Summary
כאן אנו מתארים הפרוטוקול המפורט שלנו לעריכת מושבות דבורים חד עוקבה - כלי שימושי לניתוח הפיסיולוגיה עובדת הקשורים התפקיד. כמו כן, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לטיפול עובדים עם הורמון נעורי ecdysone להעריך את המעורבות של הורמונים אלה בויסות התנהגות עובד ו / או פיזיולוגיה.
Introduction
דבורת הדבש האירופית, שהאפיס Apis, הוא חרק eusocial עם חברה מאורגנת מאוד 1. דבורי עבודה (כת עבודה) עוסקים משימות שונות כדי לשמור על פעילות מושבה, ומשימות אלה לשנות בהתאם לגיל של דבורת הדבש עובד לאחר eclosion, אשר נקרא חלוקה הקשורות לגיל העבודה 2-4. עובדים צעירים (<13 ימים) לטפל גוזלים בכוורת על ידי הפרשת מזון מלכות (דבורי אחות), ואילו עובדי מבוגרים (> 15 ימים) לאסוף צוף ואבקה מחוץ לכוורת (לקטים) 2-4. הפיזיולוגיה של העובדים משתנה בשיתוף עם משמרת את התפקיד הזה. לדוגמא, הפונקציה של בלוטות hypopharyngeal (HPGs), לזווג בלוטות אקסוקרינית הממוקמות בראש, שינויים בשיתוף עם מעבר התפקיד מ סיעודי ליקוט 2,5. HPGs דבורה מטפל בעיקר לסנתז חלבוני מזון המלכות גדולים, המהווים מרכיבים עיקריים של חלב דבורה. מצד השני, forager HPGs בעיקרלסנתז אנזימים חילוף חומרים של פחמימות, כגון-glucosidase α III, לעבד צוף לתוך דבש ידי המרת סוכרוז לגלוקוז ופרוקטוז. המחקרים הקודמים שלנו גילו כי הביטוי של mrjp2, מקודד חלבון מזון מלכות גדול, Hbg3, מקודד-glucosidase α III, שינויים במהלך תפקיד המשמרת 6-9.
כדי לקבוע אם השינויים הפיסיולוגיים ברקמות העובד, לרבות HPGs, קשור בתפקיד המשמרת או עם הגיל של העובדים, זה יהיה שימושי כדי לתפעל את רכב האוכלוסייה של מושבת דבורת דבש, כגון להכין-עוקבה יחידה מושבות בה עובדים של כמעט בני אותו גיל לבצע משימות שונות 10,11. רובינסון et al. (1989) תיאר שיטה להקמת מושבה אחת-עוקבה 10. מושבות קוהורט יחיד בתחילה מהוות מלכה 0-2 יום עובדים ישנים. ימים ספורים לאחר הקמת המושבות, עובדי ALMost באותו הגיל להניח משימות שונות. חלק מהעובדים לבצע משימות סיעוד כמו במושבות טיפוסיות, ואילו עובדים אחרים לבצע משימות ליקוט מזון מוקדם מהרגיל ולכן נקראים לקטים מוקדמים. ג'ין השוואות ביטוי בין דבורי אחות לקטים מוקדמים תספקנה מידע שימושי על הפיסיולוגיה קשור התפקיד של רקמות עובדים 12-16. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט להכנת מושבות-עוקבה אחת לניתוח של משחק תפקידים ו / או גיל הקשורים לפיזיולוגיה של HPGs 16. כמו כן, אנו מתארים בקצרה כיצד לבחון את ביטוי הגנים של mrjp2 ו Hbg3 ידי תגובת שרשרת שעתוק-פולימראז הפוך כמותית (RT-PCR) להעריך פיזיולוגיה HPG.
בנוסף הניתוח של פיזיולוגיה עובד במושבות חד עוקבה, הבדיקה של מערכת האנדוקרינית חשובה לניתוח מנגנוני הוויסות של פיזיולוגיה עובדים הקשורים תפקיד. הורמון נעורים (JH), אשר known כמו ההורמון 'סטטוס קוו' ב זחלי חרקים, מאיץ את המעבר בתפקיד מ סיעוד לחפש מזון דבורים עובדים 11. יתר על כן, ecdysone, אשר ידוע בתור הורמון השרה במהלך המטמורפוזה, עשוי להיות מעורב תפקיד המשמרת כמו גנים המקודדים מולקולות איתות ecdysone באים לידי ביטוי בגופי הפטריות, מרכז גבוה של המוח עובד 17-19. לכן, אנו גם מתארים את הפרוטוקול המפורט השתמש במחקר הקודם שלנו 16 לטיפול עובדים עם 20E, שהינה בעלת צורה פעילה של ecdysone, ו methoprene, אנלוג JH, לניתוח של שפעת המערכת האנדוקרינית על פיזיולוגית HPG (ביטוי של mrjp2 ו Hbg3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מושבות אחת-עוקבה
- כן שלוש מושבות דבורים ליצור שתי מושבות האחת-עוקבה להשיג מספר מספיק של עובדים יצאו זה עתה.
- בדקו כמה גלמים בתאים ההיקפיים כתרי המסרקים יש עיניים חומות לציפורן פיגמנט ידי פתיחת המסרקים כתרים באמצעות פינצטה. אם גלמים אלה קיימים בתאי מסרק פריפריה, רוב הגלמים של המסרקים כולה יצא ב כ 1-3 ימים.
