En RNA pull-down protokol er optimeret her til påvisning af interaktioner mellem RNA-bindende proteiner (RBP'er) og ikke-kodende samt kodende RNA'er. En RNA-fragment fra androgen receptor (AR) blev anvendt som et eksempel for at vise hvordan man kan hente sin RBP fra lystate af primære brune fedtceller.
RNA-bindende proteiner (RBP'er) dukker op som en regulerende lag i udvikling og funktion af fedt. RBP'er spiller en central rolle i genekspression regulering på posttranskriptionel niveauer ved at påvirke stabiliteten og translationel effektivitet af target mRNA. RNA pull-down teknik er blevet meget anvendt til at studere RNA-protein-interaktion, der er nødvendige for at belyse den mekanisme underliggende (lncRNAs) funktion RBP'er 'samt lange ikke-kodende RNA'er «. Men den høje lipid overflod i adipocytter udgør en teknisk udfordring i at gennemføre dette forsøg. Her en detaljeret RNA pull-down protokol er optimeret til primær adipocyt kultur. Et RNA-fragment fra androgen receptors (AR) 3 'utranslaterede region (3'UTR) indeholdende en adenylat-uridylate-rige elementwas der anvendes som et eksempel for at vise, hvordan man kan hente sin RBP partner, Hur protein fra adipocyt lystate. Den her beskrevne metode kan anvendes til at detektere interaktioner mellemRBP'er og ikke-kodende RNA, samt mellem RBP'er og kodning RNA.
RBP'er er proteiner, der binder til det dobbelte eller enkeltstrenget RNA i celler og deltager i dannelse af RNA-protein-komplekser. RBP'er kan binde en række RNA-arter, herunder mRNA og lange ikke-kodende RNA'er (lncRNAs), og udøve deres indflydelse på post-transkriptionelle niveau. Både RBP'er og lncRNAs dukker op som nye regulatorer i fedtvæv udvikling og funktion 1,2,3. For at forstå den mekanisme af RBP- og lncRNA-medieret regulering af cellulære veje, er det ofte nødvendigt at detektere interaktionen mellem en specifik RNA-molekyle og et eller flere RBP'er, og undertiden at identificere det fulde spektrum af proteinpartnere af en RNA udskrift. Imidlertid kan eksperimentet være udfordrende på grund af det høje indhold af lipider i adipocytter. Den her beskrevne RNA pull-down protokol kan anvendes til at hente de proteinpartnere af en specifik RNA fra adipocyt lysater af primære kulturer 4,5.
Baggrunden for denne protocol opsummeres som følger. Et RNA agn er in vitro transkriberet fra en DNA-skabelon, biotinmærket og konjugeret til streptavidin-belagte magnetiske perler 4. RNA agn inkuberes med cellelysater at tillade dannelsen af RNA-protein-komplekser, der efterfølgende trukket ned på et magnetisk stativ. Mere specifikt RNA pull-down protokol beskrevet nedenfor anvender en RNA-fragment fra AR 3'UTR som lokkemad for at hente Hur protein, et universelt udtrykte RBP bundet til 3'UTR af mRNA'er 6,7, fra theadipocytelysate af primær kultur. For at teste bindingsspecificiteten af denne analyse, er en ikke-relevante RNAas samt tomme streptavidinkugler inkluderet som kontrol. Denne protokol er kompatibel med western blotting eller massespektrometri (MS) for at bekræfte erobringen af en bestemt RBP eller til at identificere den fulde repertoire af tilfangetagne RBP'er henholdsvis 8.
Flere teknikker er tilgængelige til at studere RNA-protein-interaktions. At afsløre RNA'er bundet af en given RBP, RIP (RNA immunpræcipitation) og CLIP (UV tværbinding og immunpræcipitation) kan anvendes. I modsætning til at identificere protein partnere i en given RNA, RNA pull-down, kan anvendes Chirp (kromatin isolation af RNA oprensning), CHART (capture hybridisering analyse af RNA-mål) og RAP (RNA antisense rensning). I sammenligning med de senere dem, RNA pull-down teknik tager mindre indsats for at sætte op. Det kan anvendes til at indfange proteiner in vitro og in vivo. In vivo tilgang af RNA pull-down, som er teknisk mere udfordrende end dens in vitro modstykke, bevarer RNA-protein interaktioner ved tværbinding i celler, indfanger aptamer-mærkede RNA af interesse fra cellerne, og efterfølgende opdager bundne RBP'er. RNA pull-down kan anvendes til at berige lave rigelige RBP'er og at isolere og identificere de RNA-protein-komplekser, der har forskellige funktionelle roller i at kontrollere cellulær regulering 9,10 </sop>.
lncRNAs og RBP'er har afgørende roller i sundhed og sygdom, men de molekylære mekanismer i disse molekyler er dårligt forstået. Identifikation af proteiner, der interagerer med lncRNA molekyler er et vigtigt skridt i retning af at belyse de regulatoriske mekanismer. Berigelse af RBP'er af RNA pull-down assay er baseret på in-opløsning indfangning af interagerende kompleks, således at proteiner fra et cellelysat selektivt kan ekstraheres under anvendelse af biotinylerede RNA lokkemad bundet til streptavidi…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af Singapore NRF fællesskab (NRF-2011NRF-NRFF001-025) samt CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).
Major materials used in this study. | |||
MEGAscript kit | Ambion | ||
Biotin-14-CTP | Invitrogen | ||
NucAway spin columns | Ambion | ||
Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | ||
HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261) | Santa Cruz Biotechnology | ||
Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005) | Santa Cruz Biotechnology | ||
Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free) | HyClone | ||
Phosphate Buffer Saline (1×PBS) | HyClone | ||
RNase inhibitor | Bioline | ||
Protease inhibitor | Sigma | ||
Pfu Turbo DNA polymerase | Agilent Technologies | ||
TRIsure | Bioline | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Major equipment used in this study. | |||
Sorvall Legend Micro 21R centrifuge | Thermo Scientific | ||
Sorvall Legend X1R centrifuge | Thermo Scientific | ||
Bio-Rad T100 thermal cycler | Bio-Rad | ||
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
BOECO rotator Multi Bio RS-24 | BOECO,Germany | ||
Protein gel electrophoresis and blotting apparatus | Bio-Rad | ||
DynaMag-2 magnet | Life Technologies |