Summary
Heri beskriver vi metoder for disseksjon av foster eller mor vev fra menneskelig begrep placenta, etterfulgt av isolasjon og utvidelse av mesenchymale stamceller / stromale celler (MSC) fra disse vev.
Introduction
Mesenchymale stamceller / stromale celler (MSC) er fremstår som en lovende kandidat for bruk i celle-baserte terapier 1. De fleste programmer ser ut til å målrette MSC-mediert vev reparasjon eller immunregulering to. I mange av disse programmene, kan allogen MSC være like effektivt som autolog MSC 3. Bruken av allogene MSC har den økonomiske fordel av å være kompatible med stor-skala produksjon av flere celle doser fra en enkelt kilde vev 4 til behandling av mange pasienter.
Historisk sett har prekliniske og kliniske studier benyttet MSC-avledet fra benmargen 4. Benmarg er vanligvis hentet fra hoftekammen hos en frivillig donor. Denne prosessen er invasiv, og bare et lite volum av marg (~ 20 ml) blir samlet opp gjennom en enkelt punktering. Generering av klinisk betydning antall MSC krever omfattende in vitro ekspansjon. Cell potens avtar med passering nummer
Morkaken er et fetomaternal organ bestående av både fosterets og morens vev 7, og dermed MSC for foster eller mors opprinnelse kan være teoretisk isolert. Følgende referanser gir detailed informasjon om utviklingen og patologi, samt makroskopisk og mikroskopisk undersøkelse av human placenta og adnexa 8,9. Morkaken skikkelig består i stor grad av fosterets blodårer og sekretorisk og støtte celler som kalles trophoblasts, som utgjør chorion villi omfattes av chorion frondosum (plate) 8. De forgrenede placenta villi er badet i mors blod levert fra livmorspiralarteriene, slik at næringsmidler, hormoner og gassutveksling mellom foster og mor. Morkaken er forankret til endometrium via mors Deciduale stromale celler og foster extravillious trophoblasts er ispedd i ekstracellulære matrise 8. De villi konvergerer mot foster chorionic plate hvor de danner navlestreng 8.
Et resultat av den første internasjonale Workshop på Placen-stamceller (2008) var en styrking av behovet for å standardisere isolasjon og characterization av celler fra human term placenta 10. På grunn av anatomien av morkaken, disseksjon av de ulike vev, isolering av MSC og forventede kultur utfall kan være overveldende for nykommere til feltet. I denne protokollen, høsting av placenta chorionic vev, etterfulgt av MSC isolasjon og utvidelse er grundig detaljert. MSC karakterisering via flowcytometri og in vitro differensiering anses som rutine 5,11-13, og derfor bare kort beskrevet her.
Som fremhevet i en fersk systematisk litteraturgjennomgang 14, MSC hentet fra placenta chorion villi er generelt antatt å være foster. Selv om bare 18% av studiene undersøkte opprinnelsen til MSC innhentet, og av dem, bare halvparten av studiene rapporterte foster MSC og den andre halvparten rapporterte mors eller blandede MSC bestander. Hver av de tre vevskomponenter beskrevet heri (chorion villi, chorionic plate og decidua basalis) er komposed hovedsakelig av fosterets membran / villi, og en liten andel av livmor-avledet mors celler, som forblir festet til den leverte morkaken. Vi gir data som viser at isolere MSC fra mors side av placenta, snarere enn foster side av placenta, som vi tidligere har rapportert 5,11, er en mer hensiktsmessig utgangsmateriale hvis moder MSC er ønsket. Denne protokollen beskriver også bruken av XY FISH å validere føtal eller mors bidrag til cellekulturer. Selv om dette er en standard protokoll fra produsenten, er denne analysen ofte neglisjert og dens betydning undervurdert 14.
Protocol
Human forskningsetiske komiteer på Mater Health Services, kongeBrisBane og kvinner Hospital, Queensland University of Technology og University of Queensland godkjente forskning og innsamling av menneskelige placenta prøver som brukes i studien. Alle protokoller holdt nasjonale forsknings retningslinjer. Pasienter forutsatt informert skriftlig samtykke til bruk av vev for forskningsformål.
Tredje trimester placentas ble oppnådd fra friske mødre følgende rutine keisersnitt (CS) fødsler på sikt fra de ovennevnte sykehus i Brisbane, Australia. Mann uharmoniske svangerskap for langtidsprøver ble brukt i denne studien å skille fosterets fra mors celler. Fosterets kjønn hadde blitt bestemt av ultralyd før fødselen og / eller visuell inspeksjon av den nyfødte ved fødsel av kliniske personalet. X og Y-kromosom fluorescens in situ hybridisering (FISH) ble benyttet til å videre validere kjønn og fosterets eller maternal opprinnelse vev bevart fraopprinnelige placentas.
1. Før Harvest Klargjør Etter
Merk: Når du gjør opp enzymløsninger, bør de spesifikke krav og konsentrasjoner gitt av produsenten for hvert produkt følges. Enzymer er ofte gitt som en rå blanding av proteiner, derfor tilsvarende enzymer fra ulike selskaper er sannsynlig å ha ulike aktiviteter / konsentrasjoner. Av denne grunn produsentens råd skal bli anerkjent og løsning forberedelse må kanskje endres tilsvarende.
- Forbered eller kjøpe 1,5 til 2 L total steril Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) for denne protokollen.
- Forbered kollagenase I stamløsning ved å veie ut kollagenase type I og oppløse 1 mg / ml i HBSS og vortex forsiktig for å sikre fullstendig oppløsning. Bestemme volumet av HBSS (inneholdende kalsium og magnesium) som er nødvendig for å bringe kollagenaseoppløsning til 100 enheter (U) / mikroliter (1,000x stamløsning), og deretter å filtrere ved hjelp av en 0,2-# 181; m sprøytefilter. Delmengde 1 ml volumer i 1,5 ml rør og oppbevares ved -20 ° C inntil behov.
- Fremstille dispase stamløsning ved å oppløse ikke-sterile dispase ved 10 mg / ml i Dulbeccos fosfatbufret saltoppløsning (DPBS) uten kalsium eller magnesium. Ytterligere fortynnet med DPBS uten kalsium eller magnesium til en endelig konsentrasjon på 2,4 U / ml. Filtrer sterilisere gjennom et 0,2 mikrometer sprøyte filter. Delmengde 1 ml volumer i 1,5 ml rør og oppbevar ved -20 ° C inntil nødvendig.
