Summary
役割に関連する労働者の生理機能を解析するための便利なツール - ここでは、単一コホートミツバチコロニーの製造のための私達の詳細なプロトコルを記述します。また、労働者の行動および/または生理の調節におけるこれらのホルモンの関与を評価するために、幼若ホルモンおよびエクジソンで労働者を治療するための詳細なプロトコルを記述します。
Introduction
ヨーロッパミツバチ、 ミツバチは 、高度に組織化された社会1と真社会性昆虫です。ワーカーミツバチ（労働カーストは）労働2-4の年齢関連部門と呼ばれる、コロニー活性を維持するためにさまざまなタスクに従事し、かつ、これらのタスクは、羽化後ワーカーミツバチの年齢に応じて変更されています。若年労働者（<13日齢）高齢労働者がいる間、ローヤルゼリー（看護師蜂）を分泌することによりハイブのひなの世話をする（> 15日齢）はハイブ（飼料収穫機）2-4の外に蜜や花粉を集めます。労働者の生理機能は、この役割のシフトに関連して変化します。例えば、下咽頭腺（HPGs）の機能は、頭部に位置する外分泌腺、2,5を採餌する看護か らロールシフトに関連して変化をペアリング。ナース蜂HPGsは、主に蜂のミルクの主要な構成要素である主要なローヤルゼリーのタンパク質を合成します。一方、飼料収穫機HPGs主ブドウ糖と果糖にショ糖を変換することによって蜂蜜に蜜を処理するために、このようなαグルコシダーゼIIIなどの炭水化物代謝酵素を合成。我々の以前の研究では、α-グルコシダーゼIIIをコードする主要なローヤルゼリータンパク質、およびHBG3、ロールシフト6-9中の変更をエンコードするmrjp2の発現、ことを明らかにしました。
HPGsを含む労働者の組織における生理的変化は、ロールシフトまたは労働者の年齢と関連しているかどうかを判断するためには、単一のコホートを準備するなど、ミツバチのコロニーの人口構成を操作することが有用ですほぼ同じ年齢の労働者が異なるタスク10,11を実行したコロニー。ロビンソンら （1989）は、単一のコホートコロニー10を確立するための方法を記載しています。シングルコホートコロニーは、最初は女王と0-2日齢の労働者を含みます。コロニーを確立した後、数日間、ALMの労働者同じ年齢OST異なるタスクを想定しています。他の労働者がいつもより早く採餌タスクを実行するため、早熟飼料収穫機と呼ばれているのに対し、一部の労働者は、典型的なコロニーのように看護タスクを実行します。看護師の蜂と早熟飼料収穫機間の遺伝子発現の比較は、労働者の組織12-16の役割に関連した生理機能に関する有用な情報を提供するであろう。ここでは、ロールベースおよび/ またはHPGs 16の加齢に伴う生理機能の解析のための単一のコホートのコロニーを調製するための詳細なプロトコルを記述します。我々はまた、簡単にHPGの生理機能を評価するために、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によってmrjp2とHBG3の遺伝子発現を検査する方法について説明します。
シングルコホートコロニー内のワーカー生理学の分析に加えて、内分泌系の検査は、役割に関連する労働者の生理機能の調節機構を解析するために重要です。自演れる幼若ホルモン（JH）、昆虫の幼虫の「現状」ホルモンとしてWN、ワーカーミツバチ11で採餌への看護の役割のシフトを加速します。また、変態の間に脱皮ホルモンとして知られているエクジソンは、、キノコ体に労働者の脳17-19の高い中心部を表現しているジソンシグナル伝達分子をコードする遺伝子としての役割シフトに関与している可能性があります。したがって、我々はまた、HPG生理学上の内分泌系の効果の分析（の発現のために詳細なエクジソンの活性型である20Eと労働者を治療するために、我々の以前の研究16で使用されるプロトコル、およびメトプレン、JHアナログを、記述しますmrjp2とHBG3）。
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Protocol
シングルコホートコロニーの調製
- 2つの単一コホートコロニーを作成するために、3つのミツバチのコロニーを準備し、新たに出現した労働者の十分な数を取得します。
