Abstract
Quatre à six semaines vieux rats mâles Wistar ont été utilisés pour produire des modèles animaux de fibrose du foie. Le processus nécessite quatre semaines d'administration de 10 mg / kg diméthylnitrosamine (DMN), étant donné intrapéritonéale pendant trois jours consécutifs par semaine. injections intra-péritonéales ont été effectuées dans la hotte comme DMN est un hépatotoxine et cancérigène connu. Ce modèle présente plusieurs avantages. Tout d'abord, les changements du foie peuvent être étudiés de manière séquentielle ou à des étapes particulières d'intérêt. Deuxièmement, le stade de la maladie du foie peut être contrôlée par la mesure de sérum alanine aminotransférase (ALT) et aspartate aminotransférase (AST) enzymes. En troisième lieu, la gravité des dommages au foie à différents stades peut être confirmé par le sacrifice des animaux à des moments désignés, suivie d'un examen histologique des tissus du foie Trichome tachés de Masson. Après quatre semaines de DMN dosage, le score typique de la fibrose est de 5 à 6 sur l'échelle Ishak. Le modèle peut être reproduit de manière cohérente et a étélargement utilisé pour évaluer l'efficacité d'agents anti-fibrotiques potentiels.
Introduction
DMN est une toxine spécifique du foie puissant. Son métabolisme, la distribution tissulaire, et la capacité de causer des blessures aux foies de rats a été signalée par Magee 1, et le mécanisme des dommages des hépatocytes et la mort cellulaire par apoptose a été décrit par Pritchard et Butler 2. L' administration intermittente de ce composé a été rapporté pour induire une fibrose du foie chez les chiens et les rats 3,4.
Les mécanismes et des changements morphologiques de la fibrose hépatique ont été largement étudiés en utilisant ce modèle. Dans les premières études utilisant le rat, le traitement de 3 semaines avec DMN produit une nécrose hémorragique centro - lobulaire suivie d' une cirrhose micronodulaire sans stéatose 5. Il a été montré que la fibrose précoce, le collagène formé est de plus réticulé de type III étant plus important que le type I 6. En commun avec d'autres causes, des changements fibrotiques induite DMN-ont été associés à une augmentation des cellules Kupffer; les macrophages hépatiques qui résident in sinusoïdes. Ces cellules se transforment en myofibroblastes et produisent des quantités excessives de matrice extracellulaire qui est le principal problème de la fibrose 7.
En ce qui concerne la signalisation cellulaire, Nakamura et al. , Ont démontré que le TGF-β joue un rôle critique dans la progression de la fibrose hépatique 8. Ils ont utilisé un adénovirus exprimant un récepteur de TGF-β tronqué de type II, d'inhiber spécifiquement la signalisation du TGF-β. La fibrose hépatique chez ces rats a été interrompue de manière spectaculaire au cours du traitement de DMN par rapport aux groupes témoins. D' autres études ont confirmé que la suppression du TGF-β conduit à la réduction du foie le développement de la fibrose 9,10. Le modèle a également été utilisé dans une étude globale de profilage génétique pour identifier d' autres marqueurs de fibrose et de protéines qui pourraient être utilisés comme cibles de médicaments pour la thérapie anti-fibrotique 11.
D'autres agents chimiques utilisés pour induire une fibrose du foie comprennent thioacétamide (TAA) et ctétrachlorure arbon (CCl 4). TAA a été utilisé pour la première chez les rats et plus tard chez les souris 12. Les avantages de ce modèle comprennent: la facilité d'administration de produits chimiques dans l'eau, la reproductibilité du modèle avec la cirrhose micronodulaire caractéristique et les modifications biochimiques de boisson. Les inconvénients comprennent: la période de 3 mois pour la fibrose hépatique de longue date pour développer et le manque de compréhension du mécanisme moléculaire pour l'induction de la fibrose hépatique. Quant à CCl 4, son utilisation a diminué pour les raisons suivantes: il ne reproduit pas la maladie de foie humain, a des effets nocifs sur la couche d'ozone, provoque la douleur et la détresse des animaux, est très toxique pour les humains et nécessite des précautions supplémentaires dans sa manipulation et élimination 13,14.
