Abstract
Dört eski bir hafta altı, erkek Wistar sıçanlar karaciğer fibrozis hayvan modelleri üretmek için kullanıldı. işlem, haftada üç gün boyunca intraperitonal olarak verilen 10 mg / kg dimethylnitrosamine (DMN) verilmesinden sonra dört hafta gerektirir. DMN bilinen hepatoxin ve kanserojen olduğu gibi intraperitonal enjeksiyon davlumbaz yapıldı. modeli birçok avantajı vardır. İlk olarak, karaciğer değişiklikleri ardışık olarak veya ilgi konusu özel aşamalarında incelenebilir. İkinci olarak, karaciğer hastalığı aşaması serum alanin aminotransferaz (ALT) ve aspartat aminotransferaz (AST) enzim ölçümü ile takip edilebilir. Üçüncü olarak, farklı aşamalarda karaciğer hasarının şiddeti Masson diken lekeli karaciğer dokularının histolojik inceleme ardından belirlenen zaman noktalarında hayvanların kurban tarafından teyit edilebilir. DMN dört haftalık dozajlama sonrasında tipik fibroz skoru 5 Ishak ölçekte 6 etmektir. Model sürekli olarak yeniden olabilir ve olmuşturyaygın potansiyel anti-fibrotik ajanların etkinliğini değerlendirmek için kullanılır.
Introduction
DMN güçlü bir karaciğere özgü bir toksindir. Sıçanların karaciğerlerinde yaralanmasına neden olan metabolizma, doku dağılımı ve yetenek Magee 1 tarafından rapor edildi ve apoptoz ile hepatosit hasarı ve hücre ölümü mekanizması Pritchard ve Butler 2 tarafından tarif edilmiştir. Bu bileşiğin aralıklı idaresi için köpekler ve fareler 3,4 karaciğer fibrozu indüklediği rapor edilmiştir.
mekanizmaları ve karaciğer fibroz morfolojik değişiklikler yaygın bu modeli kullanarak incelenmiştir. Sıçan kullanarak erken çalışmalarda, DMN ile 3 haftalık tedavi steatoz 5 olmadan mikronodüler siroz ardından sentrilobuler hemorajik nekroz üretti. Erken fibrozis olduğu gösterilmiştir, oluşan kollajen daha fazla çapraz tip I 6 daha belirgin olmak tip III bağlantılı idi. Diğer nedenler ile ortak olarak, DMN kaynaklı fibrotik değişiklikler Kupffer hücrelerinde bir artış ile ilişkili olduğunu; i ikamet karaciğer makrofajlarn sinüzoidlerinde. Bu hücreler miyofibroblastlar içine morph ve fibrozis 7 birincil sorundur hücre dışı matriks aşırı miktarda üretir.
Hücresel sinyal açısından, Nakamura ve ark., TGF-β karaciğer fibrozu 8 ilerlemesinde önemli bir rol oynadığını göstermiştir. Özel olarak, TGF-β sinyalini inhibe etmek için bir tepe bölümü kesik tip II TGF-β reseptörünü sentezleyen bir adenovirüs kullanılan. kontrol grubuna kıyasla bu sıçanlarda karaciğer fibroz olağanüstü DMN tedavisi sırasında durduruldu. Diğer çalışmalar TGF-ß bastırılması karaciğer fibroz gelişimi 9,10 azaltılmasına yol açtığını doğruladı. Model, aynı zamanda anti-fibrotik tedavi 11 ilaç hedefleri olarak kullanılabilecek diğer fibroz belirteçleri ve proteinleri belirlemek için genel bir gen profili çalışmada kullanılmıştır.