- בהמשך לכך, לאסוף את המסרקים המכילים גלמים אלה אחרי הכל הדבורים הבוגרות החסידות הוסרו עם מברשת, ומערבבים מסרקים משלוש המושבות למזער שונה בין מושבות.
- מניח את המסרקים שנאספו תיבת כוורת ריקה לדגור על 33 מעלות צלזיוס מתחת בתנאי לחות (לחות יחסית> 60%). אסוף כ -6,000 עובדים עתה הגיח מעל 3 ימים (3,000 עובדים לכל מושבה) ממסרקי שנאספו.
- לקבוע את הכמות וורקrs לפי המשקל של חמישה פועלים עתה הגיח שנאספו באקראי ממושבות unmanipulated.
- לשקול חמש פועל עתה הגיח שנאספו באקראי ממושבות unmanipulated באמצעות ומכונות שקילות.
הערה: המשקל של חמישה פועלים החדשים שנוצרו בסופו של דבר בדרך כלל 500-600 מ"ג. - להעריך את כמות העובדים שנאספו על ידי חלוקת המשקל של העובדים שגבו המשקל הממוצע של חמישה פועל יצאו זה עתה.
- לשקול חמש פועל עתה הגיח שנאספו באקראי ממושבות unmanipulated באמצעות ומכונות שקילות.
- החל סימני צבע על thoraces של כ -1,800 עובדים (900 עובדים לכל מושבה) באמצעות סמני צבע פוסטר על בסיס מים.
הערה: סמן רחיץ אשר משמש כדי להחיל את הצבע מופיע בטבלה של חומרים. - הצג מלכה וכ -3,000 העובדים הישנים 0-2 היום לתיבת כוורת חדשה המכילה שני מסרקים, מנה אחת של דבש מסרק המכיל ואבקה כמו מזונות משומרים ועוד מסרק ריק הטלה ידי המלכה. אסוף את המסרק המכיל fr דבש ואבקת פרחיםom אחר מושבת unmanipulated אחרי כל הדבורים החסידים יוסרה.
הערה: שימוש תיבת כוורת גרעינית (תיבת כוורת בגודל קטנה) מומלץ. - אסוף דבורי אחות לקטים מוקדמים עם סימני צבע 6 עד 8 ימים לאחר יצירת מושבות האחת-עוקבה.
- כדי לאסוף דבורי אומנות, להרים עובדים כי טמנו את ראשיהם לתוך תאים מסרקים לטפל של הגוזלים. להשתמש בפינצטה כדי לאסוף דבורי אחות מסרקים המכילים עובדים גוזלים ומבוגרים רבים.
הערה: אם HPGs עובדים שנאספו מפותחים כאשר גזור כמתוארים בשלב 1.7, עובדים אלה מוגדרים דבורי אומנות. החזקת thoraces ידי פינצטה מומלץ להרים עובדים מהמסרקים. - כדי לאסוף לקטים, השתמש נטו חרקים ללכוד עובדים לחזור הכוורות שלהם עם המון אבקה על רגליהם האחוריות.
הערה: אם HPGs העובדים שנתפסו מופיעים מצומק כאשר גזור כמתואר בשלב 1.7, עובדים אלה מוגדרים הלקטים.
- כדי לאסוף דבורי אומנות, להרים עובדים כי טמנו את ראשיהם לתוך תאים מסרקים לטפל של הגוזלים. להשתמש בפינצטה כדי לאסוף דבורי אחות מסרקים המכילים עובדים גוזלים ומבוגרים רבים.
- ClasSify HPG לשלוש קבוצות, 'פותח', 'ביניים', ו 'שהתכווץ' על ידי לנתיחה תחת סטראו.
- להרדים 10-15 דבורים בתוך כלוב חרקים במקרר למשך 10-15 דקות עד דבורים לא יכול לעוף או ללכת. לאחר מכן, להעביר דבורים על קרח ולהשלים את ההרדמה על קרח למשך 5 דקות.
הערה: זה לוקח בערך 15-20 דקות בסה"כ להגיע להרדמה. אם זמן ההרדמה צריך להתקצר, מספר דבורים בתוך כלוב צריך להיות מופחת 1-3 דבורים בכל כלוב. - לנתח את הראש מהגוף עם מספריים פינצטה. תקן את הראש על שעוות שיני דגש על צלחת פטרי עם סיכות. הכנס שתי סיכות לתוך הבסיסים של האנטנות לתקן את הראש. משרים ראשי קבוע מלוחים חרקים (130 mM NaCl, KCl 5 מ"מ, 1 מ"מ CaCl 2).
- הסר את ההיבט הקדמי של לציפורן של הראש באמצעות פינצטה בסדר וסכין כירורגית תחת מיקרוסקופ משקפת.
הערה: HPGs ניתן למצוא בקלות ראש לאחר הסרת גuticle. HPG הוא איבר botryoid שקיים סביב המוח בראשו. - הסרת הרקמה קנה הנשימה שהנה רקמה קרומית לבנה מתחת לציפורן. לאחר מכן, לנתח את HPGs מהראש ידי משיכת אותם לאט עם פינצטה.