Prolongée des voies biliaires obstruction (par une intervention chirurgicale) comme modèle expérimental pour la cirrhose du foie a été rapporté par Kountouras et al. 15. Cette méthode est non toxique pour les humains et les animaux. Houtefois, le temps nécessaire pour que la fibrose du foie pour développer varie. Un examen de 30 rapports par Marques et al. 16, a constaté qu'il a fallu de sept jours à quatre semaines après la chirurgie de la fibrose du foie à se développer. Les changements pathologiques décrites ressemblent à ceux de la fibrose biliaire chronique humaine et le modèle serait plus adapté pour les chercheurs intéressés dans ce domaine.
En résumé, l'administration intermittente d'une dose constante de DMN chez le rat de plus de 4 semaines produit une fibrose hépatique qui imite la maladie humaine. Rats traités montrent le développement progressif des lésions du foie et la fibrose parenchymateuse 4,17. Progression de la maladie et la gravité peuvent être contrôlés par l' intermédiaire d' échantillons de sang ou sacrifice des animaux à des moments spécifiques et l'effet est hautement reproductible 18. Ainsi , le modèle a été largement utilisé pour étudier les mécanismes de la fibrose hépatique et de la cirrhose, ainsi que pour cribler des agents potentiels anti-fibrotiques 10,19,20.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par le comité de protection des animaux et l'utilisation de l'École des sciences appliquées, Temasek Polytechnic.
1. Préparation du DMN
- Pipette 200 pi de DMN (1 g / ml de solution mère) et ajouter 19,8 ml de PBS pour préparer une solution de DMN 10 mg / ml pour l'injection.
Remarque: DMN est cancérogène. Utilisez une hotte pour préparer le DMN et effectuer les injections animales.
2. Injection intrapéritonéale de DMN
- Utilisez des rats mâles Wistar d'un poids moyen de 150-200 g. Acclimate rats pour 4 - 7 jours avant le début de l'expérience.
- Maintenir les rats à la température ambiante de 22 ± 1 ° C, avec 12 heures de lumière et 12 heures de cycles sombres. Fournir chow de rat et de l' eau ad libitum.
- Mesurer les prises d'eau et de nourriture quotidienne. Mesurer le poids corporel hebdomadaire.
- Calculer la quantité de DMN pour chaque rat en fonction de la dose de 10 mg / kg de poids corporel. Utiliser une seringue de 1 ml avec une aiguille de calibre 25 to tirer le volume calculé de solution de DMN dans la seringue.
- Restreindre le rat pour l' injection intrapéritonéale 21.
- Avec le rat correctement retenu, introduire l'aiguille dans le quadrant inférieur droit de l'abdomen, tirer sur le piston de la seringue (rien ne doit être aspiré) pour vérifier le placement correct de l'aiguille dans l'espace abdominale et injecter lentement la solution de DMN.
- Lorsque la dose de DMN a été administré, retirer lentement l'aiguille et la jeter dans la poubelle d'objets tranchants.
- Effectuer les injections intra-péritonéales de DMN pendant 3 jours consécutifs par semaine pendant 4 semaines. Administrer les injections à la même heure chaque jour. Re-calculer la dose sur la base du poids corporel au début de chaque semaine des injections.
- Prélever le sang de la veine hebdomadaire de queue pour mesurer les paramètres biochimiques: alanine aminotransférase (ALT) et aspartate aminotransférase (AST) 22.
- Mesure ALT sérique et AST à l'aide d'un vétérinaire commercialAnalyseur de chimie Test.
3. Examen brut et récolte du foie
- Euthanize les rats par injection intraperitoneale de pentobarbital à la dose de 100 mg / kg de poids corporel. Veiller à la mort en vérifiant l'absence de battements cardiaques.
- Préparer la post - mortem et d' évaluer l'état de l'animal tel que décrit par Parkinson et al. 23 La place des rats morts sur une planche à dissection en décubitus dorsal avec l'abdomen vers le haut.
- Désinfecter et humidifier la peau avec 70% d'éthanol.
- Avec des ciseaux, incise la peau toute la longueur de la partie ventrale de l'anus vers le menton, et reflètent la peau. Avec les ciseaux, inciser la paroi abdominale de l'anus vers le cartilage xiphoïde, pour exposer les viscères abdominaux.
