Summary
Hier beschreiben wir unser ausführliches Protokoll zur Herstellung von Single-Kohorte Bienenvölker - ein nützliches Werkzeug für die Analyse der Rolle-assoziierten Arbeiter Physiologie. Wir beschreiben auch detaillierte Protokolle für Arbeitnehmer mit Juvenilhormons und Ecdyson Behandlung der Beteiligung dieser Hormone an der Regulation der Arbeiter Verhalten und / oder Physiologie zu bewerten.
Introduction
Die Europäische Honigbiene, Apis mellifera, ist ein eusocial Insekt mit einer hoch organisierten Gesellschaft 1. Arbeiter Honigbienen (Arbeits Kaste) sind in verschiedener Aufgaben Kolonie Aktivität zu erhalten, und diese Aufgaben ändern sich je nach dem Alter des Arbeitnehmers Honigbiene nach dem Schlüpfen, die als altersbedingte Arbeitsteilung bezeichnet wird 2-4. Junge Arbeitnehmer (<13 Tage alt) kümmern sich um die Brut in den Bienenstock von Gelée Royale sezer (Ammen), während ältere Arbeitnehmer (> 15 Tage alt) sammeln Nektar und Pollen außerhalb des Bienenstocks (foragers) 2-4. Die Physiologie der Arbeiter ändert sich in Verbindung mit dieser Rolle Verschiebung. Zum Beispiel kann die Funktion der Hypopharynxdrüsen (HPGs), gepaart im Kopf befindet exokrinen Drüsen, Änderungen im Zusammenhang mit der Rolle Verschiebung von Pflege bis 2,5 Nahrungssuche. Krankenschwester Biene HPGs synthetisieren hauptsächlich großen Gelee royale Proteine, die wichtigsten Komponenten der Bienenmilch sind. Auf der anderen Seite, forager HPGs hauptsächlichKohlenhydrat-metabolisierende Enzyme wie α-Glucosidase III synthetisieren Nektar in Honig zu verarbeiten, indem Saccharose in Glucose und Fructose umwandelt. Unseren früheren Studien zeigten , dass die Expression von mrjp2, die einen Haupt Gelée royale - Protein kodiert, und Hbg3, die während der Rolle Verschiebung 6-9 α-Glucosidase III, Änderungen kodiert.
Um zu bestimmen, ob die physiologischen Veränderungen in den Arbeiter Geweben, einschließlich der HPGs, mit der Rolle Verschiebung oder mit dem Alter der Arbeiter verbunden ist, wäre es nützlich, die Population Zusammensetzung eines Bienenvolk zu manipulieren, beispielsweise single-Kohorte vorzubereiten Kolonien , in denen Arbeiter fast im gleichen Alter führen verschiedene Aufgaben 10,11. Robinson et al. (1989) beschrieben , ein Verfahren zur Herstellung einer Einzelkolonie Kohorten 10 herzustellen. Einzel-Kohorte Kolonien umfassen zunächst eine Königin und 0-2 Tage alten Arbeiter. Einige Tage nach der Kolonien Gründung, Arbeiter von almost im gleichen Alter übernehmen verschiedene Aufgaben. Einige Arbeiter verrichten Pflegeaufgaben wie in typischen Kolonien, während andere Arbeiter Nahrungssuche Aufgaben früher als üblich und werden so altklug foragers genannt. Die Genexpression Vergleiche zwischen Ammen und altklug foragers würde nützliche Informationen über die Rolle assoziierte Physiologie der Arbeiter Gewebe 16.12. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für 16 Single-Kohorte Kolonien für die Analyse der rollen- und / oder altersassoziierte Physiologie der HPGs vorbereitet. Wir beschreiben auch kurz , wie die Genexpression von mrjp2 und Hbg3 durch quantitative reverse Transkription-Polymerase - Kettenreaktion (RT-PCR) zu untersuchen HPG Physiologie zu untersuchen.
Neben der Analyse der Arbeiter Physiologie im Einzel Kohorte Kolonien, Prüfung des endokrinen Systems ist wichtig für die Regulationsmechanismen der Rolle assoziierten Arbeiter Physiologie zu analysieren. Juvenile Hormon (JH), die kno istwn als in Insektenlarven Hormon 'Status quo', beschleunigt den Wandel in der Rolle von Pflege in Arbeitshonigbienen 11 bis Nahrungssuche. Weiterhin Ecdyson, das als Häutungshormons während der Metamorphose bekannt ist, könnte in der Rolle Verschiebung als Gene , die für Ecdyson Signalmoleküle in den Pilzkörpern, ein höheres Zentrum des Arbeiters brain 17-19 exprimiert werden beteiligt sein. Deshalb beschreiben wir auch das detaillierte Protokoll in unserer früheren Studie 16 verwendet , um Arbeitnehmer mit 20E behandeln, die eine aktive Form von Ecdyson ist, und Methopren, ein JH analog zur Analyse der Wirkung des endokrinen Systems auf HPG Physiologie (Expression von mrjp2 und Hbg3).