Diğer kimyasal maddeler arasında tiyoasetamid (TAA) ve C karaciğer fibrozu uyarılması için kullanılanarbon tetraklorür (CCl4). TAA sıçanlarda ve daha sonra fareler 12 birinci kullanıldı. Bu modelin avantajları şunlardır: Kimyasal yönetim kolaylığı suyu, karakteristik mikronodüler siroz ve biyokimyasal değişiklikler ile modelin tekrarlanabilirliği içme. sakıncaları şunlardır: karaciğer fibrozu için 3 aylık uzun süre geliştirmek ve karaciğer fibrozis indüksiyonu için moleküler mekanizmasının anlaşılması eksikliği için. CCl4 gelince, kullanımı aşağıdaki nedenlerle azalmıştır: insan karaciğer hastalığı taklit değil, ozon tabakası üzerinde zararlı etkileri vardır hayvanlara acı ve sıkıntı neden olur, insanlar için çok toksiktir ve kullanımı konusunda ek önlemler gerektirir ve bertaraf 13,14.
Karaciğer sirozu için deneysel bir model olarak (cerrahi müdahale ile) Uzun süreli safra kanalı tıkanıklığı ilk Kountouras ve ark., 15 tarafından rapor edilmiştir. Bu yöntem, insan ve hayvanlar için toksik olan. However geliştirilmesi karaciğer fibrozu için gerekli süre arasında değişir. Marques ve arkadaşları. 16 ile 30 raporların bir yorum, karaciğer fibroz geliştirmek için ameliyattan sonra dört hafta yedi gün sürdü bulundu. açıklanan patolojik değişiklikler insan kronik safra fibrozis taklit ve model bu alanda ilgilenen araştırmacılar için daha uygun olacaktır.
Özetle, 4 hafta boyunca farede DMN sabit bir doz aralıklı idaresi, insan hastalığı taklit karaciğer fibrozu üretir. Uygulanan farelerde karaciğer hasarı ve parankimal fibrozis 4,17 progresif gelişim gösterirler. Hastalığın ilerlemesi ve şiddeti belirli zaman noktalarında kan örneklerinin veya hayvanların kurban aracılığıyla izlenebilir ve etkisi 18 derece tekrarlanabilir. Böylece modeli genel olarak, karaciğer fibrozu ve siroz mekanizmaları incelemek için ve potansiyel anti-fibrotik maddeler 10,19,20 taranması için kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Uygulamalı Bilimler Yüksekokulu, Temasek Polytechnic hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylandı.
DMN 1. Hazırlık
- Pipet 200 DMN'nin ul (1 ug / ml stok çözelti) ve enjeksiyon için 10 mg / ml DMN çözelti hazırlamak için PBS 19.8 ml ekleyin.
Not: DMN kanserojen. Hayvan enjeksiyonları DMN hazırlamak ve gerçekleştirmek için bir davlumbaz kullanın.
DMN 2. intraperitoneal enjeksiyon
- 200 g - 150 ortalama ağırlığı erkek sıçan kullanın. Deneyin başlamasından önce 7 gün - 4 sıçan alıştırıldı.
- 12 saat ışık ve 12 saat karanlık çevrimi ile 22 ± 1 ° C, oda sıcaklığında fareleri koruyun. Sıçan yemi ve su ad libitum sağlamak.
- günlük yiyecek ve su alımı ölçün. vücut ağırlığı haftalık ölçün.
- 10 mg / kg vücut ağırlığı dozunda bağlı olarak, her bir sıçan için DMN miktarını hesaplayın. 25 gauge iğne t 1 ml şırınga kullanıno şırıngaya DMN solüsyonu hesaplanan hacmi çizin.
- Periton içine enjekte 21 sıçan kısıtlamaktadır.
- Sıçan düzgün ölçülü beraber, karın sağ alt kadranda içine iğne tanıtmak karın boşluğunda iğnenin doğru yerleştirilmesi için kontrol edin ve yavaş yavaş DMN çözüm enjekte etmek (hiçbir şey aspire edilmelidir) şırınga pistonu geri çekin.
- DMN dozu edildiğinde, yavaş yavaş iğneyi çek ve kesici kutusu içine atın.
- 4 hafta boyunca haftada 3 gün üst üste DMN intraperitoneal gerçekleştirin. Her gün aynı anda enjeksiyon yönetmek. enjeksiyon haftanın başlangıcında vücut ağırlığına göre dozaj yeniden hesaplar.
- Biyokimyasal parametreleri ölçmek için kuyruk ven haftalık kan toplayın: alanin aminotransferaz (ALT) ve aspartat aminotransferaz (AST) 22.