- Examiner les organes abdominaux in situ pour vérifier toutes les anomalies. Notez tous les changements dans la couleur, la taille, l'emplacement des organes et la présence de liquide dans la cavité péritonéale. Examinerla cohérence des organes et noter la présence de toutes les odeurs.
- Avec des ciseaux et des pinces, disséquer entièrement libre du foie de ses ligaments et des pièces jointes.
- Commencez par le hile où elle est attachée au diaphragme et à travailler pour libérer tous les lobes du foie de pièces jointes. Découpez soigneusement tous les ligaments et les vaisseaux sanguins.
- Transférer le foie sur une boîte de Pétri et peser le foie.
- L'utilisation d'un scalpel, couper 2 - 5 mm sections épaisses de lobes du foie. Par souci de cohérence, toujours prendre des échantillons provenant du même lobe du foie. Prenez une cale d' environ 5 mm de diamètre dans l' épaisseur, du lobe latéral droit 24 d' environ 1 cm du bord de la place lobe.Immediately dans 10% de formaline tamponnée pour la fixation. Vérifiez que le tissu et le volume de formaline est de 1:10 ou plus.
- Récolte et geler immédiatement les parties (en utilisant de l'azote liquide) des lobes du foie à ce stade si nécessaire pour d'autres études. En ce qui concerne (3.8), un échantillon du même lobe de foie de cohérence.
- Fixer les échantillons de foie dans 10% de formaline tamponnée pour un minimum de 24 heures.
- Après fixation, couper le foie, placer dans des cassettes et de les charger dans le panier du processeur de tissu automatisé.
- Placez le panier avec des cassettes dans la première station qui contient 10% de formol tamponné. Assurer les cassettes sont entièrement submergés. Ils peuvent rester dans cette chambre pour un maximum de 12 heures jusqu'à ce que le cycle commence.
- Programmer le processeur de tissus pour faire pivoter les cassettes pendant 1 h chacune, à travers des postes successifs contenant les solutions suivantes: l'éthanol à des concentrations de 50%, 70%, 90%, 100% (2 stations), du xylène (2 stations) et de la paraffine liquide ( 2 stations).
- Transférer les échantillons de foie dans le bain de la station d'enrobage de cire. Faire en sorte que la machine d'enrobage est mis en marche au moins une heure avant.
- Utilisation des pinces pré-chauffé (65 ° C), retirer chaque cassette du wbain de hache et la place sur la plaque chaude (65 ° C) de la machine d'enrobage. Distribuer une quantité suffisante de la paraffine liquide dans le moule de base en acier inoxydable (préchauffée à 65 ° C) jusqu'à la moitié. Transférer la section du foie, de la cassette dans le moule. Que le spécimen est placé avec la surface de coupe (à examiner au microscope) à plat sur le fond du moule.
- Remplissez complètement le moule avec de la paraffine liquide, monter la cassette vide sur le dessus et placez le moule sur la plaque C 4 ° de la machine d'enrobage à refroidir pendant au moins 30 min.
- Vérifiez que la cire a refroidi et solidifié, et retirer le bloc de paraffine du moule. Le bloc devrait sortir facilement et ne colle pas ou se fissurer. Si cela se produit, faire fondre le bloc et répétez cette étape. Le bloc de paraffine peut être sectionné une fois qu'il se solidifie. Les blocs peuvent être stockés à température ambiante pendant de nombreuses années.
- Placer le bloc de paraffine dans le microtome et la section de 10 um d'épaisseur jusqu'à ce que la couche de cireest éliminé suffisamment pour que le tissu hépatique incorporé soit visible.
- Changez le réglage sur le microtome pour couper à 5 um d'épaisseur. En utilisant des pinces, ramasser une section bien coupé en le tenant par le bord et flotter attentivement la section dans le bain d'eau à une température de 40 ° C.
- Placez délicatement une lame de verre propre sous la section flottante et soulevez-le sur la surface de la lame de verre. Placer la lame sur une lame chaude à 37 ° C pendant une nuit.
5. Masson Trichrome Coloration
- Avant d'appliquer les taches, traiter les lames pour enlever la cire et réhydrater les tissus comme suit:
- Immerger les sections dans du xylène pendant 5 min. Répéter 2x.
- Immerger les sections dans 100% d'éthanol pendant 3 min. Répéter 1x.
- Immerger les sections pendant 1 minute dans chacune des solutions suivantes d'éthanol: 90%, 80% et 70%.
