Abstract
4~6週齢の雄Wistarラットは、肝線維症の動物モデルを作製するために使用しました。プロセスは、1週間に3日間連続して腹腔内投与し、10mg / kgのジメチルニトロソアミン（DMN）の投与4週間が必要です。 DMNが知られてhepatoxinと発がん性物質であるとして腹腔内注射は、ドラフト内で行いました。モデルにはいくつかの利点を有します。まず、肝臓の変化は、連続的に、または関心のある特定の段階で研究することができます。第二に、肝疾患の段階は、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）酵素を測定することによってモニターすることができます。第三に、異なる段階での肝臓損傷の重症度は、マッソントリコーム染色された肝臓組織の組織学的検査に続いて、指定された時点で動物を屠殺することにより確認することができます。 DMN投与の4週間後、典型的な線維化スコアが5 Ishakのスケールで6です。モデルは、一貫して再現することが可能となっています広く潜在的な抗線維化剤の有効性を評価するために使用されます。
Introduction
DMNは、強力な肝臓特異的毒素です。その代謝、組織分布、およびラットの肝臓への損傷を引き起こす能力は、マギー1によって報告された、およびアポトーシスによる肝細胞の損傷および細胞死のメカニズムは、プリチャードとバトラー2により説明しました。この化合物の断続的投与は、イヌ及びラット3,4における肝線維症を誘発することが報告されました。
機構及び肝線維症の形態学的変化は、広範囲に、このモデルを用いて研究されてきました。ラットを用いた初期の研究では、DMNと3週間の処置は、脂肪症5せずに小結節性肝硬変に続く中心性出血性壊死を生じました。これは、初期の線維症で、形成されたコラーゲンは、よりクロスタイプIIIは、タイプI 6よりもより顕著であることと関連していたことが示されました。他の原因と共通で、DMN誘発性線維変化はクッパー細胞の増加と関連していました。私が存在する肝マクロファージn個の正弦波。これらの細胞は、筋線維芽細胞に変形し、線維症7における主要な問題である細胞外マトリックスの過剰な量を生産します。
細胞シグナル伝達の観点から、中村らは 、TGF-βは、肝線維症8の進行において重要な役割を果たしていることを実証しました。これらは、特に、TGF-βシグナル伝達を阻害するために、短縮型、II型TGF-β受容体を発現するアデノウイルスを使用します。対照群と比較した場合、これらのラットにおける肝線維症は、見事DMN処理の間に停止しました。他の研究では、TGF-βの抑制は肝線維症の開発9,10の緩和につながることを確認しました。モデルはまた、抗線維化療法の11のための薬物標的として使用することができる他の線維症のマーカーおよび蛋白質を同定するための包括的遺伝子プロファイリング研究に使用しました。
他の化学物質は、チオアセトアミド（TAA）及びcを含む肝線維症を誘導するために使用しましたアルボン四（ 四塩化炭素）。 TAAは、ラットで、後にマウス12で最初に使用されました。このモデルの利点は次のとおりです。飲料水中の化学物質管理の容易さ、特性小結節性肝硬変と生化学的変化とモデルの再現性を。短所は次のとおりです。肝線維症のための3ヶ月の長い期間が開発し、肝線維症の誘導のための分子機構の理解の欠如します。 四塩化炭素については、その使用は、次の理由で減少している：それは人間の肝疾患を模倣しないオゾン層への有害な影響を持っている、動物に痛みや苦痛を引き起こし、人間に対して非常に毒性であり、その取り扱いに特に注意を必要とし、処分13,14。
肝硬変のための実験モデルとして（外科的介入によって）長時間の胆管閉塞は、最初Kountouras ら 15により報告されました。この方法は、ヒトおよび動物に対して非毒性です。 However、開発するために、肝線維症のために必要な時間が変化します。マルケスら 16で30のレポートのレビューは、肝線維症を開発するために、それは手術後4週間に7日から取ったことがわかりました。説明病理学的変化は、人間の慢性胆管線維症のものを模倣したモデルは、この分野に興味を持つ研究者にとって、より適しているだろう。
要約すると、4週間にわたってラットにおけるDMNの一定用量の断続的な投与は、ヒト疾患を模倣肝線維症を生成します。投与したラットでは肝損傷および実質線維症4,17の漸進的発達を示しています。疾患の進行および重症度、特定の時点で血液試料または動物の犠牲を介して監視することができ、効果が18高度に再現可能です。したがってこのモデルは広く肝線維症及び肝硬変のメカニズムを研究するため、ならびに潜在的な抗線維化剤10,19,20をスクリーニングするために使用されてきました。
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Protocol
全ての動物実験は、応用科学の学校、テマセク・ポリテクニックの動物のケアと使用委員会によって承認されました。
DMNの調製
