Abstract
ארבעה עד שישה בן שבוע, חולדות Wistar זכר שימשו להפקת במודלים של בעלי חיים של פיברוזיס בכבד. התהליך דורש ארבעה שבועות של הממשל של 10 מ"ג / ק"ג dimethylnitrosamine (DMN), נתון intraperitoneally במשך שלושה ימים רצופים בשבוע. זריקות Intraperitoneal בוצעו במנדף כמו DMN הוא hepatoxin ו מסרטן ידוע. יש מודל מספר יתרונות. ראשית, שינויים כבדים ניתן ללמוד ברצף או בשלבים מסוימים של עניין. שנית, בשלב של מחלה כבדה יכול להיות במעקב על ידי מדידה של aminotransferase אלאנין בסרום (ALT) ו aminotransferase aspartate (AST) אנזימים. שלישית, את חומרת הניזק כבד בשלבים שונים יכולה להיות מאושרת על ידי הקרבת חיות בנקודות זמן מיועד, ואחריו בדיקה היסטולוגית של הרקמות הכבדות המוכתמות היונק של מייסון. לאחר ארבעה שבועות של מינון DMN, תוצאת סיסטיק הטיפוסית היא 5 עד 6 בסולם אסחאק. המודל יכול להיות מועתק באופן עקבי כברבשימוש נרחב כדי להעריך את היעילות של תרופות אנטי-fibrotic פוטנציאליים.
Introduction
DMN הוא רעלן ספציפי בכבד חזק. חילוף החומרים, רקמות תפוצתו, והיכולת לגרום לפגיעה כבדה חולדות נמסרו על ידי מגי 1, ואת המכניזם הקשור לניזק hepatocyte מוות של תאים על ידי אפופטוזיס תואר על ידי פריצ'רד ובאטלר 2. ממשל לסירוגין של המתחם הזה נמסר לגרום פיברוזיס כבד כלבים וחולדות 3,4.
המנגנונים ושינויים מורפולוגיים של הפיברוזיס נחקרו בהרחבה באמצעות מודל זה. במחקרים מוקדם באמצעות עכברוש, 3 שבועות טיפול עם DMN מיוצר נמק המורגי centrilobular ואחריו שחמת micronodular ללא steatosis 5. זה היה הראה כי ב סיסטיק מוקדם, קולגן נוצר היה יותר לחצות מקושר עם הסוג III להיות בולט יותר מסוג I 6. במשותף עם גורמים אחרים, שינויים fibrotic הנגרמת DMN היו קשורים עם עלייה תאים Kupffer; מקרופאגים כבדים הנמצאים in את sinusoids. תאים אלה morph לתוך myofibroblasts לייצר כמויות עודפות של תאי מטריקס המהווה את הבעיה העיקרית ב סיסטיק 7.
מבחינת איתות הסלולר, נקמורה et al., הוכיחו כי TGF-β משחק תפקיד קריטי בהתקדמות של הכבד סיסטיק 8. הם השתמשו אדנו לבטא קולטן TGF-β II סוג קטום, לעכב באופן ספציפי איתות TGF-β. פיברוזיס כבד חולדות אלה נבלם בצורה מרהיבה במהלך טיפול DMN בהשוואה לקבוצות ביקורת. מחקרים אחרים אשרו כי דיכוי TGF-β מוביל קל של פיתוח כבד סיסטיק 9,10. המודל גם שימש במחקר פרופיל גנטי העולמי לזהות סמנים סיסטיק אחרים וחלבונים אשר יכול לשמש מטרה לתרופות לטיפול אנטי-fibrotic 11.
חומרים כימיים אחרים המשמשים כדי לעודד פיברוזיס בכבד כוללים thioacetamide (TAA) ו- Cטטרא arbon (CCL 4). TAA שימש לראשונה אצל חולדות מאוחר יותר בעכברים 12. היתרונות של מודל זה כוללים: קלות ההעברה כימית במי שתייה, השחזור של המודל עם שחמת micronodular מאפיין ושינויים ביוכימיים. החסרונות כוללים: תקופת הזמן של 3 חודשים עבור פיברוזיס כבד לפתח וחוסר ההבנה של המנגנון המולקולרי לזירוז של פיברוזיס בכבד. באשר CCl 4, השימוש בו ירד מהסיבות הבאות: זה לא לחקות מחל כבד אנושיות, יש השפעות מזיקות על שכבת האוזון, גורם לכאב ומצוקה לבעלי חיים, הוא מאוד רעיל לבני אדם ומחייב זהירות בטיפול שלה לרשות 13,14.
