på att fysisk dissektion av moderns vävnad ledde till att berika maternella celler i de efterföljande kulturer. Emellertid är det viktigt att överväga de odlingsresultaten från fostrets chorionic villi och chorionic platt härledda kulturer. Vid passage 0, både fetal korionvilli och chorionic plattan härledda kulturer var ~ 85% XY, eller foster ursprung, vilket tyder på att riktade dissektion anrikat för fetala celler (Figur 6). Vid passage 0, båda kulturerna innehöll ~ 15% moderns cell (XX) kontaminering. Överraskande, vid passage 2, båda foster kulturer befolkade med ~ 100% maternella celler (XX) och fosterceller (XY)var inte längre detekterbar. XY FISH-analys visar att maternella celler (XX kromosomer) snabbt och konsekvent övertagande kulturer som härrör från foster chorionic vävnader. Detta är en kritisk kultur iakttagelse som ofta förbises 5. Detaljerna i denna analys ingår i detta protokoll, eftersom det visar på mycket viktig iakttagelse som maternella celler fylla snabbt alla kulturer när DMEM kompletterat med 10% FBS användes utan ytterligare faktorer för att stödja fostrets härrörande populationer.
Figur 1:. Sammanfattning av placenta-MSC isoleringsförfarande (Steg 1) orientera sig med moderkakan anatomi. (Steg 2) manuellt dissekera 10 g vävnad från antingen decidua, korionvilli eller chorionic plattan med hjälp av en sax. (Steg 3) Mince tHan dissekerade delar av decidua, chorionic villi eller chorionic plattan vävnader i fina bitar med sax eller en skalpell.
(Steg 4) Liberate celler från de fina bitar via en 2/1 hr digestion i dispas och kollagenas I.
(Steg 5) separera cellerna från den fibrösa vävnaden genom pulscentrifugering och / eller tvätta dem genom ett cellfilter. Samla och resuspendera cellerna i odlingsmedium och placerades i odlingsflaskor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Mesenkymala stromaceller (MSC) kommer att väljas baserat på deras benägenhet för plast vidhäftning och förmåga att överleva och föröka sig i odlingsmediet. Slutligen, i resultatdelen, den expanderade MSC kan karakteriseras och lagras för användning i framtida experiment.
Figur 2:. Anatomy av termen moderkakan och vävnader mänskliga isolerade i detta förfarande Den första vävnad som skördas är moderns decidua. Decidua är vävnad som blir kvar som ett tunt skikt på ytan av moderkakan efter att den utgjuts från livmoderväggen (decidua identifieras av de gröna markörer). Den andra vävnad som kommer att skördas från det inre av moderkakan är det fetala korionvilli (blå markörer). Den tredje vävnad som skördas är foster chorionic plattan (röda markörer) (anpassad från referens 36). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Morfologi av kulturer 48 h efter isolering och reflytta vävnadsrester. (A) utseende odlingssupernatanten kan variera kraftigt mellan placenta givare innan tvätta bort skräpet. Exempel kulturer 1 och 2 visar denna variation. Dessa två isoleringar utfördes samtidigt, men från två olika moderkakor. När tvättade kulturer kommer att framgå av de röda blodkropparna och vävnadsrester som visas i exempel 3. De efterföljande expansions resultaten är i allmänhet konsekvent. (B) Efter 48 h medie utbyte kommer endast ett fåtal celler fästas till kolven. Skalstreck = 200 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Morfologi MSC kulturer över tiden (A) Sju dagar efter isolering, små fibroblastic MSC kolonier är synliga även icke-MSC-celler kommer också att vara närvarande som runda eller löst bundna celler. (B) 13 dagar efter isolering, fibroblastiska MSC kolonier är stora och ofta monolager av MSC är sammanflytande och redo att passagen. (C) från passagen 2 och framåt, kommer MSC monoskiktet utveckla en karakteristisk bubbelliknande morfologi vid konfluens. Skalstreck = 200 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. MSC karakterisering genom flödescytometri och mesodermal differentiering (A) The placental korionvilli härledda MSC visa en klassisk MSC markör profil med flödescytometri analys, även om för dessa cellytmarkörer, expressionen är liknande för alla typer av humana MSC. Varje histogram visar signalintensitet (x-axel) mot den normaliserade celltal på y-axeln (% av max). I detta representativa uppgifter som var cellerna positiva för CD73, CD105 och CD44 och negativ för de hematopoietiska markörerna CD45 och CD34 och HLA-DR. (B) Placental MSC genomgår generellt robust osteogen differentiering, dock (C) adipogena