- לסווג HPGs עם acini גדול עגול כמו 'פותח'. לסווג HPGs עם acini קטן ומעוות כמו 'שהתכווצה'. לסווג HPGs מתאים לא 'פותח' ולא 'שהתכווצתי' כמו 'ביניים'.
הערה: תמונות נציג המראות שלושה שיעורים אלה של מדינות HPG מסומנים באיור 2. - נושא 'פותח' ו HPGs 'שהתכווצה' כדי מיצוי RNA כמו 'HPGs דבורה מטפלת' ו 'HPGs forager', בהתאמה, ולהשוות ביטוי גנים HPGs בין אחות דבורים הלקטים (סעיף 4).
- להרדים 10-15 דבורים בתוך כלוב חרקים במקרר למשך 10-15 דקות עד דבורים לא יכול לעוף או ללכת. לאחר מכן, להעביר דבורים על קרח ולהשלים את ההרדמה על קרח למשך 5 דקות.
2. הזרקה של 20E
- אסוף דבורי אומנות ממושבות טיפוסיות כמו described בהליך 1.6.1.
הערה: HPGs לא יכול להיבחן מהדבורים כמו הדבורים יהיה גודלו. - להרדים את הדבורים ב 4 ° C במקרר (לא על הקרח).
הערה: זה לוקח בערך 30 דקות כדי להשיג הרדמה. אם זמן ההרדמה מתקצר, מספר דבורים בכלוב צריך להיות מופחת 1-3 דבורים בכל כלוב. - בעזרת פינצטה, לשתק את הדבורים על שעוות שיני דגש על צלחת פטרי.
- להזריק 1 μl של פתרון 20E לתוך ההיבט הקדמי של הראש באמצעות טיפ הזרקה עשוי micropipette נימים מכויל באמצעות חולץ מחט זכוכית.
- ממיסים 20E מלוחים אתנול-חרקים (130 mM NaCl, KCl 5 מ"מ, 1 מ"מ CaCl 2) תערובת (1: 4) ב 2.5 מיקרוגרם / μl.
- חבר את קצה ההזרקה לצינור גומי, ולהתחבר טיפ micropipette צהוב לצד השני של הצינור.
- מקום 1 μl של פתרון 20E על parafilm באמצעות micropipette, להחזיק את קצה micropipette צהוב פה,d לצייר הפתרון לתוך קצה ההזרקה.
- הכנס את קצה ההזרקה לתוך הבסיס של האנטנות, ולהזריק את הפתרון על ידי נושבת קצה micropipette הצהוב.
ההערה: הפרוטוקול שמוצג צעד זה הוא שיטת הזרקת הנציג, אבל השימוש של מכונת ההזרקה האוטומטית מומלץ עבור בטיחות כמו 20 הכרחית.
- אחורי הדבורים המוזרקים בכלובי חרקים ב 33-36 מעלות צלזיוס (הטמפרטורה האידיאלית הם 35 מעלות צלזיוס) בתנאים כהים ולחים (> 60% לחות יחסית) עבור 1 או 3 ימים. אספקת תערובת דבש-מים (1: 1) כדי הדבורים. במידת הצורך, לספור לשרוד דבורים לאחר ההזרקה.
3. יישום Methoprene
- אסוף את המסרקים המכילים גלמי ממושבות בדרך כלל אחרי כל הדבורים הבוגרות החסידות תוסרנה עם מברשת. הדגירה המסרקת ב- C ° 33-36 (הטמפרטורה האידיאלית היא 35 מעלות צלזיוס) בתנאי לחות (לחות יחסית> 60%) בהיקף של עד 1 יום.
- לאחר 6 ימים, לאסוף עובדים צבועים (6 יממה) מן המושבות. תרים עובדים צבועים מהמסרקים ידי החזקת thoraces שלהם עם פינצטה.
- להרדים את הדבורים ב 4 ° C במקרר (לא על הקרח) כמו בפרוצדורה 2.2. בעזרת פינצטה, לשתק את הדבורים על שעווה שיניים דגש על צלחת פטרי ולהחיל 1-5 μl של פתרון methoprene (50-250 מיקרוגרם / μl) מומס אצטון כדי ראשיהם באמצעות micropipette. השתמש קצה מסנן כי הוא עמיד בפני אצטון.
הערה: אצטון יכול להיות השפעות מזיקות על דבורים מובילה למוות. אם התמותה של דבורים הגבוהות הוא ציין, צמצום היקף אצטון 1 μl לכל הפחות מומלץ. - אחורי הדבורים בכלובי חרקים ב 33-36 ° C (t האידיאליemperature הוא 35 מעלות צלזיוס) במשך 7 ימים בתנאים כהים ולחים (לחות יחסית> 60%). אספקת תערובת דבש-מים (1: 1) כדי הדבורים. במידת הצורך, לספור לשרוד דבורים לאחר יישום מקומי.
הערה: במאמר זה, דבורים לשרוד נספרים 7 ימים לאחר היישום (לוח 3).
הפקת 4. רנ"א כמותי RT-PCR
- להרדים דבורים לנתח HPGs כמתואר 1.7.1 צעדים 1.7.4.
- אסוף את HPGs גזור בצינור microcentrifuge על קרח ולאחסן יבש ב -80 ° C עד השימוש.
- להוסיף 400 μl של מגיב עבור denaturation חלבון.