- DMNのピペットを200μl（1グラム/ mlストック溶液）および注射用10 mg / mlでのDMN溶液を調製し、PBSの19.8ミリリットルを追加します。
注：DMNは発がん性です。 DMNを準備し、動物の注射を実行するためにヒュームフードを使用してください。
DMNの2.腹腔内注射
- 200グラム - 150の平均重量とWistar系雄性ラットを使用してください。実験開始前の7日 - 4匹のラットを順応させます。
- 12時間の明及び12時間暗サイクルで、22±1℃の室温でラットを維持します。ラット飼料および水を自由に提供します。
- 毎日の食料や水の摂取量を測定します。体重を毎週測定します。
- 10 mg / kg体重の用量に基づいて、各ラットについてDMNの量を計算します。 25ゲージの針トンで1ミリリットル注射器を使用してくださいOシリンジにDMN液の計算量を描きます。
- 腹腔内注射21用のラットを拘束。
- ラットを適切に抑制して、腹部の右下の象限に針を導入腹部空間内針の正しい配置を確認し、ゆっくりとDMN液を注入するために（何も吸引されるべきではない）、シリンジのプランジャーに戻って描画します。
- DMNの用量が投与されたときは、ゆっくりと針を撤回し、鋭利物のビンに廃棄してください。
- 4週間、週に3日間連続DMNの腹腔内注射を行います。毎日同じ時間に注射を管理します。注射の各週の開始時の体重に基づいて投与量を再計算します。
- 生化学的パラメータを測定するために尾静脈から毎週採血：アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）22。
- 商業獣医を使用して、血清ALTおよびASTを測定しますテスト化学分析装置。
3.総審査及び肝臓の収穫
- 100 mg / kg体重の用量でのペントバルビタールの腹腔内注射によって、ラットを安楽死させます。ハートビートの不足のためにチェックすることによって死を確認してください。
- 死後の準備と腹部を上に向けた状態で背側横臥位で解剖ボードにパーキンソンら 23場所死んだラットによって記載されているように動物の状態を評価します。
- 殺菌し、70％エタノールで皮膚を潤します。
- はさみを使用して、肛門からあごに皮膚にventrumの全長を切開し、皮膚を反映しています。はさみで、腹部の内臓を露出するように、剣状突起軟骨に肛門から腹壁を切開。
- 異常をチェックするために、その場で腹部臓器を調べます。任意の色、大きさの変化、臓器の位置や腹腔内の流体の存在に注意してください。調べます臓器の一貫性とは、任意の臭気の存在に注意してください。
- ハサミやピンセットを使用して、その靭帯および添付ファイルのない肝臓全体を分析。
- それが振動板に取り付けられている門から始まり、添付ファイルのすべての肝葉を解放するために働きます。慎重にすべての靭帯や血管を切ります。
- ペトリ皿に肝臓を転送し、肝臓の重量を量ります。
- 5ミリメートル肝葉の厚いセクション - メスを使用して、2をカット。一貫性を保つため、常に同じ肝葉からサンプルを取ります。固定用緩衝ホルマリン10％にlobe.Immediately地の端から約1cm右側葉24から、厚さのウェッジ約5mmの直径を取ります。ホルマリンボリュームへの組織は1：10以上であることを確認してください。
- 収穫や他の研究のために必要な場合は、直ちに、この時点で肝葉の（液体窒素を使用して）部分を凍結します。 （3.8）については、一貫性のために同じ肝葉からのサンプル。
- 24時間の最低10％緩衝ホルマリンで肝臓サンプルを修正しました。
- 固定後、カセットに肝臓、場所をトリミングして、自動化された組織プロセッサのバスケットにロードします。
- 10％緩衝ホルマリンを含む最初のステーションにカセットでバスケットを置きます。カセットが完全に水没していることを確認します。サイクルが始まるまで彼らは、最大12時間のために、このチャンバ内に留まることができます。
- （50％、70％、90％、100％（2局）、キシレン（2局）及び流動パラフィンの濃度でエタノール：以下の溶液を含む連続したステーションを介して、1時間ごとに、カセットを回転させるために、組織のプロセッサをプログラム2局）。
- 埋め込みステーションのワックス浴に肝臓サンプルを転送します。埋め込みマシンは、少なくとも1時間早くオンになっていることを確認してください。
- 予熱した鉗子（65°C）を使用して、ワットから各カセットを削除埋め込みマシンの温かいプレート上に斧風呂と場所（65°C）。半分まで（65℃に予め温めておいた）ステンレス製のベースモールドに液体パラフィンを十分に分配します。金型内にカセットから肝臓の一部を転送します。金型の底の平らな（顕微鏡で検査する）試験片を切断面に配置されていることを確認してください。
- 流動パラフィンで完全に金型を記入し、上に空のカセットを装着し、少なくとも30分間冷却するために埋め込み機の4℃のプレート上に金型を配置します。
