Abstract
Fire til seks uger gamle, blev Wistar-hanrotter anvendes til fremstilling af dyremodeller for leverfibrose. Processen kræver fire ugers indgivelse af 10 mg / kg dimethylnitrosamin (DMN), givet intraperitonealt tre på hinanden følgende dage om ugen. Intraperitoneale injektioner blev udført i stinkskab som DMN er et kendt hepatoxin og kræftfremkaldende. Modellen har flere fordele. For det første kan leverforandringer studeres sekventielt eller på bestemte stadier af interesse. For det andet kan den fase af leversygdom overvåges ved måling af serum-alanin-aminotransferase (ALT) og aspartataminotransferase (AST) enzymer. For det tredje kan sværhedsgraden af leverskade på forskellige stadier bekræftes ved aflivning af dyr på udpegede tidspunkter, efterfulgt af histologisk undersøgelse af Massons trichome farvede levervæv. Efter fire ugers DMN dosering, den typiske fibrose score er 5 til 6 på Ishak skalaen. Modellen kan reproduceres konsekvent og har væretalmindeligt anvendt til at vurdere effektiviteten af potentielle anti-fibrotiske midler.
Introduction
DMN er en potent leveren specifikke toksin. Dens stofskifte, væv fordeling, og evne til at forårsage skade på lever af rotter blev rapporteret af Magee 1, og mekanismen for hepatocyt skader og celledød ved apoptose blev beskrevet af Pritchard og Butler 2. Intermitterende indgivelse af denne forbindelse blev rapporteret at inducere leverfibrose hos hunde og rotter 3,4.
De mekanismer og morfologiske forandringer af leverfibrose er blevet omfattende undersøgt ved anvendelse af denne model. I tidlige undersøgelser under anvendelse af rotte, 3-ugers behandling med DMN produceret centrilobulær hæmoragisk nekrose efterfulgt af mikronodulær cirrose uden steatose 5. Det blev vist, at i begyndelsen af fibrose, det dannede collagen var mere tværbundet med type III er mere fremtrædende end type I 6. Til fælles med andre årsager, blev DMN-induceret fibrotiske forandringer forbundet med en stigning i Kupffer-celler; hepatiske makrofager, der bor in sinusoider. Disse celler morph i myofibroblaster og producere store mængder af ekstracellulær matrix, som er det primære problem i fibrose 7.
Med hensyn til cellulær signalering, Nakamura et al. Viste, at TGF-β spiller en kritisk rolle i progressionen af leverfibrose 8. De brugte et adenovirus, der udtrykker en trunkeret type II TGF-β-receptor, til specifikt at inhibere TGF-β-signalering. Leverfibrose i disse rotter spektarkulært standset under DMN behandling sammenlignet med kontrolgrupper. Andre undersøgelser har bekræftet, at undertrykkelse af TGF-β fører til lindring af leverfibrose udvikling 9,10. Modellen blev også anvendt i en global gen profilering undersøgelse for at identificere andre fibrose markører og proteiner, som kan anvendes som lægemiddelmål for anti-fibrotisk terapi 11.
Andre kemiske midler, som anvendes til at inducere leverfibrose omfatter thioacetamid (TAA) og cArbon tetrachlorid (CCI4). TAA blev brugt først i rotter og senere i mus 12. Fordelene ved denne model omfatter: nem kemisk indgivelse i drikkevand, reproducerbarheden af modellen med karakteristiske mikronodulær cirrose og biokemiske ændringer. Ulemperne omfatter: den lange periode på 3 måneder for leverfibrose at udvikle og manglende forståelse af den molekylære mekanisme for induktion af leverfibrose. Som for CCI4, har dens anvendelse faldet af følgende grunde: det ikke efterligne menneskelige leversygdom, har skadelige virkninger på ozonlaget, forårsager smerte og lidelse for dyrene, er meget giftige for mennesker og kræver ekstra forholdsregler i dens håndtering og bortskaffelse 13,14.
