Abstract
Quatro a seis semanas de idade, os ratos Wistar machos foram usados para produzir modelos animais de fibrose hepática. O processo requer quatro semanas de administração de 10 mg / kg dimetilnitrosamina (DMN), administrado intraperitonealmente em três dias consecutivos por semana. As injecções intraperitoneais foram realizadas no exaustor de fumos, como é DMN um hepatoxin conhecida e cancerígeno. O modelo apresenta várias vantagens. Em primeiro lugar, alterações hepáticas podem ser estudadas sequencialmente ou em fases particulares de interesse. Em segundo lugar, do estágio da doença do fígado pode ser monitorizado pela medição de alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) enzimas. Em terceiro lugar, a gravidade dos danos no fígado em diferentes fases pode ser confirmada por sacrifício dos animais no ponto de tempo designado, seguido por exame histológico de tecidos do fígado corados Tricoma de Masson. Depois de quatro semanas de dosagem DMN, o marcador típico fibrose é de 5 a 6 na escala de Ishak. O modelo pode ser reproduzido de forma consistente e tem sidoamplamente utilizado para avaliar a eficácia de agentes anti-fibróticos potenciais.
Introduction
DMN é uma toxina específica potente fígado. O seu metabolismo, distribuição nos tecidos, e a capacidade de provocar ferimentos aos fígados de ratos foi relatado por Magee 1, e o mecanismo de dano dos hepatócitos e a morte celular por apoptose foi descrito por Pritchard e Butler 2. Administração intermitente deste composto foi relatada para induzir a fibrose do fígado em cães e ratos 3,4.
Os mecanismos e as alterações morfológicas da fibrose hepática têm sido amplamente estudados usando este modelo. Em estudos iniciais utilizando o rato, o tratamento de 3 semanas com DMN produziu necrose hemorrágica centrolobular seguido de cirrose micronodular sem esteatose 5. Foi demonstrado que, em fibrose precoce, o colagénio formada era mais ligações cruzadas com o tipo III ser mais proeminente do tipo I 6. Em comum com outras causas, alterações fibróticas induzida por DMN estavam associados com um aumento das células de Kupffer; macrófagos hepáticos que residem in sinusóides. Estas células transformar em miofibroblastos e produzem quantidades excessivas de matriz extracelular que é o principal problema na fibrose 7.
Em termos de sinalização celular, Nakamura et ai. Demonstraram que o TGF-β desempenha um papel fundamental na progressão da fibrose hepática 8. Eles usaram um adenovírus que expressa um receptor truncado tipo II TGF-β, para inibir especificamente a sinalização de TGF-β. fibrose hepática nestes ratos foi espetacularmente interrompido durante o tratamento DMN quando comparado ao grupo controle. Outros estudos têm confirmado que a supressão do TGF-β leva até ao alívio de fígado desenvolvimento fibrose 9,10. O modelo também foi utilizado num estudo global perfil genético para identificar outros marcadores de fibrose e proteínas que podem ser utilizadas como alvos de drogas para a terapia anti-fibrótico 11.
Outros agentes químicos usados para induzir a fibrose do fígado incluem tioacetamida (TAA) e Ctetracloreto de Arbon (CCI4). TAA foi usado pela primeira vez em ratos e depois em ratos 12. As vantagens deste modelo incluem: a facilidade de administração química em água, a reprodutibilidade do modelo com cirrose micronodulares característica e alterações bioquímicas beber. As desvantagens incluem: o longo período de tempo de 3 meses para a fibrose hepática e para desenvolver a falta de compreensão do mecanismo molecular para a indução de fibrose hepática. Quanto CCI4, seu uso tem diminuído pelas seguintes razões: não imitar a doença de fígado humano, tem efeitos nocivos na camada de ozono, causa dor e sofrimento aos animais, é muito tóxico para os seres humanos e exige precauções extras em seu manuseio e eliminação 13,14.