- ticari bir Vet kullanarak Tedbir serum ALT ve ASTDeney Kimya Analiz.
3. Brüt Sınav ve Karaciğer Hasat
- 100 mg / kg vücut ağırlığı bir dozda pentobarbital intraperitonal enjeksiyonu ile sıçanlarda öldürülür. kalp atışı eksikliği denetleyerek ölümü sağlayın.
- Otopsisi için hazırlayın ve karın yukarı bakacak şekilde sırt yatma diseksiyon karta Parkinson ve ark., 23 yerleştirin ölü fareler tarafından tarif edildiği gibi hayvan durumunu değerlendirmek.
- Dezenfekte ve% 70 etanol ile cildi nemlendirmek.
- makas kullanarak, cilde çene anüs ventrum tam uzunlukta insizyon ve cildi yansıtmaktadır. makasla, karın iç organ maruz, kılıç şeklinde kıkırdak anüs karın duvarı insizyon.
- Herhangi bir anormallik olup olmadığını kontrol etmek yerinde karın organları inceleyin. herhangi bir renk, boyut değişiklikleri, organların yerini ve periton boşluğu içinde sıvı varlığını unutmayın. Muayene etmekorganların tutarlılığı ve herhangi bir koku varlığı not edin.
- makas ve forseps kullanarak, kendi bağ ve ekleri tüm karaciğer Free teşrih.
- o diyaframa bağlı olduğu hilusunda başlayın ve tüm ekleri karaciğer lobları serbest çalışmak. Dikkatle tüm bağ ve kan damarlarını kesti.
- petri üzerine karaciğer aktarın ve karaciğer tartın.
- 5 mm karaciğer lobları kalın kesitler - Bir neşter kullanılarak, 2 kesti. Tutarlılık için, hep aynı karaciğer lobunda numune alır. Tespiti için sağ yan lob kalınlığında bir kama% 10 tamponlu formalin içine lobe.Immediately yer kenarından 24 yaklaşık 1 cm yaklaşık 5 mm çapında al. formalin hacmine doku 01:10 ya da daha fazla olduğundan emin olun.
- diğer çalışmalar için gerekirse hasat ve hemen bu noktada karaciğer lobu (sıvı azot kullanılarak) bölümlerini dondurma. tutarlılık için aynı karaciğer lob (3.8), numune gelince.
- 24 saat en az% 10 tamponlu formalin karaciğer örnekleri saptamak.
- Tespit edildikten sonra, karaciğer Döşeme kasetler içine yerleştirin ve otomatik doku işlemci sepet içine yerleştirin.
- % 10 tamponlu formalin içeren ilk istasyonu kasetleri ile sepet yerleştirin. Emin olun kasetler tamamen su altında. döngüsü başlar dek en fazla 12 saat boyunca bu odada kalabilir.
- (% 50,% 70,% 90,% 100 (2 istasyon), iksilen (2 istasyon) ve sıvı parafin konsantrasyonlarda etanol: aşağıdaki çözümleri içeren istasyonlardan ile 1 saat için her kasetleri döndürmek için doku işlemci program 2 istasyon).
- gömme istasyonunun balmumu banyosu içine karaciğer örnekleri aktarın. gömme makinesi, en az bir saat önce açık olduğundan emin olun.
- Kullanılarak önceden ısıtılmış kıskaçlar (65 ° C), W her kaseti çıkarmakgömme makinesinin sıcak plaka (65 ° C) üzerine balta banyo ve yer. paslanmaz çelik taban kalıbına sıvı parafin yeterli miktarının tevzi yarısı dolu kadar (65 ° C önceden ısıtılmış). kalıbın içine kasetinden karaciğer bölümünü aktarın. numune kesme yüzeyi ile yerleştirilir emin olun kalıbın altındaki düz (mikroskobik incelenmesi gereken).
- , Sıvı parafin ile tamamen kalıp doldurun üst boş kaseti montaj ve en az 30 dakika soğumasını gömme makinenin 4 ° C plaka üzerine kalıp yerleştirin.