Langvarig galdegang obstruktion (ved et kirurgisk indgreb) som en eksperimentel model for levercirrhose blev først rapporteret af Kountouras et al. 15. Denne metode er ikke-toksiske for mennesker og dyr. However, den nødvendige tid til leverfibrose at udvikle varierer. En gennemgang af 30 rapporter fra Marques et al. 16, fandt, at det tog fra syv dage til fire uger efter operation for leverfibrose at udvikle sig. De patologiske ændringer, der er beskrevet efterligner dem af human kronisk galde fibrose og modellen ville være mere velegnet til forskere interesseret i dette område.
Sammenfattende den intermitterende indgivelse af en konstant dosis af DMN i rotten over 4 uger producerer leverfibrose, der efterligner den humane sygdom. Doserede rotter viser gradvise udvikling af leverskade og parenkymalt fibrose 4,17. Sygdomsprogression og sværhedsgraden kan overvåges via blodprøver eller ofring af dyr på bestemte tidspunkter, og effekten er meget reproducerbar 18. Således modellen har været meget anvendt til at undersøge mekanismerne ved leverfibrose og cirrose samt til at screene for potentielle anti-fibrotiske midler 10,19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter dyr blev godkendt af pasning af dyr og brug udvalg af School of Applied Science, Temasek Polytechnic.
1. Udarbejdelse af DMN
- Pipetter 200 pi DMN (1 g / ml stamopløsning) og tilsæt 19,8 ml PBS til fremstilling 10 mg / ml DMN opløsning til injektion.
Bemærk: DMN er kræftfremkaldende. Brug en emhætte for at forberede DMN og udfører dyret injektioner.
2. intraperitoneal injektion af DMN
- Brug Wistar hanrotter med en gennemsnitlig vægt på 150-200 g. Akklimatisere rotter i 4 - 7 dage før starten af forsøget.
- Oprethold rotter ved stuetemperatur på 22 ± 1 ° C, med 12 h lys og 12 timers mørke cyklusser. Tilvejebringe rottefoder og vand ad libitum.
- Mål mad og vand indtag dagligt. Mål legemsvægt ugentligt.
- Beregne mængden af DMN for hver rotte baseret på en dosis på 10 mg / kg legemsvægt. Brug en 1 ml sprøjte med en 25 gauge nål to trække den beregnede mængde af DMN opløsning ind i sprøjten.
- Begrænse rotten til intraperitoneal injektion 21.
- Med rotte korrekt fastspændt, indføre nålen ind i den nedre højre kvadrant af maven, trække tilbage i stemplet af sprøjten (intet skal aspireret) at kontrollere, om den korrekte placering af nålen i den abdominale rum og langsomt injicere DMN opløsning.
- Når dosis af DMN er blevet indgivet, langsomt trække nålen og bortskaffes i skarpe bin.
- Udfør intraperitoneale injektioner af DMN i 3 på hinanden følgende dage om ugen i 4 uger. Administrere injektioner på samme tidspunkt hver dag. Genberegne dosis baseret på kropsvægt ved begyndelsen af hver uge af injektioner.
- Indsaml blod fra halevenen ugentlige til at måle biokemiske parametre: alaninaminotransferase (ALT) og aspartat aminotransferase (AST) 22.
- Mål serum ALT og AST anvendelse af et kommercielt VetTest Chemistry Analyzer.
3. Gross Undersøgelse og Harvest of Liver
- Aflive rotterne ved intraperitoneal injektion af pentobarbital ved en dosis på 100 mg / kg legemsvægt. Sikre død ved at kontrollere for de manglende hjerteslag.
- Forbered dig på post mortem og vurdere tilstanden af dyret, som beskrevet af Parkinson et al. 23 Place døde rotter på dissekere bord liggende på ryggen med maven opad.
- Desinficer og fugte huden med 70% ethanol.
- Med en saks, incise huden den fulde længde af ventrum fra anus til hagen, og afspejler huden. Med saksen, incise bugvæggen fra anus til formet som et sværd brusk, at eksponere den abdominale indvolde.
- Undersøg de abdominale organer in situ for at kontrollere for eventuelle afvigelser. Bemærk eventuelle ændringer i farve, størrelse, placering af organer og tilstedeværelsen af væske i bughulen. Undersøgekonsistensen af organer og se tilstedeværelsen af eventuelle lugtgener.