Obstrução do ducto biliar prolongada (por intervenção cirúrgica) como um modelo experimental para cirrose hepática foi relatada pela primeira vez por Kountouras et al. 15. Este método não é tóxico para os seres humanos e animais. Ho entanto, o tempo necessário para a fibrose do fígado a desenvolver varia. Uma revisão de 30 relatórios por Marques et al. 16, descobriu que ele tirou de sete dias a quatro semanas após a cirurgia para a fibrose do fígado para se desenvolver. As alterações patológicas descritas imitam os de fibrose biliar humana e crónica do modelo seria mais adequado para investigadores interessados neste domínio.
Em resumo, a administração intermitente de uma dose constante de DMN no rato ao longo de 4 semanas produz fibrose hepática que imita a doença humana. Ratos doseados mostram desenvolvimento progressivo de lesões no fígado e parênquima fibrose 4,17. Progressão e gravidade da doença pode ser monitorizado através de amostras de sangue ou de sacrifício dos animais a pontos de tempo específicos e o efeito é altamente reprodutível 18. Assim, o modelo tem sido amplamente utilizada para estudar os mecanismos de fibrose hepática e cirrose hepática, bem como para o rastreio de potenciais agentes anti-fibróticos 10,19,20.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo comitê de cuidados com os animais e utilização da Faculdade de Ciências Aplicadas, Temasek Polytechnic.
1. Preparação de DMN
- Pipetar 200 l de DMN (1 g / ml de solução) e adicionar 19,8 mL de PBS para preparar a solução DMN 10 mg / ml para a injecção.
Nota: DMN é cancerígeno. Use um exaustor para preparar o DMN e executar as injecções de animais.
2. injecção intraperitoneal de DMN
- Use ratos Wistar machos com um peso médio de 150-200 g. Aclimatar os ratos de 4 - 7 dias antes do início da experiência.
- Manter ratos à temperatura ambiente de 22 ± 1 ° C, com 12 luz hr e 12 hr ciclos escuros. Forneça ração e água ad libitum.
- Medida de comida e água ingestão diária. Meça corpo semanal de peso.
- Calcular a quantidade de DMN para cada rato com base numa dose de 10 mg / kg de peso corporal. Use uma seringa de 1 ml com uma agulha de calibre 25 triar o volume calculado de solução DMN para dentro da seringa.
- Contenha o rato para injecção intraperitoneal 21.
- Com o rato, devidamente presas, introduzir a agulha no quadrante inferior direito do abdômen, chamar de volta o êmbolo da seringa (nada deve ser aspirado) para verificar o posicionamento correto da agulha dentro do espaço abdominal e injecte lentamente solução DMN.
- Quando foi administrada a dose de DMN, retirar lentamente a agulha e eliminar para o recipiente de agulhas.
- As injecções intraperitoneais de DMN durante 3 dias consecutivos por semana, durante 4 semanas. Administrar as injecções ao mesmo tempo em cada dia. Re-calcular a dosagem baseada no peso corporal, no início de cada semana de injecções.
- Recolha de sangue da veia da cauda semanal para medir parâmetros bioquímicos: alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) 22.
- ALT sérica medida e AST usando um Vet comercialTeste Chemistry Analyzer.
3. Exame Bruto e Colheita de fígado
- Eutanásia os ratos por injecção intraperitoneal de pentobarbital a uma dose de 100 mg / kg de peso corporal. Certifique-se de morte, verificando a ausência de batimentos cardíacos.
- Prepare-se para o post mortem e avaliar a condição do animal, como descrito por ratos mortos Parkinson et al. 23 Lugar na placa de dissecação em decúbito dorsal com o abdômen virado para cima.
- Desinfectar e umedecer a pele com etanol 70%.
- Com uma tesoura, uma incisão na pele de todo o comprimento do ventrum do ânus para o queixo, e reflectem a pele. Com uma tesoura, uma incisão na parede abdominal do ânus para a cartilagem xifóide, para expor as vísceras abdominais.
- Examinar os órgãos abdominais in situ para verificar se há qualquer anormalidade. Nota quaisquer alterações na cor, tamanho, localização de órgãos e a presença de líquido no interior da cavidade peritoneal. Examinara consistência dos órgãos e observe a presença de quaisquer odores.