הערה: מגיב זה זמין מסחרית (ראו טבלה של חומרים). - Homogenize רקמות HPG באמצעות יד שנערכה מערבל חשמלי עם עלי המגון שמתאים בתוך צינור microcentrifuge. Homogenize במהירות סיבוב של כ 300 סל"ד במשך 1 דקות על הקרח לשבור ותאי רקמות lyse.
טבלה של חומרים). - הוסף 80 μl כלורופורם ומערבבים היטב. דגירה במשך 5 דקות ב RT.
- צנטריפוגה צינורות microcentrifuge ב 14,170 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.. מעביר את השלב המימי לצינור חדש. הוסף נפח שווה של isopropanol ו 1 גליקוגן μl (5 מ"ג / מ"ל). דגירה ב -20 ° C עבור 20 דקות לפחות.
- צנטריפוגה צינורות microcentrifuge ב 14,170 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant.
- להוסיף 400 μl של אתנול 75% על גלולה ומערבבים היטב, בצנטריפוגה צינורות microcentrifuge ב 14,170 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C, ולהסיר את supernatant. חזור על נהלים אלה פעם נוספת.
- אוויר יבש גלולה במשך 5-10 דקות ולאחר מכן לפזר אותו 10 מים μl RNase חינם.
הערה: ייבוש מלא של הגלולה עלול לגרום insolubilization של גלולת RNA במים. לפיכך, גלולה שהוא רטוב מעט מתאיםהֲמָסָה. - למדוד את ריכוז RNA באמצעות ספקטרופוטומטר כגון NanoDrop או דומה.
- פנקו 500 ננוגרם של רנ"א הכל עם 2.0 U של DNase אני על ידי דוגרים על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לבזות כל הדנ"א הגנומי מזהמים.
- Reverse-לתמלל 200 ננוגרם של DNase אני שטופלתי RNA ולבצע בזמן אמת PCR באמצעות ערכות זמינות מסחרי (ראה הרשימה בטבלה של חומרים ריאגנטים) ו פריימרים גן ספציפי (mrjp2; 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 ', ו -5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3 ", Hbg3; 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3' 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3 '). בצעו את PCR כדלקמן: [95 ° C x 30 שניות + (95 מעלות צלזיוס x 5 שניות + 60 ° C x 15 שניות + 72 ° C x 20 שניות) x 45-55 מחזורים].
- לנרמל את כמות תעתיק עם זה של F2-1α גורם התארכות (EF1α˗F2) או 49 חלבון ריבוזומלי (rp49) 9,16,21,22. גנים אלו הם g המלא אמיןEnes לניתוח ביטוי גנים HPGs באמצעות qRT-PCR.
- בצע שני זנב מבחן t לזהות את ההבדלים המשמעותיים בין שתי קבוצות ניסוי (דבורי אומנות לעומת לקטים מפותחים לגילו, דבורים שטופל 20E לעומת דבורים שליטים, ודבורים שטופל methoprene לעומת דבורים מלאים) באמצעות תוכנה סטטיסטית.
הערה: אם F-מבחן מניח שונויות, מבחן t ניתן להשתמש. אם לא, יכול לשמש מבחן t של וולש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סקירה כללית של פרוטוקול להכנת מושבות אחת-עוקבה מתוארת באיור 1A. זמן-במהלך הניסויים מלהכין מושבות אחת-עוקבה לדגום אוסף מוצג באיור 1B. עובד כי בקריטריונים התנהגותיים להתנהגות סיעוד או התנהגות שיחור מזון נאספו ממושבות יחידה עוקבה, ופיתוח HPG נאמד ב עובד אלה טבלה 1 מציגה את סיווג פיתוח HPG לשלוש קבוצות.; 'פותח', 'ביניים', ו 'שהתכווצו' בהתאם לגודל. תמונות נציג מראות כיתות שלושת דברי HPGs מסומנות באיור 2. תוצאות המחקר מראות כי הן דבורי אחות לקטים מוקדמים, על פי הקריטריונים שתוארו בפרוטוקול, נצפו גם במושבות חד העוקבה. הביטוי של mrjp2 ו Hbg3 ב HPGs היה enriched בדבורי אחות לקטים מפותחים לגילו, בהתאמה, המציין כי פונקצית HPG קשורה לתפקידו של העובד (איור 3) 16.
ההליך להזרקת 20E לתוך הראש עובד מתוארת באיור 4. דבורים שורדים נספרו 1, 5 ו -7 ימים לאחר ההזרקה לבחון את הישרדות שיעור דבורים הזריקו מלוחים חרקים או ממס עבור פתרון 20E לפני הניסוי 20E. ב -7 ימים לאחר הזרקה, כ 60-80% של דבורים מוזרקים היו בחיים, שיעור הישרדות של דבורים הזריקו ממס עבור פתרון 20E היה דומה לזה עם מי מלח חרקים (טבלה 2). השפעת הזרקת 20E ירד ביטוי הן mrjp2 ו Hgb3 ב HPGs (איור 5) 16. בנוסף 20E, את השפעת יישום methoprene אקטואלי על mrjp2 ו Hbg3 (לוח 3). מצד השני, רק כ 20% עד 30% של דבורים מוזרקים עם אצטון / מלוח דבורה (1: 4) פתרון שרד 7 ימים לאחר הזרקה כאשר דבורים ששרדו נספרו 1, 3, 5 ו -7 ימים לאחר ההזרקה (לוח 4) . לכן, שיטת הבקשה לטיפול methoprene אומצה. יישום של methoprene עיכב את הביטוי של mrjp2 ומשופרים הבעת Hbg3 (איור 6) 16.