- Brug saks og pincet, dissekere hele leveren fri af sine ledbånd og vedhæftede filer.
- Begynd ved hilus hvor den er fastgjort til membranen og arbejde for at befri alle leveren kamre af vedhæftede filer. Skær forsigtigt alle ledbånd og blodkar.
- Overfør leveren på en petriskål og vejer leveren.
- Ved hjælp af en skalpel, skæres 2 - 5 mm tykke sektioner af lever lapper. For konsistens, altid tage prøver fra den samme leveren lap. Tag en kile omkring 5 mm i diameter i tykkelse, fra højre laterale lap 24 ca 1 cm fra kanten af lobe.Immediately sted i 10% bufferet formalin til fiksering. Sørg vævet til formalin volumen er 01:10 eller mere.
- Høst og straks fryse portioner (ved hjælp af flydende nitrogen) i leveren lapper på dette tidspunkt, hvis det kræves for andre undersøgelser. Som for (3.8), prøve fra den samme leverlap for konsistens.
- Fastgør leverprøver i 10% pufret formalin i mindst 24 timer.
- Efter fiksering, trim leveren, anbringes i kassetter og indlæse dem i kurven af den automatiske væv processor.
- Placer kurven med kassetter i den første station, der indeholder 10% bufferet formalin. Sørg kassetterne er helt neddykket. De kan forblive i dette kammer i op til 12 timer, indtil cyklus begynder.
- Programmere vævsprocessor at rotere kassetterne i 1 time hver, gennem successive stationer indeholdende følgende løsninger: ethanol i koncentrationer på 50%, 70%, 90%, 100% (2 stationer), xylen (2 stationer) og flydende paraffin ( 2 stationer).
- Overfør leverprøver i voksbadet af indlejring station. Sikre, at indlejring maskinen tændes mindst én time tidligere.
- Brug af pre-varmet pincet (65 ° C), skal du fjerne hver kassette fra wax bad og sted på den varme plade (65 ° C) af indlejringen maskinen. Dispensere tilstrækkelig mængde af flydende paraffin i rustfrit stål basisformen (forvarmet til 65 ° C) indtil halvt fuldt. Overfør den del af leveren fra kassetten ind i formen. At behandle enheden er placeret med skærefladen (skal undersøges mikroskopisk) fladt på bunden af formen.
- Fylde formen fuldstændigt med flydende paraffin, montere den tomme kassette oven og placere formen på 4 ° C plade af indlejring maskinen køle i mindst 30 min.
- Check, at voksen er afkølet og størknet, og fjern paraffinblokken fra formen. Blokken skal poppe ud nemt og ikke holde sig eller knække. Hvis dette sker, smelte blokken og gentage dette trin. Paraffinblokken kan sektioneret når den størkner. Blokke kan opbevares ved stuetemperatur i mange år.
- Placer paraffin blok ind mikrotomen og § 10 um tykkelse indtil voks lagfjernes tilstrækkeligt for den integrerede levervæv til at være synlige.
- Skift indstillingen på mikrotom til at skære på 5 um tykkelse. Ved hjælp af pincet, afhente en godt skåret sektion ved at holde den i kanten og flyde omhyggeligt afsnittet i vandbad ved en temperatur på 40 ° C.
- Anbring forsigtigt en ren glasplade under den flydende del og løfte den ud på overfladen af objektglasset. Placer dias på et dias varmere ved 37 ° C natten over.
5. Masson trichromfarvning
- Før anvendelse pletter, behandle dias til at fjerne voks og rehydrere væv som følger:
- Fordyb afsnittene i xylen i 5 min. Gentag 2x.
- Fordyb afsnittene i 100% ethanol i 3 min. Gentag 1x.
- Fordybe sektionerne i 1 minut hver i følgende opløsninger af ethanol: 90%, 80% og 70%.
- Skyl dias under vandhanen for at fjerne enhver eksisterende ethanol på diaset.
- Fordybe objektglassene i jernhematoxylin i 10 minutter til farvning af kernen.
- Skyl objektglassene med vand for at fjerne den overskydende pletten fra slide.
- Fordyb dias i Biebrich Scarlet-sur fuchsin i 2 min til at farve cytoplasmaet.
- Skyl objektglassene med vand.