- Com uma tesoura e uma pinça, dissecar todo o livre fígado de seus ligamentos e anexos.
- Comece no hilo, onde ele está ligado ao diafragma e trabalhar para libertar todos os lobos do fígado de anexos. Corte cuidadosamente todos os ligamentos e vasos sanguíneos.
- Transferir o fígado para uma placa de petri e pesa o fígado.
- Utilizando um bisturi, cortar 2 - 5 milímetros de espessura de lobos hepáticos. Para consistência, sempre tomar amostras de um mesmo lobo hepático. Aqui uma cunha de cerca de 5 mm de diâmetro de espessura, a partir do lóbulo lateral direito 24 cerca de 1 cm do bordo do lugar lobe.Immediately em formalina a 10% tamponada para fixação. Assegurar que o tecido para o volume de formalina é 01:10 ou mais.
- Colheita e congelar imediatamente porções (usando nitrogênio líquido) dos lobos do fígado neste momento, se necessário para outros estudos. Tal como para (3,8), da amostra a partir do mesmo lóbulo do fígado para a consistência.
- Fixar as amostras de fígado em 10% de formalina tamponada para um mínimo de 24 horas.
- Após a fixação, cortar o fígado, coloque em cassetes e carregá-los no cesto do processador de tecido automático.
- Colocar o cesto com cassetes para a primeira estação, que contém 10% de formalina tamponada. Garantir as cassetes são totalmente submerso. Eles podem permanecer nesta câmara para até 12 horas até que o ciclo começa.
- Programar o processador de tecidos para rodar as cassetes durante 1 h cada, através de estações sucessivas contendo as seguintes soluções: etanol em concentrações de 50%, 70%, 90%, 100% (2 estações), o xileno (2 estações) e parafina líquida ( 2 estações).
- Transferir as amostras de fígado para o banho de cera da estação de embebimento. Assegure-se que a incorporação da máquina é ligada, pelo menos, uma hora mais cedo.
- Usando fórceps pré-aquecido (65 ° C), remover cada cassete da Wbanho de machado e lugar sobre a placa quente (65 ° C) da máquina incorporação. Dispensar quantidade suficiente de parafina líquida para o molde da base de aço inoxidável (pré-aquecido a 65 ° C) até metade cheio. Transferir a secção de fígado a partir da cassete para dentro do molde. Garantir que o espécime é colocado com a superfície de corte (a serem examinadas microscopicamente) plana sobre o fundo do molde.
- Encha o molde completamente com parafina líquida, montar a cassete vazia em cima e coloque o molde na placa de 4 ° C da máquina incorporação esfriar por pelo menos 30 min.
- Verifique se a cera esfriou e solidificou, e remova o bloco de parafina a partir do molde. O bloco deve sair facilmente e não furar ou crack. Se isso acontecer, derreter o bloco e repita esta etapa. O bloco de parafina pode ser seccionado, uma vez que se solidifica. Os blocos podem ser armazenadas à temperatura ambiente durante muitos anos.
- Coloque o bloco de parafina para o micrótomo e seção de 10 m de espessura, até a camada de ceraé removido suficientemente para o tecido do fígado incorporado para ser visível.
- Alterar a configuração do micrótomo para cortar a 5 mm de espessura. Utilizando uma pinça, pegar uma seção bem cortadas, segurando-o na borda e flutuar atentamente a secção no banho de água a uma temperatura de 40 ° C.
- Suavemente colocar uma lâmina de vidro limpa sob o ponto flutuante e levantá-la sobre a superfície da lâmina de vidro. Colocar a lâmina sobre uma lâmina quente a 37 ° C durante a noite.
5. tricromo Masson
- Antes de aplicar as manchas, tratar as lâminas para remover a cera e re-hidratar os tecidos como se segue:
- Mergulhe as seções em xileno durante 5 min. Repetir 2x.
- Mergulhe as secções em etanol 100% por 3 min. Repetir 1x.
- Mergulhar as secções durante 1 min cada, nas seguintes soluções de etanol: 90%, 80% e 70%.
- Lavar a lâmina em água corrente para remover qualquer etanol existente no slide.