סקירה כללית באיור 1. ניסוי מושבה אחת-עוקבה. (א) תכנית להכנת מושבות קוהורט יחיד. (ב) זמן כמובן של הניסוי preparinמושבות האחת-עוקבה גרם לאיסוף דבורי אחות לקטים מוקדמים. חץ אופקי מציין את מהלך חייו של עובד בעת ובעונה אחת מושבות האחת-העוקבה. מספרים עם קווים אנכיים מציינים גיל עובד. לא רק לקטים בוגרים לגילה אבל גם דבורי אומנות מזדקנים (28-32 ימים) מדווחות נמצאים מושבות אחת-עוקבה 15. לפיכך, השוואה של הפיסיולוגיה בין דבורי לקטי אחות מזדקן יכולה להתבצע במושבות חד עוקבה, אם כי זה לא נעשה במחקר זה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תמונות איור 2. מראה שלוש מעמדות של מדינות HPG. פותח (א), בינוני (B), ומצומקת (C לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. תפקידים הקשורים ביטוי mrjp2 ו Hbg3 ב HPGs עובדים ממושבות יחידה עוקבה. הגרף מציג השוואה של רמות ה- mRNA של mrjp2 (א) ו Hbg3 (B) ב HPGs בין דבורי אומנות (N) לקטים מוקדמים (PF) משתי שיתוף חד עוקבהlonies. רמת ה- mRNA של כל גן היה מנורמל עם זה של חלבון ריבוזומלי 49 (rp49). רמת ה- mRNA היחסית של כל גן ב HPGs דבורה המטפלת הוגדרה 1. רמת ה- mRNA של mrjp2 בחלק הלקטים מוקדמים לא ניתן לכמת בגלל עוצמות אות נמוכות מסף זיהוי. לכן, מספר דגימות שונה בין גנים. רמות ה- mRNA יחסית מסומנים באמצעות סטיית התקן. כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים בין דבורי אחות לקטים מוקדמים (*, p <0.05; t-test). נתון זה שוחזר מאל et Ueno., (2015) 16. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Scheme איור 4. פרוטוקול 20E injection. ונהלי 2.3 ו -2.4 באזור הפרוטוקול מומחשים בנתון זה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. השפעת הזרקת 20E על mrjp2 וביטוי Hbg3 ב HPGs 16. הגרף מציג השוואה של רמות ה- mRNA של mrjp2 (א) ו Hbg3 (B) ב HPGs בין דבורים שטופלו 20E (20E +) ודבורים מלאים (20E-). מספרים תחת הגרף מציינים את היום לאחר טיפול 20E. רמת ה- mRNA של כל גן היה מנורמל עם זה של F2-1α גורם התארכות (EF1α-F2). רמת ה- mRNA יחסית שלכל גן ב HPGs הדבורה המלא הוגדר 1. רמות mRNA יחסית מסומנות עם סטיית התקן. כוכבית מציינת הבדל משמעותי בין דבורי 20E שטופל ודבורים מלאים (*, p <0.05; t-test). נתון זה שוחזר מאל et Ueno., (2015) 16. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. ההשפעה כתוצאה מישום methoprene על mrjp2 וביטוי Hbg3 ב HPGs 16. הגרף מציג את ההשוואה של רמות ה- mRNA של mrjp2 (א) ו Hbg3 (B) ב HPGs בין דבורים ודבורים מלאים שטופל methoprene. הרמת ה- mRNA של כל גן היה מנורמל עם זה של EF1α-F2. רמת ה- mRNA יחסית של כל גן ב HPGs הדבורה המלא הוגדרה 1. רמות mRNA יחסית מסומנות באמצעות סטיית התקן. כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים בין דבורים ודבורים מלאים שטופל methoprene (*, p <0.05; t-test). נתון זה שוחזר מאל et Ueno., (2015) 16. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| מס 'קולוני | התנהגות נצפית | מספר האנשים בכל כיתה HPG | |||
| מפותח | ביניים | מְכוּוָץ | סה"כ | ||
| 1 | הֲנָקָה | 8 | 1 | 1 | 10 |
| חִפּוּשׂ מָזוֹן | 0 | 4 | 7 | 11 | |
| 2 | הֲנָקָה | 4 | 2 | 0 | 6 |
| חִפּוּשׂ מָזוֹן | 0 | 0 | 5 | 5 | |
טבלה 1: סיווג של HPGs של שעובדיהם סיעוד או ליקוט התנהגות נצפתה מושבות אחת-עוקבה. גודל HPG עובדים משתי מושבות אחת-עוקבה (nos המושבה 1 ו -2.) היה מקובצים לשלוש כיתות; 'פותח', 'ביניים' ו 'שהתכווצו' על פי גודלם.