- 櫛でキャップされた末梢細胞内のいくつかの蛹は、ピンセットを使用してキャップされた櫛を開くことによって、茶色の目と着色されたキューティクルを持っていることを確認してください。これらの蛹が周辺コーム細胞に存在する場合、全体の櫛で蛹のほとんどは約1-3日で出てきます。
- その後、すべての付着大人のミツバチをブラシで除去された後にこれらの蛹を含む櫛を収集し、コロニー間のばらつきを最小限にするために3個のコロニーから櫛を混ぜます。
- 空の巣のボックスに集めコームを置き、高湿度（> 60％の相対湿度）下で33℃でインキュベートします。収集した櫛から3日（コロニーあたり3,000労働者）で約6000新興労働者を集めます。
- workeの量を決定5新たに出現した労働者の重量に基づいて、RSはランダムに操作されていないコロニーから集めました。
- ランダムに計量機を使用して操作されていないコロニーから収集した5新興労働者を計量。
注：5新興労働者の量は、一般に500から600 mgです。 - 5新たに出現した労働者の平均重量によって収集された労働者の重量を割ることによって収集した労働者の量を推定します。
- ランダムに計量機を使用して操作されていないコロニーから収集した5新興労働者を計量。
- 水ベースのポスターペイントマーカーを用いて、約1,800の労働者（コロニーあたり900労働者）のthoraxの複数形にペイントマークを適用します。
注：ウォッシャブルマーカー塗料を適用するために使用される材料の表に記載されています。 - 女王を導入し、約3,000 0-2日齢労働者の2櫛、保存食品、女王によって産卵のための別の空の櫛のように蜂蜜と花粉を含む1櫛を含む新しいハイブボックスに。ハチミツと花粉のFRを含む櫛を収集すべての付着ミツバチが除去された後オム別の未操作のコロニー。
注：核ハイブボックス（小型ハイブボックス）の使用が推奨されます。 - 6〜8日、シングルコホートコロニーを作成した後、ペイントマークで看護師のミツバチと早熟飼料収穫機を収集します。
- 看護師の蜂を収集するには、ひなの世話をするためにコーム細胞に頭を入れた労働者を拾います。多くのひなと大人の労働者が含まれている櫛から看護師蜂を収集するためにピンセットを使用してください。
注：ステップ1.7で説明したように解剖したときに収集された労働者のHPGsが開発されている場合は、これらの労働者は、看護師の蜂のように定義されています。ピンセットによってthoraxの複数形を保持することは櫛から労働者をピックアップすることをお勧めします。 - 飼料収穫機を収集するには、その後ろ足に花粉負荷との巣箱に戻る労働者をキャプチャするために昆虫ネットを使用しています。
注：ステップ1.7で説明したように解剖したときに撮影した労働者のHPGsが収縮し表示された場合は、これらの労働者は、飼料収穫機のように定義されています。
- 看護師の蜂を収集するには、ひなの世話をするためにコーム細胞に頭を入れた労働者を拾います。多くのひなと大人の労働者が含まれている櫛から看護師蜂を収集するためにピンセットを使用してください。
- CLAS実体顕微鏡下で解剖によって三つのグループにHPGをSIFY、「開発」、「中級」、および「縮みました」。
- ミツバチが飛んだり歩くことができないまで、10〜15分間冷蔵庫に虫かごで10-15ミツバチを麻酔。その後、氷の上にミツバチを移動し、5分間氷上で麻酔を完了します。
注：これは、麻酔を達成するために、合計15〜20分程度かかります。麻酔時間を短縮する必要がある場合は、ケージ内の蜂の数は、ケージ当たり1-3蜂に減少させるべきです。 - ハサミやピンセットで身体から頭を解剖。ピンとペトリ皿に置い歯科用ワックスに頭を固定します。ヘッドを固定するためのアンテナのベースに2つのピンを挿入します。昆虫生理食塩水（130のNaCl、5mMのKCl、1mMのCaCl 2を）に固定されたヘッドを浸します。
- 双眼顕微鏡下で微細なピンセットやメスを使用してヘッドのキューティクルの前面を削除します。
注：HPGsは簡単にCを除去した後の頭の中で見つけることができますuticle。 HPGは、頭の中で脳の周りに存在するブドウ状の器官です。 - キューティクルの下に白い膜状の組織である気管組織を削除します。そして、ゆっくりとピンセットでそれらを引いて、頭からHPGsを分析。