differentiering kan vara mindre effektiv än med benmärgshärledda MSC. Bilder i bildtexter B och C togs vid 40X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Placental MSC är maternal ursprung med användning av denna metod för odling, trots den anatomiska placeringen av utgångsmaterialet.Diagrammen visar kvantifiering av fostrets (hane, XY) och moderns (hona, XX) cellkomposition av moderkakan MSC kulturer isolerade från decidual, chorionic villi och chorionic tallrik vävnader vid varannan passage. Maternella celler (XX) snabbt och reproducerbart överta kulturer härledda från fetala chorionic vävnader. Fetal = hane = XY kromosomer upptäckts i en enskild cell, moderns = kvinnliga = XX kromosomer upptäckts i en enskild cell. Data som presenteras här var från N = 3 oberoende givarmoderkakor från manliga spädbarn, med ett minimum av 100 celler färgade för XY FISH och räknas för varje datapunkt. Staplar representerar medelvärden och felstaplar återspeglar en standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Moderkakan är en fysiskt stor fetomaternal organ, som foster eller moderns MSC kan isoleras 22. Häri vi en detaljerad översikt över placenta anatomi och instruktioner om hur man specifikt dissekera decidua (moderns), chorionic villi (fetalt), och chorionic plattan (foster) vävnad (steg från 2,2 till 2,4). Därefter redogjorde vi en robust protokoll som gör det möjligt för MSC isolering från vart och ett av dessa tre vävnader (Steg 2,5-2,6). Placental MSC expansion är effektiv och kulturer likna härledd från benmärg MSC kulturer (figurerna 3 och 4). Osteogen differentiering är tillförlitlig (Figur 5B), medan adipogena differentiering är i allmänhet mindre effektiv (Figur 5C) 5.
Många nykomlingar till området kommer att förutsätta att kulturer härledda från fetal korionvilli eller chorionic platt vävnader kommer att berikas för foster MSC. Men i våra händer fetal cell anrikning är bara övergående när standard MSC expansionsmedium såsom DMEM-LG + 10% FBS utnyttjas 5. Här ger vi representativa resultat med hjälp av moderkakan vävnad som härrör från en manlig bebis. Genom att använda placenta vävnad från en manlig bebis, de fetala cellerna är lätt identifierbart ha XY kromosomer, medan maternella celler kan identifieras som har XX kromosomer. Figur 6 visar XY FISH resultat för en representativ kultur. Medan fetalt MSC (XY) är anrikade (upp till 80%) i de initiala kulturerna härledda från fetal korionvilli eller chorionic platt vävnader, är dessa samma kulturer snabbt overtaken (~ 100%) genom maternell (XX) MSC över de två första passager . I standardmedium sammansatt av DMEM-LG + 10% FBS, de få maternal härledda MSC som förorenar de fetala vävnader konkurrerar ut de fetala härledda celler i kultur.
Ett kritiskt steg som beskrivs i detta protokoll är en uppskattning av placenta anatomi och varifrån fosteroch maternell vävnad kan mest effektivt skördas. Som beskrivs i avsnittet Resultat företrädaren, dissektion av fostervävnad gör det möjligt gående anrikning för foster härrörande MSC. Förbättringar i expansionsmediumformulering, genom specifik exogen tillväxtfaktor mediet tillskott bör tillåta selektiv expansion av fetala härrörande MSC populationer, och tillverka en cellprodukt som är berikad för foster snarare än maternella celler (vår grupp utvecklar för närvarande sådana medel formuleringar). Tillverkningen av fetala MSC populationer kan ha ett antal fördelar, såsom fetalt MSC är påstås ha större angiogenes och immunsuppressiva egenskaper än motsvarande matern MSC populationer 37.
I vart och ett av de beskrivna isoleringsprotokoll, använde vi cirka 10 g vävnad. En hel placenta är typiskt 500-750 g, och i tidigare arbete vi visat att genom automatiserad vävnad Digest och en cellexpansion bioreaktor proccesser som det ska vara möjligt att tillverka mer än 7000 kliniska celldoser från en enda moderkakan 4. Dessa siffror markerar den potentiella lämpligheten placenta härrörande MSC i allogena MSC terapier, och betydelsen av denna metod oavsett MSC ursprung (foster eller moderns). Ur ett terapeutiskt perspektiv, är det mest kritiska att användarna har full förståelse för den cellprodukt och förmågan att på ett tillförlitligt sätt tillverka denna cellprodukt. Vi hoppas att vår video kommer att hjälpa forskarna att förstå placenta anatomi, isolera MSC från placenta, och förutse den sannolika foster eller maternell cellkomposition av deras kulturer.