- balmumu soğutulur ve katılaşmış olup olmadığını kontrol edin, ve kalıptan parafin blok kaldırın. Blok kolayca dışarı pop ve sopa veya çatlak olmamalıdır. Bu durumda, blok eritmek ve bu adımı tekrarlayın. katılaşır kez parafin blok kesitli olabilir. Bloklar yıllar boyunca oda sıcaklığında saklanabilir.
- balmumu tabakasının kadar 10 mikron kalınlığında mikrotom ve bölüme parafin blok yerleştiringömülü karaciğer dokusu görünür olması için yeterli kaldırılır.
- 5 mikron kalınlığında kesmek için mikrotom ayarı değiştirin. Forseps kullanarak, kenarında tutarak iyi olarak kesilmiş bölümü almak ve dikkatli bir şekilde 40 ° C'lik bir sıcaklıkta su banyosunda bölümü yüzer.
- Yavaşça yüzen bölümünün altında temiz bir cam slayt yerleştirin ve cam slayt yüzeyine kaldırın. gece boyunca 37 ° C'de sıcak bir slayt üzerine slayt yerleştirin.
5. Masson Trikrom Boyası
- aşağıdaki gibi lekeleri uygulamadan önce, balmumu kaldırmak ve dokuları rehydrate slaytlar tedavi:
- 5 dakika boyunca ksilen bölümleri daldırın. 2x tekrarlayın.
- 3 dakika boyunca% 100 etanol içinde bölümleri bırakın. 1x tekrarlayın.
- % 90,% 80 ve% 70: 1 dakika etanol, aşağıdaki Çözeltilerin her bölümleri bırakın.
- slayt üzerinde herhangi bir mevcut etanol kaldırmak için musluk suyu altında slayt durulayın.
- çekirdeği leke 10 dakika Demir Hematoksilen slaytlar daldırın.
- slayt aşırı leke çıkarmak için su ile slaytlar durulayın.
- sitoplazma leke 2 dakika süreyle Biebrich Scarlet-Asit fuksin slaytlar daldırın.
- Su ile slaytlar durulayın.
- Anilin mavisi alımını teşvik etmek 10 dakika Fosfotungstik / fosfomolibdik asit solüsyonundan slaytlar yerleştirin. Kullanım 2 tur sonra Fosfotungstik / fosfomolibdik asit solüsyonundan değiştirin.
- kolajen elyafları leke, 10 dakika boyunca anilin mavi çözelti slaytlar yerleştirin.
- Su ile aşırı leke durulayın ve farklılaşma slayt rengi daha narin ve şeffaf kılmak için gerçekleşmesine izin 1 dakika süreyle% 1 asetik asit çözeltisi slaytlar yerleştirin.
- Su ile slaytlar durulayın ve doku bölümleri kurutmak geçin. aşağıdaki gibi dehidrasyon adımlar şunlardır:
- Aşağıdaki conce olarak, 10 saniye her zaman için arka arkaya slaytlar daldırınetanol ntrations:% 70,% 80,% 95 ve% 100.
- % 100 etanol içinde 30 sn için slaytlar bırakın. 1x tekrarlayın.
- 5 dakika her kaldırmak için etanol için ksilen 3 istasyonları aracılığıyla slaytlar durulayın.
- Montaj medya (örneğin, DPX mountant) ile numune üzerine bir cam kapak kayma monte edin ve kurumaya bırakın.
Not: DPX, çabuk kurur leke korur ve doku bölümü koruyan bir sentetik reçine olduğunu.
Karaciğer Masson diken Lekeli Bölümleri 6. Fibrozis Puanlama
- Bir veteriner patolog var 25 puan fibrozis göre fibrozis şiddetini değerlendirmek. fibrozis puanlama bir kör şekilde bağımsız iki veya üç patolog tarafından yapılırsa Optimum olurdu. Böyle bir senaryoda, puanlama herhangi farklılıkları sıralamak için tartışma ve grup gözden geçirdikten sonra bir final skoru elde edin.