- 「開発」として大きな円形腺房でHPGsを分類します。 「縮んだ」として、小と歪んだ腺房でHPGsを分類します。 HPGsが「中級」としていずれも「開発」や「縮んだ 'に対応する分類。
注：HPG状態のこれらの3つのクラスが示す代表的な写真を図2に示されています。 - 件名は「開発」およびRNA抽出に「収縮」HPGs」看護師蜂HPGs」と「飼料収穫機HPGs」として、それぞれ、および看護師のミツバチと飼料収穫機（セクション4）との間にHPGsにおける遺伝子発現を比較します。
- ミツバチが飛んだり歩くことができないまで、10〜15分間冷蔵庫に虫かごで10-15ミツバチを麻酔。その後、氷の上にミツバチを移動し、5分間氷上で麻酔を完了します。
20Eの2インジェクション
- DESCRのような典型的なコロニーからの看護師蜂を収集手順1.6.1でibed。
注意：ミツバチを飼育するようHPGsは、これらの蜂で調べることができません。 - （ない氷上で）冷蔵庫内で4℃でハチを麻酔。
注：これは、麻酔を達成するのに約30分かかります。麻酔時間が短縮されている場合は、ケージ内の蜂の数は、ケージ当たり1-3蜂に減少させるべきです。 - ピンセットを使用して、ペトリ皿に置かれた歯科用ワックスのハチを固定します。
- ガラス針プラーを用いて較正キャピラリーマイクロピペットから作られた噴射口を使用して、ヘッドの前面に20E溶液1μlを注入します。
- エタノール昆虫生理食塩水に（130のNaCl、5mMのKCl、1mMのCaCl 2を）混合物20Eを溶解させ（1：4）を2.5μgに/μL。
- ゴムチューブに注入チップを接続し、チューブの反対側に黄色のマイクロピペットチップを接続します。
- マイクロピペットを用いてパラフィルム上20E溶液1μlを置き、口の中で黄色のマイクロピペットチップを保持し、噴射口の中にソリューションを描くdは。
- アンテナのベースへの注入先端を挿入し、黄色のマイクロピペットチップを吹き抜けることにより溶液を注入します。
注：この手順に示されているプロトコルは、代表的な注入方法であるが、自動化された射出成形機の使用は、安全性、必要に応じて20のために推奨されます。
- リアは、1または3日間、暗くて湿った条件（> 60％の相対湿度）下で33-36℃で昆虫のケージ内に注入ミツバチ（理想的な温度は35℃です）。供給蜂蜜 - 水混合物（1：1）ミツバチします。必要に応じて、注射後にミツバチを存続数えます。
メトプレンの3.アプリケーション
- すべての付着大人のミツバチをブラシで除去された後、典型的なコロニーから蛹が含まれている櫛を収集します。 33-36℃で櫛をインキュベート1日までのために湿度の高い条件で（> 60％の相対湿度）（理想的な温度は35℃です）。
- 6日後、コロニーから（6日齢）塗装労働者を集めます。ピンセットでそのthoraxの複数形を保持することによって櫛から描いた労働者をピックアップ。
- 手順2.2のように（ない氷上で）冷蔵庫内で4℃でハチを麻酔。ピンセットを使用して、ペトリ皿に置い歯科用ワックスにミツバチを固定化し、マイクロピペットを用いて頭にアセトンに溶解メトプレン液の1-5μlの（50-250μgの/μl）を適用します。アセトンに耐性のあるフィルターチップを使用してください。
注意：アセトンは死に至るミツバチに有害な影響を与えることがあります。ミツバチの高い死亡率が観察される場合には、最低でも1μlのアセトンの量の減少が推奨されます。 - リア33-36℃で昆虫のケージでミツバチ（理想トンemperatureは暗く、湿気の多い条件下で7日間35°C）（> 60％の相対湿度）です。供給蜂蜜 - 水混合物（1：1）ミツバチします。必要に応じて、局所適用後にミツバチを存続数えます。
注：この記事では、生き残った蜂が7日、アプリケーション（ 表3）の後にカウントされます。
4. RNA抽出および定量的RT-PCR
- ハチを麻酔し、1.7.4へのステップ1.7.1で説明したようにHPGsを分析。
- 使用するまで-80℃でドライアイスとストアのマイクロ遠心チューブ内の解剖HPGsを収集します。