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Protocol
1. Herstellung von Einzel-Kohorte Kolonien
- Bereiten Sie drei Bienenvölker zu schaffen zwei Single-Kohorte Kolonien und eine ausreichende Anzahl von neu entstandenen Arbeiter zu erhalten.
- Überprüfen Sie, dass einige Puppen in den verkappten peripheren Zellen in den Waben haben braune Augen und ein pigmentiertes Kutikula durch die verkappten Kämme mit einer Pinzette zu öffnen. Wenn diese pupae in Umfangskammzellen vorhanden sind, werden die meisten Puppen in den ganzen Kämme entstehen in etwa 1-3 Tagen.
- Anschließend sammeln die Kämme haben diese enthalten Puppen nach allen anhaftenden erwachsenen Bienen mit einer Bürste entfernt worden ist, und von den drei Kolonien Kämme mischen Variabilität unter Kolonien zu minimieren.
- Legen Sie die gesammelten Kämme in einem leeren Feld Struktur und Inkubation bei 33 ° C unter feuchten Bedingungen (> 60% relative Luftfeuchtigkeit). Sammeln Sie rund 6.000 neu entstandenen Arbeiter über 3 Tage (3.000 Arbeiter pro Kolonie) aus den gesammelten Kämme.
- Bestimmen Sie die Menge von workers bezogen auf das Gewicht von fünf neu entstandenen Arbeiter aus unmanipulated Kolonien zufällig gesammelt.
- Wiegen fünf neu entstandenen Arbeiter aus unmanipulated Kolonien mit einem Gewicht von Maschinen zufällig gesammelt.
Hinweis: Das Gewicht von fünf neu entstandenen Arbeiter im Allgemeinen 500-600 mg ist. - Schätzen Sie die Menge der gesammelten Arbeiter durch das Gewicht der gesammelten Arbeiter durch das durchschnittliche Gewicht von fünf neu entstandenen Arbeiter geteilt wird.
- Wiegen fünf neu entstandenen Arbeiter aus unmanipulated Kolonien mit einem Gewicht von Maschinen zufällig gesammelt.
- Bewerben Farbmarkierungen auf den thoraces von rund 1.800 Arbeiter (900 Arbeiter pro Kolonie) mit wasserbasierenden Plakatfarbe Marker.
Hinweis: Waschbar Marker, der verwendet wird , um die Farbe aufzutragen ist in der Tabelle der Materialien aufgeführt. - Einführung einer Königin und etwa 3.000 der 0-2 Tage alten Arbeiter zu einem neuen Feld Struktur, die zwei Kämme enthält, ein Kamm aus Honig und Pollen als Konserven und andere leer Kamm für die Eiablage durch die Königin. Sammeln Sie den Kamm aus Honig und Pollen from eine andere unmanipulated Kolonie, nachdem alle anhaftenden Bienen werden entfernt.
Hinweis: Die Nutzung der Kern hive Box (klein hive-Box) wird empfohlen. - Sammeln Krankenschwester Bienen und altklug foragers mit Farbmarkierungen 6 bis 8 Tage nach dem Single-Kohorte Kolonien zu schaffen.
- So sammeln Krankenschwester Bienen holen Arbeiter, die ihre Köpfe in Kamm Zellen gelegt kümmern sich um die Brut. Verwenden einer Pinzette die Krankenschwester Bienen Waben zu sammeln, die viele Brut und erwachsene Arbeitnehmer enthalten.
Hinweis: Wenn HPGs der gesammelten Arbeiter entwickelt werden, wenn seziert als 1,7 in Schritt beschrieben, werden diese Arbeiter als Krankenschwester Bienen definiert. die thoraces durch Pinzette halten wird empfohlen, Arbeiter aus den Waben zu holen. - So sammeln foragers, verwenden Sie ein Insektennetz Arbeiter zu erfassen, die mit Pollen Lasten auf die Hinterbeine, um ihre Bienenstöcke zurück.
Hinweis: Wenn HPGs der gefangenen Arbeiter geschrumpften erscheinen, wenn seziert als 1,7 in Schritt beschrieben, werden diese Arbeitnehmer als foragers definiert.
- So sammeln Krankenschwester Bienen holen Arbeiter, die ihre Köpfe in Kamm Zellen gelegt kümmern sich um die Brut. Verwenden einer Pinzette die Krankenschwester Bienen Waben zu sammeln, die viele Brut und erwachsene Arbeitnehmer enthalten.
- Classifizieren die HPG in drei Gruppen, "entwickelt", "Intermediate" und "geschrumpfte" durch die Präparation unter einem Stereomikroskop.
- Anesthetize 10-15 Bienen in einem Insekt Käfig in einem Kühlschrank für 10-15 Minuten, bis die Bienen fliegen oder kann nicht gehen. Dann Bienen auf Eis bewegen und die Anästhesie auf Eis für 5 min ab.