Acknowledgments
RP fick stöd av ett National Health och Medical Research Council (NHMRC) Forskar Training gemenskap. VS stöddes av University of Queensland International Forskarstuderande stipendium. MRD stöddes av NHMRC och Inner Wheel Australien.
Vi tackar klinisk och vårdpersonal för att bistå i patientens samtycke och provtagning. Vi tackar Prof. Nickolas Fisk, professor Kerry Atkinson och Dr Rohan Lourie för insiktsfulla diskussioner i obstetrik, feto-placental utveckling och placenta anatomi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| HBSS | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Long name: Hanks Balanced Salt Solution |
| FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
| trypsin-substitute | Gibco/Invitrogen | 12563-029 | Long name: TrypLE Select |
| DMEM-LG | Gibco/Invitrogen | 11885-092 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-Low Glucose |
| DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
| PBS (Mg+Ca+ free) | Gibco/Invitrogen | 14190-250 | Long name: Dulbecco's Phosphate buffered saline, magnesium and calcium free |
| Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
| paraformaldehyde powder or 4% solution | any | ||
| Collagenase I | Invitrogen | 17100-017 | 2,500 U/ml |
| Dnase I | Sigma | D5025 | 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | 10 mg/ml in water (20,000 U/ml). |
| Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables: | |||
| 50 ml centrifuge tubes | Falcon or any brand | ||
| petri dishes, sterile plactic (25 cm and 10 cm diameter) | Nunc | ||
| Cell strainers (100 μm) | Becton Dickinson | 352340 | |
| 175 and 75 cm2 (T175 and T75) tissue culture flasks | Nunc | ||
| 5 ml, 10 ml, 25 ml sterile serolgical pipettes | any brand | ||
| Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | |||
| tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Sterile scissors and tweezers | |||
| Tube racks | |||
| Pipette-boy or equivalent | |||
| Gilson type pipetters and sterile tips 1,000 µl, 200 µl, 20 µl. | |||
| rocking or shaking incubator (37 °C) | |||
| personal protective equipment | |||
| cleaning solutions (suitable for blood) | |||
| waste containers, correct disposal bins for tissue/blood | |||
| Reagents for MSC characterization | |||
| Antibody (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | Isotype |
| CD73 (AD2) | Miltenyi Biotec | 130-095-183 | Mouse IgG1 |
| CD105 (43A4E1) | Miltenyi Biotec | 130-094-941 | Mouse IgG1 |
| CD90/Thy-1 (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-403 | Mouse IgG1 |
| CD45 (5B1) | Miltenyi Biotec | 130-080-202 | Mouse IgG2a |
| CD34 (AC136) | Miltenyi Biotec | 130-090-954 | Mouse IgG2a |
| HLA-DR (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-298 | Mouse IgG2a |
| CD31 (PECAM-1) | BD Pharmingen | 555446 | Mouse IgG1 |
| CD146 (541-10B2) | Miltenyi Biotec | 130-092-849 | Mouse IgG1 |
| CD44 (DB105) | Miltenyi Biotec | 130-095-180 | Mouse IgG1 |
| Isotype Controls (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | |
| Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-214 | |
| Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-212 | |
| Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
| Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-091-837 | |
| Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-098-849 | |
| MACS Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Osteogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
| DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
| FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
| Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| β-Glycerol Phophate | Sigma | 50020 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | For calcium matrix staining |
| Adipogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
| DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
| FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
| Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
| insulin | Sigma | I2643 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378 | |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine | Sigma | I5879 | |
| Oil Red O solution | Sigma | O1391-250ML | For lipid vacuole staining |
| XY FISH kit to determine fetal or maternal origin of cells | |||
| XY chomosome FISH kit | Vysis (Abbott Molecular) | 07J20-050 | Long name: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Direct Labeled Fluorescent DNA Probe Kit |
References
- Brooke, G., et al. Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells. Semin Cell dev Biol. 18, 846-858 (2007).
- Wei, X., et al. Mesenchymal stem cells: a new trend for cell therapy. Acta Phamacol Sin. 34, 747-754 (2013).
- Ma, S., et al.
- Timmins, N. E., et al. Closed system isolation and scalable expansion of human placental mesenchymal stem cells. Biotechnol Bioeng. 109, 1817-1826 (2012).
- Barlow, S., et al. Comparison of human placenta- and bone marrow-derived multipotent mesenchymal stem cells. Stem Cell Dev. 17, 1095-1107 (2008).