- タンパク質の変性用試薬の400μlのを追加します。
注：この試薬 は（ 材料の表を参照）は、市販されています。 - マイクロチューブの内側に収まる均質化乳棒で手持ち電動ミキサーを使用して、HPG組織をホモジナイズします。組織細胞を破壊し、溶解し、氷上で1分間約300回転の回転速度で均質化します。
材料の表を参照してください）。 - 80μlのクロロホルムを加え、よく混ぜます。 RTで5分間インキュベートします。
- 4℃で15分間、14170×gでマイクロ遠心チューブを遠心。新しいチューブに水相を転送します。等量のイソプロパノールを加え、1μlのグリコーゲン（5 mg / mlで）。少なくとも20分間-20℃でインキュベートします。
- 4℃で10分間14170×gでマイクロ遠心チューブを遠心し、上清を除去します。
- ペレットに75％エタノール400μlを添加して、よく混ぜ、4℃で15分間14170×gでマイクロ遠心チューブを遠心し、上清を除去します。もう一度これらの手順を繰り返します。
- 5-10分間ペレットを空気乾燥した後、10μlのRNaseフリー水に溶解します。
注：ペレットの完全な乾燥は水にRNAペレットの不溶化を引き起こす可能性があります。このように、少し濡れているペレットに適しています溶解。 - 光度計または類似のような分光光度計を用いてRNA濃度を測定します。
- 任意の混入したゲノムDNAを分解するために、37℃で30分間インキュベートすることによってDNアーゼIの2.0 Uで500ngの全RNAを扱います。
- -逆転写のDNase I処理したRNA 200ngのをし、市販のキットを用いてリアルタイムPCRを行い、遺伝子特異的プライマー（mrjp2（材料および試薬の表でリストを参照）; 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 '、および5 「-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3 '、HBG3; 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3'および5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3 '）。次のようにPCRを実行します。[95℃×30秒+（95℃×5秒間+ 60℃×15秒間+ 72℃×20秒）45-55サイクルをX]。
- 延長因子1α-F2（EF1α˗F2）またはリボソームタンパク質49（rp49）9,16,21,22のそれと転写産物の量を正規化します。これらの遺伝子は、信頼性の高い制御グラムです定量RT-PCRを用いてHPGsにおける遺伝子発現を分析するためのエン。
- 統計ソフトウェアを使用して、2つの実験群（看護師蜂対早熟飼料収穫機、制御蜂対20E処理された蜂、および制御蜂対メトプレン処理されたハチ）との間に有意な差を検出するために両側t検定を実行します。
注：F検定は分散の均一性を仮定した場合、スチューデントのt検定を使用することができます。そうでない場合、ウェルチのt検定を使用することができます。
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Representative Results
単一コホートコロニーを調製するための手順の概要を、図1Aに示されています。サンプルコレクションに単一コホートコロニーを調製から実験の時間経過を、 図1Bに示されています。看護の動作や採餌行動のための行動基準を満たした労働者は、シングルコホートコロニーから回収し、HPGの開発はこれらの労働者に推定された表1は、3つのグループにHPG開発の分類を示しています。サイズに応じて「開発」、「中級」、および「縮みました」。 HPGsこれら3つのクラスを示す代表的な写真を図2に示されている。結果は、看護師の蜂と早熟飼料収穫機の両方が、プロトコルに記載された基準に従って、またシングルコホートコロニーで観察されたことを示しています。 HPGsでmrjp2とHBG3の発現したアンHPG機能は労働者の役割（ 図3）16に関連付けられていることを示す、それぞれ、看護師の蜂と早熟飼料収穫機に富ん。