- Placer dias i phosphorwolfram / phosphomolybdænsyre løsning i 10 min for at fremme indførelsen af anilin blå. Skift phosphorwolfram / phosphomolybdænsyre Solution efter 2 runder af brug.
- Objektglassene anbringes i anilin blå opløsning i 10 minutter til farvning collagenfibrene.
- Skyl overskydende pletten med vand og placere objektglassene i 1% eddikesyreopløsning i 1 minut for at tillade differentiering finder sted for at gøre farven af slæden mere delikat og gennemsigtig.
- Skyl objektglassene med vand og fortsæt til dehydrere vævssnit. De dehydrering skridt er som følger:
- Fordyb dias successivt i 10 sek hver gang, i det følgende koncentrations ethanol: 70%, 80%, 95% og 100%.
- Fordyb dias i 30 sek i 100% ethanol. Gentag 1x.
- Skyl dias gennem 3 stationer xylen i 5 min hver til fjernelse af ethanol.
- Monter et dækglas på prøven med montering medier (f.eks, DPX mountant), og lad det tørre.
Bemærk: DPX er en syntetisk harpiks, der tørrer hurtigt, bevarer pletten og beskytter vævssnittet.
6. Fibrose Scoring på Masson s trichome Stained Dele af Lever
- Har en veterinær patolog vurdere sværhedsgraden af fibrose i henhold til fibrose score 25. Det ville være optimalt, hvis fibrose scoring gøres ved to eller tre patologer selvstændigt i en blindet måde. I et sådant scenario, opnå en endelig score efter drøftelse og gruppe gennemgang at sortere ud eventuelle forskelle i scoring.
| score | Beskrivelse |
| 0 | ingen fibrose |
| 1 | Fiber udvidelse af nogle portal områder, med eller uden kort fibrøse septa |
| 2 | Fiber udvidelse af de fleste portal områder, med eller uden kort fibrøst septa |
| 3 | Fiber udvidelse af de fleste portal områder, lejlighedsvis portal til portal (PP) bro |
| 4 | Fiber udvidelse af portal områder med markant bro (portal til portal (PP) samt portal til det centrale (PC) |
| 5 | Markeret bro (PP og / eller PC) med lejlighedsvise knuder (ufuldstændig cirrhosis) |
| 6 | Skrumpelever, sandsynlig eller konkret |
Tabel 1: fibrosescore Anvendes til Læsning af Masson s trichome Stained Lever §§ 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DMN behandlede rotter tabe sig og bliver mindre kraftig med pjusket pels. Der er et betydeligt tab i den gennemsnitlige legemsvægte af DMN behandlede rotter; først påvises efter 2 uger af DMN behandling, og denne forskel er fortsat gennem uger 3 og 4 efter DMN behandling (figur 1a). Som modtager rotterne DMN løbet successive uger, leverskader får den til at blive mindre. Leveren indeks; som er den procent af levervægt på endelig kropsvægt var signifikant lavere for DMN behandlede rotter (figur 1b).
Figur 1: a) Kropsvægt af DMN behandlede rotter. Dataene repræsenteres som midlet ± SD (n = 6 - 8). * P <0,05 sammenlignet med normal kontrolgruppe b) Lever indeks.; procent levervægt ved den endelige kropsvægt af DMN behandlede rotter efter 4 ugers DMN trevådt,. Dataene repræsenteres som midlet ± SD (n = 6 - 8). * P <0,05 sammenlignet med normal kontrolgruppe. Klik her for at se en større version af dette tal.
Ved aflivning efter 4 ugers DMN behandling, leveren er mindre og hårdere (figur 2a) sammenlignet med dem fra ældede matchede kontroldyr (figur 2b). Fibrin kan være til stede på leveren overflade og tilstødende lever lapper overholdes. Ca. 20% af rotter har ascites.
Figur 2: a) Lever fra en rotte efter 4 ugers DMN behandling b) Lever fra alderen matchet kontrol rotter.. I (a) leveren er indskrumpet, fast og bleg med et gulligt skær sammenlignet med leverenfra sin gamle matchet kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Skade på leveren medfører øget permeabilitet af hepatocyt cellemembranen. Øget serum ALT og AST er indikatorer for hepatocyt skader. Serum ALT (figur 3a) og AST (figur 3b) af DMN behandlede gruppe er signifikant højere end kontrolgruppen efter 2 og 4 ugers af DMN injektion. Serum ALAT og ASAT niveauer typisk stige efter hver uge DMN behandling.