| Gol | Açıklama |
| 0 | hiçbir fibrozis |
| 1 | ile veya kısa fibröz septa olmadan bazı portal alanlarda fibröz genişleme, |
| 2 | ile veya kısa fibröz septa olmaksızın en portal alanlarda fibröz genişleme, |
| 3 | En portal alanlarda fibröz genişleme, portal arada portal (PP) köprüleme |
| 4 | merkezi (PC işaretli köprüleme ((PP Portala portal) yanı sıra portal portal alanlarda fibröz genişleme) |
| 5 | Ara sıra nodüller (tamamlanmamış siroz) ile (PP ve / veya PC) köprü İşaretli |
| 6 | Siroz, olası veya kesin |
Tablo 1: Fibrozis Masson diken Lekeli Karaciğer Bölümler 25 Okuma için kullanılır Skoru.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DMN tedavi sıçanlar kilo ve karıştırdı saç kaplama ile daha az şiddetli olur. DMN tedavi edilmiş sıçanların ortalama vücut ağırlıklarında önemli bir kayıp vardır; İlk tespit sonra 2 DMN tedavi haftalar ve bu fark DMN tedavisi (Şekil 1a) sonra, 3 ve 4. haftalar boyunca kalır. Sıçanlar ardışık hafta boyunca DMN aldıkça, karaciğer hasarı daha küçük hale gelmesine neden olur. Karaciğer indeksi; hangi nihai vücut ağırlığı, karaciğer ağırlığının yüzde DMN tedavi edilen sıçanlarda (Şekil 1b) için anlamlı derecede düşük olmasıdır.
Şekil 1: a) DMN Vücut ağırlıkları sıçanları tedavi. Veri ± SD (- 8 N = 6) vasıtasıyla temsil edilir. * P <normal kontrol grubu b) Karaciğer endeksi ile karşılaştırıldığında 0.05.; DMN nihai vücut ağırlığı oranında, karaciğer ağırlığı DMN tre 4 hafta sonra tedavi edilmiş sıçanlarınolgunun yaşı. Veri ± SD (- 8 N = 6) vasıtasıyla temsil edilir. * P <0.05, normal kontrol grubuyla karşılaştırıldığında. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Kurban da DMN Tedaviden 4 hafta sonra, karaciğer yaş uyumlu kontrol hayvanlarından kıyasla daha küçük ve daha (Şekil 2a) (Şekil 2b) 'dir. Fibrin karaciğer yüzeyi ve bitişik karaciğer lobları yapıştırılır mevcut olabilir. sıçanlarda yaklaşık% 20'si asite sahiptir.
Şekil 2:. Yaşlı eşleştirilmiş kontrol sıçan DMN tedavi b) Karaciğer 4 hafta sonra bir sıçan a) Karaciğer. (A) karaciğer, büzülmüş firma ve sarımsı bir renk ile soluk karaciğerin ile karşılaştırıldığındaonun yaşlı uyumlu kontrolden. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
karaciğer yaralanması hepatosit hücre zarının geçirgenliğinin azalması neden olur. Artmış serum ALT ve AST hepatosit hasarı göstergeleridir. Serum ALT (Şekil 3a) ve AST (Şekil 3b) DMN tedavi edilen grupta hafta 2 ve DMN enjeksiyon 4'ten sonra kontrol grubuna göre anlamlı olarak yüksek bulunmaktadır. Serum ALT ve AST düzeyleri genellikle DMN tedavinin her hafta sonra artar.
Şekil 3: a) Serum alanin aminotransferaz (ALT) ve b) serum aspartat aminotransferaz (AST) hafta son DMN enjeksiyonundan sonra 0, 2 ve 4 de DMN tedavi farelerin seviyeleri. veri repr vardır± SD (- 8 N = 6) vasıtası olarak esented. * P <0.05, normal kontrol grubuyla karşılaştırıldığında. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
DMN tedavi sıçan karaciğerinin histolojik inceleme hepatositlerin kaybı ile progresif artış ve fibröz septa genişlemesi, kontrol grubundaki sıçanlara göre zamanla olduğunu göstermektedir. Masson diken leke yaygın karaciğer dokusunda kolajen mevduat vurgulamak için kullanılır: bu mavi boyanır.