Hinweis: Es dauert etwa 15-20 Minuten insgesamt zu Anästhesie erreichen. Wenn der Narkosezeit verkürzt werden muss, sollte die Anzahl der Bienen in einem Käfig auf 1-3 Bienen pro Käfig reduziert werden. - Präparieren Sie den Kopf vom Körper mit einer Schere und Pinzette. Befestigen Sie den Kopf auf Dentalwachs auf eine Petrischale gelegt mit Stiften. Legen Sie zwei Stifte in die Basen der Antennen den Kopf zu fixieren. Einweichen feste Köpfe in Insektensalzlösung (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2).
- Entfernen Sie den vorderen Aspekt der Kutikula des Kopfes mit einer feinen Pinzette und einem chirurgischen Messer unter dem Binokular.
Hinweis: Die HPGs kann leicht in den Kopf nach der Entfernung von c gefunden werdenuticle. Die HPG ist ein botryoid Organ, das rund um das Gehirn im Kopf existiert. - Entfernen Sie die Luftröhrengewebe, die eine weiße membranartige Gewebe unter der Oberhaut ist. Dann sezieren die HPGs vom Kopf, indem sie langsam mit einer Pinzette herausziehen.
- Klassifizieren HPGs mit großen und Kreis acini als "entwickelt". Klassifizieren HPGs mit kleinen und verzerrt acini als "geschrumpfte". Klassifizieren HPGs entsprechend weder "entwickelt" noch "geschrumpfte" als "Intermediate".
Hinweis: Repräsentative Fotografien , die diese drei Klassen von HPG Staaten zeigen sind in Abbildung 2 dargestellt. - Betreff "entwickelt" und "geschrumpfte" HPGs zu RNA-Extraktion als "Krankenschwester Biene HPGs 'und' forager HPGs 'bezeichnet und die Genexpression in den HPGs zwischen Ammen und foragers (Abschnitt 4) zu vergleichen.
- Anesthetize 10-15 Bienen in einem Insekt Käfig in einem Kühlschrank für 10-15 Minuten, bis die Bienen fliegen oder kann nicht gehen. Dann Bienen auf Eis bewegen und die Anästhesie auf Eis für 5 min ab.
2. Injektion von 20E
- Sammeln Krankenschwester Bienen aus typischen Kolonien als Beschribed in dem Verfahren 1.6.1.
Hinweis: HPGs kann nicht in diesen Bienen untersucht werden, wie die Bienen gezüchtet werden. - Anesthetize die Bienen bei 4 ° C im Kühlschrank (nicht auf Eis).
Hinweis: Es dauert etwa 30 min Anästhesie zu erreichen. Wenn die Anästhesiezeit verkürzt wird, sollte die Anzahl der Bienen im Käfig 1-3 Bienen pro Käfig reduziert werden. - Mit einer Pinzette zu immobilisieren, die Bienen auf Dentalwachs auf einem Teller Petri gelegt.
- Injizieren Sie 1 ul 20E-Lösung in die Vorderseite des Kopfes eine Injektionsspitze aus einem kalibrierten Kapillare Mikro hergestellt unter Verwendung einer Glas Nadel Abzieher.
- Auflösen 20E in Ethanol-Insektensalzlösung (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2) Gemisch (1: 4) bei 2,5 ug / ul.
- Verbinden Sie die Injektionsspitze an einem Gummischlauch, und eine Verbindung zu der gegenüberliegenden Seite des Rohres einen gelben Mikropipettenspitze.
- Platz 1 ul 20E Lösung auf Parafilm mit einer Mikropipette, halten Sie die gelbe Mikropipettenspitze im Mund, eind die Lösung in die Injektionsspitze ziehen.
- Legen Sie die Injektionsspitze in die Basis der Antennen, und die Lösung zu injizieren, indem sie durch die gelbe Mikropipettenspitze bläst.
Hinweis: Das Protokoll in diesem Schritt gezeigt wird , ist der repräsentative Einspritzverfahren, aber die Verwendung der automatischen Injektionsmaschine ist aus Sicherheitsgründen als notwendig 20 empfohlen.
- Hinten die injizierten Bienen in Insekten Käfigen bei 33-36 ° C (die ideale Temperatur liegt bei 35 ° C) unter dunklen und feuchten Bedingungen (> 60% relative Luftfeuchtigkeit) für 1 oder 3 Tage. Versorgungs Honig-Wasser-Gemisch (1: 1) an die Bienen. Bei Bedarf zählen Bienen nach der Injektion zu überleben.
3. Anwendung von Methoprene
- Sammeln Sie die Kämme, die Puppen aus typischen Kolonien nach allen anhaftenden erwachsenen Bienen entfernt werden mit einem Pinsel enthalten. Inkubieren der Kämme bei 33-36 ° C (die optimale Temperatur beträgt 35 ° C) unter feuchten Bedingungen (> 60% relative Luftfeuchtigkeit) für bis zu 1 Tag.