- Forbered deoksyribonuklease (DNase) -I stamløsningen ved å oppløse DNase-I ved 10 mg / ml i 0,15 M NaCl. Filter thorugh en 0,2 mikrometer sprøyte filter. Delmengde 1 ml volumer i 1,5 ml rør og oppbevar ved -20 ° C inntil nødvendig.
- Forberede arbeids fordøyelse oppløsningen ved å kombinere 100 U / ml kollagenase type I, I.5 pg / ml DNase I og 2,4 E / ml, dispase i serumfritt DMEM. Fersk tine og fortynne enzym aksjer umiddelbart før bruk. Ca, et 1: 1 forhold av fordøyelse oppløsningenvolum til volum vev er nødvendig (for eksempel 10 ml av vev, målt i et 50 ml rør, krever 10 ml fordøyelse oppløsning).
- Forbered en løsning av 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS og juster til pH 7,4 15. Butikk 25 ml alikvoter ved -20 ° C for langtids eller ved 4 ° C i en uke.
- Fremstille MSC dyrkningsmedium fra DMEM-Low glukose (DMEM-LG) supplert med antibiotisk 1x og antimykotisk løsning og 10% ikke-varmeinaktivert føtalt bovint serum. MSC-grade FBS kan kjøpes fra mange FBS leverandører.
- Autoklav sterilisere disseksjon utstyr på forhånd som per institusjonelle retningslinjer. Disse inkluderer saks, pinsett, skalpeller, og en stor metall disseksjon skuffen. Samle ekstra sterilt vev kultur plasticware og forbruksvarer (f.eks skalpellblader, 50 ml og 15 ml rør, 25 ml, 10 ml og 5 ml pipetter, og 75 eller 175 cm 2 cellekulturflasker).
- Bruk standard primære cellekultur laboratorieutstyr: en klasse II biosafety kabinett som passer for primær celleisolasjon, cellekultur-inkubator innstilt på 5% CO2 og 37 ° C, en vippe i en 37 ° C inkubator, og en sentrifuge med en kapasitet på 50 ml rør.
- Bruk egnet personlig verneutstyr: en laboratoriefrakk, 2 par hansker (til enhver tid), vernebriller, og close-toed sko som per institusjonelle retningslinjer.
- Forberede aktuelle dekontaminering løsninger for humane blodprøver som per institusjonelle retningslinjer og flytende biologiske avfallsbeholdere på forhånd.
2. Isolering av placenta MSC
- Utarbeidelse av morkaken
- Kle deg i ønsket personlig verneutstyr. Sett opp biologisk trygghetskabinett med nødvendige materialer, løsninger og avfallsbeholdere for å gjennomføre prosedyren opp til den enzymatiske fordøyelse (avsnitt 2.5.6).
- Skaff en morkake med informert samtykke og etisk godkjenning. Samle morkaken via keisersnitt seksjon under aseptiske kirurgiske tilstander, og pakke i en steril pose eller bøtte for transport til laboratoriet.
- Under transport og før disseksjon, lagre placenta ved romtemperatur eller 4 ° C.
Merk: Tissue kan lagres i opptil 6 timer uten å påvirke cellekultur ytelse.- Begrens tiden mellom placenta innsamling og behandling vev der det er mulig. Denne anbefalingen er basert på praktiske problemer. I noen tilfeller har vi forsinket cellen isolasjonsprosess for opp til 6 timer etter fødselen. I disse tilfellene placentas har blitt oppbevart i romtemperatur eller 4 ° C (i laboratoriet eller på samlingen midten). Ingen påviselige forskjeller ble observert, nevnte generelle donor variasjon, i MSC oppnådd fra placentas når de ble lagret ved 4 ° C eller ved romtemperatur.
- Plasser beholderen med placenta i biologisk trygghetskabinett. Åpne beholderen og overføre den placenta inn i et sterilt magasin.
- Åpne ut fosterhinnene (fostervann sac eller amnion-chorionic laeve) 8. Bli orientert med de delene av placenta. Foster side har navlestrengen innsetting, som er generelt sentralt innsatt i placenta. Mors side (foret med decidua basalis), som er motsatt av fosterets side, har åpenbare cotyledons (eller lapper).
- Til å begynne disseksjon, orientere morkaken med navlestrengen vendt oppover i sterile skuffen.
Merk: Denne protokollen er utformet for å gi tilstrekkelig antall celler i frø inn i en T175-kolbe fra hver av de tre vevstyper. Hver spaltningen begynner med omtrent 10 g av vev. Dette er en lignende start rekke kolber som MSC kulturer initiert fra en 20 ml benmargsaspirat. Dersom flere celler er ønsket, så kan mer vev kan høstes og protokollen kan skaleres lineært. Størrelsene på vev som skal høstes er bare en indikasjon på hva som er praktisk med placenta vev. Det er få defining funksjoner i placenta villi, som kan anvendes som et referansepunkt. De angitte dimensjoner tjene som et estimat og navlestrengen blir brukt som et landemerke på fosterets overflaten.
- Disseksjon av den decidual (D) Tissue
- Vend morkaken over slik at mors overflaten (decidua basalis) vender opp. Pass på at fosterets side med navlestreng innsettingspunktet vender ned.
- Skjær biter av 0,5 cm tykkelse fra mors side av morkaken (som inneholder decidua basalis vev).
- Plasser vev brikker i en petriskål som inneholdt HBSS under disseksjonen for å holde vevet stykkene hydratisert.
- Overfør tilstrekkelig vev til å fylle et rør opp til 10 ml-merket i et 50 ml rør (dette er omtrent 10 g av vev).
- Disseksjon av chorion Plate (CP) Tissue
- Fjernes mekanisk fra foster membranen fra fetal overflaten av placenta (ikke foster sac), forlater chorionic frondosum (chorionic plate) intakt.
- Skjær stykker ~ 1 cm bred og 0,5 cm dyp fra chorionic plate. Høster chorionic platen fra området nærmest til navlestrengen, bort fra kanten av placenta.
- Plasser vev stykker inn i en petriskål som inneholdt HBSS under disseksjonen for å holde dem hydrert.
- Overfør tilstrekkelig vev for å fylle et 50 ml rør opp til 10 ml merket (~ 10 g av vev).
- Disseksjon av den chorion villi (CV) Tissue
- Dissekere CV vev ~ 1 cm 2 x 0,5-1 cm dype fra morkakevevet der CP er allerede fjernet. Igjen høste CV fra området nærmest navlestrengen, bort fra kanten av placenta. Prøv å holde minst 1 cm fra mors side av morkaken (som inneholder decidua basalis vev); målet er å høste vev fra det indre av placenta villi vev.