Şekil 4: Masson trikomu ile lekelenmiş karaciğer kesitlerinin fotomikrograflarının: normal bir kontrol sıçan a) karaciğer bölümü, b) bir sıçan karaciğer bölümü dimethylnitrosamin 1 hafta aldıktan sonraE (DMN); DMN'nin 2 hafta aldıktan sonra bir sıçan c) karaciğer bölümü. DMN 3 hafta aldıktan sonra bir sıçan köprü. D) Karaciğer bölümü portal arada portalı ile en portal alanlarda fibröz genişleme vardır. DMN 4 hafta aldıktan sonra bir sıçan merkez köprüleme. E) Karaciğer bölümüne portal yanı sıra portal belirgin portal portal alanlarda fibröz genişleme unutmayın. nodül oluşumu ile siroz vardır. grubu DMN enjeksiyon 4 hafta sonra fareler ile birlikte kurban kontrol karaciğerdir. 0 fibrozis skoru ilerici artış desen var (a); 2 (b); (E) 'de 5/6 (d)' de 3 (c) '4. Tüm fotomikrografikler, 100 um ölçek çubuğu eşdeğer 1 birim uzunluğu ile 40X bir büyütmede alınmış. Lütfen CıBu rakamın büyük halini görmek için buraya yalamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz karaciğer fibroz bir hayvan modeli yapmak ve karaciğer fibroz şiddetini değerlendirmek için bir yöntem tanımlanmıştır. DMN doğru doz teslim ve haftalık intraperitoneal enjeksiyon programa uymak önemlidir. Deneme ilerledikçe, o fareler tartmak ve DMN enjeksiyonları her hafta başında dozu yeniden hesaplamak için çok önemlidir. DMN toksik ve duman kabinesinde ele alınması gereken unutmayın. Biz de duman kabinede intraperitoneal gerçekleştirin. Tekrarlanan enjeksiyonlar ihtiyacı ile, enjeksiyon doğru kısıtlama ve teknik iç organlara kirleticilerin giriş ve zarar görmesini önlemek için önemlidir. Biz nadiren intraperitoneal enjeksiyonu gelen mortalite var.
Sıçanlar, deney süresi boyunca günde 2x izlenmelidir. DMN enjeksiyon son haftasında, hayvanlar can çekişen işaretleri için daha sık ve yakından izlenmelidir. Bu peri olduğunukaraciğer hasarı en ağır ve etkilenen sıçanlar inappetent ne zaman od, vücut ağırlığı ve durumu kaybederler. 25 - Hiçbir veteriner müdahale varsa farelerin% 40 bu dönemde ciddi hasta olma ve ölebilir. Bu nedenle yakından takip araştırmacı hayvanın durumunu değerlendirmek ve organları taze yerine beklenmedik ölümden çürümeye kaybetmiş olmanın bir ötenazi sıçan hasat edilebilir sırayla deney uygun fesih planı yapabilirsiniz.
Biz karaciğer hasarının ilerlemesi yararlı göstergeler olmak ALT ve AST düzeylerinin haftalık ölçümünü bulduk. Biz de AST ALT daha az spesifik olduğu görülmektedir ve karaciğere ek olarak hasarlı eritrositler ve kas dokusundan Piyasaya bu özellik var.
kan yeterli hacmi sağlamak analiz için serum gerekli hacmi elde etmek için toplanır. sıçan başına kan 300 ul - Biz tipik olarak 200 toplamak.
c sırasındahistolojik inceleme için karaciğer doku ollection, biz örnek aynı lob elde edilebilir öneriyoruz. Bu karaciğer değişiklikleri üniforma olduğunu kontrol ettikten sonra yapılır. DMN karaciğerde genel değişikliklere neden olur. Çalışmanın ilk aşamalarında, sol lateral ve medial lob yanı sıra sağ medial lob örneklenmiş. Biz bu loblar arasındaki mikroskobik değişiklikler herhangi bir farklılık gözlenmedi.