- Nach 6 Tagen bemalten Arbeiter (6 Tage alt) aus den Kolonien zu sammeln. Pick-up gemalt Arbeiter aus den Waben durch ihre thoraces mit einer Pinzette zu halten.
- Anesthetize die Bienen bei 4 ° C im Kühlschrank (nicht auf dem Eis), wie in dem Verfahren 2.2. Mit einer Pinzette zu immobilisieren, die Bienen auf Dentalwachs auf einem Teller Petri gegeben und gelten 1-5 ul Methopren Lösung (50-250 ug / ul), gelöst in Aceton, um ihre Köpfe mit einer Mikropipette. Verwenden Sie eine Filterspitze, die Aceton beständig ist.
Hinweis: Aceton können die schädlichen Auswirkungen auf Bienen haben zum Tod führt. Wenn die hohe Sterblichkeit der Bienen beobachtet wird, wird die Verringerung des Volumens von Aceton zu 1 & mgr; l bei der minimalen empfohlen. - Hinten die Bienen in Insekten Käfigen bei 33-36 ° C (ideal temperaturbereich ist 35 ° C) für 7 Tage unter dunklen und feuchten Bedingungen (> 60% relative Luftfeuchtigkeit). Versorgungs Honig-Wasser-Gemisch (1: 1) an die Bienen. Bei Bedarf zählen Bienen nach der topischen Anwendung zu überleben.
Hinweis: In diesem Artikel werden überlebenden Bienen 7 Tage nach der Anwendung gezählt (Tabelle 3).
4. RNA-Extraktion und quantitative RT-PCR
- Anesthetize Bienen und sezieren HPGs wie in den Schritten 1.7.1 bis 1.7.4 beschrieben.
- Sammeln Sie die seziert HPGs in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Trockeneis und bei -80 ° C bis zur Verwendung.
- In 400 ul des Reagenz zur Denaturierung von Proteinen.
Hinweis: Dieses Reagenz im Handel erhältlich ist (siehe die Tabelle der Materialien). - Homogenisieren HPG Gewebe eine Hand elektrischen Mixer mit einer Homogenisierung zerstoßen, die in einem Mikrozentrifugenröhrchen passt. Homogenisieren für 1 min auf Eis bei einer Rotationsgeschwindigkeit von ungefähr 300 rpm zu brechen und lysieren Gewebezellen.
Tabelle der Materialien sehen). - In 80 ul Chloroform und gut mischen. Inkubieren für 5 min bei RT.
- Zentrifugieren der Mikrozentrifugenröhrchen bei 14.170 xg für 15 min bei 4 ° C. Die wäßrige Phase in ein neues Röhrchen. Hinzufügen eines gleichen Volumens an Isopropanol und 1 ul Glycogen (5 mg / ml). Inkubieren bei -20 ° C für mindestens 20 min.
- Zentrifugieren Sie die Reaktionsgefäße bei 14170 × g für 10 min bei 4 ° C, und entfernen Sie den Überstand.
- In 400 ul 75% Ethanol zu dem Pellet und gut mischen, Zentrifugieren Sie die Reaktionsgefäße bei 14170 × g für 15 min bei 4 ° C, und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diese Verfahren noch einmal.
- Der Luft trocknen das Pellet für 5-10 min und dann in 10 & mgr; l RNase-freiem Wasser auflösen.
Hinweis: Die vollständige Trocknung des Pellets Unlöslichmachen des RNA-Pellet in Wasser führen kann. Somit wird das Pellet leicht feucht ist, ist geeignet fürAuflösung. - Messen Sie die RNA-Konzentration ein Spektrophotometer wie Nanodrop oder ähnliches verwendet wird.
- Behandlung von 500 ng Gesamt-RNA mit 2,0 U DNase I für 30 min bei 37 ° C inkubiert vorhandene kontaminierende genomische DNA zu degradieren.
- Rückwärts-transkribieren 200 ng DNase I behandelten RNA und führen PCR Echtzeit im Handel erhältlichen Kits (siehe die Liste in der Tabelle der Materialien und Reagenzien) und Gen-spezifischen Primer (mrjp2; 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 'und 5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3', Hbg3; 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3 'und 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3'). Führen Sie die PCR wie folgt: [95 ° C x 30 sec + (95 ° C x 5 sec + 60 ° C x 15 s + 72 ° C x 20 sec) x 45-55 Zyklen].
- Normalisieren der Menge an Transkript mit der Elongationsfaktor 1α-F2 (EF1α˗F2) oder ribosomale Protein 49 (rp49) 9,16,21,22. Diese Gene sind zuverlässige Kontrolle genen für die Genexpression in den HPGs mit qRT-PCR-Analyse.
- Führen Sie two-tailed t-Test, um die signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Versuchsgruppen (Ammenbienen vs. altklug foragers, 20E behandelten Bienen vs. Kontrolle Bienen und Methopren behandelten Bienen vs. Kontrolle Bienen) mit Hilfe statistischer Software zu erkennen.