Figur 3: a) Serum alaninaminotransferase (ALT) og b) serum aspartat aminotransferase (AST) niveauer af DMN behandlede rotter ved uge 0, 2 og 4 efter den sidste DMN injektion. Dataene er Represented som midlet ± SD (n = 6 - 8). * P <0,05 sammenlignet med normal kontrolgruppe. Klik her for at se en større version af dette tal.
Histologisk undersøgelse af levere fra DMN behandlede rotter viser, at der sker en gradvis forøgelse og udvidelse af fibrøst septa, med tab af hepatocytter over tid sammenlignet med kontrolrotter. Massons trichome pletten er almindeligt anvendt til at fremhæve kollagen indskud i levervæv: disse er farves blå.
Figur 4: mikrofotografier af Lever Sektioner farvet med Masson s trichome: a) lever sektion fra en normal kontrol rotte b) lever sektion fra en rotte efter 1 uges dimethylnitrosamine (DMN) c) liver sektion fra en rotte efter 2 ugers DMN. Der er fiberholdigt udvidelse af de fleste portal områder med lejlighedsvis portal til portal bygge bro. D) Lever sektion fra en rotte efter 3 ugers DMN. Bemærk den fiberholdige udvidelse af portal områder med markant portal til portal samt portal til det centrale bro. E) Lever sektion fra en rotte efter 4 ugers DMN. Der er skrumpelever med knudedannelse. Styringen leveren er fra gruppen aflivet sammen med rotter efter 4 ugers DMN injektion. Der er et mønster af progressiv stigning af fibrose score fra 0 i (a); 2 i (b); 3 i (c) 4 i (d) til 5/6 i (e). Alle mikrofotografier blev taget ved en forstørrelse på 40X med 1 længdeenhed af skala bar svarende til 100 um. Zoom cslikke her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en metode til at gøre en dyremodel af leverfibrose og vurdere sværhedsgraden af leverfibrose. Det er vigtigt at levere den korrekte dosis af DMN og overholde tidsplanen for ugentlige intraperitoneale injektioner. Som eksperimentet skrider frem, er det afgørende at afveje rotterne og genberegne dosis ved starten af hver uge af DMN injektioner. Husk, at DMN er giftigt og skal håndteres i stinkskab. Vi udfører de intraperitoneale injektioner i stinkskab så godt. Med behovet for gentagne injektioner, den korrekte tilbageholdenhed og teknik injektion er vigtigt at undgå introduktion af forurenende stoffer og skader på indre organer. Vi har sjældent dødelighed fra intraperitoneale injektioner.
Rotter bør overvåges 2x om dagen i forsøgsperioden. I den sidste uge af DMN injektion, skal dyrene observeres endnu oftere og nøje for døende tegn. Dette er de period når leverskader er mest alvorlige og berørte rotter vil blive inappetent, mister kropsvægt og tilstand. 25 - 40% af rotter kan blive alvorligt syg i denne periode og dø, hvis der ikke er nogen veterinær indgriben. Derfor nøje overvågning gør det muligt for forskeren at vurdere tilstanden af dyret og planlægge passende afslutning af forsøget med henblik på, at organer kan være frisk høstet fra en aflivet rotte i stedet for at forsvinde fra forfald fra uventede død.
Vi har fundet ugentlig måling af ALT og AST niveauer for at være brugbare indikatorer for udviklingen af leverskader. Vi har også observeret, at AST er mindre specifik end ALT og forklarer det med sin løsladelse fra beskadigede erytrocytter og muskelvæv i tillæg til leveren.
Sikre, at tilstrækkelig mængde blod opsamles til opnåelse af det påkrævede volumen af serum til analyse. Vi typisk indsamler 200 - 300 pi blod per rotte.
