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Medicine

Dimethylnitrosamine प्रेरित चूहे में लिवर फाइब्रोसिस मॉडल

Published: June 17, 2016 doi: 10.3791/54208
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Technology Development, School of Applied Science, Temasek Polytechnic

Abstract

चार से छह सप्ताह पुराने करने के लिए, पुरुष Wistar चूहों जिगर फाइब्रोसिस के पशु मॉडलों का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। प्रक्रिया 10 मिलीग्राम / किग्रा dimethylnitrosamine (DMN) के प्रशासन के चार सप्ताह, प्रति सप्ताह लगातार तीन दिनों के लिए intraperitoneally दिया की आवश्यकता है। इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन धूआं हुड में प्रदर्शन किया गया के रूप में DMN एक ज्ञात hepatoxin और कैसरजन है। मॉडल के कई फायदे हैं। सबसे पहले, जिगर परिवर्तन क्रमिक रूप से या ब्याज की विशेष चरणों में अध्ययन किया जा सकता है। दूसरे, यकृत रोग की अवस्था सीरम alanine aminotransferase (ALT) और aspartate aminotransferase (एएसटी) एंजाइमों के माप से नजर रखी जा सकती है। तीसरा, विभिन्न चरणों में जिगर की क्षति की गंभीरता, नामित समय बिंदुओं पर जानवरों के बलिदान से इसकी पुष्टि की जा सकती है मेसन के trichome दाग जिगर के ऊतकों के histological परीक्षा द्वारा पीछा किया। DMN खुराक के चार सप्ताह के बाद, ठेठ फाइब्रोसिस स्कोर 5 इशक पैमाने पर 6 है। मॉडल लगातार reproduced किया जा सकता है और किया गया हैव्यापक रूप से संभावित विरोधी fibrotic एजेंटों की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया।

Introduction

DMN एक शक्तिशाली जिगर विशिष्ट विष है। अपने चयापचय, ऊतक वितरण, और चूहों के यकृत को चोट के कारण करने की क्षमता मैगी 1 से सूचना मिली थी, और apoptosis द्वारा hepatocyte नुकसान और कोशिका मृत्यु के तंत्र प्रिचार्ड और बटलर 2 से वर्णित किया गया था। इस परिसर के रुक-रुक कर प्रशासन कुत्तों और चूहों 3,4 में जिगर फाइब्रोसिस के लिए प्रेरित करने की सूचना मिली थी।

तंत्र और जिगर फाइब्रोसिस के शब्द के भागों परिवर्तन बड़े पैमाने पर इस मॉडल का उपयोग कर जांच की गई है। चूहे का उपयोग कर प्रारंभिक अध्ययन में, DMN के साथ 3 सप्ताह के उपचार केंद्र-खण्डकी रक्तस्रावी नेक्रोसिस स्टीटोसिस 5 बिना micronodular सिरोसिस से पीछा उत्पादन किया। यह दिखाया गया था कि जल्दी फाइब्रोसिस में, कोलेजन गठन अधिक पार प्रकार मैं अधिक से अधिक 6 प्रमुख होने के प्रकार III के साथ जोड़ा गया था। अन्य कारणों के साथ आम में, DMN प्रेरित fibrotic परिवर्तन Kupffer कोशिकाओं में वृद्धि के साथ जुड़े थे; यकृत मैक्रोफेज कि मैं रहते हैंn sinusoids। इन कोशिकाओं myofibroblasts में morph और बाह्य मैट्रिक्स जो फाइब्रोसिस 7 में प्राथमिक समस्या यह है की अत्यधिक मात्रा में उत्पादन।

सेलुलर संकेत के संदर्भ में, नाकामुरा एट अल। दिखा दिया है कि TGF-β जिगर फाइब्रोसिस 8 की प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। वे एक adenovirus एक छोटा प्रकार द्वितीय TGF-β रिसेप्टर व्यक्त इस्तेमाल किया है, विशेष रूप से बाधित करने TGF-β संकेत है। इन चूहों में जिगर फाइब्रोसिस शानदार DMN उपचार के दौरान रोका गया था जब नियंत्रण समूहों की तुलना में। अन्य अध्ययनों से इस बात की पुष्टि है कि TGF-β के दमन जिगर फाइब्रोसिस विकास 9,10 के उन्मूलन की ओर जाता है। मॉडल भी अन्य फाइब्रोसिस मार्करों और प्रोटीन है जो विरोधी fibrotic चिकित्सा 11 के लिए दवा लक्ष्य के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है की पहचान करने के लिए एक वैश्विक जीन की रूपरेखा अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था।