- Plasser vev stykker i en petriskål med HBSS løpet av disseDette skjer for å holde dem hydrert.
- Overfør tilstrekkelig vev for å fylle et 50 ml rør opp til 10 ml merket (~ 10 g av vev).
- Hakking og Enzymatisk spalting av D, CP, og CV morkakevev
- Ettersom det er ~ 10 g D, CP eller CV vev i tre ulike 50 ml rør, fylle hvert rør med omtrent 40 ml HBSS og gjentatte ganger invertere røret for å vaske vevet (gjentas for ~ 10 sek).
- Dekanter supernatanten og gjenta dette vasketrinn 2-3 ganger inntil oppløsningen er stort sett fri for blod. Bruke en 10 ml pipette eller lange pinsett for å sikre vev stykkene går ikke tapt ut av røret (e) ved dekantering av supernatanten.
- Returner vev stykker til en 10 cm petriskål med minimal væskeoverføring. Chop / hakke vevet inn i fine biter på ca 1-5 mm 3 med saks eller barberblad.
- Overfør hakket vev tilbake i riktig merket (D, CP eller CV) 50 ml rør.
- Legg ferskt FORBEREDELSERed fordøye media i det minste et 1: 1 forhold med vevet (for eksempel 10 ml av vev pluss 10 ml fordøye media). Sett lokket på hvert rør og invertere rørene flere ganger for å blande.
- Inkuber vev i rørene med fordøye media i 1-2 timer ved 37 ° C. En fuktet atmosfære og 5% CO 2 er ikke nødvendig for dette trinn.
Merk: Rapid rystelse er nødvendig for effektivt å dissosiere celler fra vev og maksimere MSC utbytte. Limited utbytte vil fremgå av svært få celler festet til kulturflaske ved 48 timer og en første passasje som er lengre enn 1-2 uker. Inkubasjonstiden og risting metoden er avhengig av 37 ° C inkubator tilgjengelig i laboratoriet og kan kreve optimalisering.- For en kuvøse med en rask og kontrollerbar risting mekanisme, sted vev og fordøye medium i en 50 ml tube eller sterilt erlenmeyerkolbe, sted i kuvøse og satt ristehastigheten til 250 rpm. Dette vil resultere i en komplett sammendrag avvevet i 1 time.
- Alternativt, for en inkubator med en svak vugging eller ingen vippemekanismen, ristes manuelt røret hurtig og kraftig for hånd i 10 sekunder hvert 30 min i 1,5 til 2 timer. Enzymet Inkubasjonstiden er et passende tidspunkt å kaste avfall, fjerner biosikkerhet kabinett av unødvendige elementer, endre laboratoriefrakk hvis skittent og forberede seg til neste del av prosedyren.
- Innsamling av mononukleære celler og Plating inn Parfyme
Merk: Fra forrige trinn er det tre 50 ml rør (D, CP eller CV) med bearbeider vev stykker. Når vevet fordøye løsningen utvikler en overskyet utseende og hvite blodårene er åpenbare i vevet, er fordøyelsen fullført.- Tilsett 30 ml av MSC-media inneholdende FBS til hvert rør for å inaktivere de enzymene som finnes i fordøyelsen oppløsning.
- Å separere mononukleære celler fra den store ufordøyd rusk, puls sentrifuger 50 ml tube. Kort, tillatesentrifugen å nå 340 x g i 5 sek og så stoppe. Dette vil tvinge den større avfall til pellet på bunnen av røret, og samtidig la de mononukleære celler i flytende suspensjon.
Merk: De mononukleære cellene vil forbli i væskefasen dersom røret er bare en kort stund (pulsed) sentrifugert. Dersom sentrifugering blir forlenget, vil de mononukleære celler også pellet på bunnen av røret med vevet stykker, noe som resulterer i uønsket celletap. - Samle supernatanten som inneholder de mononukleære celler, og overføre denne til et nytt 50 ml rør med en pipette.
- Tilsett 30 ml av media eller HBSS til de resterende placental vevsrester og rist kraftig. Dette vil bringe gjenværende frittliggende mononukleære celler i suspensjon og slå på en annen høsting av antatte MSC fra vevet.
- Puls sentrifuge røret en andre gang, og igjen overføres supernatanten til et nytt 50 ml tube. Gjenta dette trinnet en tredje gang for å maksimere oppsamlingseffektivitetenav mononukleære celler fra hvert vev kilde.
- Pool supernatantene fra hver av de enkelte vevstyper i to 50 ml-rør. Dette vil gi 6 rør totalt (2 rør av hver D, CP og CV). Sentrifuger hvert rør i 5 minutter ved 340 x g. Dette trinnet vil pellet mononukleære celler til bunnen av rørene.
- Nøye dekanter eller pipette av supernatant inn i avfallet. Det er unødvendig å forsøke å eliminere hver dråpe av supernatanten.
Merk: Cellepelleten blir skjøre på grunn av et stort antall røde blodlegemer. Vær forsiktig så du ikke ved et uhell forkaste pellet hvis du dekantere rett fra 50 ml tube. - Etter fjerning av det meste av supernatanten, knips forsiktig på røret flere ganger med en finger for å løsne cellepelleten. Kombiner de pellets, slik at det er et enkelt rør for hver D, CP eller CV vev og resuspender hver i 35 ml MSC media.
- Valgfritt: Filtrer mononukleære fraksjon gjennom en 100 pm sikt celle sil satt up i et 50 ml rør for å fjerne celleklumper eller fibrøst materiale.
Merk: Care er nødvendig som filtrene lett kan tette opp og over-fill. I tillegg kan luftbobler hindre filtre fra drenering. Hvis dette skjer, sakte løfte filteret ut av røret for å tillate luft å strømme under filteret, vaskes filteret gjennom med cellekulturmedier eller bytte til et nytt filter. Med unntak av filtreringstrinnet synes ikke å forandre utbytte eller kvalitet av de etterfølgende MSC kulturer.- Eventuelt kan en rød blodcelle (RBC) lysering eller tetthetsgradient-sentrifugering utføres ved dette stadiet 15. Men vår erfaring er at RBC ikke forstyrrer MSC vedlegg eller spredning, og derfor RBC lysis er ikke nødvendig. Mononukleære celler kunne telles på dette trinnet hvis RBC fjerning ble gjennomført 15. Selv om, vil det store flertallet av celler på dette stadium ikke være MSC, men være føtal opprinnelse trofoblaster, endotelceller og hematopoetiske celler, så vel som maintern opprinnelse hematopoetiske celler og Deciduale stromale celler.