- ワックスが冷却固化していることを確認し、金型からパラフィンブロックを削除します。ブロックは、簡単に飛び出すと、スティックまたは割れないようにしてください。この問題が発生した場合、ブロックを溶融し、この手順を繰り返します。それは固化後、パラフィンブロックを区分することができます。ブロックは、長年にわたって室温で保存することができます。
- ワックス層まで、10ミクロンの厚さでミクロトームやセクションにパラフィンブロックを配置埋め込まれた肝臓組織が見えるようにするために十分に除去されています。
- 5μmの厚さにカットするミクロトーム上で設定を変更します。鉗子を使用して、エッジでそれを保持することによっても切断した断面をピックアップし、慎重に40℃の温度で水浴中でセクションをフロート。
- そっとフローティングセクションの下に清浄なスライドガラスを配置し、スライドガラスの表面上に持ち上げます。一晩37℃で暖かいスライド上にスライドを配置します。
5.マッソントリクローム染色
- 次のように汚れを適用する前に、ワックスを除去し、組織を再水和するためにスライドを扱います：
- 5分間キシレン中のセクションを浸し。 2回繰り返します。
- 3分間100％エタノール中にセクションを浸し。 1倍を繰り返します。
- 90％、80％および70％エタノールの次の溶液で1分間ごとに切片を浸し。
- スライド上の既存のエタノールを除去するために水道水でスライドをすすぎます。
- 核を染色するために10分間鉄ヘマトキシリンでスライドを浸し。
- スライドから余分な汚れを除去するために水でスライドを洗浄します。
- 細胞質を染色するために2分間ビーブリッヒスカーレット - 酸性フクシンでスライドを浸し。
- 水でスライドを洗浄します。
- アニリンブルーの取り込みを促進するために10分間リンタングステン/リンモリブデン酸溶液にスライドを置きます。使用の2ラウンド後にリンタングステン/リンモリブデン酸溶液に変更します。
- コラーゲン繊維を染色するために10分間アニリンブルー溶液中にスライドを配置します。
- 水で余分な汚れを洗浄し、分化は、より繊細で透明なスライドの色をレンダリングするために場所を取ることができるように1分間1％酢酸溶液中でスライドを配置します。
- 水でスライドを洗浄し、組織切片を脱水するために進んでください。次のように脱水手順は次のとおりです。
- 以下のconceで、10秒間連続してたびに、スライドを浸しエタノールのntrations：70％、80％、95％、100％。
- 100％エタノールで30秒間スライドを浸します。 1倍を繰り返します。
- エタノールを除去するために5分間のキシレンの3局各々を通ってスライドを洗浄します。
- 取付け媒体（ 例えば 、DPXの封入）で試料上にガラスカバースリップをマウントし、乾燥させます。
注：DPXは、速乾性の合成樹脂で汚れを維持し、組織切片を保護します。
肝臓のマッソンのトライコームステンドセクション6.線維症スコアリング
- 獣医病理学者を持っている25のスコア線維症に応じて線維症の重症度を評価します。線維化スコアは盲検法で独立して2または3の病理学者によって行われた場合には最適だろう。このようなシナリオでは、スコアリングの違いを整理して議論し、グループ見直し後の最終的なスコアを得ます。
| スコア | 説明 |
| 0 | いいえ線維症はありません |
| 1 | 短い線維性中隔の有無にかかわらず、いくつかのポータルエリアの線維性拡大、 |
| 2 | 短い線維性中隔の有無にかかわらず、ほとんどのポータルエリアの線維性拡大、 |
| 3 | ほとんどのポータルエリアの線維性拡大、ポータルに時折ポータル（PP）ブリッジング |
| 4 | 中央（PCにマークされ、ブリッジング（（PPをポータルにポータル）だけでなく、ポータルとポータルエリアの線維性拡大） |
| 5 | 時折小結節（不完全な肝硬変）と（PPおよび/またはPC）の橋渡しマーク |
| 6 | 可能性や明確な肝硬変、 |
表1：マッソンのトライコーム染色された肝臓切片25 を 読み出すための線維化スコア 。
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Representative Results
DMN処理ラットは体重を減らすとフリル被毛とあまり活発になります。 DMN処理ラットの平均体重の有意な損失があります。最初のDMN処理の2週間後に検出し、この差を週3とDMN処理（ 図1a）の後に4を介して残っています。ラットは、連続週間にわたってDMNを受信すると、肝臓へのダメージは、それが小さくなるようになります。肝臓インデックス。最終体重で肝重量のパーセントこれはDMN処理ラット（ 図1b）のために有意に低かったです。
図1：DMN処理ラットのa）の体重。データは、平均±SD（ - 8はn = 6）の手段として表現されます。 * P <正常対照群と比較して0.05 B）肝臓指数。 DMN処理ラットの最終体重におけるパーセント肝重量DMN TREの4週間後atment。データは、平均±SD（ - 8はn = 6）の手段として表現されます。 * P <0.05正常対照群と比較した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