Under collection af levervæv til histologisk undersøgelse, anbefaler vi prøven opnås fra samme lap. Dette sker efter kontrol, at ændringerne i leveren er ensartede. DMN forårsager generaliserede ændringer i leveren. I de tidlige stadier af undersøgelsen, vi samplet fra den venstre laterale og mediale lapper samt højre mediale lap. Vi har ikke observere eventuelle forskelle i de mikroskopiske ændringer mellem disse lapper.
Lever sektioner bør fastsættes i 10% bufferet formalin i mindst 24 timer og behandles hurtigt efter. Langvarig nedsænkning over en uge kan resultere i vævet bliver skørt og vanskeligt at afsnittet efter paraffinindlejring. Skæring egnede 5 um tynde sektioner kræver øvelse og tålmodighed. Sektioner, der vurderes at være egnet med det blotte øje (trin 4.11) kan undersøges med mikroskop for at kontrollere, at de ikke har artefakter som folder eller tårer i afsnittet. Proceduren for farvning er bedst afsluttet efter to de perioder for slide fordybelse på hvert trin uden pauser. Under farvningen processen, at sektionerne holdes fugtig på alle tidspunkter og overføres fra en farvningsopløsning til næste snarest muligt.
Evaluering af Massons trichome farvede sektioner for graden af fibrose kræver input fra en veterinær patolog. Han / hun er en afgørende medarbejder, der bør være en del af undersøgelsen fra starten, da han / hun ville være i stand til at rådgive og deltage i den rigtige høst af organer i alle faser af forsøget. den nuværende gyldne standard for leverfibrose scoring er således vurderingen af passende farvede vævssnit af en patolog. Selv om det ville være optimalt at have effekt på over én patolog, kan dette ikke være muligt i mindre organisationer. I sådanne tilfælde kan objektivitet forbedres ved brug af billedteknologi 26. Vi har fundet, at resultaterne fra imaging teknologikan sammenlignes med patologisk scoring (upublicerede data), og anbefaler, at det anvendes som en supplerende metode til evaluering.
Sammenfattende DMN inducerede model af leverfibrose har mange fordele frem for andre dyremodeller. Det er en forholdsvis let model til at tjene som det ikke kræver kirurgiske færdigheder. DMN er miljømæssigt sikrere og mindre giftige for mennesker og dyr end CCI4 og laver et kortere tid til at inducere sygdom end TAA. Sammenlignet med leversygdom produceret af CCI4, TAA, og galdegang ligering DMN frembringer en tættere repræsentation af human lever fibrose. Af disse grunde forudser vi, at modellen vil fortsat blive anvendt bredt til at undersøge mekanismerne ved leverfibrose samt at screene for potentielle anti-fibrotiske midler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethylnitrosamine | Wako | 147-03781 | |
| Formalin | Sinopharm chemicals | F63257009 | |
| Ethanol | Sigma | 64-17-5 | |
| Xylene | Fisher | 1330-20-7 | |
| Masson trichome stains | |||
| Aniline Blue | Electron Microscopy Sciences | #42755 | |
| Acid Fuschin | Electron Microscopy Sciences | RT42685 | |
| Scarlet Red | Electron Microscopy Sciences | #26905 | |
| Phosphotungstic Acid Hydrate | ALFA AESAR | ALFA40116.4 | |
| Phosphomolybdic Acid Hydrate | Sigma SG | 221856-25G | |
| Weigert's Iron Hematoxilyn | Merck | 1.15973.0002 | |
| DPX Mounting Medium | Merck | HX066873 | |
| Tissue processor | Leica | Leica TP 1020 | |
| Embedding machine | Sakura | Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System | |
| Microtome | Leica | Leica RM 2235 | |
| Vet Test Analyzer | Idexx | Vet Test 8008 |
References
- Magee, P. N. Toxic liver injury; the metabolism of dimethylnitrosamine. Biochem J. 64 (4), 676-682 (1956).
- Pritchard, D. J., Butler, W. H. Apoptosis-the mechanism of cell death in dimethylnitrosamine-induced hepatotoxicity. J Pathol. 158 (3), 253-260 (1989).
- Madden, J. W., Gertman, P. M., Peacock, E. E. Dimethylnitrosamine-induced hepatic cirrhosis: a new canine model of an ancient human disease. Surgery. 68 (1), 260-267 (1970).