作業者の頭に20Eを注入するための手順は、 図4に示されている。ミツバチの生存率を調べるために、1,5及び7日目の注射後に計数した生存します 昆虫生理食塩水または20Eの実験前20E液の溶媒を注入したミツバチの割合。注射後7日目に、注入されたミツバチの約60から80までパーセントは生きていた、と20E溶液の溶媒を注入したミツバチの生存率は、昆虫生理食塩水（ 表2）と同等でした。 20E注射の効果はmrjp2とHPGsでHgb3（ 図5）16両方の発現を減少させました。 20E、mrjp2とHBG3への局所メトプレンアプリケーションの効果に加えて、 表3）の後に生存していました。一方アセトン/ハチの生理食塩水を注射したミツバチのわずか約20％から30％（1：4）生存ハチは1、3、5、7日間注射した（ 表4）の後にカウントした時、溶液は注射の7日後に生存。したがって、メトプレンの治療のための塗布方法を採用しました。メトプレンの適用はmrjp2の発現を阻害した （ 図6）16 HBG3の発現を増強しました。
シングルコホートコロニーを製造するための単一コホートコロニー実験。（A）スキームの 図1. 概要 。 （B）実験の時間経過preparinから看護師の蜂と早熟飼料収穫機を収集するグラムシングルコホートコロニー。水平方向の矢印は、シングルコホートコロニー内の労働者の生涯のコースを示しています。縦線の数字は、労働者の年齢を示しています。早熟飼料収穫機だけでなく、過時効ナースミツバチ（28-32日齢）だけでなく、単一のコホートコロニー15で発見されることが報告されています。これは本研究で行われていなかったが、このように、過時効看護師蜂と飼料収穫機間の生理機能の比較は、単一コホートコロニーで実行することができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
HPG状態の三つのクラスを示す 図2 写真。開発（A）、中間体（B）、及び収縮（C この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. ロール関連する 単一 の コホートコロニーからの労働者のHPGsに mrjp2 と HBG3 の発現を 。グラフは、2つのシングルコホート共同からの看護師の蜂（N）と早熟飼料収穫機（PF）の間HPGsでmrjp2（A）とHBG3（B）のmRNAレベルの比較を表示しますlonies。各遺伝子のmRNAレベルは、 リボソームタンパク質49（rp49）のものを用いて標準化しました。看護師の蜂HPGsにおける各遺伝子の相対的mRNAレベルは、いくつかの早熟飼料収穫機でmrjp2のmRNAレベルが原因で検出閾値よりも低い信号強度の定量化することができませんでした1。と定義しました。したがって、サンプル数は遺伝子間で異なります。相対的mRNAレベルを標準誤差で示されています。アスタリスクは、看護師の蜂と早熟飼料収穫機との間に有意差を示す（*、P <0.05; t検定）。この図は、上野らから再生されている。、（2015）16。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
20E injecためのプロトコルの 図4. スキームプロトコルセクションでる。手順2.3および2.4は、この図に示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
mrjp2 と HPGs 16 で HBG3 発現 に対する20E注入の 図5. 効果 。グラフはmrjp2のmRNAレベルの比較を示します 20E処理されたミツバチ（20E +）と制御ミツバチ（20E-）の間HPGs中（A）とHBG3（B）。グラフの下の数字は20E処理後の日を示しています。各遺伝子のmRNAレベルは、 伸長因子1α-F2（EF1α-F2）のものを用いて標準化しました。の相対的なmRNAレベル1.相対的mRNAレベルは標準誤差で示しているように、制御蜂HPGsにおける各遺伝子を定義しました。アスタリスクは20E処置ミツバチ及び制御ハチの間に有意な差を示す（*、p <0.05; t検定）。この図は、上野らから再生されている。、（2015）16。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