- Overfør cellesuspensjonen til hver D, CP eller CV vev inn i en enkelt T175 kolbe og kulturen i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Post Isolation-celle Expansion
- Ved 48 timer etter den første isoleringen, fjernes mediet fra hver av kolbene (D, CP og CV) og erstatt med 35 ml fersk MSC media. Det brukte medium og frigjorte celler kan kastes, som antatt MSC er antatt å være knyttet til den vevskulturkolbe 16. Returner kolber til inkubatoren i ytterligere 24 timer.
- Etter ytterligere 24 timer av kulturen, vaskes kolbene to ganger med DPBS (25 ml) for å fjerne rusk og RBC. Virvle væsken rundt bunnen av kolben for å fjerne røde blodceller. Bruk en pipette til å fjerne væske og rusk. Legg 35 ml av MSC media til kolbene og returnere flaskene til inkubatoren.
- Bytt media to ganger per uke, og icubate kulturer inntil cellemonolagene er 80- 90% sammenflytende. Denne første ekspansjonen tar 4-14 dager, avhengig av kvaliteten av vevet, mengden av utgangsmateriale og effektivitet og tiden for inkubering med fordøye løsning.
3. subkultur av pMSCs
- Når kulturer er 80-90% konfluent, vask to ganger med 20 ml 1x HBSS eller DPBS og kast vasker. Legg trypsin-erstatning i hver kolbe (dvs. bruk av 5 ml for en T175-kolbe).
- Inkuber kolbene i 5 minutter ved 37 ° C for å frigjøre MSC fra vevskultur overflate. Trykke på sidene av kolben hvert ~ 2 min for å lette løsgjøring.
- Når cellene er løsrevet fra overflaten og i en enkelt cellesuspensjon, vask cellene fra kolbe med MSC media og samle cellene i rørene. MSC media vil utvanne og deaktivere trypsin-erstatning (bruk ~ 15 ml MSC media per T175 kolbe).
- Overfør innholdet i hver kolbe til vevskultur et 50ml tube.
- Sentrifugerør ved 340 xg i 5 minutter for å pelletere cellene.
- Kast supernatanten og resuspender cellepelletene i 1 ml av MSC media.
- Fortynn 10 ul av cellesuspensjonen i 10 pl av trypan blå. Cellene telles ved hjelp av et hemocytometer og beregne det totale antall celler 15.
- Overfør cellene til nye kolber på 1.150 celler / cm 2 i friske MSC media og inkuberes i en vevsdyrkningsinkubator. På dette seeding tetthet, frø 200000 MSC inn i hver nye T175 kolbe i 35 ml MSC medier. Mate cellene to ganger per uke til 80-90% sammenflytende. Seed påfølgende passasjer på 1.150 celler / cm 2 eller 200.000 MSC i hver T175 kolbe.
- Når passasjen 1 (P1) eller P2-celler er konfluente, cryopreservere de fleste cellene for fremtidig bruk, og reseed bare en T175-kolbe for ytterligere formering og karakterisering. De formerte cellene kan brukes på P3 eller P4 for mesodermal differensiering analyser og celle karakterisering via flow cytometri.
Merk: I begynnelsen av passasjene, kan det være svært få tynt separerte kolonier, men den lokale celletettheten i hver koloni kan være meget høy. Dette er ikke ideelt, da den lokale tett pakning av cellene vil resultere i kontakt inhibisjon, forsinke vekst og redusere kultur ytelse. Det anbefales da tette kolonier er observert, må cellene bli høstet og sådd på nytt i en ny kolbe. Denne omfordelingen prosessen gir celler med plass til å spre seg, og generell kultur ytelsen vil bli forbedret. - For å cryopreservere MSC, samle ~ 1 x 10 6 celler i 1 ml 90% FCS og 10% dimetylsulfoksyd (DMSO) og fryse ved hjelp av standard protokoller.
Merk: I representative resultater delen, er det beskrivelser av MSC karakterisering ved hjelp av flowcytometri, mesodermal differensiering og XY FISH analyse for å fastslå kjønnet på tre forskjellige (D, CP og CV) utvidet cellepopulasjoner. I vår studie, placentas var fra guttebarn; dermed alleføtale celler kan skilles som mannlig (Y-kromosom) og alle mors celler kan skilles som kvinnelig (X-kromosomet bare).
Representative Results
Placenta MSC isoleringsprosedyren er oppsummert i figur 1. De tre områdene av morkake anatomi fra hvilken MSC ble isolert er fremhevet i figur 2. Dette er den maternal decidua, så vel som de i stor grad fostervev fra chorion platen og chorion villi. Mange lærebøker, artikler og online ressurser detalj utvikling og funksjonell rolle de ulike morkakevev (se referanse 8).
Morfologi av kulturer 48 timer etter isolering og fjerning av vev rusk.
Etter 48 timer med kultur, vil MSC har festet til vevet kultur plast, mens RBC og de fleste andre cellerester ikke skal ha vedlagt. På dette tidspunkt, må mediet erstattet med 35 ml friskt kulturmedium. Før dette medium utveksling, er det vanskelig å gjøre nøyaktige observasjoner på grunn avet stort antall røde blodlegemer, noe som vil vanskelig visuell vurdering. Utseendet av kultursupernatanten kan variere betydelig mellom placenta givere. Denne variasjon kan ses visuelt i eksempel 1 og 2 (figur 3A). Disse to MSC isoleringer, som syntes å være svært forskjellige, ble utført samtidig fra to forskjellige placentas. Imidlertid, når det er vasket, begge kulturer først på lignende (se vasket eksempel 3, figur 3A).
Under et mikroskop, etter 48 timer media utveksling, bare noen få celler som skal festes til kolben (figur 3B), og cellene vil vises betydelig forskjellig fra mer omfattende ekspanderte MSC. Noen rusk og RBC vil være synlig som flytende eller festet klumper og disse vil ikke forstyrre veksten av MSC. De lengre fibrino-blastcellene festet til bunnen av kolben er sannsynlig å være en blanding av celler inkludert MSC, blodkreft,trofoblastiske eller endotelceller. Igjen, de ikke-MSC celler ikke gå på akkord med MSC kulturer, som disse cellene ikke vil generelt overleve mer enn 1-2 passasjer i dyrkningsforhold MSC. Til tross for en viss variasjon i den opprinnelige utseende av kulturer, de etterfølgende ekspansjons resultatene generelt konsekvent.
Morfologi av MSC kulturer over tid.