Hinweis: Wenn F-Test, um die Homogenität der Varianz, Student-t-Test verwendet werden können, übernimmt. Wenn nicht, kann Welch t-Test verwendet werden.
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Representative Results
Eine Übersicht über das Protokoll single-Kohorte Kolonien zur Herstellung ist in 1A veranschaulicht. Zeitverlauf der Experimente von Single-Kohorte Kolonien Vorbereitung der Probenahme ist in 1B gezeigt. Arbeiter, die die Verhaltenskriterien für Pflegeverhalten oder Fraßverhalten erfüllt wurden von Single-Kohorte Kolonien gesammelt und HPG Entwicklung wurde in dieser Arbeiter Tabelle 1 zeigt die Einteilung der HPG Entwicklung in drei Gruppen geschätzt. "Entwickelt", "Intermediate" und "geschrumpfte" entsprechend der Größe. Repräsentative Fotografien diese drei Klassen von HPGs zeigen , sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen , dass beide Ammen und altklug foragers, die nach den Kriterien in dem Protokoll beschrieben, auch in den Single-Kohorte Kolonien beobachtet wurden. Die Expression von mrjp2 und Hbg3 in den HPGs war enriched in Ammen und altklug foragers jeweils, was darauf hinweist , dass HPG - Funktion mit der Rolle der Arbeitnehmer zugeordnet ist (Abbildung 3) 16.
Das Verfahren für die 20E in Arbeiter Köpfe Injektion ist in Figur 4 veranschaulicht. Die überlebenden Bienen wurden gezählt 1, 5 und 7 Tage nach der Injektion , das Überleben zu untersuchen Rate der Bienen mit Insektenkochsalzlösung oder Lösungsmittel für 20E Lösung vor dem 20E Experiment injiziert. 7 Tage nach der Injektion etwa 60-80% der injizierten Bienen am Leben waren, und die Überlebensrate der Bienen mit dem Lösungsmittel für die 20E Lösung injiziert war vergleichbar mit Insektensalzlösung (Tabelle 2). Die Wirkung der 20E Injektion verringerte Expression von sowohl mrjp2 und Hgb3 in den HPGs (Figur 5) 16. Neben 20E, die Wirkung der topischen Anwendung auf Methopren mrjp2 und Hbg3 (Tabelle 3). Auf der anderen Seite, nur etwa 20% bis 30% der Bienen injiziert mit Aceton / bee Kochsalzlösung (1: 4) Lösung 7 Tage nach Injektion überlebten , wenn überlebenden Bienen 1 gezählt wurden, 3, 5 und 7 Tage nach der Injektion (Tabelle 4) . So wurde die Anwendungsmethode für Methopren Behandlung angenommen. Anwendung von Methopren hemmte die Expression von mrjp2 und erhöhte die Expression von Hbg3 (Abbildung 6) 16.
Abbildung 1. Überblick über die Single-Kohorte Kolonie Experiment. (A) Schema für Single-Kohorte Kolonien vorzubereiten. (B) Zeitverlauf des Experiments von preparinSingle-Kohorte Kolonien g zu sammeln Krankenschwester Bienen und altklug foragers. Horizontale Pfeil zeigt den Verlauf der Lebensdauer der Arbeiter in den Single-Kohorte Kolonien. Zahlen mit vertikalen Linien zeigen Arbeiter Alter. Nicht nur altklug foragers sondern auch überalterte Ammenbienen (28-32 Tage alt) berichtet in Single-Kohorte Kolonien 15 gefunden werden. So zeigt der Vergleich der Physiologie zwischen überalterten Ammen und foragers können in Einzel Kohorte Kolonien durchgeführt werden, obwohl dies nicht in dieser Studie durchgeführt wurde. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Fotografien , die die drei Klassen von HPG Zuständen zeigt. Entwickelt (A), Mittelstufe (B), und geschrumpfte (C Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Rolle assoziierte Expression von mrjp2 und Hbg3 in den HPGs von Arbeitnehmern aus Single-Kohorte Kolonien. Das Diagramm zeigt einen Vergleich der mRNA - Spiegel von mrjp2 (A) und Hbg3 (B) in den HPGs zwischen Ammen (N) und altklug foragers (PF) von zwei Single-Kohorte colonies. MRNA - Ebene jedes Gens wurde mit dem von ribosomalem Protein 49 (rp49) normalisiert. Die relative mRNA - Ebene von jedem Gen in die Krankenschwester Biene HPGs wurde als 1. Die mRNA - Ebene von mrjp2 in einigen altklug foragers definiert konnte aufgrund von Signalintensitäten unterhalb der Nachweisschwelle quantifiziert werden. Daher unterscheidet sich die Anzahl der Abtastwerte zwischen den Genen. Relative mRNA-Spiegel sind mit Standardfehler angegeben. Sternchen zeigen signifikante Unterschiede zwischen den Ammen und altklug foragers (*, p <0,05; t-Test). Diese Zahl wurde von Ueno et al reproduziert., (2015) 16. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Schema des Protokolls für 20E INJECtion. Verfahren 2.3 und 2.4 in dem Protokollabschnitt in dieser Figur dargestellt sind. Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Wirkung von 20E Injektion auf mrjp2 und Hbg3 Ausdruck in der HPGs 16. Der Graph zeigt einen Vergleich der mRNA - Spiegel von mrjp2 (A) und Hbg3 (B) in den HPGs zwischen 20E-behandelten Bienen (20E +) und Kontrollbienen (20E-). Zahlen unter dem Graphen zeigen den Tag nach 20E Behandlung. MRNA - Ebene jedes Gens wurde mit dem von Elongationsfaktor 1α-F2 (EF1 & agr;-F2) normalisiert. Relative mRNA-Ebene vonjedes Gen in den Kontrollbienen HPGs wurde definiert als 1. Relative mRNA-Spiegel mit einem Standardfehler angegeben. Ein Sternchen zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen 20E behandelten Bienen und Kontrolle Bienen (*, p <0,05; t-Test). Diese Zahl wurde von Ueno et al reproduziert., (2015) 16. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. Wirkung von Methopren Anwendung auf mrjp2 und Hbg3 Ausdruck in den HPGs 16. Der Graph zeigt den Vergleich der mRNA - Spiegel von mrjp2 (A) und Hbg3 (B) in den HPGs zwischen Methopren behandelten Bienen und Steuer Bienen. DasmRNA Level von jedem Gen wurde mit dem des EF1 & agr;-F2 normalisiert. Relative mRNA-Ebene von jedem Gen in den Kontrollbienen HPGs wurde definiert als 1. Relative mRNA-Spiegel mit Standardfehler angegeben. Sternchen zeigen signifikante Unterschiede zwischen Methopren behandelten Bienen und Kontrolle Bienen (*, p <0,05; t-Test). Diese Zahl wurde von Ueno et al reproduziert., (2015) 16. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Colony No. | beobachtete Verhalten | Anzahl der Personen in jeder Klasse HPG | |||
| Entwickelt | Mittlere | Geschrumpft | Gesamt | ||
| 1 | Pflege | 8 | 1 | 1 | 10 |
| Futter suchen | 0 | 4 | 7 | 11 | |
| 2 | Pflege | 4 | 2 | 0 | 6 |
| Futter suchen | 0 | 0 | 5 | 5 | |
Tabelle 1: Klassifizierung von HPGs der Arbeitnehmer , deren Pflege oder Fraßverhalten wurde in Single-Kohorte Kolonien beobachtet. HPG Größe bei Arbeitern aus zwei Single-Kohorte Kolonien (Kolonie Nr. 1 und 2) wurde in drei Klassen eingeteilt; "Entwickelt", "Intermediate" und "geschrumpfte" nach Größe.
| Tage nach der Injektion | Keine Injektion | Insektenkochsalzlösung | Lösungsmittel für 20E Lsg | |
| Versuch 1 | Tag0 | 15/15 | 15/15 | 14/15 |
| Tag 1 | 15/15 | 14/15 | 13/15 | |
| Day5 | 14/15 | 13/15 | 11/15 | |
| Day7 | 14/15 | 12/15 | 9/15 | |
| Versuch 2 | Tag0 | 15/15 | 15/15 | 15/15 |
| Tag 1 | 15/15 | 13/15 | 15/15 | |
| Day5 | 15/15 | 11/15 | 12/15 | |
| Day7 | 14/15 | 10/15 | 12/15 |
Tabelle 2: Überlebensrate der Bienen mit Lösungsmittel für 20E Lösung injiziert. Fünfzehn Arbeiter wurden in jeder Versuchsgruppe vorbereitet.
| Tage nach der Anwendung | Aceton | Methoprene | |
| Versuch 1 | Tag 0 | 7/7 | 8/8 |
| Tag 7 | 7/7 | 6/8 | |
| Versuch 2 | Tag 0 | 7/7 | 8/8 |
| Tag 7 | 7/7 | 8/8 |
Tabelle 3: Überlebensrate der Bienen behandelt mit Methopren Sieben bis acht Arbeiter in jeder Versuchsgruppe hergestellt..
| Tage nach der Injektion | Keine Injektion | Aceton / Bee Salzlösung (1: 4) |
| Tag 0 | 15/15 | 15/15 |
| Tag 1 | 15/15 | 6/15 |
| Tag 3 | 15/15 | 5/15 |
| Tag 5 | 15/15 | 4/15 |
| Tag 7 | 15/15 | 4/15 |
Tabelle 4: Überlebensrate der Bienen mit Aceton / Biene Kochsalzlösung injiziert (1: 4). Lösung Fünfzehn Arbeiter für jede Versuchsgruppe hergestellt. Aceton / bee Kochsalzlösung (1: 4) Lösung wurde in den Arbeiter Abdomen injiziert. Die Zusammensetzung von Bienen saline 130 mM NaCl, 6 mM KCl, 4 mM MgCl 2, 2,5 mM CaCl 2, 160 mM Saccharose, 25 mM Glucose und 10 mM HEPES (pH 7,0).