mrjp2 と HPGs 16 で HBG3 発現 に対するメトプレンアプリケーションの 図6. 効果 。グラフは、メトプレン処理されたミツバチとコントロールハチの間HPGsでmrjp2（A）とHBG3（B）のmRNAレベルの比較を示します。ザ各遺伝子のmRNAレベルは、EF1α-F2のもので標準化しました。 1.相対的mRNAレベルを標準誤差で示しているように、制御蜂HPGsにおける各遺伝子の相対的mRNAレベルを定義しました。アスタリスクは、メトプレン処置ミツバチ及び制御ハチの間に有意な差を示す（*、p <0.05; t検定）。この図は、上野らから再生されている。、（2015）16。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| コロニー号 | 観察された挙動 | 各HPGクラスの個体数 | |||
| 発展した | 中間体 | 縮みました | 合計 | ||
| 1 | 看護 | 8 | 1 | 1 | 10 |
| 狩猟採集 | 0 | 4 | 7 | 11 | |
| 2 | 看護 | 4 | 2 | 0 | 6 |
| 狩猟採集 | 0 | 0 | 5 | 5 | |
表1：看護や採餌行動シングルコホートコロニーで観察された労働者のHPGsの分類 。 （コロニー第1番、第2）2つのシングルコホートコロニーからの労働者でHPGサイズは、3つのクラスにグループ化されました。 「開発」、「中級」や大きさによって「縮みました」。
| 注入後の日数 | いいえ注射ません | 昆虫生理食塩水 | 20E SOLN用の溶剤 | |
| 試験1 | Day0 | 15/15 | 15/15 | 14/15 |
| 1日目 | 15/15 | 14/15 | 13/15 | |
| Day5 | 14/15 | 13/15 | 11月15日 | |
| Day7 | 14/15 | 12月15日 | 9月15日 | |
| トライアル2 | Day0 | 15/15 | 15/15 | 15/15 |
| 1日目 | 15/15 | 13/15 | 15/15 | |
| Day5 | 15/15 | 11月15日 | 12月15日 | |
| Day7 | 14/15 | 10月15日 | 12月15日 |
表2：20E液の溶媒を注入したミツバチの生存率 。 十五の労働者は、各実験群で調製しました。
| 適用後の日 | アセトン | メトプレン | |
| 試験1 | 0日目 | 7/7 | 8/8 |
| 7日目 | 7/7 | 6/8 | |
| トライアル2 | 0日目 | 7/7 | 8/8 |
| 7日目 | 7/7 | 8/8 |
表3：メトプレンで処理されたミツバチの生存率 7〜8労働者は各実験群で調製しました。
| 注入後の日数 | いいえ注射ません | アセトン/ビー生理食塩水（1：4） |
| 0日目 | 15/15 | 15/15 |
| 1日目 | 15/15 | 6月15日 |
| 3日目 | 15/15 | 5月15日 |
| 5日目 | 15/15 | 4月15日 |
| 7日目 | 15/15 | 4月15日 |
表4：アセトン/ハチの生理食塩水（1：4）を注射したミツバチの生存率。ソリューションフィフティーン労働者は各実験群のために調製しました。アセトン/ハチの生理食塩水（1：4）溶液を、ワーカー腹部に注射しました。ハチの生理食塩水の組成は、130mMのNaClを、6のKCl、4mMのMgCl 2を、2.5 mMのCaCl 2を、160mMのスクロース、25 mMグルコース、および10mMのHEPES（pH7.0）です。
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Discussion
シングルコホートコロニーの調製