חסימת דרכי המרה ממושך (על ידי התערבות כירורגית) כמודל ניסיוני עבור שחמת הכבד דווח לראשונה על ידי Kountouras et al. 15. שיטה זו היא רעילה לבני אדם ובעלי חיים. However, הזמן הנדרש הפיברוזיס לפתח משתנה. סקירה של 30 דוחות על ידי Marques et al. 16, נמצאה כי זה לקח מן שבעה ימים עד ארבעה שבועות לאחר ניתוח עבור פיברוזיס כבד לפתח. השינויים הפתולוגיים תארו לחקות את אלה של סיסטיק המר אדם כרוני המודל יהיה מתאים יותר עבור חוקרים המעוניינים בתחום זה.
לסיכום, הממשל לסירוגין מינון קבוע של DMN בחולדה מעל 4 שבועות מייצר הפיברוזיס מחקת המחלה האנושית. חולדות במינון להראות התפתחות הדרגתית של הפיברוזיס נזק parenchymal 4,17. התקדמות וחומרת המחלה יכולה להיות פיקוח באמצעות דגימות דם או הקרבת בעלי חיים בנקודות ספציפיות זמן ההשפעה היא מאוד לשחזור 18. לכן המודל כבר בשימוש נרחב כדי לחקור את המנגנונים של סיסטיק הכבד שחמת וכן להקרין לסוכני פוטנציאל אנטי fibrotic 10,19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ולשימוש חיה של בית הספר למדע שימושי, Temasek הפוליטכני.
1. הכנת DMN
- פיפטה 200 μl של DMN (1 גר '/ מ"ל פתרון המניות) ולהוסיף 19.8 מ"ל של PBS להכין פתרון DMN 10 מ"ג / מ"ל עבור הזריקה.
הערה: DMN הוא מסרטנים. השתמש במנדף להכין את DMN ולבצע זריקות חיה.
2. הזרקת Intraperitoneal של DMN
- השתמש חולדות Wistar זכרו עם משקל ממוצע של 150 - 200 גרם. לאקלם חולדות במשך 4 - 7 ימים לפני תחילת הניסוי.
- לשמור על חולדות בטמפרטורת חדר של 22 ± 1 ° C, עם 12 אור hr ו -12 שעות מחזורים כהים. ספק צ'או חולדה כרצונך מים.
- מדוד צריכת מזון ומים מדי יום. מדוד שבועי משקל גוף.
- לחשב את הסכום של DMN לכל חולדה מבוסס על מינון של 10 מ"ג / ק"ג משקל גוף. השתמש מזרק 1 מ"ל עם חולצת מחט 25 מדo לצייר את הנפח המחושב של פתרון DMN לתוך המזרק.
- לרסן את העכברוש להזרקה intraperitoneal 21.
- עם מאופק העכברוש כראוי, להציג את המחט לתוך ברבע הימני התחתון של הבטן, לסגת על הבוכנה של המזרק (שום דבר לא צריך להיות aspirated) כדי לבדוק את המיקום המתאים של מחט בתוך המרחב בטן להזריק פתרון DMN לאט.
- כאשר המינון של DMN כבר מנוהל, לאט למשוך את המחט ולהיפטר לפח החד.
- בצעו את זריקות intraperitoneal של DMN במשך 3 ימים רצופים בשבוע במשך 4 שבועות. נהל את הזריקות באותו זמן בכל יום. Re-לחשב את המינון מבוסס על משקל גוף בתחילת כל שבוע של זריקות.
- איסוף דם משבועון וריד הזנב למדוד פרמטרים ביוכימיים: aminotransferase אלאנין (ALT) ו aminotransferase aspartate (AST) 22.
- ALT ו- AST בסרום מדוד באמצעות Vet מסחרימנתח כימית מבחן.