अन्य रासायनिक एजेंटों जिगर फाइब्रोसिस के लिए प्रेरित करने thioacetamide (TAA) और सी में शामिल इस्तेमाल कियाArbon टेट्राक्लोराइड (सीसीएल) 4। TAA चूहों में और बाद में चूहों 12 में पहली बार इस्तेमाल किया गया था। इस मॉडल के लाभ में शामिल हैं: रासायनिक प्रशासन की आसानी पीने के पानी, विशेषता micronodular सिरोसिस और जैव रासायनिक परिवर्तन के साथ मॉडल के reproducibility में। नुकसान में शामिल हैं: जिगर फाइब्रोसिस के लिए 3 महीने के लंबे समय अवधि के लिए विकसित और जिगर फाइब्रोसिस के शामिल होने के लिए आणविक तंत्र की समझ की कमी है। सीसीएल 4 का सवाल है, इसके उपयोग के लिए निम्नलिखित कारणों से मना कर दिया है: यह मानव यकृत रोग की नकल नहीं है, ओजोन परत पर हानिकारक प्रभाव पड़ता है जानवरों के लिए दर्द और संकट का कारण बनता है, मनुष्य के लिए बहुत ही विषैला होता है और अपने को संभालने में अतिरिक्त सावधानी की आवश्यकता है और निपटान 13,14।

लंबे समय तक पित्त नली में रुकावट लीवर सिरोसिस के लिए एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में (शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप से) पहली Kountouras एट अल। 15 द्वारा सूचना मिली थी। इस विधि मनुष्यों और पशुओं के लिए nontoxic है। एचowever, समय जिगर फाइब्रोसिस के लिए आवश्यक विकसित करने के लिए भिन्न होता है। Marques एट अल। 16 से 30 रिपोर्टों की समीक्षा में पाया गया है कि यह सर्जरी के बाद चार सप्ताह के सात दिनों से लिया जिगर फाइब्रोसिस को विकसित करने के लिए। वर्णित रोग परिवर्तन मानव पुरानी पित्त फाइब्रोसिस के उन नकल और मॉडल इस क्षेत्र में रुचि शोधकर्ताओं के लिए अधिक अनुकूल होगा।

सारांश में, एक निरंतर 4 हफ्तों में चूहे में DMN की खुराक के रुक-रुक कर प्रशासन जिगर फाइब्रोसिस कि मानव रोग mimics पैदा करता है। Dosed चूहों जिगर की क्षति और parenchymal फाइब्रोसिस 4,17 के प्रगतिशील विकास दिखा। रोग प्रगति और गंभीरता विशिष्ट समय बिंदुओं पर रक्त के नमूनों या जानवरों के बलिदान के माध्यम से नजर रखी जा सकती है और प्रभाव अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य 18 है। इस प्रकार मॉडल व्यापक रूप से जिगर फाइब्रोसिस और सिरोसिस के तंत्र का अध्ययन करने के साथ ही संभावित विरोधी fibrotic एजेंटों 10,19,20 के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों एप्लाइड साइंस के स्कूल, टेमासेक पॉलिटेक्निक जानवरों की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. DMN की तैयारी

  1. पिपेट DMN के 200 μl (1 जी / एमएल शेयर समाधान) और इंजेक्शन के लिए 10 मिलीग्राम / एमएल DMN समाधान तैयार करने के लिए पीबीएस के 19.8 मिलीलीटर जोड़ें।
    नोट: DMN कैंसर है। DMN तैयार करने और जानवर इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए एक धूआं हुड का प्रयोग करें।