I dette representativt eksempel sju dager etter isolering, små fibrinoblast MSC kolonier var synlige, selv om ikke-MSC-celler kan også bli sett på som rund eller løst festet celler (figur 4A). De vedlagte Cellene blir det som opprinnelig ble kalt en "koloni enhet dannende -fibroblast "(CFU-F) 17 og senere betegnet MSC 18. Tretten dager etter isolasjon, fibrinoblast MSC kolonier var store (figur 4B). Generelt vil den monolaget være 80-90% konfluent på dette punkt, og cellene må være passa ged. Fra passasjen 2 og utover, vil placenta MSC mono utvikle den karakteristiske boblelignende morfologi ved samløpet (Figur 4C). Med mindre cellene passeres ved lav tetthet, vil CFU-F dannelsen ikke lenger overholdes. Ved lav tetthet, placenta-avledet MSC har en mindre, mer firkantet utseende enn voksen benmarg-avledede MSC-1. Mens placenta-avledet MSC og benmarg-avledede MSC viser lignende spredning priser, placenta-avledede celler som er mindre utsatt for hurtig begynnende alderdom 5.
Karakterisering av morkake MSC in vitro.
Hver ekspanderte cellepopulasjon skal preges for å sikre at det er i samsvar med standard-MSC kriterier 16, inkludert (1) av plast tilslutning (2) nærværet av mesenchymale overflatemarkører og fravær av hematopoetiske overflatemarkører, og (3) evnen til å gjennomgå mesodermal Differensiering.
Som vist i figur 4, vil MSC i kultur er plastisk adherente og har en fibroblastisk lignende morfologi; Dette bekrefter at cellene oppfyller de første kriteriene som definerer MSC 16.
Placenta MSC skjerm mesenchymale overflatemarkører.
Den andre definerende egenskap MSC er tilstedeværelsen av mesenchymale overflatemarkører og fravær av hematopoetiske overflatemarkører 16. Siden det ikke er enkelt markør kan definitivt identifisere en MSC, er paneler av markører vanligvis benyttes i forbindelse med flowcytometri analyse for å identifisere celler som er mesenchymale, men ikke blodkreft. I det representative datasettet gitt her (figur 5A), evaluert vi celle uttrykk for mesenchymale markører CD73, CD105, CD90, CD146, og CD44, de blodkreft markører CD45 og CD34, og HLA-DR, som well som endothelial markør CD31. Alle de antistoffer som brukes i denne morkake MSC karakterisering prosessen er oppført i tabellen av materiell / utstyr. Farging ble utført i henhold til produsentens anbefalinger, med analysemetodene som er beskrevet her 19.
Cellene var positivt for mesenchymale markører CD73, CD105, CD44, og negative for celleoverflatemarkører CD45, CD34, HLA-DR og CD31, som forventet 5,20. Omtrent 37% og 57% av cellene i vår representant datasett var positive for CD90 og CD146 21, henholdsvis. Både CD90 og CD146 blir ofte brukt MSC markører 21. MSC markør celleoverflaten profiler kan være forskjellig avhengig av MSC vev kilde, medium sammensetning, eller passasje nummer 22. I våre mange års erfaring, har vi ikke observert langvarig forurensning av morkake-avledet MSC med ikke-mesenchymale celler etter 1-2 passages 5,11.
Morkake MSC skjerm mesenchymale differensiering potensial
Ved definisjon må besitte MSC in vitro mesodermal differensiering kapasitet 5,13. Mesodermal differensiering potensialet er ofte vurdert gjennom enten tri eller bi-avstamning differensiering analyser. Bi-avstamning analyser generelt vurdere osteogene og adipogenic differensiering kapasitet, mens tri-avstamning analyser i tillegg vurdere chondrogenic differensiering kapasitet. I de representative resultatene som presenteres her viser vi at den utvidede MSC populasjoner danner både kalkavleiringer, indikerer osteogent differensiering og lipid vakuoler, indikerer adipogenesen (figur 5B).
For å karakterisere MSC-populasjoner som er rapportert her, sådd vi cellene inn i 24 kulturbrønnene ved 6 x 10 4 celler i 1 ml induksjonsmedium. Mediet componenter er oppført i tabell for material / utstyr. Mens induksjonsmellom formuleringer er vanlig i litteraturen, er det en betydelig variasjon i publiserte formuleringer. Av denne grunn vi kort liste våre induksjons medium formuleringer og flekker tilnærminger her. Osteogene induksjonsmedium inneholdt DMEM-HG, 10% FBS, 1 x antibiotisk antimykotisk løsning, 10 mM β-glycerol phophate, 100 nM deksametason, og 50 pM L-askorbinsyre 2-fosfat. Adipogenic induksjonsmedium inneholdt DMEM-HG, 10% FBS, 1 x antibiotisk antimykotisk løsning, 10 pg / ml insulin, 100 nM deksametason, 200 uM indometacin, og 500 mM 3-isobutyl-1-metyl xanthin. Her, kulturene ble opprettholdt i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator og dyrket i 14 dager. Induksjonsmediet ble skiftet ut to ganger per uke i løpet av dyrkningsperioden. Etter 14 dager etter induksjon ble kulturene karakterisert for enten beinlignende matrise (osteogenesis) eller lipid vakuoler (adipogenese) i henhold til vår previous publikasjon 5. Osteogene kalsium matrise avsetning analyse ble oppnådd ved først å aspirere av medium, fiksering av kulturene med 4% paraformaldehyd i 20 minutter, vasking av monolaget med DPBS, og deretter farging med Alizarin Red S i henhold til produsentens anbefalinger. Adipogenic induksjon ble vurdert ved aspirering av medium, fiksering av kulturene med 4% paraformaldehyd i 20 minutter, vasking av monolaget, og farging med Oil Red O-løsning i henhold til produsentens anbefalinger. Farget kalkavleiringer og olje vakuoler ble deretter visualisert med et lysmikroskop, og bildene lagres for fremtidig referanse.