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Discussion
Herstellung von Single-Kohorte Kolonien
Hier haben wir beschrieben , das Protokoll in unserer früheren Studie 16 verwendet , um Single-Kohorte Kolonien für die Analyse von HPG Physiologie vorzubereiten im Zusammenhang mit der Verschiebung der Rolle der Arbeiterbienen. Krankenschwester Bienen und altklug foragers, die die Kriterien in den Verfahren beschrieben erfüllt 1,6-1,7 und 2 wurden in den Single-Kohorte Kolonien (Tabelle 1) beobachtet. Die Aufnahmen in Abbildung 2 wäre nützlich bei der Klassifizierung von HPG heißt es als Referenz. basierend auf Kriterien sowohl Arbeitnehmer Verhalten und HPG Entwicklung sind für die Definition von Ammen oder foragers in typischen Kolonien gültig. Rollenwechsel von der Krankenpflege Nahrungssuche geht allmählich in den Kolonien: die Zeit , in der Pflegeverhalten verbrachte allmählich ab , während sie in Nahrungssuchverhalten nach und nach während der Rolle Verschiebung 2 erhöht. Somit wäre es schwierig, Arbeiter zu sammeln, die ausschließlichführen Krankenpflege oder Nahrungssuche von nur Verhaltenskriterien. Das Ergebnis , dass die Expression von mrjp2 und Hbg3 in den HPGs mit der Rolle der Arbeiter verbunden ist , zeigt deutlich , dass das Protokoll hier kann HPG Physiologie angenommen beschrieben werden in Ammen und altklug foragers von Single-Kohorte Kolonien (Abbildung 3) zu untersuchen. basierend auf Kriterien sowohl Arbeitnehmer Verhalten und HPG Entwicklung könnte auch bei der Definition von Ammen und altklug foragers von Single-Kohorte Kolonien anwendbar sein. Zusätzlich zu den HPGs, andere exokrinen Drüsen im Kopf unterziehen physiologischen Veränderungen im Zusammenhang mit der Rolle Verschiebung. Beispielsweise 2 die Funktion der Unterkieferdrüse Änderungen aus der Synthese von Fettsäuren für Futtersaft auf die Synthese von Alarmpheromon 2-Heptanon. Das hier beschriebene Protokoll kann somit die Rolle assoziierte Physiologie der exokrinen Drüsen andere als die HPGs zu untersuchen angepasst werden.
Erfolgreiche Sammlung von nurse Bienen und altklug foragers von Single-Kohorte Kolonien abhängig von der Sammlung von einer ausreichenden Anzahl von neu entstandenen Arbeiter, wenn die Kolonien hergestellt werden. Wenn eine geringe Anzahl von neu entstandenen Arbeiter gesammelt wird, würde es schwierig sein, genug Krankenschwester Bienen und altklug foragers sammeln. Darüber hinaus ist der Zustand der Königinnen ein weiterer wichtiger Punkt für eine erfolgreiche Probenentnahme. Queens mit einem großen Bauch sind gut für die Eier zu legen, weil diese Königinnen in der Regel Ovarien entwickelt haben. So wird die Arbeit der Arbeiter gedacht, um effektiv auch in Single-Kohorte Kolonien geteilt werden, da die Brut ständig von der Königin zugeführt wird. Wenn keine Brut versorgt wird, würde es schwierig sein, Krankenschwester Bienen aus den einzelnen Kohorten Kolonien sammeln. Schließlich markiert die Arbeiter Plakatfarbe verwendet wird, um zu gewährleisten, dass die Arbeitnehmer von Single-Kohorte Kolonien gesammelt werden, weil foragers gelegentlich an die falsche Kolonie zurück. So sammeln altklug foragers effektiv, Farbmarkierungen solltenum so viele Arbeitnehmer wie möglich angewendet (mehr als 900 neu Single-Kohorte Kolonie entstanden Arbeiter pro). Die Verwendung von Tinte auf Wasserbasis für Markierungs kann empfohlen werden, weil eine Tinte auf Ölbasis, die in der Regel flüchtigen organischen Verbindungen enthält, kann die chemische Verbindung zwischen den Bienen unterbrechen. Die auf Wasser basierende Tintenmarkierungen verblassen nicht sehr stark im Verlauf des Experiments.