2. DMN की intraperitoneal इंजेक्शन

  1. 200 ग्राम - 150 के एक औसत वजन के साथ पुरुष Wistar चूहों का प्रयोग करें। प्रयोग के शुरू होने से पहले 7 दिन - 4 के लिए चूहों acclimate।
  2. 12 घंटा प्रकाश और 12 घंटा अंधेरे चक्र के साथ 22 ± 1 डिग्री सेल्सियस के कमरे के तापमान पर चूहों को बनाए रखें। चूहे चाउ और पानी यथेच्छ प्रदान करें।
  3. उपाय दैनिक भोजन और पानी के सेवन। उपाय शरीर के वजन साप्ताहिक।
  4. प्रत्येक चूहे 10 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन की एक खुराक के आधार पर DMN की राशि की गणना। एक 25 गेज सुई टी के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग करेंओ सिरिंज में DMN समाधान की गणना की मात्रा आकर्षित।
  5. Intraperitoneal इंजेक्शन 21 के लिए चूहे को नियंत्रित।
  6. साथ चूहे ठीक से रोका, पेट के निचले सही चक्र में सुई परिचय सिरिंज (कुछ भी नहीं होना चाहिए aspirated) के सवार पर वापस खींचना पेट अंतरिक्ष के भीतर सुई का सही स्थान के लिए जाँच करने के लिए और धीरे धीरे DMN समाधान इंजेक्षन।
  7. जब DMN की खुराक प्रशासित किया गया है, धीरे-धीरे सुई वापस लेने और तेजधार बिन में निपटाने।
  8. 4 सप्ताह के लिए एक सप्ताह लगातार 3 दिनों के लिए DMN की intraperitoneal इंजेक्शन प्रदर्शन करना। प्रत्येक दिन एक ही समय में इंजेक्शन प्रशासन। इंजेक्शन के लिए प्रत्येक सप्ताह के शुरू में शरीर के वजन के आधार पर खुराक फिर से गणना।
  9. जैव रासायनिक मानकों को मापने के लिए पूंछ नस से खून साप्ताहिक लीजिए: alanine aminotransferase (ALT) और aspartate aminotransferase (एएसटी) 22।
  10. उपाय सीरम ALT और AST एक वाणिज्यिक व्यावसायिक शिक्षा और प्रशिक्षण का उपयोग करटेस्ट रसायन विश्लेषक।

3. सकल परीक्षा और जिगर की फसल

  1. 100 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन की एक खुराक पर pentobarbital की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा चूहों euthanize। दिल की धड़कन की कमी के लिए जाँच के द्वारा मृत्यु सुनिश्चित करें।
  2. पोस्टमार्टम के लिए तैयार है और के रूप में पेट के ऊपर की तरफ का सामना करना पड़ के साथ पृष्ठीय लेटना में विदारक बोर्ड पर पार्किंसंस एट अल। 23 प्लेस मृत ​​चूहों द्वारा वर्णित जानवर की स्थिति का आकलन।
  3. कीटाणुरहित और 70% इथेनॉल के साथ त्वचा गीला।
  4. कैंची का प्रयोग, त्वचा ठोड़ी को गुदा से ventrum की पूरी लंबाई काटकर अलग कर देना, और त्वचा को प्रतिबिंबित। कैंची के साथ, जिफाएडा कार्टिलेज को गुदा से पेट की दीवार काटकर अलग कर देना, पेट में आंत का पर्दाफाश करने के लिए।
  5. किसी भी असामान्यताओं के लिए जाँच करने के लिए बगल में पेट अंगों की जांच करना। रंग, आकार में कोई परिवर्तन, अंगों के स्थान और पेरिटोनियल गुहा के भीतर तरल पदार्थ की उपस्थिति पर ध्यान दें। की जांचअंगों की स्थिरता और किसी भी odors की उपस्थिति ध्यान दें।
  6. कैंची और संदंश का प्रयोग, इसकी लिगामेंट और अनुलग्नकों के पूरे जिगर मुक्त काटना।
    1. hilus जहां यह डायाफ्राम से जुड़ा हुआ है पर शुरू और अनुलग्नकों के सभी जिगर पालियों मुक्त करने के लिए काम करते हैं। ध्यान से सभी लिगामेंट और रक्त वाहिकाओं में कटौती।
  7. एक पेट्री डिश पर जिगर स्थानांतरण और जिगर तौलना।
  8. 5 मिमी जिगर पालियों की मोटी धारा - एक छुरी का प्रयोग, 2 काट दिया। स्थिरता के लिए, हमेशा एक ही जिगर पालि से नमूने ले। एक कील के बारे में 5 मिमी व्यास मोटाई में सही पार्श्व पालि से निर्धारण के लिए 24 के बारे में 1 10% बफर formalin में lobe.Immediately जगह के किनारे से सेमी, ले लो। सुनिश्चित करें formalin मात्रा के लिए ऊतक 01:10 या अधिक है।
  9. हार्वेस्ट और तुरंत इस बिंदु पर कुछ भागों जिगर पालियों की (तरल नाइट्रोजन का उपयोग) फ्रीज यदि अन्य अध्ययन के लिए जरूरी है। (3.8), स्थिरता के लिए एक ही जिगर पालि से नमूना के रूप में।