בחינת גרוס 3. קציר של הכבד
- להרדים את החולדות על ידי הזרקת intraperitoneal של pentobarbital במינון של 100 מ"ג / ק"ג משקל גוף. ודא למוות על ידי בדיקת העדר דופק.
- היכונו פוסט מורטם ולהעריך את מצבו של החיה כפי שתואר על ידי פרקינסון et al. 23 עכברושים מתים מקום ללוח לנתח שכיבה על הגב עם הבטן כלפי מעלה.
- לחטא ו ללחלח את העור עם 70% אתנול.
- בעזרת מספריים, לחתוך את העור אורכו של ventrum מפי הטבעת אל הסנטר, ומשקפים את העור. עם מספריים, לחתוך את דופן הבטן מפי הטבעת אל הסחוס xiphoid, לחשוף את הקרביים בטן.
- בדוק את אברי הבטן באתרו כדי לבדוק את כל חריגות. הערה כל שינוי בצבע, בגודל, מיקום איברים ואת הנוכחות של נוזל בתוך חלל הצפק. לִבחוֹן העקביות של איברים לציין את נוכחותו של כל ריחות.
- בעזרת מספריים מלקחיים, לנתח את בחינם הכבד כולו של הרצועות ונספחיו.
- תחילתו של מסלול hilus שבו היא מחוברת הסרעפת ולעבוד לשחרר את כל האונה של הכבד של קבצים מצורפים. בזהירות לחתוך את כל הרצועות וכלי דם.
- מעבירים את הכבד על צלחת פטרי ולשקול את הכבד.
- באמצעות אזמל, לחתוך 2 - חלקים עבים 5 מ"מ של אונה של הכבד. לקבלת עקביות, תמיד לקחת דגימות מאותו האונה הכבדה. קח טריז כ -5 מ"מ קוטר עובי, מהאונה לרוחב תקין 24 כ -1 ס"מ מהקצה של המקום lobe.Immediately לתוך פורמלין 10% שנאגרו עבור קיבעון. ודא הרקמה נפח פורמלין היא 1:10 או יותר.
- קציר ומיד להקפיא חלקים (באמצעות חנקן נוזלי) של אונה של הכבד בשלב זה אם נדרש מחקרים אחרים. באשר (3.8), מדגם מאותה האונה כבדה לעקביות.
ילדה = "jove_title"> 4. עיבוד, טבעת ואת החתך של הכבד
- תקן דגימות כבד בפורמלין 10% שנאגרו למשך תקופה מינימלית של 24 שעות.
- לאחר קיבוע, חתוך את הכבד, להציב לתוך קלטות ומעלה אותם לתוך הסל של מעבד רקמות האוטומטית.
- מניחים את הסל עם קלטות לתוך התחנה הראשונה המכיל 10% שנאגרו פורמלין. ודאו הקלטות שקועות לגמרי. הם יכולים להישאר בחדר הזה עד 12 שעות עד המחזור מתחיל.
- לתכנת את מעבד הרקמות כדי לסובב את הקלטות עבור שעת 1 כל אחד, באמצעות תחנות רצופות המכילות את הפתרונים הבאים: אתנול בריכוזים של 50%, 70%, 90%, 100% (2 תחנות), קסילן (2 תחנות) פרפין נוזלי ( 2 תחנות).
- העברת הדגימות הכבדות לאמבטית השעווה של תחנת ההטבעה. ודא שמכשיר ההטבעה מופעל לפחות קודם לכן שעה אחת.
- מלקחיים מחומם מראש באמצעות (65 מעלות צלזיוס), הסר כל קלטת מן wאמבטיה ומקום גרזן לצלחת החמה (65 מעלות צלזיוס) של מכונה ההטבעה. לוותר כמות מספקת של פרפין נוזלי לתוך תבנית בסיס נירוסטה (מחומם מראש ל 65 מעלות צלזיוס) עד חצי מלא. מעבירים את החלק של הכבד מתוך הקלטת לתוך התבנית. ודא הדגימה ממוקמת עם המשטח לחתוך (להיבדק מיקרוסקופי) שטוח על החלק התחתון של התבנית.
- ממלאים את התבנית לחלוטין עם פרפין נוזלי, לעלות על קלטת ריקה על גבי ולמקם את התבנית על צלחת 4 ° C. של המכונה הטבעה להתקרר במשך 30 דקות לפחות.