- Imergir as lâminas de ferro em hematoxilina durante 10 minutos para corar o núcleo.
- Lavar as lâminas com água para remover o excesso de corante da corrediça.
- Imergir as lâminas em Biebrich Scarlet-ácido Fuchsin por 2 min para manchar o citoplasma.
- Lavar as lâminas com água.
- Colocar as lâminas em solução de ácido fosfotúngstico / fosfomolíbdico por 10 min para promover a absorção de Anilina azul. Alterar a solução de ácido fosfotúngstico / fosfomolíbdico após 2 rodadas de uso.
- Colocar as lâminas em solução de azul de anilina por 10 min para corar as fibras de colágeno.
- Lavar o excesso de corante com água e colocar as lâminas em solução de ácido acético a 1% durante 1 min para permitir a diferenciação para ter lugar para tornar a cor da lâmina mais delicada e transparente.
- Lavar as lâminas com água e proceder a desidratar as secções de tecido. Os passos de desidratação são como se segue:
- Mergulhar as lâminas sucessivamente durante 10 seg de cada vez, na seguinte concentrations de etanol: 70%, 80%, 95% e 100%.
- Mergulhar as lâminas durante 30 segundos em 100% de etanol. Repetir 1x.
- Lavar as lâminas através de 3 estações de xileno durante 5 minutos cada para remover o etanol.
- Montar uma lamela de vidro para a amostra com meios de montagem (por exemplo, DPX montagem) e deixar secar.
Nota: DPX é uma resina sintética que seca rapidamente, preserva mancha e protege a secção de tecido.
6. fibrose Scoring em secções Tricoma manchados de Masson de fígado
- Possui um patologista avaliar a gravidade da fibrose de acordo com a fibrose marcar 25. Seria melhor se o marcador fibrose é feito por dois ou três patologistas de forma independente de modo cego. Em tal cenário, obter uma pontuação final após discussão e revisão do grupo para resolver quaisquer diferenças na pontuação.
| Ponto | Descrição |
| 0 | Sem fibrose |
| 1 | expansão fibrosa de algumas áreas do portal, com ou sem curto septos fibrosos |
| 2 | expansão fibrosa da maior parte das áreas de portal, com ou sem curto septos fibrosos |
| 3 | expansão fibrosa da maior parte das áreas de portal, portal ocasional ao portal (PP) colmatar |
| 4 | expansão fibrosa de áreas de portal com marcada ponte (portal para o portal (PP), bem como portal para central (PC) |
| 5 | Marcado ponte (PP e / ou PC) com nódulos ocasionais (cirrose incompleta) |
| 6 | Cirrose, provável ou definitiva |
Tabela 1: Fibrose escore utilizado para leitura das seções Tricoma manchado fígado do Masson 25.
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Representative Results
DMN ratos tratados perder peso e se tornam menos vigorosa com pêlo arrepiou. Não há perda significativa nos pesos médios do corpo de ratos DMN tratada; primeiro detectável após 2 semanas de tratamento DMN, e essa diferença se mantém através semanas 3 e 4 após o tratamento DMN (Figura 1A). Como os ratos recebem DMN sobre semanas sucessivas, danos no fígado faz com que se torne menor. O índice de fígado; que é a percentagem de peso do fígado no peso corporal final foi significativamente menor para os ratos tratados DMN (Figura 1B).
Figura 1: a) Os pesos corporais dos ratos tratados DMN. Os dados estão representados como a média ± SD (n = 6 - 8). * P <0,05 em comparação com o grupo de controlo normal b) índice de fígado.; por cento em peso do fígado no peso corporal final de DMN ratos tratados após 4 semanas de tre DMNatment. Os dados estão representados como a média ± SD (n = 6 - 8). * P <0,05 em comparação com o grupo controle normal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
No momento do sacrifício, após 4 semanas de tratamento DMN, o fígado é mais pequeno e mais difícil (Figura 2a) em comparação com aqueles de animais de controlo com idades correspondentes (Figura 2b). Fibrina pode estar presente sobre a superfície do fígado e lobos hepáticos adjacentes sejam respeitados. Cerca de 20% dos ratos têm ascite.