  1. 24 घंटा की एक न्यूनतम के लिए 10% बफर formalin में जिगर के नमूनों को ठीक करें।
  2. निर्धारण के बाद, जिगर ट्रिम कैसेट में जगह है और उन्हें स्वचालित ऊतक प्रोसेसर की टोकरी में लोड।
  3. पहला स्टेशन है जो 10% बफर formalin शामिल में कैसेट के साथ टोकरी रखें। सुनिश्चित करें कैसेट पूरी तरह डूबे हुए हैं। वे अप करने के लिए 12 घंटे के लिए इस कक्ष में रह सकते हैं जब तक चक्र शुरू होता है।
  4. ऊतक प्रोसेसर कार्यक्रम के बाद समाधान युक्त लगातार स्टेशनों के माध्यम से, 1 घंटा प्रत्येक के लिए कैसेट बारी बारी से करने के लिए: 50%, 70%, 90%, 100% (2 स्टेशनों), xylene (2 स्टेशनों) और तरल आयल की सांद्रता में इथेनॉल ( 2 स्टेशनों)।
  5. एम्बेडिंग स्टेशन के मोम स्नान में जिगर नमूने स्थानांतरण। सुनिश्चित करें कि एम्बेडिंग मशीन पर बंद है कम से कम एक घंटे पहले।
  6. का उपयोग करते हुए पूर्व गर्म संदंश (65 डिग्री सेल्सियस), w से प्रत्येक कैसेट को दूरकुल्हाड़ी स्नान और एम्बेडिंग मशीन की गर्म प्लेट (65 डिग्री सेल्सियस) पर रखें। आधा भरा तक (65 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म) स्टेनलेस स्टील के आधार मोल्ड में तरल पैराफिन के लिए पर्याप्त राशि बांटना। मोल्ड में कैसेट से जिगर की धारा स्थानांतरण। सुनिश्चित करें कि नमूना कटौती की सतह के साथ रखा गया है मोल्ड के तल पर (जांच की जानी microscopically) फ्लैट।
  7. तरल तेल के साथ पूरी तरह से मोल्ड भरें, शीर्ष पर खाली कैसेट माउंट और एम्बेडिंग मशीन के 4 डिग्री सेल्सियस थाली पर ढालना जगह कम से कम 30 मिनट के लिए शांत करने के लिए।
  8. जाँच करें कि मोम ठंडा और जम गया है, और मोल्ड से पैराफिन ब्लॉक को हटा दें। ब्लॉक आसानी से बाहर पॉप चाहिए और छड़ी या दरार नहीं। यदि ऐसा होता है, ब्लॉक पिघल और इस चरण को दोहराएँ। एक बार यह solidifies पैराफिन ब्लॉक sectioned जा सकता है। ब्लाकों कई वर्षों के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है।
  9. मोम की परत जब तक 10 माइक्रोन मोटाई में microtome और इस खंड में पैराफिन ब्लॉक रखेंएम्बेडेड जिगर ऊतक दिखाई करने के लिए पर्याप्त रूप से हटा दिया जाता है।
  10. microtome पर सेटिंग बदलें 5 माइक्रोन मोटाई में कटौती करने के लिए। संदंश का प्रयोग, किनारे पर इसे धारण करके एक अच्छी तरह से कट खंड लेने के लिए और ध्यान से 40 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर नहाने के पानी में खंड तैरने लगते हैं।
  11. धीरे चल धारा के तहत एक साफ कांच स्लाइड जगह और गिलास स्लाइड की सतह पर इसे उठा। एक स्लाइड रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म पर स्लाइड रखें।