ここでは、働きバチの役割の変化に関連したHPG生理学の分析のための単一のコホートのコロニーを準備するために私たちの以前の研究16で使用されるプロトコルを説明しました。手順1.6から1.7と図2に記載された基準を満たした看護師蜂と早熟飼料収穫機は、シングルコホートコロニー（ 表1）で観察されました。 図2の写真は、基準とHPG状態の分類に有用であろう。労働者の行動とHPG開発の両方に基づいた基準は、典型的なコロニーで看護師蜂や飼料収穫機を定義するための有効です。徐々に採餌への看護の役割のシフトは、これらのコロニーで進行：それは採食行動に徐々に役割シフト2の間に増加しながら、看護の行動に費やされる時間の量が徐々に低下します。したがって、排他的にその労働者を収集することは困難です唯一の行動基準によって、看護や採餌を行います。 HPGsでmrjp2とHBG3の発現は労働者の役割に関連付けられていることを結果が明らかにここで説明するプロトコルは、看護師の蜂とシングルコホートコロニーからの早熟飼料収穫機（ 図3）にHPG生理学を調べるために採用することができることを示しています。労働者の行動とHPG開発の両方に基づく基準は、シングルコホートコロニーから看護師蜂と早熟飼料収穫機の定義に該当する可能性があります。 HPGsに加えて、頭の中で他の外分泌腺は、ロールのシフトに関連して、生理学的変化を受けます。例えば、警報フェロモン2-ヘプタノン2の合成にひなの食品用脂肪酸の合成から下顎腺変化の関数。ここで説明するプロトコルは、このようHPGs以外の外分泌腺の役割に関連する生理機能を検査するように構成することができます。
n個の成功したコレクションコロニーが用意されているときにシングルコホートコロニーからURSE蜂と早熟飼料収穫機は、新たに出現した労働者の十分な数のコレクションに依存します。新たに出現した労働者の数が少ないが収集される場合には、十分な看護ミツバチ及び早熟飼料収穫機を収集することは困難です。また、女王の条件が成功した試料採取のための別の重要な点です。これらの女王は通常卵巣を開発しているので、大きな腹部クイーンズは卵を産むのに適しています。このように、労働者の労働力はひなを常に女王によって供給されるため効果的であっても、単一のコホートコロニーに分割されると考えられています。何のひなが供給されていない場合、単一コホートコロニーから看護師蜂を収集することは困難です。最後に、ポスターの塗料を使用して、労働者をマーキングすると、飼料収穫機は時々間違った植民地に戻るため、労働者は、単一コホートコロニーから収集されることを保証するために必要とされます。効果的に早熟飼料収穫機を収集するには、ペイントマークがあるべきです（シングルコホートコロニーあたり900以上の新興労働者）できるだけ多くの労働者に適用されます。通常、揮発性有機化合物を含有する油性インクは、ハチの間の化学の通信を中断させる可能性があるため、マーキングのための水性インクの使用が推奨されてもよいです。水性インクマークは、実験の過程で非常に多くをフェードしませんでした。
ホルモン療法
また、HPG生理学（mrjp2とHBG3式 ）に対するエクジソンの影響を調べるために、労働者の頭の中に20Eを注入するためのプロトコルを説明しました。昆虫生理食塩水または20E溶液の溶媒を注入蜂の生存率は、20E注入実験（ 表2を採用することができる射出先端と20E溶液の溶媒を使用したプロトコルは、注射のためにここに記載されたものを示し、その後の分析のために十分でした）。また、HPGsにおける遺伝子発現の比較20E処理されたミツバチとコントロール蜂の間に注入20Eはmrjp2とHPG機能に関連しているどちらもHBG3、（ 図5）の発現を変更することを示しました。この結果は、ここに記述されたプロトコルは、HPGの生理学上のエクジソンの効果を調べるために有用であろうことを示唆し、このような下顎腺のように、頭の中で他の外分泌腺を調べるために採用することができます。また、注入法は、他の化学物質を注入するために採用することができます。例えば、ここで説明するプロトコルは、遺伝子ノックダウン実験のためのヘッドに、二本鎖RNA溶液を注入するための適切であろう。