| ימים לאחר ההזרקה | אין הזרקה | מלוח חרקים | מרכך עבור soln 20E | |
| ניסיון 1 | יום 0 | 15/15 | 15/15 | 14/15 |
| יום 1 | 15/15 | 14/15 | 13/15 | |
| Day5 | 14/15 | 13/15 | 11/15 | |
| יום 7 ג | 14/15 | 12/15 | 9/15 | |
| ניסוי 2 | יום 0 | 15/15 | 15/15 | 15/15 |
| יום 1 | 15/15 | 13/15 | 15/15 | |
| Day5 | 15/15 | 11/15 | 12/15 | |
| יום 7 ג | 14/15 | 10/15 | 12/15 |
טבלה 2: הישרדות שיעור דבורים הזריקו ממס עבור 20E פתרון. חמש עשרה עובדים הוכנו בכל קבוצת הניסוי.
| ימים לאחר יישום | אֲצֵטוֹן | Methoprene | |
| ניסיון 1 | יום 0 | 7/7 | 8/8 |
| יום 7 | 7/7 | 6/8 | |
| ניסוי 2 | יום 0 | 7/7 | 8/8 |
| יום 7 | 7/7 | 8/8 |
טבלה 3: שיעור הישרדות של דבורים שטופלו methoprene שבע עד שמונה עובדים הוכנו בכל קבוצת ניסוי..
| ימים לאחר ההזרקה | אין הזרקה | אצטון / מלוח דבורה (1: 4) |
| יום 0 | 15/15 | 15/15 |
| יום 1 | 15/15 | 6/15 |
| יום 3 | 15/15 | 5/15 |
| יום 5 | 15/15 | 4/15 |
| יום 7 | 15/15 | 4/15 |
לוח 4: הישרדות שיעור הדבורים מוזרקים עם אצטון / דבורה מלוחה (1: 4). פתרון חמישה עשרה עובדים הוכנו עבור כל קבוצת ניסוי. אצטון / דבורה מלוחה (1: 4) פתרון שהוזרק לתוך הבטן עובד. הרכב מלוחים דבורה הוא 130 מ"מ NaCl, 6 מ"מ KCl, 4 מ"מ MgCl 2, 2.5 מ"מ 2 CaCl, 160 סוכרוז מ"מ, 25 מ"מ גלוקוז, ו -10 מ"מ HEPES (pH 7.0).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הכנת מושבות אחת-עוקבה
כאן תיארנו את פרוטוקול השתמשו במחקר הקודם שלנו 16 להכין מושבות אחת-עוקבה לניתוח של הפיזיולוגיה HPG הקשורים משמרת בתפקיד הדבורים הפועלות. הדבורים המטפלות ואת הלקטים בוגרת לגילה, שלעתים עומדת בקריטריונים המתוארים נהלים 1.6-1.7 ואיור 2 נצפו מושבות אחת-עוקבה (טבלה 1). הצילומים באיור 2 יהיו שימושיים בסיווג HPG מקובע כהפניה. קריטריונים המבוססים משני התנהגות העובד ופיתוח HPG תקפים להגדרת דבורי אומנות או לקטים במושבות טיפוסיות. תפקיד מעבר סיעודי ליקוט ממשיך בהדרגה במושבות אלה: כמות הזמן המושקע בהתנהגות סיעוד יורדת בהדרגה תוך כי התנהגות שיחור מזון מגביר בהדרגה במהלך תפקיד המשמרת 2. לכן, זה יהיה קשה לאסוף עובדים באופן בלעדילבצע סיעוד או ליקוט על ידי קריטריונים התנהגותיים בלבד. התוצאה כי ביטוי של mrjp2 ו Hbg3 ב HPGs מזוהה עם התפקיד של העובדים עולה בבירור כי הפרוטוקול המתואר כאן ניתן לאמץ כדי לבחון פיזיולוגית HPG בדבורי אחות לקטים מוקדמים ממושבות יחידה עוקבה (איור 3). קריטריונים המבוססים משני התנהגות העובד ופיתוח HPG יכולים גם הוא להיות מיושמים בהגדרת דבורי אחות לקטים מוקדמים ממושבות יחידה עוקבה. בנוסף HPGs, בלוטות אקסוקרינית אחרות בראש עוברות שינויים פיסיולוגיים בשיתוף עם מעבר התפקיד. לדוגמא, הפונקציה של שינויי mandibular בלוטה מן הסינתזה של חומצות שומן למזון גוזל לסינתזה של אזעקת פרומון 2-heptanone 2. הפרוטוקול המתואר כאן ניתן אפוא להיות מותאם לבחון הפיזיולוגיה הקשורים-תפקיד של בלוטות אקסוקרינית מלבד HPGs.
אוסף מוצלח של nדבורי urse ו לקטים מוקדמים ממושבות יחידה עוקבה תלויות האוסף של מספר מספיק של עובדים עתה הגיחו כאשר המושבות מוכנות. אם מספר נמוך של עובדים יצאו זה עתה נאסף, זה יהיה קשה לאסוף מספיק דבורי אחות לקטים מוקדמים. יתר על כן, התנאי של המלכות היא עוד נקודת מפתח עבור אוסף מדגם מוצלח. קווינס עם בטן גדולה טוב להטיל ביצים כי מלכות אלה בדרך כלל פתחו השחלות. לפיכך, העבודה של עובדים היא חשב תחולק אפילו ביעילות במושבות חד עוקבה משום הגוזלים מסופקים ללא הרף על ידי המלכה. אם לא גוזל מסופק, זה יהיה קשה לאסוף דבורי אחות מן המושבות חד עוקבה. לבסוף, סימון העובדים באמצעות צבע פוסטר נדרש כדי להבטיח שעובדים נאספים ממושבות יחידה עוקבה, כי לקטים מדי פעם לחזור המושבה הטועה. כדי לאסוף לקטים מוקדמים ביעילות, סימני צבע צריכים להיותלהחיל עובדים רבים ככל האפשר (יותר מ -900 עובדים יצאו זה עתה לכל מושבה אחת-עוקבה). השימוש בדיו על בסיס מים לסימון עשוי להיות מומלץ, כי די על בסיס שמן, אשר בדרך כלל מכיל תרכובות אורגניות נדיפות, עלול להפריע התקשורת הכימית בין הדבורים. סימני דיו על בסיס מים לא דוהה מאוד במהלך הניסוי.