- בדוק כי השעווה מתקררת הקרושה, ולהסיר את בלוק פרפין מהתבנית. הבלוק צריך לקפוץ בקלות ולא להיצמד או סדק. אם זה יקר, להמס את הגוש וחזור על שלב זה. בלוק פרפין יכול להיות מחולק פעם זה מבצר. בלוקים ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר במשך שנים רבות.
- מניחים את גוש פרפין לתוך microtome וסעיף 10 מיקרומטר עובי עד שהשכבה שעווהמוסר מספיק עבור רקמת הכבד מוטבעת להיות גלויה.
- שנו את ההגדרה על microtome לחתוך בכל 5 מיקרומטר עובי. בעזרת מלקחיים, להרים את החלק לחתוך היטב על ידי מחזיק אותו בקצה ובזהירות לצוף בסעיף באמבט מים בטמפרטורה של C ° 40.
- בעדינות במקום שקופית זכוכית נקיה תחת הסעיף צף והרם אותו על פני השטח של שקופיות הזכוכית. מניחים את השקף לשקופית חם ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
5. מאסון Trichrome מכתים
- לפני החלת כתמים, לטפל השקופיות כדי להסיר את השעווה רעננותם הרקמות כדלקמן:
- לטבול את הסעיפים קסילן במשך 5 דקות. חזור 2x.
- לטבול את הסעיפים אתנול 100% במשך 3 דקות. חזור 1x.
- לטבול את סעיפים 1 דקות כל אחד הפתרונות הבאים של אתנול: 90%, 80% ו -70%.
- יש לשטוף את השקופית תחת מי ברז כדי להסיר כל אתנול הקיים בשקופית.
- לטבול שקופיות הברזל Hematoxylin במשך 10 דקות להכתים את הגרעין.
- יש לשטוף את השקופיות במים כדי להסיר את הכתם עודף משקופית.
- לטבול את השקופיות Biebrich סקרלט-חומצה Fuchsin למשך 2 דקות להכתים את הציטופלסמה.
- יש לשטוף את השקופיות עם מים.
- מניח את שקופיות Phosphotungstic / Phosphomolybdic חומצת פתרון במשך 10 דקות כדי לקדם את הספיגה של כחול אנילין. שנה את פתרון חומצת Phosphotungstic / Phosphomolybdic אחרי 2 סיבובי שימוש.
- מניחים את השקופיות פתרון כחול אנילין במשך 10 דקות להכתים את סיבי הקולגן.
- יש לשטוף את הכתם עם עודף מים ומניחים את שקופיות פתרון חומצה 1% אצטית עבור 1 דקות כדי לאפשר בידול להתקיים כדי להבהיר את הצבע של השקופית יותר עדין ושקוף.
- יש לשטוף את השקופיות עם מים והמשך מייבש את סעיפי רקמות. צעדי ההתייבשות הם כדלקמן:
- לטבול את השקופיות ברציפות במשך 10 שניות בכל פעם, ב conce הבאntrations של אתנול: 70%, 80%, 95% ו -100%.
- לטבול את השקופיות עבור 30 שניות באתנול 100%. חזור 1x.
- יש לשטוף את השקופיות באמצעות 3 תחנות של קסילן במשך 5 דקות כל אחד כדי להסיר אתנול.
- הר להחליק כיסוי זכוכית על הדגימה עם תקשורת הרכבה (למשל, DPX mountant) ולאפשר לו להתייבש.
הערה: DPX הוא שרף סינטטי שמתייבש מהר, שומר כתם ומגן על קטע הרקמה.