屠殺時に、DMN処理の4週間後に、肝臓は、高齢者マッチした対照動物からのものに比べて小さく、硬い（ 図2a）（ 図2b）です。フィブリンは、肝臓表面上に存在してもよく、隣接する肝葉に接着されています。ラットの約20％は腹水を持っています。
図2：経年マッチした対照ラットからのDMN処置b）の肝臓の4週間後のラットからa）の肝臓。肝臓と比較した場合、（a）は、肝臓が黄色がかった色合いと、縮んしっかりと淡いですその高齢者対応対照から。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
肝臓への傷害は、肝細胞の細胞膜の透過性の増加を引き起こします。増加した血清ALTおよびASTは肝細胞損傷の指標です。血清ALT（ 図3a）とDMN処理群のAST（ 図3b）が週2とDMN注射の4後に対照群よりも有意に高いです。血清ALTおよびASTレベルは、典型的には、DMN処理の各週後に増加します。
図3 は、a）血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）およびb）血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）週間最後のDMN注射後0,2および4でのDMN処理ラットのレベル。データはのreprありますSD±（ - 8はn = 6）の手段としてesented。 * P <0.05正常対照群と比較した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
DMN処理ラット由来の肝臓の組織学的検査は、肝細胞の損失と漸進的に増加し、線維性中隔の拡大は、対照ラットと比較して時間をかけて、そこにあることを示しています。マッソンのトライコームの染色は、一般的に肝組織中のコラーゲン沈着を強調するために使用されています。これらは、青色に染色されています。
図4：マッソンのトライコームにより染色された肝臓切片の顕微鏡写真：正常対照ラットからa）は肝臓部と、b）は 、ラットの肝臓セクションdimethylnitrosaminの1週間を受け取った後E（DMN）; DMNの2週間を受信した後、ラットからc）の肝臓切片。 DMNの3週間を受信した後のラットから。d）の肝臓セクションをブリッジポータルに時折ポータルで最もポータルエリアの繊維状の拡大があります。 DMNの4週間を受けた後のラットから中央のブリッジ。e）の肝臓セクションへのポータルとしてだけでなくポータルにマークされたポータルとポータルエリアの繊維状の拡大に注意してください。結節形成を伴う肝硬変があります。グループはDMN注射の4週間後のラットと一緒に屠殺からの制御レバーです。 （a）は 0から線維症スコアの漸進的増加のパターンがあります。 2（b）において、 （e）の中で5/6〜（d）は（c）において、4で3。全ての顕微鏡写真は、100μmのスケールバーと同等の1単位長さで40倍の倍率で撮影した。 してくださいCこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをなめます。
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Discussion
我々は、肝線維症の動物モデルを作るために、肝臓線維症の重症度を評価するための方法を記載しています。 DMNの適切な投与量を提供し、毎週の腹腔内注射のスケジュールに固執することは重要です。実験が進むにつれて、ラットを計量し、DMN注射の各週の開始時に投与量を再計算することが重要です。 DMNは毒性があり、ヒュームキャビネットに処理する必要があることに注意してください。我々としてもヒュームキャビネットに腹腔内注射を行います。反復注射の必要性により、注射の正確な拘束や技術は、汚染物質や内臓へのダメージの導入を避けることが重要です。私たちはめったに腹腔内注射による死亡率を持っていません。
ラットは、実験期間を通して一日約2倍のモニターすべきです。 DMN注射の最後の週の間、動物は、瀕死の兆候に対してもより頻繁かつ綿密に観察する必要があります。これはペリです肝臓の損傷が最も深刻で、影響を受けたラットをinappetentされたときにODが、体重および状態を失います。 25 - ラットの40％がこの期間中に深刻な病気になると全く獣医の介入がない場合死ぬことができます。したがって、綿密なモニタリングは、研究者が動物の状態を評価し、臓器をたて代わりに予期せぬ死から減衰に失われるの安楽死させたラットから採取することができるようにするために、実験の適切な終了を計画することができます。