- Rincer la lame sous l'eau du robinet pour éliminer tout éthanol existant sur la diapositive.
- Immerger les lames en fer hématoxyline pendant 10 minutes pour colorer le noyau.
- Rincer les lames avec de l'eau pour éliminer l'excès de colorant de la diapositive.
- Immerger les lames dans Biebrich Scarlet-fuchsine acide pendant 2 minutes pour colorer le cytoplasme.
- Rincer les lames avec de l'eau.
- Placer les lames dans / solution d'acide phosphomolybdique Phosphotungstic pendant 10 min pour favoriser l'absorption du Aniline bleu. Changer la solution d'acide phosphotungstique / phosphomolybdique après 2 tours d'utilisation.
- Placer les lames dans une solution de bleu d'aniline pendant 10 minutes pour colorer les fibres de collagène.
- Rincer l'excès tache avec de l'eau et placer les lames dans une solution d'acide acétique à 1% pendant 1 min pour permettre une différenciation au lieu de rendre la couleur de la lame plus délicate et transparente.
- Rincer les lames avec de l'eau et passez à déshydrater les coupes de tissus. Les étapes de déshydratation sont les suivantes:
- Immerger les lames successivement pendant 10 secondes à chaque fois, dans la conce suivantentrations d'éthanol: 70%, 80%, 95% et 100%.
- Immerger les lames pendant 30 secondes dans 100% d'éthanol. Répéter 1x.
- Rincer les lames par 3 stations de xylène pendant 5 minutes chaque éthanol pour éliminer.
- Monter une lamelle de verre sur l'échantillon avec les médias de montage (par exemple, DPX milieu de montage) et laisser sécher.
Note: DPX est une résine synthétique qui sèche rapidement, préserve la tache et protège la section de tissu.
6. Fibrose Scoring sur Trichome Stained Sections Masson de foie
- Avoir un pathologiste vétérinaire évaluer la gravité de la fibrose selon le score de fibrose 25. Il serait optimal si le score de fibrose se fait par deux ou trois pathologistes indépendamment d'une manière aveugle. Dans un tel scénario, obtenir un score final après discussion et l'examen du groupe pour trier les différences de notation.
| But | La description |
| 0 | pas de fibrose |
| 1 | l'expansion fibreuses de certaines zones du portail, avec ou sans court septa fibreux |
| 2 | l'expansion fibreuses de la plupart des zones de portail, avec ou sans court septa fibreux |
| 3 | l'expansion fibreuses de la plupart des zones de portail, portail occasionnel au portail (PP) de pontage |
| 4 | l'expansion fibreuse des zones de portail avec pont marqué (portail au portail (PP), ainsi que portail central (PC) |
| 5 | Marqué pontage (PP et / ou PC) avec des nodules occasionnels (cirrhose incomplète) |
| 6 | Cirrhose, probable ou certain |
Tableau 1: Fibrosis Score utilisé pour la lecture Trichome Stained foie Sections du Masson 25.
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Representative Results
les rats traités de DMN perdre du poids et deviennent moins vigoureux avec poil hérissé. Il y a une perte significative de poids corporel moyen de DMN rats traités; première détectable après 2 semaines de traitement DMN et cette différence reste par semaine 3 et 4 , après traitement de DMN (figure 1a). Comme les rats reçoivent DMN au fil des semaines successives, des dommages au foie fait qu'il devient plus petit. L'indice du foie; qui est le pour cent du poids du foie au poids corporel final était significativement plus faible pour les DMN rats traités (figure 1b).
Figure 1: a) Le poids corporel des rats traités DMN. Les données sont représentées comme des moyennes ± écart type (n = 6 - 8). * P <0,05 par rapport au groupe témoin normal b) Indice du foie. pour cent en poids du foie au poids corporel final du DMN rats traités après 4 semaines de DMN treatment. Les données sont représentées comme des moyennes ± écart type (n = 6 - 8). * P <0,05 par rapport au groupe témoin normal. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Au moment du sacrifice, après 4 semaines de traitement DMN, le foie est plus petit et plus dur (figure 2a) par rapport à ceux de l' âge des animaux témoins appariés (figure 2b). La fibrine peut être présent sur la surface du foie et des lobes hépatiques adjacents sont respectées. Environ 20% des rats ont ascite.