טיפול הורמונלי
אנחנו גם תארנו את הפרוטוקול להזרקת 20E אל ראשיהם של עובדים לבחון את השפעת ecdysone על פיזיולוגית HPG (mrjp2 וביטוי Hbg3). שיעור ההישרדות של דבורים הזריקו מלוחים חרקים או ממס עבור 20E הפתרון היה מספיק לניתוח שלאחר מכן, המציין כי הפרוטוקול המתואר כאן להזרקה באמצעות טיפ הזרקת וממס פתרון 20E ניתן לאמץ לצורך הניסוי הזרקת 20E (טבלה 2 ). יתר על כן, השוואה של ביטוי גנים HPGsבין דבורי 20E שטופל ודבורים מלאים ציין כי 20E המוזרק שינה את הביטוי של mrjp2 ו Hbg3, ששתיהן קשורות פונקצית HPG (איור 5). תוצאה זו מרמזת כי הפרוטוקול המתואר כאן יהיה שימושי לבדיקת ההשפעות של ecdysone על פיזיולוגית HPG, והיא ניתנת ליישום לבחינת בלוטות אקסוקרינית אחרות בראש, כגון בלוטות mandibular. יתר על כן, שיטת ההזרקה ניתן לאמץ להזרקת חומרים כימיים אחרים. לדוגמא, הפרוטוקול המתואר כאן יהיה מתאים להזרקת פתרונות RNA פעמים תקועות לתוך ופונה ניסויי מציאת גן.
בנוסף 20E תיארנו פרוטוקול ליישום methoprene, שהוא אנלוג JH. Methoprene בדרך כלל מוחלת על הבטן. מצד השני, methoprene היה מוחל על הראש של עובדים, כאן. כמעט כל הדבורים עם יישום מקומי של methoprene או אצטון שרדו 7 ימים לאחר הטיפוליש, דבר המצביע על יישום של methoprene 5 μl או פתרון אצטון לראשים מעט השפעה על שיעור הישרדות עובד (לוח 3). יתר על כן, השוואה של mrjp2 וביטוי Hbg3 ב HPGs בין methoprene- ודבורים שטופלו אצטון עולה כי ההקפדה methoprene מעכב ביטוי mrjp2 ומשפר ביטוי Hbg3 (איור 6). תוצאות אלו מצביעות כי הפרוטוקול המתואר כאן הוא מתאים לניתוח השפעות methoprene על הפיזיולוגיה של בלוטות אקסוקרינית כגון HPGs בראש.
טיפול הורמונלי מוצלח תלוי את שיעור ההישרדות של דבורי מטופלים. חשיפה בעלי טמפרטורה נמוכה במקרר עשויה להתאים בהרדמת דבורים. הרדמה על קרח אינה מומלצת בגלל דבורים יירטבו על הקרח, וכתוצאה מכך שיעור הישרדות נמוך. יתר על כן, שיטת ההזרקה יכולה להיות עוד נקודת מפתח לשמירה על דבורים בחיים. חשוב מאקה קצה הזרקת ארוכים ודקים, ולעצב אותו קצה חד באמצעות חותך למזער נזק הדבורים בזריקה. עם זאת, שיטת ההזרקה אינה בחירה נכונה לבחינת ההשפעות של methoprene על פיזיולוגית HPG, משום אצטון הממס עבור methoprene משפיע לרעה הישרדות דבורה (לוח 4). בנוסף, שיטת ההזרקה המתוארת כאן לא יכולה להיות מתאימה לניתוח התנהגותי במושבות כמו דבורים מוזרקים היו מוצאים מכלל המושבות שלהם כאשר הם מחדש הציגו לאחר הזרקה. עובד עם פציעה קלה עלולים להיות שלילי מן המושבות. שיטות אחרות, כגון יישום או אוראלי של הורמון עשויות להיות מתאימות לניתוח התנהגות.
המושבה חד עוקבה נעשה שימוש כדי לבחון את הסדרת חלוקת העבודה של דבורי דבש עובד 10,11. בנוסף, הטיפול עם הורמון נעורים נוצל בעבר לבחינת functi התנהגות והמוחעל קשור חלוקת העבודה 11. עם זאת, פרוטוקולים מפורטים הוא בהכנת המושבות חד המחזור לבין הטיפול עם JH לא סופקו בעבר בפירוט כזה. לאחרונה, את החשיבות של ecdysone בחלוקת העבודה היא להיות מוכרת יותר ויותר, ואת הסדרת חלוקת עבודה על ידי שני JH ו ecdysone הוא הציעה 23. הפרוטוקולים המפורטים ההכנה המוצלחת של מושבות האחת-עוקבה וטיפול הורמונלי כגון JH ו ecdysone המתואר במאמר זה עשויים לתרום לקידום בחקר פיזיולוגיה עובד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | Marker pen for the application of marks to bees |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| Breeding case insect | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| Electromotion mixier | ISO | 23M-R25 | homogenization of tissue |
| TRIZol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | the reagent for total RNA extraction |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT reagent kit | Takara | RR037A | the reagent for reverse transcription |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | the reagent for real-time PCR |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | the instrument for real-time PCR |
| LightCycle Capillaries (20μl) | Roche | 4929292001 | the material for real-time PCR |
References
- Wilson, E. O. The insect societies. , Harvard university press. (1971).