6. ניקוד פיברוזיס על סעיפים ויטראז יונקת של מהאסון של כבד
- יש פתולוג וטרינרי להעריך את חומרת סיסטיק פי סיסטיק להבקיע 25. זה יהיה אופטימלי אם ניקוד סיסטיק נעשה על ידי שניים או שלושה פתולוגים עצמאיים באופן עיוור. בתרחיש כזה, להשיג תוצאה סופית לאחר דיון וסקירת קבוצה למיין את כל הבדלים בשערו.
| ציון | תיאור |
| 0 | אין סיסטיק |
| 1 | הרחבה סיבית של כמה תחומי פורטל, עם או בלי septa הסיבי קצר |
| 2 | הרחבה סיבית על רוב אזורי פורטל, עם או בלי septa הסיבי קצר |
| 3 | הרחבה סיב תחומי הפורטל ביותר, פורטל מזדמן פורטל (PP) גישור |
| 4 | הרחבה סיב תחומי פורטל עם גישור מסומן (פורטל פורטל (PP) וכן לפורטל (מחשב מרכזי) |
| 5 | מסומן גישור (PP ו / או PC) עם גושים מזדמנים (שחמת שלמה) |
| 6 | שחמת, סביר או מובהק |
טבלת 1: פיברוזיס ניקוד המשמשת קריאת הסעיפים הכבדים ויטראז היונקת של מייסון 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חולדות DMN מטופלים לרדת במשקל ולהיות פחות נמרץ עם מעייל שיער פרוע. יש אובדן משמעותי משקולות הגוף הממוצע של חולדות שטופלו DMN; הראשון לזיהוי לאחר 2 שבועות של טיפול DMN, וההבדל הזה נשאר דרך שבועות 3 ו -4 לאחר טיפול DMN (איור 1 א). כמו החולדות לקבל DMN בשבועות רצופים, פגיעה בכבד וגורמת לו להיות קטן יותר. המדד הכבד; המהווה את אחוז ממשקל כבד במשקל הגוף הסופי היה נמוך משמעותית עבור החולדות שטופלו DMN (איור 1b).
איור 1: א) משקולות גוף של DMN שטופלו חולדות. הנתונים מוצגים כאילו הם אמצעי ± סטיית תקן (n = 6 - 8). * P <0.05 לעומת קבוצת ביקורת רגילה ב) מדד כבד.; משקל כבד אחוזים ממשקל הגוף הסופי של DMN שטופלו חולדות לאחר 4 שבועות של tre DMNatment. הנתונים מוצגים כאילו הם אמצעי ± סטיית תקן (n = 6 - 8). * P <0.05 לעומת קבוצת ביקורת רגילה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
מתוך הקרבה, לאחר 4 שבועות של טיפול DMN, הכבד הוא קטן יותר (איור 2 א) בהשוואה לאלו מחיות מקבוצת הבקרה בגילאי (איור 2b). הפיברין רשאי להיות נוכח על פני השטח של הכבד או אונה כבדה סמוכה הם דבקו. כ -20% של חולדות יש מיימת.
איור 2: א) כבד של חולדה לאחר 4 שבועות של טיפול DMN ב) כבד מן החולדה מקבוצת הבקרה בגילים.. ב (א) את הכבד הוא מצומק, חברה וחיוורת עם גוון צהבהב בהשוואה הכבדההמשליטה המתאימה בגיל שלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
פגיעה בכבד גורמת חדירה מוגברת של קרום תא hepatocyte. ALT ו- AST בסרום מוגבר הם אינדיקטורים של ניזק hepatocyte. סרום ALT (איור 3 א) ו AST (איור 3 ב) של הקבוצה שטופלה DMN גבוה באופן משמעותי מאשר בקבוצת הביקורת לאחר שבועות 2 ו -4 של הזרקת DMN. רמות ALT ו- AST סרום בדרך כלל להגדיל לאחר כל שבוע של טיפול DMN.
איור 3: א) aminotransferase אלאנין סרום (ALT) ו- B) aminotransferase בסרום aspartate (AST) רמות של חולדות שטופלו DMN בשבועות 0, 2 ו -4 לאחר ההזרקה DMN האחרון. הנתונים הם represented כאמצעי ± סטיית תקן (n = 6 - 8). * P <0.05 לעומת קבוצת ביקורת רגילה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בדיקה היסטולוגית של כבדי חולדות שטופלו DMN מראים כי יש עלייה והתרחבות הדרגתית של septa סיביים, עם הפסד של hepatocytes, לאורך זמן לעומת חולדות שליטה. יונק הכתם של מייסון משמש בדרך כלל כדי להדגיש פיקדונות הקולגן ברקמת כבד: אלה הם מוכתמים כחולים.