- Jones, B. J., Brooke, G., Atkinson, K., McTaggart, S. J. Immunosuppression by placental indoleamine 2,3-dioxygenase: a role for mesenchymal stem cells. Placenta. 28, 1174-1181 (2007).
- Parolini, O., et al. Toward cell therapy using placenta-derived cells: disease mechanisms, cell biology, preclinical studies, and regulatory aspects at the round table. Stem Cell Dev. 19, 143-154 (2010).
- Benirschke, K., Burton, G. J., Baergen, R. N. Pathology of the Human Placenta. , 6 edn (2012).
- Moore, K., Persaud, T., Torchia, M. The developing human: clinically oriented embryology. , Elsevier/ Saunders. (2013).
- Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem cells. 26, 300-311 (2008).
- Brooke, G., et al. Manufacturing of human placenta-derived mesenchymal stem cells for clinical trials. Brit J Haematol. 144, 571-579 (2009).
- Pelekanos, R. A., et al. Intracellular trafficking and endocytosis of CXCR4 in fetal mesenchymal stem/stromal cells. BMC cell biology. 15, 15 (2014).
- Chen, Y. S., et al. Small molecule mesengenic induction of human induced pluripotent stem cells to generate mesenchymal stem/stromal cells. Stem Cells Transl Med. 1, 83-95 (2012).
- Heazlewood, C. F., et al. High incidence of contaminating maternal cell overgrowth in human placental mesenchymal stem/stromal cell cultures: a systematic review. Stem Cells Transl Med. 3, 1305-1311 (2014).
- Horn, P., Bork, S., Wagner, W. Standardized isolation of human mesenchymal stromal cells with red blood cell lysis. Methods Mol Biol. 698, 23-35 (2011).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol. 2, 83-92 (1974).
- Caplan, A. I.
- Futrega, K., et al. The microwell-mesh: A novel device and protocol for the high throughput manufacturing of cartilage microtissues. Biomaterials. 62, 1-12 (2015).
- Liu, Y., Goldberg, A. J., Dennis, J. E., Gronowicz, G. A., Kuhn, L. T. One-step derivation of mesenchymal stem cell (MSC)-like cells from human pluripotent stem cells on a fibrillar collagen coating. PloS one. 7, 33225 (2012).
- Maleki, M., Ghanbarvand, F., Reza Behvarz, M., Ejtemaei, M., Ghadirkhomi, E. Comparison of mesenchymal stem cell markers in multiple human adult stem cells. Int J Stem Cell. 7, 118-126 (2014).
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
- Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal stem cells: revisiting history, concepts, and assays. Cell stem cell. 2, 313-319 (2008).
- Bianco, P., et al. The meaning, the sense and the significance: translating the science of mesenchymal stem cells into medicine. Nature med. 19, 35-42 (2013).
- Da Silva Meirelles, L., Caplan, A. I., Nardi, N. B. In search of the in vivo identity of mesenchymal stem cells. Stem cells. 26, 2287-2299 (2008).
- Caplan, A. I., Correa, D. The MSC: an injury drugstore. Cell Stem Cell. 9, 11-15 (2011).
- Wegmeyer, H., et al. Mesenchymal Stromal Cell Characteristics Vary Depending on Their Origin. Stem Cell Dev. , (2013).
- Guillot, P. V., Gotherstrom, C., Chan, J., Kurata, H., Fisk, N. M. Human first-trimester fetal MSC express pluripotency markers and grow faster and have longer telomeres than adult MSC. Stem cells. 25, 646-654 (2007).
- Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hemol. 36, 642-654 (2008).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem cell res. 8, 58-73 (2012).
- da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P. C., Nardi, N. B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119, 2204-2213 (2006).
- James, A. W. Review of Signaling Pathways Governing MSC Osteogenic and Adipogenic Differentiation. Scientifica (Cairo). 2013, 684736 (2013).
- Xu, C., et al. Cross-Talking between PPAR and WNT Signaling and Its Regulation in Mesenchymal Stem Cell Differentiation. Curr Stem Cell Res Ther. , (2015).
- Zhuang, H., et al. Molecular Mechanisms of PPAR-gamma Governing MSC Osteogenic and Adipogenic Differentiation. Curr Stem Cell Res Ther. , (2015).
- Moore, K., Persaud, T., Torchia, M. Before We Are Born: Essentials of Embryology and Birth Defects. , Elsevier Health Sciences. 8 edn (2011).
- Zhu, Y., et al. Placental mesenchymal stem cells of fetal and maternal origins demonstrate different therapeutic potentials. Stem Cell Res Ther. 5, 48 (2014).