I tidligere publikasjoner, har vi preget differensiering potensialet i placenta-avledet MSC mer omfattende 4,5. Placental-avledede MSC osteogenesis er lik benmarg-avledede MSC, mens adipogenese er generelt mindre effektiv i placenta-avledede MSC 5 </ Sup>. Vi har ikke rutinemessig utfører chondrogenic differensiering av flere grunner, men dette har tidligere blitt rapportert av oss for placenta-MSC 5. For det første, mens mesodermal differensiering kapasitet er et særtrekk ved MSC, er det sannsynlig av underordnet betydning 23-25, særlig hvor den terapeutiske fordelen er sannsynlig å være avledet fra MSC parakrine sekreter 26. For det andre, selv om Dominici et al. Foreslåtte minstekrav for klinisk fremstilling av et voksent menneske benmarg-avledede MSC 16, mer nylige studier indikerer MSC fra forskjellige nisjer har forskjellige iboende egenskaper og evner differensierings 5,13,27-32. Faktisk, Parolini et al., Foreslo at placenta-avledet MSC skal differensiere til "en eller flere" mesodermal linjer i stedet for alle de tre linjene 10. Til slutt, mange MSC studier inkluderer chondrogenic differensiering som det skjer ved en tilsvarintracellulære signalveien som osteogenesis (TGFB familie pathway) 33-35.
Placental MSC er maternal opprinnelse ved bruk av denne metoden for kulturen, til tross for anatomisk lokalisering av utgangsmaterialet.
Mange publikasjoner anta at celler isolert fra fosterets chorion utbyttet foster MSC på kultur 14. Men som vi har rapportert tidligere fem, alle kulturer som stammer fra foster chorion, ved hjelp av denne protokollen, raskt bli beriket for mors MSC som ville intuitivt kan forventes for mors Deciduale MSC kulturer. I disse representative resultatene vi brukt placenta vev fra guttebarn, slik at det var mulig å enkelt avgrense fosterets og morens celle bidrag i utvidet cellepopulasjoner. For disse studiene brukte vi XY FISH kit oppført i tabellmaterialer / utstyr, og fulgte produsentens instruksjoner.
(figur 6) . Ved passering 2, cellepopulasjoner avledet fra mors vev var ~ 100% mors celler (XX), og fosterceller (XY) var umulig å oppdage. Dette tyder på at fysisk disseksjon av mors vev førte til berikelse av mors celler i de etterfølgende kulturer. Imidlertid er det viktig å vurdere dyrkningsutbytte fra fetal chorion villi og chorionic plate-avledet kulturer. Ved passasje 0, både foster chorion villi og chorionic plate avledet kulturer var ~ 85% XY, eller føtal opprinnelse, noe som indikerer at målrettet disseksjon anriket for føtale celler (figur 6). Ved passering 0, begge kulturer inneholdt ~ 15% mødre celle (XX) forurensning. Overraskende, ved passering to ble begge foster kulturer befolket med ~ 100% mors celler (XX) og føtale celler (XY)ikke lenger var synlig. XY FISH analyse viser at mors celler (XX kromosomer) raskt og konsekvent oppkjøps kulturer avledet fra fosterets chorionic vev. Dette er en kritisk kultur observasjon som ofte blir oversett fem. Detaljene av denne analysen er inkludert i denne protokollen, fordi det viser den meget viktig observasjon at maternale celler raskt fylle alle kulturer når DMEM supplert med 10% FBS ble anvendt uten ytterligere faktorer utformet for å støtte fetal-avledede populasjoner.
Figur 1:. Oppsummering av morkake MSC isoleringsprosedyren (trinn 1) Orientere deg selv med morkaken anatomi. (Trinn 2) dissekere manuelt 10 g av vev fra enten decidua, chorion villi eller chorion platen ved hjelp av en saks. (Trinn 3) Finhakk tHan dissekerte deler av decidua, chorion villi eller chorionic plate vev i fine biter med saks eller en skalpell.
(Trinn 4) frigjøre cellene fra de fine stykker via en 1-2 timers fordøyelse i dispase og kollagenase I.
(Trinn 5) skille cellene fra det fibrøse vev ved puls sentrifugering og / eller vaske dem gjennom en celle sil. Samle og resuspender celler i kulturmedium og plassert inn i kulturflasker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Mesenchymale stromaceller (MSC) vil bli valgt på grunnlag av deres tilbøyelighet til plastisk tilslutning og evne til å overleve og formere seg i kulturmediet. Til slutt, i resultatene delen, den utvidede MSC kan karakteriseres og lagret for bruk i fremtidige eksperimenter.
Figur 2:. Anatomy av de menneskelige sikt placenta og vev isolert i denne prosedyren Den første vev som skal høstes er mors decidua. Decidua er vev som er igjen som et tynt lag på overflaten av placenta etter at den støtes fra livmorveggen (decidua er identifisert ved de grønne markører). Den andre vev som vil bli høstet fra det indre av placenta er foster chorion villi (blå markører). Den tredje vev som skal høstes er foster chorionic plate (røde markører) (tilpasset fra referanse 36). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Morfologi av kulturer 48 timer etter isolering og gjenbevege vevsrester. (A) Utseendet av kultursupernatanten kan variere betydelig mellom placenta givere før vask av rusk. Eksempel kulturer 1 og 2 viser denne varianten. Disse to isoleringer ble utført samtidig, men fra to forskjellige placentas. Når vaskede kulturer vil være klart av RBC og vev rusk slik som vist i eksempel 3. De etterfølgende ekspansjons resultatene generelt konsekvent. (B) Ved å følge 48 hr media utveksling, vil bare noen få celler festes til kolben. Scale bar = 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. Morfologi av MSC kulturer over tid (A) Sju dager etter isolasjon, liten fibroblastic MSC kolonier er synlige, selv om ikke-MSC-celler vil også være til stede som runde eller løst festede celler. (B) 13 dager etter isolering, fibrinoblast MSC kolonier er store og ofte monolaget av MSC er flytende og klar til å passasje. (C) Fra passasje 2 og utover, vil MSC mono utvikle et karakteristisk boblebad-lignende morfologi ved samløpet. Scale bar = 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 5: MSC karakterisering ved strømningscytometri og mesodermal differensiering (A) placental chorion villi-avledede MSC viser en klassisk MSC markør profil ved strømningscytometri-analyse, selv om det for disse celleoverflatemarkører, ekspresssion er lik for alle typer menneskelig MSC. Hvert histogram viser signalintensiteten (x-aksen) som funksjon av den normaliserte celletall på y-aksen (% av maks). I denne representative datasett var positive for CD73, CD105 og CD44, og negativ for blodkreft markører CD45 og CD34 og HLA-DR cellene. (B) Placental MSC generelt gjennomgå robust osteogene differensiering, men (C) adipogenic differensiering kan være mindre effektivt enn ved benmarg-avledede MSC. Bilder i bildetekster B og C ble tatt på 40X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Placental MSC er maternal opprinnelse ved bruk av denne metoden for kulturen, til tross for anatomisk lokalisering av utgangsmaterialet.Tomtene viser kvantifisering av fosterets (mannlig, XY) og mors (kvinnelig, XX) celle sammensetning av placenta MSC kulturer isolert fra decidual, chorion villi og chorionic plate vev på alle andre passasje. Maternale celler (XX) raskt og reproduserbart overta kulturer avledet fra føtale chorionic vev. Fetal = male = XY kromosomer oppdaget i en enkelt celle, mors = kvinne = XX kromosomer oppdaget i en enkelt celle. Data presentert her var fra N = 3 uavhengige giver placentas fra guttebarn, med et minimum av 100 celler farget for XY FISH og telles for hvert datapunkt. Barer representerer gjennomsnitt, og feilfelt reflektere ett standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Morkaken er en fysisk stor fetomaternal organ, som fetal eller mors MSC kan isoleres 22. Heri vi gitt en detaljert oversikt over morkake anatomi og instruksjon om hvordan du spesifikt dissekere decidua (maternal), chorion villi (foster), og chorionic plate (fetal) vev (trinn 2,2-2,4). Deretter skissert vi en robust protokoll som muliggjør MSC isolert fra hver av disse tre vevene (trinn 2.5 til 2.6). Placenta MSC utvidelse er effektiv og kulturer ligne på benmargavledede MSC kulturer (figur 3 og 4). Osteogene differensiering er pålitelig (figur 5B), mens adipogenic differensiering er generelt mindre effektiv (figur 5C) 5.