5. मेसन Trichrome धुंधला

  1. दाग आवेदन करने से पहले, इस प्रकार है मोम हटाने और ऊतकों rehydrate करने के लिए स्लाइड का इलाज:
    1. 5 मिनट के लिए xylene में वर्गों को विसर्जित कर दिया। 2x दोहराएँ।
    2. 3 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में वर्गों को विसर्जित कर दिया। 1x दोहराएँ।
    3. 90%, 80% और 70%: 1 मिनट इथेनॉल के निम्न समाधानों में से प्रत्येक के लिए वर्गों को विसर्जित कर दिया।
  2. नल के पानी के नीचे स्लाइड कुल्ला स्लाइड पर किसी भी मौजूदा इथेनॉल हटा दें।
  3. 10 मिनट के लिए आयरन Hematoxylin में विसर्जित स्लाइड नाभिक दाग।
  4. पानी से कुल्ला स्लाइड स्लाइड से अतिरिक्त दाग हटाने के लिए।
  5. 2 मिनट के लिए Biebrich लाल रंग एसिड Fuchsin में विसर्जित स्लाइड कोशिका द्रव्य दाग।
  6. पानी के साथ स्लाइड कुल्ला।
  7. रंगों का रासायनिक आधार नीले रंग की तेज बढ़ावा देने के लिए 10 मिनट के लिए Phosphotungstic / Phosphomolybdic एसिड के घोल में स्लाइड रखें। उपयोग के 2 दौर के बाद Phosphotungstic / Phosphomolybdic एसिड समाधान बदलें।
  8. कोलेजन फाइबर दाग 10 मिनट के लिए एनिलिन नीले समाधान में स्लाइड्स रखें।
  9. पानी के साथ अतिरिक्त दाग कुल्ला और भेदभाव स्लाइड के रंग और अधिक नाजुक और पारदर्शी प्रस्तुत करने के लिए जगह लेने के लिए अनुमति देने के लिए 1 मिनट के लिए 1% एसिटिक एसिड के घोल में स्लाइड जगह है।
  10. पानी के साथ स्लाइड कुल्ला और ऊतक वर्गों निर्जलीकरण के लिए आगे बढ़ें। निर्जलीकरण कदम इस प्रकार हैं:
  11. 10 सेकंड के प्रत्येक समय के लिए क्रमिक विसर्जित स्लाइड, निम्नलिखित conce मेंइथेनॉल के ntrations: 70%, 80%, 95% और 100%।
  12. 100% इथेनॉल में 30 सेकंड के लिए स्लाइड विसर्जित कर दिया। 1x दोहराएँ।
  13. 5 मिनट प्रत्येक इथेनॉल को दूर करने के लिए xylene के 3 स्टेशनों के माध्यम से स्लाइड कुल्ला।
  14. एक गिलास को कवर पर्ची बढ़ते मीडिया (जैसे, DPX mountant) के साथ नमूना पर माउंट और सूखे के लिए अनुमति देते हैं।
    नोट: DPX एक सिंथेटिक राल कि जल्दी सूख जाता है, दाग को बरकरार रखता है और ऊतक खंड की रक्षा करता है।

6. जिगर के मेसन के trichome दाग वर्गों पर फाइब्रोसिस स्कोरिंग

  1. एक पशु चिकित्सा रोगविज्ञानी है स्कोर 25 फाइब्रोसिस के अनुसार फाइब्रोसिस की गंभीरता का आकलन करें। यह इष्टतम यदि फाइब्रोसिस स्कोरिंग एक अंधे ढंग से स्वतंत्र रूप से दो या तीन पैथोलॉजिस्ट के द्वारा किया जाता होगा। ऐसे परिदृश्य में, स्कोरिंग में कोई मतभेद को सुलझाने के लिए चर्चा और समूह समीक्षा के बाद एक अंतिम स्कोर प्राप्त करते हैं।
स्कोर विवरण
0 कोई फाइब्रोसिस
1 कुछ पोर्टल क्षेत्रों की रेशेदार विस्तार के साथ या कम रेशेदार सेप्टा के बिना
2 सबसे पोर्टल क्षेत्रों की रेशेदार विस्तार के साथ या कम रेशेदार सेप्टा के बिना
3 सबसे पोर्टल क्षेत्रों की रेशेदार विस्तार, कभी-कभी द्वार द्वार को (पीपी) ब्रिजिंग
4 केंद्रीय (पीसी के लिए चिह्नित ब्रिजिंग (द्वार द्वार को (पीपी) के साथ ही पोर्टल के साथ पोर्टल क्षेत्रों की रेशेदार विस्तार)
5 कभी-कभी पिंड (अधूरा सिरोसिस) के साथ (पीपी और / या पीसी) ब्रिजिंग चिह्नित
6 सिरोसिस, संभावित या निश्चित

तालिका 1: फाइब्रोसिस स्कोर मेसन के trichome सना हुआ लिवर धारा 25 पढने के लिये प्रयुक्त।

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Representative Results

DMN इलाज चूहों वजन कम करने और लोगों में असंतोष बढ़ बाल कोट के साथ कम जोरदार हो जाते हैं। वहाँ DMN इलाज चूहों की औसत शरीर के वजन में उल्लेखनीय कमी है; DMN इलाज के पहले detectable 2 के बाद सप्ताह, और इस अंतर को सप्ताह 3 और 4 DMN उपचार (चित्रा 1 ए) के बाद के माध्यम से बनी हुई है। चूहों लगातार हफ्तों में DMN प्राप्त करते हैं, जिगर को नुकसान यह छोटे बनने के लिए कारण बनता है। जिगर सूचकांक; जो अंतिम शरीर के वजन में जिगर वजन का प्रतिशत DMN इलाज चूहों (चित्रा 1 बी) के लिए काफी कम था।