Hormonbehandlung
Wir beschrieben auch das Protokoll 20E in die Köpfe der Arbeiter zum Injizieren der Wirkung von Ecdyson auf HPG Physiologie (mrjp2 und Hbg3 Ausdruck) zu untersuchen. Die Überlebensrate der Bienen mit Insektensalzlösung oder das Lösungsmittel für 20E Lösung injiziert war ausreichend für die nachfolgende Analyse, was anzeigt , dass das Protokoll für die Injektion unter Verwendung einer Injektionsspitze und Lösungsmittel zur 20E hier beschriebene Lösung kann für die 20E Injektions Experiment (Tabelle 2 übernommen werden ). Außerdem Vergleich der Genexpression in den HPGs20E zwischen behandelten und Kontroll Bienen Bienen gekennzeichnet , dass das injizierte 20E die Expression von mrjp2 und Hbg3 verändert, die beide auf HPG - Funktion verbunden sind (Abbildung 5). Dieses Ergebnis legt nahe, dass die hier beschriebene Protokoll nützlich wäre, um die Auswirkungen von Ecdyson auf HPG Physiologie für die Prüfung und kann zur Prüfung von anderen exokrinen Drüsen im Kopf, wie beispielsweise die Unterkieferdrüsen angenommen werden. Weiterhin kann das Einspritzverfahren zum Einspritzen von anderen Chemikalien angenommen werden. Zum Beispiel beschriebene Protokoll hier würde zum Injizieren doppelsträngige RNA-Lösungen in die Köpfe für Knock-Down-Experimente geeignet.
Neben 20E beschrieben wir ein Protokoll Methopren zum Auftragen, die eine JH-Analogon ist. Methopren ist normalerweise auf das Abdomen aufgetragen. Auf der anderen Seite wurde Methopren an den Leiter der Arbeiter angewendet, hier. Fast alle Bienen mit topischen Anwendung von Methopren oder Aceton überlebt 7 Tage nach der BehandlungDass die Anwendung von 5 ul Methopren oder Aceton - Lösung, was darauf hindeutet , auf die Köpfe hat wenig Einfluss auf Arbeiter - Überlebensrate (Tabelle 3). Weiterhin Vergleich mrjp2 und Hbg3 Expression in den HPGs zwischen methoprene- und Aceton behandelten Bienen zeigt an, dass Methopren Anwendung mrjp2 Expression und verbessert Hbg3 Expression (Abbildung 6) hemmt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das hier beschriebene Protokoll ist geeignet für die Analyse der Auswirkungen von Methopren auf die Physiologie der exokrinen Drüsen wie die HPGs im Kopf.
Erfolgreiche Hormonbehandlung hängt von der Überlebensrate der behandelten Bienen. Niedertemperatur-Exposition in einem Kühlschrank kann für anesthetizing Bienen geeignet sein. Anesthesia auf Eis wird nicht empfohlen, da Bienen nass auf dem Eis zu bekommen, auf eine niedrige Überlebensrate führt. Außerdem könnte das Injektionsverfahren ein weiterer wichtiger Punkt sein, für die Bienen am Leben zu halten. Es ist wichtig zu make die Injektionsspitze lang und dünn, und es zu einer scharfen Spitze zu formen das Messer mit Schäden an den Bienen durch Injektion zu minimieren. Allerdings könnte die Einspritzverfahren zur Untersuchung der Wirkungen von Methopren auf HPG Physiologie nicht geeignet sein, weil das Lösungsmittel Aceton für Methopren negativ bee Überleben (Tabelle 4) betrifft. Zusätzlich beschriebene Injektionsverfahren kann hier nicht für Verhaltensanalyse in Kolonien geeignet sein als injiziert Bienen aus ihren Kolonien ausgeschlossen würden, wenn sie nach der Injektion wieder eingeführt werden. Arbeitnehmer mit leichten Verletzungen könnten aus den Kolonien ausgeschlossen werden. Andere Verfahren, wie beispielsweise Anwendungs- oder orale Verabreichung von Hormon kann für Verhaltensanalyse geeignet.
Die Single-Kohorte Kolonie verwendet worden ist 10,11 die Regelung der Arbeitsteilung von Arbeitshonigbienen zu untersuchen. Zusätzlich hat die Behandlung mit Juvenilhormon wurde zur Untersuchung des Verhaltens und des Gehirns verwendet functiauf im Zusammenhang mit der Arbeitsteilung 11. Jedoch detaillierte Protokolle für sowohl die Herstellung der Einzelkohorten Kolonien und die Behandlung mit JH nicht so detailliert zuvor bereitgestellt worden ist. In letzter Zeit werden immer die Bedeutung von Ecdyson in der Arbeitsteilung zunehmend erkannt, und die Regelung der Arbeitsteilung sowohl von JH und Ecdyson 23 vorgeschlagen. Die detaillierten Protokolle für die erfolgreiche Herstellung von Single-Kohorte Kolonien und Hormonbehandlung wie JH und Ecdyson in diesem Artikel beschriebenen könnte in der Studie der Arbeiter Physiologie Fortschritt beitragen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | Marker pen for the application of marks to bees |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| Breeding case insect | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| Electromotion mixier | ISO | 23M-R25 | homogenization of tissue |
| TRIZol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | the reagent for total RNA extraction |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT reagent kit | Takara | RR037A | the reagent for reverse transcription |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | the reagent for real-time PCR |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | the instrument for real-time PCR |
| LightCycle Capillaries (20μl) | Roche | 4929292001 | the material for real-time PCR |
References
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