Karaciğer bölümleri en az 24 saat süreyle% 10 tamponlu formalin sabit ve kısa bir süre sonra işleme tabi tutulmalıdır. Bir hafta ötesinde uzun süreli daldırma parafine sonra bölümüne kırılgan ve zor hale dokuda neden olabilir. Uygun 5 mikron ince kesitler Kesme uygulama ve sabır gerektirir. Çıplak gözle (Adım 4.11) ile uygun olduğu değerlendirilmektedir Bölümler onlar bölümünde kıvrımlar veya yırtılma gibi eserleri yok kontrol etmek için mikroskop ile muayene edilebilir. boyama işlemi en uygun t tamamlandıdinlenme molaları olmadan her adımda bir slayt daldırma için zaman dilimleri o. boyama işlemi sırasında bölümler sürekli nemli tutulan ve mümkün olduğu kadar kısa bir süre sonraki bir boyama çözeltisi üzerine transfer edilmesini sağlar.
fibrozis derecesi için Masson diken boyanan kesitler değerlendirilmesi bir veteriner patolog girişini gerektirir. O / O o / o tavsiye ve deney her aşamasında organların doğru hasat katılmak mümkün olurdu, baştan çalışmanın parçası olmalıdır önemli bir ekip üyesidir. Böylece karaciğer fibroz puanlama için geçerli altın standart bir patolog tarafından uygun boyanan doku kesitlerinde değerlendirilmesidir. birden fazla patoloğun girişi var optimum olurdu ama, bu küçük organizasyonlarda mümkün olmayabilir. Bu gibi durumlarda, nesnellik görüntüleme teknolojisi 26 kullanılması ile iyileştirilebilir. Bu bulduk görüntüleme tekniği sonuçlarıpatolojik puanlama (yayınlanmamış veri) karşılaştırılabilir ve bu değerlendirme bir ek yöntem olarak kullanılmasını öneririz.
Özetle, karaciğer fibroz DMN kaynaklı modeli diğer hayvan modelleri üzerinde birçok avantajı vardır. Cerrahi beceri gerektirmez olarak yapmak için nispeten kolay bir modeldir. DMN çevre güvenli ve CCl4 göre insanlarda ve hayvanlarda daha az toksik olan ve TAA daha hastalık oluşturmak için daha kısa bir zaman alır. CCl 4, TAA tarafından üretilen karaciğer hastalığı ve safra kanalı ligasyonu ile karşılaştırıldığında, DMN insan karaciğer fibrozu yakından temsilini üretir. Bu nedenlerden dolayı, bir model karaciğer fibrozu mekanizmaları incelemek için ve potansiyel anti-fibrotik maddeler taranması için yaygın olarak kullanılmaya devam öngörmekteyiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethylnitrosamine | Wako | 147-03781 | |
| Formalin | Sinopharm chemicals | F63257009 | |
| Ethanol | Sigma | 64-17-5 | |
| Xylene | Fisher | 1330-20-7 | |
| Masson trichome stains | |||
| Aniline Blue | Electron Microscopy Sciences | #42755 | |
| Acid Fuschin | Electron Microscopy Sciences | RT42685 | |
| Scarlet Red | Electron Microscopy Sciences | #26905 | |
| Phosphotungstic Acid Hydrate | ALFA AESAR | ALFA40116.4 | |
| Phosphomolybdic Acid Hydrate | Sigma SG | 221856-25G | |
| Weigert's Iron Hematoxilyn | Merck | 1.15973.0002 | |
| DPX Mounting Medium | Merck | HX066873 | |
| Tissue processor | Leica | Leica TP 1020 | |
| Embedding machine | Sakura | Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System | |
| Microtome | Leica | Leica RM 2235 | |
| Vet Test Analyzer | Idexx | Vet Test 8008 |
References
- Magee, P. N. Toxic liver injury; the metabolism of dimethylnitrosamine. Biochem J. 64 (4), 676-682 (1956).
- Pritchard, D. J., Butler, W. H. Apoptosis-the mechanism of cell death in dimethylnitrosamine-induced hepatotoxicity. J Pathol. 158 (3), 253-260 (1989).
- Madden, J. W., Gertman, P. M., Peacock, E. E. Dimethylnitrosamine-induced hepatic cirrhosis: a new canine model of an ancient human disease. Surgery. 68 (1), 260-267 (1970).