Figura 2: a) do fígado de um rato após 4 semanas de tratamento DMN b) Fígado de idade de ratos controle pareado.. Em (a) o fígado é encolhida, firme e pálido com um tom amarelado, quando comparado com o fígadoa partir do seu controle pareado idade. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A lesão do fígado provoca um aumento da permeabilidade da membrana celular de hepatócitos. Aumento da ALT sérica e AST são indicadores de danos hepatócitos. ALT sérica (Figura 3a) e AST (Figura 3b) do grupo DMN tratados são significativamente mais elevados do que o grupo controle após semanas 2 e 4 da injeção DMN. Os níveis de ALT e AST séricas normalmente aumentam depois de cada semana de tratamento DMN.
Figura 3: a) níveis séricos de alanina-aminotransferase (ALT) e b), aspartato aminotransferase (AST) de ratos tratados DMN nas semanas 0, 2 e 4 após a última injecção DMN. Os dados são represented como as médias ± DP (n = 6 - 8). * P <0,05 em comparação com o grupo controle normal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O exame histológico de fígados de ratos tratados DMN mostram que há um aumento progressivo e de expansão de septos fibrosos, com perda de hepatócitos, ao longo do tempo em comparação com os ratos de controlo. mancha Tricoma de Masson é comumente usado para destacar os depósitos de colágeno no tecido hepático: são manchado azul.
Figura 4: Fotomicrografias de cortes de fígado corados com Tricoma de Masson: a) seção de fígado de um rato de controlo normal; b) seção de fígado de um rato depois de receber uma semana de dimethylnitrosamine (DMN); c) a secção de fígado de um rato após a recepção de 2 semanas de DMN. Há expansão fibrosa da maioria das áreas do portal com o portal ocasional ao portal ponte d seção de fígado.) De um rato depois de receber 3 semanas de DMN. Note-se a expansão fibrosa de zonas de portal com o portal marcada para portal, bem como portal para a secção do fígado e Central de ponte.) A partir de um rato, depois de receber 4 semanas de DMN. Há cirrose com formação de nódulos. O fígado é o controlo a partir do grupo sacrificados em conjunto com ratos após 4 semanas de injecção DMN. Há um padrão de aumento progressivo da pontuação da fibrose de 0 em (a); 2, em (b); 3, em (c) em 4 (d) a 5/6 em (e). Todos os fotomicrografias foram tiradas com uma ampliação de 40x com uma unidade de comprimento da escala de barra equivale a 100 um. Por favor Clamber aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nós descrevemos um método para fazer um modelo animal de fibrose hepática e para avaliar a gravidade da fibrose hepática. É importante administrar a dose correcta de DMN e aderir ao esquema de injecções intraperitoneais semanalmente. À medida que a experiência progride, é crucial para pesar os ratos e re-cálculo da dose no início de cada semana de injecções DMN. Tenha em mente que DMN é tóxico e precisa ser tratado no gabinete de fumos. Nós as injecções intraperitoneais no gabinete fume bem. Com a necessidade de injecções repetidas, o sistema de retenção correcta e técnica de injecção é importante evitar a introdução de contaminantes e danos aos órgãos internos. Raramente temos a mortalidade das injeções intraperitoneal.
Os ratos devem ser monitorizados 2x por dia durante todo o período experimental. Durante a última semana de injecção DMN, os animais devem ser observados até com mais freqüência e de perto para sinais moribundos. Este é period quando dano hepático é mais grave e ratos afetados serão inapetentes, perder peso corporal e condição. 25 - 40% dos ratos pode tornar-se gravemente doente durante este período e morrer se não há intervenção veterinária. Daí estreito acompanhamento permite ao pesquisador avaliar a condição do animal e plano de extinção apropriada do experimento, a fim de que os órgãos podem ser recém-colhida de um rato sacrificados em vez de ser perdido para a decadência da morte inesperada.
Encontramos medição semanal dos níveis de ALT e AST ser indicadores úteis da progressão da lesão hepática. Observamos, também, que a AST é menos específico do que ALT e atribuem isso à sua libertação eritrócitos danificados e tecido muscular, além de fígado.