Figure 2: a) du foie d'un rat après 4 semaines de traitement DMN b) du foie de rat âgés de témoins appariés.. En (a) le foie est rétréci, ferme et pâle avec une teinte jaunâtre en comparaison avec le foiede son contrôle appariés ans. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Lésion du foie provoque une perméabilité accrue de la membrane cellulaire des hépatocytes. ALT sérique accrue et AST sont des indicateurs de dommages hépatocytaire. ALT sérique (Figure 3a) et AST (Figure 3b) du groupe traité DMN sont significativement plus élevés que ceux du groupe de contrôle après des semaines 2 et 4 de l' injection de DMN. taux d'ALAT et ASAT sériques augmentent habituellement après chaque semaine de traitement de DMN.
Figure 3: a) alanine aminotransférase (ALT) et b) aspartate aminotransférase (AST) les niveaux de DMN rats traités aux semaines 0, 2 et 4 après la dernière injection de DMN. Les données sont réédesented comme moyen ± écart-type (n = 6 - 8). * P <0,05 par rapport au groupe témoin normal. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
L'examen histologique des foies de DMN rats traités montrent qu'il ya augmentation progressive et l'expansion de septa fibreux, avec une perte d'hépatocytes, au fil du temps par rapport aux rats témoins. Trichome la coloration de Masson est couramment utilisé pour mettre en évidence les dépôts de collagène dans les tissus du foie: elles sont colorées en bleu.
Figure 4: photomicrographies de foie Sections colorées avec de Masson Trichome: a) la section de foie d'un rat témoin normal; b) la section de foie d'un rat après avoir reçu de 1 semaine de dimethylnitrosamine (DMN); c) la section de foie d'un rat après avoir reçu 2 semaines de DMN. Il est l' expansion fibreuse de la plupart des zones de portail avec le portail occasionnel au portail relais. D) la section de foie d'un rat après avoir reçu 3 semaines de DMN. Notez l'expansion fibreuse des zones de portail avec portail marqué au portail ainsi que portail e) section centrale pontage. Hépatique à partir d' un rat après avoir reçu 4 semaines de DMN. Il y a une cirrhose avec la formation de nodules. Le foie de commande est dans le groupe sacrifié avec des rats au bout de 4 semaines après l'injection de DMN. Il y a une tendance d'augmentation progressive du score de fibrose de 0 à (a); 2 (b); 3 (c) 4 à (d) 6/5 à (e). Toutes les microphotographies ont été prises à un grossissement de 40X avec une unité de longueur de la barre échelle correspond à 100 um. S'il vous plaît clécher ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nous avons décrit un procédé pour rendre un modèle animal de la fibrose hépatique et d'évaluer la gravité de la fibrose hépatique. Il est important de délivrer la dose correcte de DMN et respecter le calendrier des injections intraperitoneales hebdomadaires. Comme l'expérience progresse, il est essentiel de peser les rats et recalculer la dose au début de chaque semaine des injections de DMN. Gardez à l'esprit que DMN est toxique et doit être manipulé dans l'armoire de fumées. Nous effectuons les injections intra-péritonéales dans l'armoire de fumée ainsi. Avec le besoin d'injections répétées, la retenue et la technique de l'injection est importante pour éviter l'introduction de contaminants et des dommages aux organes internes. Nous avons rarement la mortalité des injections intra-péritonéales.
Les rats doivent être surveillés 2x par jour pendant la période expérimentale. Au cours de la dernière semaine de l'injection de DMN, les animaux doivent être observés encore plus fréquemment et de près les signes moribonds. Ce sont les zones périod lorsque les dommages du foie est plus sévère et les rats affectés sera inappetent, perdre du poids corporel et de l'état. 25 - 40% des rats peut devenir gravement malade au cours de cette période et de mourir s'il n'y a pas d'intervention vétérinaire. Par conséquent une surveillance étroite permet au chercheur d'évaluer l'état de l'animal et de planifier la terminaison appropriée de l'expérience afin que les organes peuvent être fraîchement récoltées à partir d'un rat euthanasiés au lieu d'être perdu à la pourriture de la mort inattendue.