- Jenkins, S. A., Grandison, A., Baxter, J. N., Day, D. W., Taylor, I., Shields, R. A dimethylnitrosamine-induced model of cirrhosis and portal hypertension in the rat. J Hepatol. 1 (5), 489-499 (1985).
- Jézéquel, A. M., Mancini, R., Rinaldesi, M. L., Macarri, G., Venturini, C., Orlandi, F. A morphological study of the early stages of hepatic fibrosis induced by low doses of dimethylnitrosamine in the rat. J Hepatol. 5 (2), 174-181 (1987).
- George, J., Chandrakasan, G. Molecular characteristics of dimethylnitrosamine induced fibrotic liver collagen. Biochim Biophys Acta, Protein Struct Mol Enzymol. 1292 (2), 215-222 (1996).
- Winwood, P. J., Arthur, M. J. Kupffer cells: their activation and role in animal models of liver injury and human liver disease. Semin Liver Dis. 13 (1), 50-59 (1993).
- Nakamura, T., Sakata, R., Ueno, T., Sata, M., Ueno, H. Inhibition of transforming growth factorβ prevents progression of liver fibrosis and enhances hepatocyte regeneration in dimethylnitrosamine-treated rats. Hepatology. 32 (2), 247-255 (2000).
- Shek, F. W., Benyon, R. C. How can transforming growth factor beta be targeted usefully to combat liver fibrosis? Eur J Gastroenterol Hepatol. 16 (2), 123-126 (2004).
- Wang, J. H., Shin, J. W., Son, J. Y., Cho, J. H., Son, C. G. Antifibrotic effects of CGX, a traditional herbal formula, and its mechanisms in rats. J Ethnopharmacol. 127 (2), 534-542 (2010).
- Su, L. J., Hsu, S. L., Yang, J. S., Tseng, H. H., Huang, S. F., Huang, C. Y. F. Global gene expression profiling of dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis: from pathological and biochemical data to microarray analysis. Gene Expr. 13 (2), 107-132 (2006).
- Müller, A., Machnik, F., Zimmermann, T., Schubert, H. Thioacetamide-induced cirrhosis-like liver lesions in rats usefulness and reliability of this animal model. Exp Pathol. 34 (4), 229-236 (1988).
- Martinez-Hernandez, A. The hepatic extracellular matrix. II. Electron immunohistochemical studies in rats with CCl4-induced cirrhosis. Lab Invest. 53 (2), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3894794 166-186 (1985).
- Pritchard, M. T., Apte, U. Models to Study Liver Regeneration. Liver Regeneration. , 15-40 (2015).
- Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
- Marques, T. G., Chaib, E., et al. Review of experimental models for inducing hepatic cirrhosis by bile duct ligation and carbon tetrachloride injection. Acta Cir Bras. 27 (8), 589-594 (2012).
- Wasser, S., Tan, C. E. Experimental models of hepatic fibrosis in the rat. Ann Acad Med Singapore. 28 (1), 109-111 (1999).
- George, J., Chandrakasan, G. Biochemical abnormalities during the progression of hepatic fibrosis induced by dimethylnitrosamine. Clin Biochem. 33 (7), 563-570 (2000).
- Shimizu, I., Ma, Y. R., et al. Effects of Sho-saiko-to, a Japanese herbal medicine, on hepatic fibrosis in rats. Hepatology. 29 (1), 149-160 (1999).
- Wang, Y., Gao, J., Zhang, D., Zhang, J., Ma, J., Jiang, H. New insights into the antifibrotic effects of sorafenib on hepatic stellate cells and liver fibrosis. J Hepatol. 53 (1), 132-144 (2010).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat. J Vis Exp. (99), (2015).
- Parkinson, C. M., O'Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. J Vis Exp. (54), (2011).
- Ruehl-Fehlert, C., Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Ishak, K., Baptista, A., et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol. 22 (6), 696-699 (1995).
- Sant'Anna, L. B., Sant'Anna, N., Parolini, O. Application of computer assisted image analysis for identifying and quantifying liver fibrosis in a experimental model. J Comput Interdiscip Sci. 2 (2), 139-148 (2011).