Mange nykommere til feltet vil anta at kulturer som stammer fra foster chorion villi eller chorionic plate vev vil bli beriket for foster MSC. Men i våre hender fetal celle berikelse er bare forbigående når standard MSC utvidelse medium som DMEM-LG + 10% FBS benyttes fem. Her gir vi representative resultater ved hjelp morkakevev stammer fra en mannlig baby. Ved hjelp av placenta vev fra en mannlig baby, føtale celler er lett identifiseres som å ha XY kromosomer, mens maternale celler kan identifiseres som å ha XX kromosomer. Figur 6 viser XY FISH resultater for et representativt kultur. Mens fetal MSC (XY) er anriket (opptil 80%) i de første kulturer avledet fra føtalt chorion villi eller chorionic plate vev, er de samme kulturene hurtig forbikjørt (~ 100%) av mors (XX) MSC i løpet av de to første passasjene . I standard medium, som består av DMEM-LG + 10% FBS, de få mors-avledet MSC som forurense fostervev utkonkurrere fosterets-deriverte celler i kultur.
Et kritisk punkt er skissert i denne protokollen er en styrking av morkake anatomi og fra hvor fosterog mors vev kan mest effektivt høstes. Som beskrevet i den representative resultater delen, betyr disseksjon av fostervevet gjør at forbigående berikelse for foster-avledet MSC. Forbedringer i ekspansjon medium formulering, gjennom konkrete eksogene vekstfaktor medium tilskudd bør tillate selektiv utvidelse av foster-avledet MSC populasjoner, og produserer en celle produkt som er beriket for foster snarere enn mors celler (vår gruppe er i ferd med å utvikle slike mellom formuleringer). Fremstillingen av føtale MSC populasjoner kan ha en rekke fordeler, som føtalt MSC er påstått å ha større angiogenese og immunsuppressive egenskaper enn tilsvarende maternale MSC populasjoner 37.
I hver av de beskrevne isoleringsmetoder, anvendte vi ca. 10 g vev. En hel placenta er typisk 500-750 g, og i tidligere arbeid vi vist at gjennom automatisert vev fordøye og en celle ekspansjon bioreaktor procsesser at det bør være mulig å produsere over 7000 kliniske celle doser fra en enkelt placenta 4. Disse tallene markere potensialet egnetheten av morkake-avledet MSC i allogene MSC terapi, og betydningen av denne metoden uavhengig av MSC opprinnelse (fetal eller mors). Fra et terapeutisk perspektiv, er det mest avgjørende at brukerne har full forståelse av cellen produktet og evnen til å pålitelig produsere denne cellen produktet. Vi håper at vår video vil hjelpe forskerne å forstå placenta anatomi, isolere MSC fra morkaken, og forutse sannsynlig fetal eller mors celle sammensetningen av sine kulturer.
Acknowledgments
RP ble støttet av en National Health and Medical Research Council (NHMRC) Postdoktor Training Fellowship. VS ble støttet av en University of Queensland International Graduate Student stipend. MRD ble støttet av NHMRC og Indre Wheel Australia.
Vi takker klinisk og pleiepersonell for å bistå i pasient samtykke og prøvetaking. Vi takker professor Nickolas Fisk, Prof. Kerry Atkinson og Dr Rohan Lourie for innsiktsfulle diskusjoner i obstetrikk, feto placentaiskemi utvikling og morkaken anatomi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| HBSS | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Long name: Hanks Balanced Salt Solution |
| FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
| trypsin-substitute | Gibco/Invitrogen | 12563-029 | Long name: TrypLE Select |
| DMEM-LG | Gibco/Invitrogen | 11885-092 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-Low Glucose |
| DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
| PBS (Mg+Ca+ free) | Gibco/Invitrogen | 14190-250 | Long name: Dulbecco's Phosphate buffered saline, magnesium and calcium free |
| Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
| paraformaldehyde powder or 4% solution | any | ||
| Collagenase I | Invitrogen | 17100-017 | 2,500 U/ml |
| Dnase I | Sigma | D5025 | 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | 10 mg/ml in water (20,000 U/ml). |
| Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables: | |||
| 50 ml centrifuge tubes | Falcon or any brand | ||
| petri dishes, sterile plactic (25 cm and 10 cm diameter) | Nunc | ||
| Cell strainers (100 μm) | Becton Dickinson | 352340 | |
| 175 and 75 cm2 (T175 and T75) tissue culture flasks | Nunc | ||
| 5 ml, 10 ml, 25 ml sterile serolgical pipettes | any brand | ||
| Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | |||
| tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Sterile scissors and tweezers | |||
| Tube racks | |||
| Pipette-boy or equivalent | |||
| Gilson type pipetters and sterile tips 1,000 µl, 200 µl, 20 µl. | |||
| rocking or shaking incubator (37 °C) | |||
| personal protective equipment | |||
| cleaning solutions (suitable for blood) | |||
| waste containers, correct disposal bins for tissue/blood | |||
| Reagents for MSC characterization | |||
| Antibody (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | Isotype |
| CD73 (AD2) | Miltenyi Biotec | 130-095-183 | Mouse IgG1 |
| CD105 (43A4E1) | Miltenyi Biotec | 130-094-941 | Mouse IgG1 |
| CD90/Thy-1 (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-403 | Mouse IgG1 |
| CD45 (5B1) | Miltenyi Biotec | 130-080-202 | Mouse IgG2a |
| CD34 (AC136) | Miltenyi Biotec | 130-090-954 | Mouse IgG2a |
| HLA-DR (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-298 | Mouse IgG2a |
| CD31 (PECAM-1) | BD Pharmingen | 555446 | Mouse IgG1 |
| CD146 (541-10B2) | Miltenyi Biotec | 130-092-849 | Mouse IgG1 |
| CD44 (DB105) | Miltenyi Biotec | 130-095-180 | Mouse IgG1 |
| Isotype Controls (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | |
| Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-214 | |
| Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-212 | |
| Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
| Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-091-837 | |
| Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-098-849 | |
| MACS Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Osteogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
| DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
| FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
| Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| β-Glycerol Phophate | Sigma | 50020 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | For calcium matrix staining |
| Adipogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
| DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
| FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
| Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
| insulin | Sigma | I2643 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378 | |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine | Sigma | I5879 | |
| Oil Red O solution | Sigma | O1391-250ML | For lipid vacuole staining |
| XY FISH kit to determine fetal or maternal origin of cells | |||
| XY chomosome FISH kit | Vysis (Abbott Molecular) | 07J20-050 | Long name: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Direct Labeled Fluorescent DNA Probe Kit |
References
- Brooke, G., et al. Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells. Semin Cell dev Biol. 18, 846-858 (2007).