איור 4: Photomicrographs של סעיפים כבדים מרוחה של יונקת מהאסון: א) סעיף כבד מפני עכברוש שליטה נורמלי; ב) סעיף כבד מפני עכברוש לאחר קבלת 1 בשבוע של dimethylnitrosaminדואר (DMN); ג) סעיף כבד מפני עכברוש לאחר קבלת 2 שבועות של DMN. יש רחבה סיבית תחומי הפורטל ביותר עם פורטל מזדמן פורטל גישור. ד) סעיף כבד של חולדה לאחר קבלת 3 שבועות של DMN. הערת ההתרחבות הסיבית תחומי פורטל עם פורטל בולט פורטל וכן לפורטל גישור המרכזי. ה) סעיף כבד של חולדה לאחר קבלת 4 שבועות של DMN. יש שחמת עם היווצרות גולה. כבד השליטה הוא מהקבוצה הקריבה יחד עם חולדות לאחר 4 שבועות של הזרקת DMN. יש דפוס של עלייה הדרגתית של ציון סיסטיק בין 0 ב (א); 2 ב (ב); 3 ב (ג) 4 (ד) כדי 5/6 ב (ה). כל photomicrographs צולם בהגדלה של 40X עם 1 יחידת אורך שווה ערך סרגל קנה מידה ל -100 מיקרומטר. אנא גללקק כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תיארנו שיטה לעשות במודל חיה של פיברוזיס בכבד ועל מנת להעריך את חומרת הפיברוזיס. חשוב לספק את המינון הנכון של DMN ו לדבוק בלוח הזמנים של זריקות intraperitoneal שבועיות. ככל שהניסוי מתקדם, חשוב לשקול את החולדות מחדש לחשב את המינון בתחילת כל שבוע של זריקות DMN. זכור כי DMN הוא רעילים צריך להיות מטופלים בקבינט הקטר. אנו מבצעים את זריקות intraperitoneal בקבינט הקטר גם כן. עם הצורך זריקות חוזרות ונשנות, איפוק הנכון והטכניקה של הזרקת חשוב להימנע כניסתה של מזהמים ונזק לאיברים פנימיים. יש לנו לעתים רחוקות תמותה מן הזריקות intraperitoneal.
חולדות צריכות להיות במעקב 2x יום לאורך כל תקופת הניסוי. במהלך השבוע האחרון של הזרקת DMN, חיות יש לשים לב אפילו בתדירות גבוהה יותר לב לסימנים גוססים. זהו פריod כאשר הניזק כבד הוא חמור ביותר וחולדות מושפעות תהיינה inappetent, לאבד משקל גוף ומצבו. 25 - 40% של חולדות יכולים להיות חולים קשה בתקופה זו ולמות אם אין התערבות וטרינרית. לפיכך מעקב צמוד מאפשר לחוקר להעריך את מצבו של בעל החיים ולתכנן סיום הולם של הניסוי כדי שאיברים ניתן לקצור טרי מן עכברוש מורדם במקום ללכת לאיבוד כדי ריקבון ממוות לא צפוי.
מצאנו מדידה שבועית של רמות ALT ו- AST להיות אינדיקטורים שימושיים של התקדמות הניזק כבד. ראינו גם כי AST הוא פחות ספציפי מאשר ALT ו מייחסים זאת השקתו אריתרוציטים הפגומים רקמת שריר בנוסף כבד.
ודא כי נפח הדם מספיק נאסף להניב את הנפח הנדרש בסרום לניתוח. אנחנו בדרך כלל לאסוף 200 - 300 μl של דם לכל חולדה.
במהלך גollection של רקמת כבד לצורך בדיקה היסטולוגית, אנו ממליצים על מדגם לקבל מאותו האונה. הדבר נעשה לאחר בדיקת שהשינויים בכבד הם אחידים. DMN גורם לשינויים כלליים בכבד. בשלבים המוקדמים של המחקר, טעמנו מן האונות לרוחב המדיאלי השמאליות וכן את האונה הימנית המדיאלי. אנחנו לא צופים שום הבדלים בשינויים מיקרוסקופיים בין האונות הללו.