आकृति 1
चित्रा 1: एक) DMN के शरीर के वजन चूहों का इलाज किया। डेटा का मतलब ± एसडी (- 8 N = 6) के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। * पी <0.05 सामान्य नियंत्रण समूह ख) लिवर सूचकांक के साथ तुलना में। DMN के अंतिम शरीर के वजन पर प्रतिशत जिगर वजन DMN Tre के 4 हफ्तों के बाद चूहों में इलाजatment। डेटा का मतलब ± एसडी (- 8 N = 6) के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। * पी <0.05 सामान्य नियंत्रण समूह के साथ तुलना में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

यज्ञ में DMN उपचार के 4 हफ्तों के बाद, जिगर छोटे और कठिन (चित्रा 2A) आयु वर्ग के लिए मिलान नियंत्रण जानवरों से उन लोगों की तुलना में (2 बी चित्रा) है। आतंच जिगर सतह और आसन्न जिगर पालियों पालन कर रहे हैं पर मौजूद हो सकता है। चूहों के बारे में 20% जलोदर है।

चित्र 2
चित्रा 2:। एक) आयु वर्ग के लिए मिलान नियंत्रण चूहे से DMN उपचार ख) जिगर के 4 सप्ताह के बाद एक चूहे से जिगर की। (क) जिगर, सिकुड़ा हुआ फर्म और एक पीले रंग के साथ पीला है जब जिगर के साथ तुलना मेंइसकी आयु वर्ग के लिए मिलान नियंत्रण से। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

जिगर को चोट hepatocyte कोशिका झिल्ली की वृद्धि की पारगम्यता का कारण बनता है। वृद्धि सीरम ALT और AST hepatocyte नुकसान का संकेतक हैं। सीरम एएलटी (चित्रा 3 ए) और एएसटी (चित्रा 3 बी) DMN इलाज समूह की काफी सप्ताह 2 और DMN इंजेक्शन के 4 के बाद नियंत्रण समूह की तुलना में अधिक है। सीरम ALT और AST स्तर आमतौर पर DMN उपचार के लिए प्रत्येक सप्ताह के बाद वृद्धि हुई है।

चित्र तीन
चित्रा 3: एक) सीरम alanine aminotransferase (ALT) और ख) सीरम aspartate aminotransferase (एएसटी) सप्ताह 0, पिछले DMN इंजेक्शन के बाद 2 और 4 पर DMN इलाज चूहों का स्तर। डेटा रेपर हैंसाधन ± एसडी (- 8 N = 6) के रूप में esented। * पी <0.05 सामान्य नियंत्रण समूह के साथ तुलना में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

DMN इलाज चूहों से यकृत के histological परीक्षा दिखाने नियंत्रण चूहों के साथ तुलना में है कि समय के साथ प्रगतिशील वृद्धि और रेशेदार सेप्टा के विस्तार, hepatocytes के नुकसान के साथ। मेसन के trichome दाग आमतौर पर जिगर के ऊतकों में कोलेजन जमा उजागर करने के लिए प्रयोग किया जाता है: ये नीला दाग रहे हैं।

चित्रा 4

चित्रा 4: मेसन के trichome के साथ दाग जिगर धारा के Photomicrographs: क) एक सामान्य नियंत्रण चूहे से जिगर खंड; ख) एक चूहे से जिगर खंड dimethylnitrosamin के 1 सप्ताह प्राप्त करने के बादई (DMN), ग) DMN के 2 हफ्तों प्राप्त करने के बाद एक चूहे से जिगर अनुभाग। वहाँ कभी पोर्टल DMN के 3 सप्ताह प्राप्त करने के बाद ब्रिजिंग। घ) एक चूहे से जिगर की धारा पोर्टल के साथ सबसे अधिक पोर्टल क्षेत्रों की रेशेदार विस्तार है। नोट उल्लेखनीय पोर्टल के साथ पोर्टल क्षेत्रों का विस्तार रेशेदार DMN के 4 हफ्तों प्राप्त करने के बाद एक चूहे से केंद्रीय ब्रिजिंग। ई) लिवर अनुभाग के लिए पोर्टल के रूप में रूप में अच्छी तरह पोर्टल। वहाँ गुत्थी गठन के साथ सिरोसिस है। नियंत्रण जिगर से समूह DMN इंजेक्शन के 4 हफ्तों के बाद चूहों के साथ एक साथ बलिदान है। वहाँ 0 से फाइब्रोसिस स्कोर के प्रगतिशील वृद्धि का एक पैटर्न है (एक); 2 (ख); में 3 (ग) में (ई) (घ) 5/6 करने के लिए 4। सभी photomicrographs 100 माइक्रोन तक पैमाने पर पट्टी बराबर की 1 यूनिट की लंबाई के साथ 40X के एक बढ़ाई पर ले जाया गया। कृपया गयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ चाटना।