Nous avons trouvé la mesure hebdomadaire des taux d'ALAT et ASAT être des indicateurs utiles de la progression des lésions du foie. Nous avons également observé que AST est moins spécifique que l'ALT et l'attribuer à sa sortie des érythrocytes endommagés et des tissus musculaires en plus de foie.
Veiller à ce que le volume suffisant de sang est recueilli pour donner le volume nécessaire de sérum pour analyse. Nous recueillons généralement 200 - 300 ul de sang par rat.
Au cours de la collection de tissu hépatique pour un examen histologique, nous recommandons l'échantillon soit obtenu à partir du même lobe. Pour ce faire, après avoir vérifié que les changements dans le foie sont uniformes. DMN provoque des changements généralisés dans le foie. Dans les premiers stades de l'étude, nous avons échantillonné des lobes latéral et médial gauche ainsi que le lobe médian droit. On n'a pas observé de différences dans les changements microscopiques entre ces lobes.
sections de foie devraient être fixés à 10% du formol tamponné pendant au moins 24 heures et traitées peu après. Une immersion prolongée au-delà d'une semaine peut entraîner dans le tissu devenir cassant et difficile à section après inclusion dans la paraffine. Cutting 5 um sections minces appropriées exige de la pratique et de patience. Les articles qui sont évalués à être adapté à l'oeil nu (étape 4.11) peuvent être examinés au microscope pour vérifier qu'ils ne sont pas des objets tels que des plis ou des déchirures au sein de la section. La procédure de coloration est mieux rempli selon to les délais de diapositives immersion à chaque étape sans pauses. Pendant le processus de coloration, veiller à ce que les sections sont maintenus humides en tout temps et transférés d'une solution de coloration à l'autre le plus tôt possible.
Évaluation des sections trichomes de Masson colorées pour le degré de fibrose nécessite l'entrée d'un pathologiste vétérinaire. Il / elle est un membre de l'équipe cruciale qui devrait faire partie de l'étude dès le début, comme il / elle serait en mesure de conseiller et participer à la récolte correcte des organes à toutes les étapes de l'expérience. Ainsi l'étalon-or actuel de la fibrose du foie notation est l'évaluation des coupes de tissus colorés de façon appropriée par un pathologiste. Bien qu'il serait optimal d'avoir l'entrée de plus d'un pathologiste, cela peut ne pas être possible dans les petites organisations. Dans de tels cas, l'objectivité peut être améliorée par l'utilisation de la technologie d'imagerie 26. Nous avons constaté que les résultats de la technologie d'imageriesont comparables à la notation pathologique (données non publiées), et recommande qu'il soit utilisé comme une méthode supplémentaire d'évaluation.
En résumé, le modèle induit DMN de la fibrose hépatique a de nombreux avantages par rapport à d'autres modèles animaux. Il est un modèle relativement facile à faire car il ne nécessite pas de compétences chirurgicales. DMN est plus écologique et moins toxiques pour les humains et les animaux que CCl 4 et prend un temps plus court pour induire la maladie que TAA. Par rapport à une maladie du foie produite par CCl 4, TAA, et la bile ligature du canal, DMN produit une représentation plus proche de la fibrose du foie humain. Pour ces raisons, nous prévoyons que le modèle continuera à être largement utilisées pour étudier les mécanismes de la fibrose du foie, ainsi que pour cribler des agents anti-fibrotiques potentiels.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethylnitrosamine | Wako | 147-03781 | |
| Formalin | Sinopharm chemicals | F63257009 | |
| Ethanol | Sigma | 64-17-5 | |
| Xylene | Fisher | 1330-20-7 | |
| Masson trichome stains | |||
| Aniline Blue | Electron Microscopy Sciences | #42755 | |
| Acid Fuschin | Electron Microscopy Sciences | RT42685 | |
| Scarlet Red | Electron Microscopy Sciences | #26905 | |
| Phosphotungstic Acid Hydrate | ALFA AESAR | ALFA40116.4 | |
| Phosphomolybdic Acid Hydrate | Sigma SG | 221856-25G | |
| Weigert's Iron Hematoxilyn | Merck | 1.15973.0002 | |
| DPX Mounting Medium | Merck | HX066873 | |
| Tissue processor | Leica | Leica TP 1020 | |
| Embedding machine | Sakura | Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System | |
| Microtome | Leica | Leica RM 2235 | |
| Vet Test Analyzer | Idexx | Vet Test 8008 |
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