צריכים להיות קבועים סעיפים כבדים בפורמלין 10% שנאגר במשך שעה לפחות 24 ומעובד קצר לאחר מכן. טבילה ממושכת מעבר בשבוע יכולה לגרום הרקמה הופכת פריך וקשה סעיף לאחר הטבעת פרפין. חיתוך חלקים דקים 5 מיקרומטר מתאימים דורש אימון וסבלנות. מדורים כי מוערכים להיות מתאים בעין בלתי מזוינת (שלב 4.11) ניתן לבדוק עם מיקרוסקופ כדי לבדוק כי אין להם חפצים כמו קפלי או דמעות בתוך הקטע. ההליך המכתים הושלם טובת t פיo תקופות הזמן לטבילה שקופית בכל שלב ללא הפסקות מנוחה. במהלך התהליך המכתים, להבטיח כי אותם הקטעים נשמרים לחים בכל העת והועברו מפתרון מכתים אחד למשנו בהקדם האפשרי.
הערכת הסעיפים המוכתמים היונק של מאסון עבור מידת סיסטיק דורשת ההזנה של פתולוג וטרינרים. הוא / הוא חבר צוות מכריע אשר צריך להיות חלק במחקר מההתחלה, כפי שהוא / הוא יוכל לייעץ ולהשתתף הקצירה הנכונה של איברים בכל שלבי הניסוי. לפיכך תקן הזהב הנוכחי עבור הניקוד הכבד סיסטיק הוא הערכת סעיפים רקמה צבעונית כראוי על ידי פתולוג. למרות שזה יהיה אופטימלי כדי לקבל את הקלט של יותר מ פתולוג אחד, זה לא יכול להיות אפשרי בארגונים קטנים. במקרים כאלה, את האובייקטיביות ניתן לשפר על ידי שימוש בטכנולוגיות הדמיה 26. מצאנו כי תוצאות טכנולוגיית הדמיהניתנות להשוואת ניקוד פתולוגי (נתונים שלא פורסמו), ולהמליץ שזה לשמש כשיטה ההערכה משלימה.
לסיכום, המודל המושרה DMN של הפיברוזיס יש יתרונות רבים על פני במודלים של בעלי חיים אחרים. זהו מודל קל יחסית לעשות כפי שהוא אינו דורש מיומנויות כירורגיות. DMN לסביבה בטוח יותר ופחות רעיל לבני אדם ובעלי חיים מ CCl 4 ולוקח זמן קצר כדי לגרום מחלה מאשר TAA. לעומת מחלות כבד המיוצר על ידי CCl 4, TAA, קשירת צינור המרה, DMN מייצר ייצוג קרוב של סיסטיק הכבד האנושי. מסיבות אלה, אנו צופים כי המודל ימשיך להיות בשימוש נרחב כדי לחקור את המנגנונים של פיברוזיס בכבד וכן למסך בחומרים אנטי fibrotic פוטנציאליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethylnitrosamine | Wako | 147-03781 | |
| Formalin | Sinopharm chemicals | F63257009 | |
| Ethanol | Sigma | 64-17-5 | |
| Xylene | Fisher | 1330-20-7 | |
| Masson trichome stains | |||
| Aniline Blue | Electron Microscopy Sciences | #42755 | |
| Acid Fuschin | Electron Microscopy Sciences | RT42685 | |
| Scarlet Red | Electron Microscopy Sciences | #26905 | |
| Phosphotungstic Acid Hydrate | ALFA AESAR | ALFA40116.4 | |
| Phosphomolybdic Acid Hydrate | Sigma SG | 221856-25G | |
| Weigert's Iron Hematoxilyn | Merck | 1.15973.0002 | |
| DPX Mounting Medium | Merck | HX066873 | |
| Tissue processor | Leica | Leica TP 1020 | |
| Embedding machine | Sakura | Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System | |
| Microtome | Leica | Leica RM 2235 | |
| Vet Test Analyzer | Idexx | Vet Test 8008 |
References
- Magee, P. N. Toxic liver injury; the metabolism of dimethylnitrosamine. Biochem J. 64 (4), 676-682 (1956).
- Pritchard, D. J., Butler, W. H. Apoptosis-the mechanism of cell death in dimethylnitrosamine-induced hepatotoxicity. J Pathol. 158 (3), 253-260 (1989).
- Madden, J. W., Gertman, P. M., Peacock, E. E. Dimethylnitrosamine-induced hepatic cirrhosis: a new canine model of an ancient human disease. Surgery. 68 (1), 260-267 (1970).