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Discussion

हम एक विधि जिगर फाइब्रोसिस का एक पशु मॉडल बनाने के लिए और जिगर फाइब्रोसिस की गंभीरता का आकलन करने का वर्णन किया है। यह DMN की सही खुराक देने और साप्ताहिक intraperitoneal इंजेक्शन की अनुसूची का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रयोग की प्रगति के रूप में, यह चूहों का वजन करने के लिए और DMN इंजेक्शन के लिए प्रत्येक सप्ताह के शुरू में खुराक फिर से गणना महत्वपूर्ण है। ध्यान रखें कि DMN विषैला होता है और धूआं कैबिनेट में संभाला की जरूरत रखें। हम साथ ही धूआं कैबिनेट में intraperitoneal इंजेक्शन प्रदर्शन करते हैं। बार-बार इंजेक्शन के लिए जरूरत के साथ, सही संयम और इंजेक्शन की तकनीक आंतरिक अंगों को प्रदूषणों से परिचय और नुकसान से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। हम शायद ही कभी intraperitoneal इंजेक्शन से मृत्यु दर है।

चूहे प्रयोगात्मक अवधि के दौरान एक दिन में 2x निगरानी की जानी चाहिए। DMN इंजेक्शन के अंतिम सप्ताह के दौरान, जानवरों मरणासन्न संकेत के लिए भी अधिक बार और बारीकी से मनाया जाना चाहिए। इस पेरी हैआयुध डिपो जब जिगर की क्षति सबसे गंभीर है और प्रभावित चूहों inappetent किया जाएगा, शरीर के वजन और हालत खो देते हैं। 25 - चूहों का 40% इस अवधि के दौरान गंभीर रूप से बीमार हो जाते हैं और मर सकते हैं अगर कोई पशु चिकित्सा हस्तक्षेप है। इसलिए करीब से निगरानी शोधकर्ता जानवर की स्थिति का आकलन और आदेश में प्रयोग की उचित समाप्ति की योजना है कि अंगों हौसले से एक euthanized चूहे के बजाय अप्रत्याशित मौत से क्षय करने के लिए खो दिया जा रहा से काटा जा सकता है की अनुमति देता है।

हम ALT और AST स्तर के साप्ताहिक माप पाया है जिगर की क्षति की प्रगति की उपयोगी संकेतक हो सकता है। हम यह भी कहा कि एएसटी एएलटी से कम विशिष्ट है और जिगर के अलावा क्षतिग्रस्त एरिथ्रोसाइट्स और मांसपेशियों के ऊतकों से अपनी रिहाई के लिए इस विशेषता है।

सुनिश्चित करें कि रक्त की पर्याप्त मात्रा के विश्लेषण के लिए सीरम के लिए आवश्यक मात्रा उपज के लिए एकत्र किया जाता है। चूहे प्रति रक्त के 300 μl - हम आम तौर पर 200 इकट्ठा।

ग के दौरानऊतकीय परीक्षा के लिए जिगर ऊतक के ollection, हम अनुशंसा करते नमूना ही पालि से प्राप्त किया जा। इस जाँच है कि जिगर में परिवर्तन एक समान हैं के बाद किया जाता है। DMN जिगर में सामान्यीकृत परिवर्तन का कारण बनता है। अध्ययन के प्रारंभिक दौर में, हम बाएं पार्श्व और औसत दर्जे का पालियों के साथ ही सही औसत दर्जे का पालि से जांचा। हम इन खण्डों के बीच सूक्ष्म परिवर्तनों में कोई मतभेद का पालन नहीं किया।