20Eに加えて、JH類似体であるメトプレンを適用するためのプロトコルを記載しています。メトプレンは、通常、腹部に適用されます。一方、メトプレンは、ここでは、作業者の頭に適用しました。メトプレン又はアセトンの局所適用にほとんどすべてのミツバチは、処理の7日後に生存しました、ヘッドに5μlのメトプレンまたはアセトン溶液の適用を示唆して作業者の生存率（ 表3）にほとんど影響を与えません。さらに、methoprene-及びアセトンで処理したハチの間HPGsでmrjp2とHBG3の発現の比較は、メトプレンアプリケーションがmrjp2発現を阻害し、HBG3式 （ 図6）を増強することを示します。これらの結果は、ここに記載されているプロトコルは、頭の中でHPGsとして外分泌腺の生理学上のメトプレンの影響を分析するための適切であることを示唆しています。
成功したホルモン処理は、処理されたミツバチの生存率に依存します。冷蔵庫で低温露出はハチを麻酔のために適切かもしれません。ミツバチが低い生存率につながる、氷の上に濡れますので、氷上で麻酔が推奨されていません。また、注入法は、生きている蜂を維持するためのもう一つの重要なポイントである可能性があります。それはメートルに重要です噴射口細長いAKE、および注射によってミツバチへのダメージを最小限に抑えるために、カッターを使用して、鋭い先端にそれを形にします。メトプレンのためのアセトン溶媒にマイナス蜂の生存（ 表4）に影響を与えるので、しかし、注入方法は、HPG生理学上のメトプレンの影響を調べるために適切ではありません。彼らは、注射後に再導入されたときに注入されたミツバチが自分のコロニーから除外されるように加えて、ここで説明する注入法は、コロニー内の行動解析のために適切でないかもしれません。軽傷を持つ労働者はコロニーから除外される可能性があります。そのようなホルモンの適用または経口投与のような他の方法は、行動分析のために適切であり得ます。
シングルコホートコロニーは、ワーカーミツバチ10,11の分業の規制を検討するために使用されています。さらに、幼若ホルモンを用いた治療は、行動および脳の検査に用いられてきたfuncti労働11の部門に関連した上で。しかし、単一コホートコロニーの準備とJHと治療の両方のための詳細なプロトコルは、以前、このような詳細に提供されていません。最近では、分業におけるエクジソンの重要性がますます認識しつつある、とJHとエクダイソンの両方による分業の規制が23示唆されています。シングルコホートコロニーとJHなどのホルモン処理と、この資料に記載さエクジソンの成功を調製するための詳細なプロトコルは、労働者の生理学の研究に発展に貢献することがあります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | Marker pen for the application of marks to bees |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| Breeding case insect | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| Electromotion mixier | ISO | 23M-R25 | homogenization of tissue |
| TRIZol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | the reagent for total RNA extraction |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT reagent kit | Takara | RR037A | the reagent for reverse transcription |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | the reagent for real-time PCR |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | the instrument for real-time PCR |
| LightCycle Capillaries (20μl) | Roche | 4929292001 | the material for real-time PCR |
References
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