- Jenkins, S. A., Grandison, A., Baxter, J. N., Day, D. W., Taylor, I., Shields, R. A dimethylnitrosamine-induced model of cirrhosis and portal hypertension in the rat. J Hepatol. 1 (5), 489-499 (1985).
- Jézéquel, A. M., Mancini, R., Rinaldesi, M. L., Macarri, G., Venturini, C., Orlandi, F. A morphological study of the early stages of hepatic fibrosis induced by low doses of dimethylnitrosamine in the rat. J Hepatol. 5 (2), 174-181 (1987).
- George, J., Chandrakasan, G. Molecular characteristics of dimethylnitrosamine induced fibrotic liver collagen. Biochim Biophys Acta, Protein Struct Mol Enzymol. 1292 (2), 215-222 (1996).
- Winwood, P. J., Arthur, M. J. Kupffer cells: their activation and role in animal models of liver injury and human liver disease. Semin Liver Dis. 13 (1), 50-59 (1993).
- Nakamura, T., Sakata, R., Ueno, T., Sata, M., Ueno, H. Inhibition of transforming growth factorβ prevents progression of liver fibrosis and enhances hepatocyte regeneration in dimethylnitrosamine-treated rats. Hepatology. 32 (2), 247-255 (2000).
- Shek, F. W., Benyon, R. C. How can transforming growth factor beta be targeted usefully to combat liver fibrosis? Eur J Gastroenterol Hepatol. 16 (2), 123-126 (2004).
- Wang, J. H., Shin, J. W., Son, J. Y., Cho, J. H., Son, C. G. Antifibrotic effects of CGX, a traditional herbal formula, and its mechanisms in rats. J Ethnopharmacol. 127 (2), 534-542 (2010).
- Su, L. J., Hsu, S. L., Yang, J. S., Tseng, H. H., Huang, S. F., Huang, C. Y. F. Global gene expression profiling of dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis: from pathological and biochemical data to microarray analysis. Gene Expr. 13 (2), 107-132 (2006).
- Müller, A., Machnik, F., Zimmermann, T., Schubert, H. Thioacetamide-induced cirrhosis-like liver lesions in rats usefulness and reliability of this animal model. Exp Pathol. 34 (4), 229-236 (1988).
- Martinez-Hernandez, A. The hepatic extracellular matrix. II. Electron immunohistochemical studies in rats with CCl4-induced cirrhosis. Lab Invest. 53 (2), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3894794 166-186 (1985).
- Pritchard, M. T., Apte, U. Models to Study Liver Regeneration. Liver Regeneration. , 15-40 (2015).
- Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
- Marques, T. G., Chaib, E., et al. Review of experimental models for inducing hepatic cirrhosis by bile duct ligation and carbon tetrachloride injection. Acta Cir Bras. 27 (8), 589-594 (2012).
- Wasser, S., Tan, C. E. Experimental models of hepatic fibrosis in the rat. Ann Acad Med Singapore. 28 (1), 109-111 (1999).
- George, J., Chandrakasan, G. Biochemical abnormalities during the progression of hepatic fibrosis induced by dimethylnitrosamine. Clin Biochem. 33 (7), 563-570 (2000).
- Shimizu, I., Ma, Y. R., et al. Effects of Sho-saiko-to, a Japanese herbal medicine, on hepatic fibrosis in rats. Hepatology. 29 (1), 149-160 (1999).
- Wang, Y., Gao, J., Zhang, D., Zhang, J., Ma, J., Jiang, H. New insights into the antifibrotic effects of sorafenib on hepatic stellate cells and liver fibrosis. J Hepatol. 53 (1), 132-144 (2010).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat. J Vis Exp. (99), (2015).
- Parkinson, C. M., O'Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. J Vis Exp. (54), (2011).
- Ruehl-Fehlert, C., Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Ishak, K., Baptista, A., et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol. 22 (6), 696-699 (1995).
- Sant'Anna, L. B., Sant'Anna, N., Parolini, O. Application of computer assisted image analysis for identifying and quantifying liver fibrosis in a experimental model. J Comput Interdiscip Sci. 2 (2), 139-148 (2011).