- Wei, X., et al. Mesenchymal stem cells: a new trend for cell therapy. Acta Phamacol Sin. 34, 747-754 (2013).
- Ma, S., et al.
- Timmins, N. E., et al. Closed system isolation and scalable expansion of human placental mesenchymal stem cells. Biotechnol Bioeng. 109, 1817-1826 (2012).
- Barlow, S., et al. Comparison of human placenta- and bone marrow-derived multipotent mesenchymal stem cells. Stem Cell Dev. 17, 1095-1107 (2008).
- Jones, B. J., Brooke, G., Atkinson, K., McTaggart, S. J. Immunosuppression by placental indoleamine 2,3-dioxygenase: a role for mesenchymal stem cells. Placenta. 28, 1174-1181 (2007).
- Parolini, O., et al. Toward cell therapy using placenta-derived cells: disease mechanisms, cell biology, preclinical studies, and regulatory aspects at the round table. Stem Cell Dev. 19, 143-154 (2010).
- Benirschke, K., Burton, G. J., Baergen, R. N. Pathology of the Human Placenta. , 6 edn (2012).
- Moore, K., Persaud, T., Torchia, M. The developing human: clinically oriented embryology. , Elsevier/ Saunders. (2013).
- Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem cells. 26, 300-311 (2008).
- Brooke, G., et al. Manufacturing of human placenta-derived mesenchymal stem cells for clinical trials. Brit J Haematol. 144, 571-579 (2009).
- Pelekanos, R. A., et al. Intracellular trafficking and endocytosis of CXCR4 in fetal mesenchymal stem/stromal cells. BMC cell biology. 15, 15 (2014).
- Chen, Y. S., et al. Small molecule mesengenic induction of human induced pluripotent stem cells to generate mesenchymal stem/stromal cells. Stem Cells Transl Med. 1, 83-95 (2012).
- Heazlewood, C. F., et al. High incidence of contaminating maternal cell overgrowth in human placental mesenchymal stem/stromal cell cultures: a systematic review. Stem Cells Transl Med. 3, 1305-1311 (2014).
- Horn, P., Bork, S., Wagner, W. Standardized isolation of human mesenchymal stromal cells with red blood cell lysis. Methods Mol Biol. 698, 23-35 (2011).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol. 2, 83-92 (1974).
- Caplan, A. I.
- Futrega, K., et al. The microwell-mesh: A novel device and protocol for the high throughput manufacturing of cartilage microtissues. Biomaterials. 62, 1-12 (2015).
- Liu, Y., Goldberg, A. J., Dennis, J. E., Gronowicz, G. A., Kuhn, L. T. One-step derivation of mesenchymal stem cell (MSC)-like cells from human pluripotent stem cells on a fibrillar collagen coating. PloS one. 7, 33225 (2012).
- Maleki, M., Ghanbarvand, F., Reza Behvarz, M., Ejtemaei, M., Ghadirkhomi, E. Comparison of mesenchymal stem cell markers in multiple human adult stem cells. Int J Stem Cell. 7, 118-126 (2014).
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
- Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal stem cells: revisiting history, concepts, and assays. Cell stem cell. 2, 313-319 (2008).
- Bianco, P., et al. The meaning, the sense and the significance: translating the science of mesenchymal stem cells into medicine. Nature med. 19, 35-42 (2013).
- Da Silva Meirelles, L., Caplan, A. I., Nardi, N. B. In search of the in vivo identity of mesenchymal stem cells. Stem cells. 26, 2287-2299 (2008).
- Caplan, A. I., Correa, D. The MSC: an injury drugstore. Cell Stem Cell. 9, 11-15 (2011).
- Wegmeyer, H., et al. Mesenchymal Stromal Cell Characteristics Vary Depending on Their Origin. Stem Cell Dev. , (2013).
- Guillot, P. V., Gotherstrom, C., Chan, J., Kurata, H., Fisk, N. M. Human first-trimester fetal MSC express pluripotency markers and grow faster and have longer telomeres than adult MSC. Stem cells. 25, 646-654 (2007).
- Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hemol. 36, 642-654 (2008).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem cell res. 8, 58-73 (2012).
- da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P. C., Nardi, N. B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119, 2204-2213 (2006).
- James, A. W. Review of Signaling Pathways Governing MSC Osteogenic and Adipogenic Differentiation. Scientifica (Cairo). 2013, 684736 (2013).
- Xu, C., et al. Cross-Talking between PPAR and WNT Signaling and Its Regulation in Mesenchymal Stem Cell Differentiation. Curr Stem Cell Res Ther. , (2015).
- Zhuang, H., et al. Molecular Mechanisms of PPAR-gamma Governing MSC Osteogenic and Adipogenic Differentiation. Curr Stem Cell Res Ther. , (2015).
- Moore, K., Persaud, T., Torchia, M. Before We Are Born: Essentials of Embryology and Birth Defects. , Elsevier Health Sciences. 8 edn (2011).
- Zhu, Y., et al. Placental mesenchymal stem cells of fetal and maternal origins demonstrate different therapeutic potentials. Stem Cell Res Ther. 5, 48 (2014).