- Jenkins, S. A., Grandison, A., Baxter, J. N., Day, D. W., Taylor, I., Shields, R. A dimethylnitrosamine-induced model of cirrhosis and portal hypertension in the rat. J Hepatol. 1 (5), 489-499 (1985).
- Jézéquel, A. M., Mancini, R., Rinaldesi, M. L., Macarri, G., Venturini, C., Orlandi, F. A morphological study of the early stages of hepatic fibrosis induced by low doses of dimethylnitrosamine in the rat. J Hepatol. 5 (2), 174-181 (1987).
- George, J., Chandrakasan, G. Molecular characteristics of dimethylnitrosamine induced fibrotic liver collagen. Biochim Biophys Acta, Protein Struct Mol Enzymol. 1292 (2), 215-222 (1996).
- Winwood, P. J., Arthur, M. J. Kupffer cells: their activation and role in animal models of liver injury and human liver disease. Semin Liver Dis. 13 (1), 50-59 (1993).
- Nakamura, T., Sakata, R., Ueno, T., Sata, M., Ueno, H. Inhibition of transforming growth factorβ prevents progression of liver fibrosis and enhances hepatocyte regeneration in dimethylnitrosamine-treated rats. Hepatology. 32 (2), 247-255 (2000).
- Shek, F. W., Benyon, R. C. How can transforming growth factor beta be targeted usefully to combat liver fibrosis? Eur J Gastroenterol Hepatol. 16 (2), 123-126 (2004).
- Wang, J. H., Shin, J. W., Son, J. Y., Cho, J. H., Son, C. G. Antifibrotic effects of CGX, a traditional herbal formula, and its mechanisms in rats. J Ethnopharmacol. 127 (2), 534-542 (2010).
- Su, L. J., Hsu, S. L., Yang, J. S., Tseng, H. H., Huang, S. F., Huang, C. Y. F. Global gene expression profiling of dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis: from pathological and biochemical data to microarray analysis. Gene Expr. 13 (2), 107-132 (2006).
- Müller, A., Machnik, F., Zimmermann, T., Schubert, H. Thioacetamide-induced cirrhosis-like liver lesions in rats usefulness and reliability of this animal model. Exp Pathol. 34 (4), 229-236 (1988).
- Martinez-Hernandez, A. The hepatic extracellular matrix. II. Electron immunohistochemical studies in rats with CCl4-induced cirrhosis. Lab Invest. 53 (2), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3894794 166-186 (1985).
- Pritchard, M. T., Apte, U. Models to Study Liver Regeneration. Liver Regeneration. , 15-40 (2015).
- Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
- Marques, T. G., Chaib, E., et al. Review of experimental models for inducing hepatic cirrhosis by bile duct ligation and carbon tetrachloride injection. Acta Cir Bras. 27 (8), 589-594 (2012).
- Wasser, S., Tan, C. E. Experimental models of hepatic fibrosis in the rat. Ann Acad Med Singapore. 28 (1), 109-111 (1999).
- George, J., Chandrakasan, G. Biochemical abnormalities during the progression of hepatic fibrosis induced by dimethylnitrosamine. Clin Biochem. 33 (7), 563-570 (2000).
- Shimizu, I., Ma, Y. R., et al. Effects of Sho-saiko-to, a Japanese herbal medicine, on hepatic fibrosis in rats. Hepatology. 29 (1), 149-160 (1999).
- Wang, Y., Gao, J., Zhang, D., Zhang, J., Ma, J., Jiang, H. New insights into the antifibrotic effects of sorafenib on hepatic stellate cells and liver fibrosis. J Hepatol. 53 (1), 132-144 (2010).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat. J Vis Exp. (99), (2015).
- Parkinson, C. M., O'Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. J Vis Exp. (54), (2011).
- Ruehl-Fehlert, C., Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Ishak, K., Baptista, A., et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol. 22 (6), 696-699 (1995).
- Sant'Anna, L. B., Sant'Anna, N., Parolini, O. Application of computer assisted image analysis for identifying and quantifying liver fibrosis in a experimental model. J Comput Interdiscip Sci. 2 (2), 139-148 (2011).