- Winston, M. L. The biology of the honey bee. , Harvard university press. (1987).
- Lindauer, M. Ein Beitrag zur Frage der Arbeitsteilung im Bienenstaat. Zeitschrift für vergleichende Physiologie. 34 (4), 299-345 (1952).
- Sakagami, S. Untersuchungen uber die Arbeitsteilung in einen Zwergvolk der Honigbienen. Beitrage zur Biologie des Bienenvolkes, Apis mellifera L. I. Jap J Zool. 11, 117-185 (1953).
- Kubo, T., et al. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. J Biochem. 119 (2), 291-295 (1996).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Change in the mode of gene expression of the hypopharyngeal gland cells with an age-dependent role change of the worker honeybee Apis mellifera L. Eur J Biochem. 249 (3), 797-802 (1997).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Expression of amylase and glucose oxidase in the hypopharyngeal gland with an age-dependent role change of the worker honeybee (Apis mellifera L). Eur J Biochem. 265 (1), 127-133 (1999).
- Ohashi, K., Sawata, M., Takeuchi, H., Natori, S., Kubo, T. Molecular cloning of cDNA and analysis of expression of the gene for alpha-glucosidase from the hypopharyngeal gland of the honeybee Apis mellifera L. Biochem Biophys Res Commun. 221 (2), 380-385 (1996).
- Ueno, T., Nakaoka, T., Takeuchi, H., Kubo, T. Differential gene expression in the hypopharyngeal glands of worker honeybees (Apis mellifera L.) associated with an age-dependent role change. Zoolog Sci. 26 (8), 557-563 (2009).
- Robinson, G. E., Page, R. E., Strambi, C., Strambi, A. Hormonal and genetic control of behavioral integration in honey bee colonies. Science. 246 (4926), 109-112 (1989).
- Sullivan, J. P., Fahrbach, S. E., Robinson, G. E. Juvenile hormone paces behavioral development in the adult worker honey bee. Horm Behav. 37 (1), 1-14 (2000).
- Ben-Shahar, Y., Robichon, A., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. Influence of gene action across different time scales on behavior. Science. 296 (5568), 741-744 (2002).
- Lehman, H. K., et al. Division of labor in the honey bee (Apis mellifera): the role of tyramine beta-hydroxylase. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2774-2784 (2006).
- Mutti, N. S., Wang, Y., Kaftanoglu, O., Amdam, G. V. Honey bee PTEN--description, developmental knockdown, and tissue-specific expression of splice-variants correlated with alternative social phenotypes). PLoS One. 6 (7), e22195 (2011).
- Whitfield, C. W., Cziko, A. M., Robinson, G. E. Gene expression profiles in the brain predict behavior in individual honey bees. Science. 302 (5643), 296-299 (2003).
- Ueno, T., Takeuchi, H., Kawasaki, K., Kubo, T. Changes in the Gene Expression Profiles of the Hypopharyngeal Gland of Worker Honeybees in Association with Worker Behavior and Hormonal Factors. PLoS One. 10 (6), e0130206 (2015).
- Paul, R. K., Takeuchi, H., Matsuo, Y., Kubo, T. Gene expression of ecdysteroid-regulated gene E74 of the honeybee in ovary and brain. Insect Mol Biol. 14 (1), 9-15 (2005).
- Takeuchi, H., et al. Identification of a novel gene, Mblk-1, that encodes a putative transcription factor expressed preferentially in the large-type Kenyon cells of the honeybee brain. Insect Mol Biol. 10 (5), 487-494 (2001).
- Takeuchi, H., Paul, R. K., Matsuzaka, E., Kubo, T. EcR-A expression in the brain and ovary of the honeybee (Apis mellifera L). Zoolog Sci. 24 (6), 596-603 (2007).
- Yamane, T., Miyatake, T. Reduced female mating receptivity and activation of oviposition in two Callosobruchus species due to injection of biogenic amines. Journal of Insect Physiology. 56 (3), 271-276 (2010).
- Ben-Shahar, Y., Leung, H. T., Pak, W. L., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. cGMP-dependent changes in phototaxis: a possible role for the foraging gene in honey bee division of labor. J Exp Biol. 206 (Pt 14), 2507-2515 (2003).
- Danforth, B. N., Ji, S. Elongation factor-1 alpha occurs as two copies in bees: implications for phylogenetic analysis of EF-1 alpha sequences in insects. Mol Biol Evol. 15 (3), 225-235 (1998).
- Pandey, A., Bloch, G. Juvenile hormone and ecdysteroids as major regulators of brain and behavior in bees. Current Opinion in Insect Science. 12, 26-37 (2015).