私たちは、ALTおよびASTレベルの毎週の測定は、肝損傷の進行の有用な指標であることが判明しています。また、ASTはALT未満特異的であることが観察され、肝臓に加えて、損傷を受けた赤血球および筋肉組織から、そのリリースにこの属性ました。
血液の十分な量を分析するための血清の必要量を得るために収集されていることを確認してください。ラットあたりの血液300μlの - 私たちは、典型的には200を収集します。
Cの間組織学的検査のために肝臓組織のollectionは、我々は、サンプルが同じ葉から得ることをお勧めします。これは、肝臓の変化が均一であることを確認した後に行われます。 DMNは、肝臓における一般的な変化を引き起こします。研究の初期段階では、我々は左横および内側ローブだけでなく、右中葉からサンプリング。我々は、これらのローブ間の微視的変化の違いを観察しませんでした。
肝臓切片は、少なくとも24時間、10％緩衝ホルマリン中で固定し、すぐ後に処理されるべきです。週を超えた長時間の浸漬は、パラフィン包埋した後に脆くセクションに困難になってきた組織になることがあります。適切な5μmの薄い部分をカットする練習と忍耐が必要です。裸眼（ステップ4.11）で適切であると評価されたセクションは、彼らがセクション内の折り目や涙などのアーティファクトを持っていないことを確認するために顕微鏡で検査することができます。染色手順は、最良に従ってトンを完了しました休憩なしの各ステップでのスライドの浸漬のための期間がo。染色プロセスの間に、セクションは常に湿った保ち、できるだけ早く次の1つの染色溶液から転送されていることを確認します。
線維症の程度のためのマッソン毛染色切片の評価は、獣医病理学者の入力が必要です。彼/彼女は彼/彼女は、実験のすべての段階で助言や臓器の正しい収穫に参加することができるだろうとして、最初から研究の一部であるべき重要なチームメンバーです。したがって、肝線維症のスコアの現在のゴールドスタンダードは、病理学者によって適切に染色された組織切片の評価です。それは複数の病理学者の入力を有することが最適であろうが、これは、小規模な組織では可能ではないかもしれません。このような場合には、客観性をイメージング技術26を使用することによって改善することができます。我々は、イメージング技術の結果病理学的スコアリング（未発表データ）に匹敵する、それが評価の補助的な方法として使用することをお勧めします。
要約すれば、肝線維症のDMN誘発モデルは、他の動物モデルよりも多くの利点を有しています。外科的なスキルを必要としないようにする比較的簡単なモデルです。 DMNは、環境に安全で四塩化炭素よりもヒトおよび動物への毒性が低いとTAAよりも、病気を誘発するために、より短い時間がかかります。 四塩化炭素、TAAによって産肝疾患、胆管結紮に比べて、DMNは、ヒト肝線維症のより近い表現を生成します。これらの理由から、我々はモデルが肝線維症のメカニズムを研究するだけでなく、潜在的な抗線維性薬剤をスクリーニングするために広く使用され続けることを予見します。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethylnitrosamine | Wako | 147-03781 | |
| Formalin | Sinopharm chemicals | F63257009 | |
| Ethanol | Sigma | 64-17-5 | |
| Xylene | Fisher | 1330-20-7 | |
| Masson trichome stains | |||
| Aniline Blue | Electron Microscopy Sciences | #42755 | |
| Acid Fuschin | Electron Microscopy Sciences | RT42685 | |
| Scarlet Red | Electron Microscopy Sciences | #26905 | |
| Phosphotungstic Acid Hydrate | ALFA AESAR | ALFA40116.4 | |
| Phosphomolybdic Acid Hydrate | Sigma SG | 221856-25G | |
| Weigert's Iron Hematoxilyn | Merck | 1.15973.0002 | |
| DPX Mounting Medium | Merck | HX066873 | |
| Tissue processor | Leica | Leica TP 1020 | |
| Embedding machine | Sakura | Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System | |
| Microtome | Leica | Leica RM 2235 | |
| Vet Test Analyzer | Idexx | Vet Test 8008 |
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