Assegure-se que um volume suficiente de sangue é recolhido para produzir o volume necessário de soro para análise. Nós normalmente recolher 200 - 300 l de sangue por rato.
Durante o Collection de tecido hepático para exame histológico, recomendamos a amostra ser obtidas no mesmo lobo. Isso é feito depois de verificar que as mudanças no fígado são uniformes. DMN provoca alterações generalizadas no fígado. Nas fases iniciais do estudo, foram amostrados a partir dos lóbulos laterais e medial esquerdo, bem como o lobo medial direito. Não foram observadas diferenças nas alterações microscópicas entre estes lobos.
secções de fígado deve ser fixado em 10% de formalina tamponada durante pelo menos 24 h e processadas logo após. imersão prolongada para além de uma semana, pode resultar no tecido se torne quebradiço e difícil de secção após inclusão em parafina. Corte adequados 5 mm seções finas requer prática e paciência. Seções que são avaliados para ser adequado a olho nu (Passo 4.11) pode ser examinada ao microscópio para verificar se eles não têm artefactos como dobras ou rasgos dentro da seção. O processo de coloração é melhor concluída de acordo com to os prazos para a imersão slides em cada etapa, sem pausas para descanso. Durante o processo de coloração, assegurar que as secções são mantidas húmidas em todos os momentos e transferidos de uma solução de coloração para o outro o mais rapidamente possível.
Avaliação das secções de Masson Tricoma coradas para o grau de fibrose requer a entrada de um patologista. Ele / Ela é um membro da equipe cruciais que devem fazer parte do estudo desde o início, como ele / ela seria capaz de aconselhar e participar da colheita correta de órgãos em todas as etapas do experimento. Assim, o padrão ouro atual para marcar fibrose hepática é a avaliação das secções de tecido adequadamente manchado por um patologista. Apesar de que seria óptimo a ter a entrada de mais do que um patologista, isto pode não ser possível em organizações menores. Em tais casos, a objectividade pode ser melhorada através da utilização de tecnologia de imagem 26. Descobrimos que resulta da tecnologia de imagemsão comparáveis a pontuação patológica (dados não publicados), e recomendado que seja utilizado como um método de avaliação suplementar.
Em resumo, o modelo induzido DMN da fibrose hepática tem muitas vantagens em relação a outros modelos animais. É um modelo, relativamente fácil de fazer, uma vez que não requer habilidade cirúrgica. DMN é ambientalmente mais seguro e menos tóxico para os seres humanos e animais do que CCl4 e leva um tempo mais curto para induzir a doença de TAA. Comparado com doença hepática produzida por CCI4, TAA e ligadura de ducto biliar, DMN produz uma representação mais próxima da fibrose do fígado humano. Por estas razões, prevemos que o modelo irá continuar a ser amplamente utilizado para estudar os mecanismos da fibrose do fígado, bem como para o rastreio de agentes anti-fibróticos potenciais.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethylnitrosamine | Wako | 147-03781 | |
| Formalin | Sinopharm chemicals | F63257009 | |
| Ethanol | Sigma | 64-17-5 | |
| Xylene | Fisher | 1330-20-7 | |
| Masson trichome stains | |||
| Aniline Blue | Electron Microscopy Sciences | #42755 | |
| Acid Fuschin | Electron Microscopy Sciences | RT42685 | |
| Scarlet Red | Electron Microscopy Sciences | #26905 | |
| Phosphotungstic Acid Hydrate | ALFA AESAR | ALFA40116.4 | |
| Phosphomolybdic Acid Hydrate | Sigma SG | 221856-25G | |
| Weigert's Iron Hematoxilyn | Merck | 1.15973.0002 | |
| DPX Mounting Medium | Merck | HX066873 | |
| Tissue processor | Leica | Leica TP 1020 | |
| Embedding machine | Sakura | Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System | |
| Microtome | Leica | Leica RM 2235 | |
| Vet Test Analyzer | Idexx | Vet Test 8008 |
References
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