लिवर वर्गों में कम से कम 24 घंटे के लिए 10% बफर formalin में तय की और बाद जल्द ही कार्रवाई की जानी चाहिए। पिछले एक सप्ताह से परे लंबे समय तक विसर्जन ऊतक पैराफिन एम्बेड करने के बाद भंगुर हैं और इस खंड के लिए मुश्किल होता जा रहा में परिणाम कर सकते हैं। उपयुक्त 5 माइक्रोन से पतली वर्गों को काटने अभ्यास और धैर्य की आवश्यकता है। धारा है कि नग्न आंखों (चरण 4.11) के साथ उपयुक्त होने के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं जाँच करने के लिए है कि वे अनुभाग के भीतर परतों या आँसू की तरह कलाकृतियों की जरूरत नहीं है माइक्रोस्कोप के साथ जांच की जा सकती है। धुंधला प्रक्रिया सबसे अच्छा टी अनुसार पूरा हो गया हैओ आराम टूटता बिना हर कदम पर स्लाइड विसर्जन के लिए समय समय। धुंधला प्रक्रिया के दौरान, यह सुनिश्चित करें कि वर्गों हर समय नम रखा और जितनी जल्दी हो सके अगले करने के लिए एक धुंधला समाधान से स्थानांतरित कर रहे हैं।

फाइब्रोसिस की डिग्री के लिए मेसन के trichome दाग वर्गों का मूल्यांकन एक पशु चिकित्सा रोगविज्ञानी के इनपुट की आवश्यकता है। वह / वह एक महत्वपूर्ण टीम के सदस्य हैं, जो शुरू से ही अध्ययन का हिस्सा होना चाहिए, के रूप में वह / वह सलाह और प्रयोग के सभी चरणों में अंगों का सही कटाई में भाग लेने के लिए सक्षम हो जाएगा। इस प्रकार जिगर फाइब्रोसिस स्कोरिंग के लिए वर्तमान सोने के मानक एक पैथोलॉजिस्ट ने उचित रूप से सना हुआ ऊतक वर्गों का आकलन है। हालांकि यह एक से अधिक रोगविज्ञानी के इनपुट के लिए इष्टतम होगा, इस छोटे संगठनों में संभव नहीं हो सकता है। ऐसे मामलों में, निष्पक्षता इमेजिंग तकनीक के उपयोग के 26 से सुधार किया जा सकता है। हमने पाया है कि इमेजिंग तकनीक से परिणामरोग स्कोरिंग (अप्रकाशित डेटा) के लिए तुलना कर रहे हैं, और सुझाव है कि यह मूल्यांकन के एक अनुपूरक विधि के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा।

सारांश में, जिगर फाइब्रोसिस के DMN प्रेरित मॉडल अन्य पशु मॉडल पर कई फायदे हैं। यह के रूप में यह शल्य चिकित्सा कौशल की आवश्यकता नहीं है बनाने के लिए एक अपेक्षाकृत आसान मॉडल है। DMN पर्यावरण की दृष्टि से सुरक्षित और कम मानव और सीसीएल 4 से पशुओं के लिए विषाक्त है और TAA से रोग को उत्पन्न करने के लिए एक कम समय लेता है। जिगर की बीमारी सीसीएल 4, TAA द्वारा उत्पादित, और पित्त नली बंधाव की तुलना में, DMN मानव यकृत फाइब्रोसिस के करीब प्रतिनिधित्व पैदा करता है। इन कारणों के लिए, हम उम्मीद है कि इस मॉडल को व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जा करने के लिए जिगर फाइब्रोसिस के तंत्र का अध्ययन करने के साथ ही संभावित विरोधी fibrotic एजेंटों के लिए स्क्रीन करने के लिए जारी रहेगा।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dimethylnitrosamine Wako 147-03781
Formalin Sinopharm chemicals F63257009
Ethanol Sigma 64-17-5
Xylene Fisher 1330-20-7
Masson trichome stains
Aniline Blue Electron Microscopy Sciences #42755
Acid Fuschin Electron Microscopy Sciences RT42685
Scarlet Red Electron Microscopy Sciences #26905
Phosphotungstic Acid Hydrate ALFA AESAR ALFA40116.4
Phosphomolybdic Acid Hydrate Sigma SG 221856-25G
Weigert's Iron Hematoxilyn Merck 1.15973.0002
DPX Mounting Medium Merck HX066873
Tissue processor Leica Leica TP 1020
Embedding machine Sakura  Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System
Microtome Leica Leica RM 2235
Vet Test Analyzer Idexx Vet Test 8008

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References

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चिकित्सा अंक 112 dimethylnitrosamine जिगर फाइब्रोसिस पशु मॉडल चूहे preclinical अध्ययनों
Dimethylnitrosamine प्रेरित चूहे में लिवर फाइब्रोसिस मॉडल
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Chooi, K. F., Kuppan Rajendran, D.… More

Chooi, K. F., Kuppan Rajendran, D. B., Phang, S. S. G., Toh, H. H. A. The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat. J. Vis. Exp. (112), e54208, doi:10.3791/54208 (2016).

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